專利名稱：黃芪當(dāng)歸合劑的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥組合物的新用途，特別是涉及黃芪當(dāng)歸合劑制在藥領(lǐng)域中的新用途。
背景技術(shù)：
黃芪為豆科植物內(nèi)蒙黃芪[Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.Vas.mongholicus(Bge.)Hsiao]或膜莢黃芪[Astrgalus membranaceus(Fisch.)Bge.]的干燥根，有補(bǔ)氣升陽、固表解汗、利水消腫等功效；當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸[AngelicaSinensis(Olivo.)Diels]的干燥根，有補(bǔ)血調(diào)經(jīng)、潤燥滑腸的功效。黃芪配伍當(dāng)歸，是常用的補(bǔ)氣養(yǎng)血活血藥物。該藥既可獨(dú)立成方，又可組方。黃芪、當(dāng)歸作為中醫(yī)治療“腎病水腫”方劑中的常用藥，其療效已為長期臨床觀察證實(shí)。
許多腎臟疾病發(fā)展到一定階段，無論原發(fā)疾患是否存在，腎臟損傷都會不斷進(jìn)展直至腎小球硬化和/或間質(zhì)纖維化，導(dǎo)致終末期腎衰竭。因此，延緩和阻斷慢性進(jìn)展性腎損害是防治終末期腎臟病的關(guān)鍵，也是國內(nèi)外腎臟病界研究的熱點(diǎn)。雖然對慢性進(jìn)展性腎損害的防治研究從未中斷，但迄今經(jīng)循證醫(yī)學(xué)證實(shí)并得到國際公認(rèn)的腎保護(hù)作用藥物僅有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑。中醫(yī)治療慢性腎炎有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，中藥防治慢性進(jìn)展性腎損害有巨大開發(fā)前景。
腎病綜合征(NS)由多種病因引起，是腎小球疾病的最常見臨床表現(xiàn)之一。NS的主要臨床表現(xiàn)是大量蛋白尿，低血漿白蛋白和高脂血癥，導(dǎo)致體內(nèi)一系列病理生理改變和嚴(yán)重血栓、栓塞合并癥。故臨床上NS的治療常著眼于減少蛋白尿、提高血漿白蛋白和降脂，但迄今尚未取得滿意的療效。中醫(yī)強(qiáng)調(diào)宏觀觀察，重視整體效果。因此，中藥組方具備多重作用的特點(diǎn)，值得深入研究。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供黃芪當(dāng)歸合劑的一種新用途。
本發(fā)明人的研究表明，黃芪當(dāng)歸合劑具有多途徑、多環(huán)節(jié)、多重作用的特點(diǎn)，具體體現(xiàn)為具有減輕腎組織損傷，預(yù)防和/或治療腎小球硬化，腎小管、間質(zhì)纖維化，延緩腎功能慢性進(jìn)行性損傷等功能；并能調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)代謝紊亂。
黃芪當(dāng)歸合劑包括黃芪和當(dāng)歸兩種主要成分，其重量份數(shù)比優(yōu)選為1∶1。
需要的時候，在上述黃芪當(dāng)歸合劑中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等，必要時還可以加入香味劑、甜味劑等。
本發(fā)明的藥物可以制成注射液、片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服液、膏劑、霜劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
上述藥物的用量一般為0.5-1.0g/kg體重/天，療程為30至90天。


圖1a為正常對照組腎組織病理損傷變化(HE，×100)照片圖1b為腎病綜合征模型組腎組織病理損傷變化(HE，×100)照片圖1c為ACEi治療組腎組織病理損傷變化(HE，×100)照片圖1d為黃芪當(dāng)歸治療組腎組織病理損傷變化(HE，×100)照片圖2a為血漿尿素氮和腎小球硬化指數(shù)相關(guān)性分析曲線圖2b為血漿尿素氮和小管間質(zhì)損傷指數(shù)相關(guān)性分析曲線圖3a為模型組的膠原III積聚免疫組化(×200)照片圖3b為黃芪當(dāng)歸合劑治療組膠原III的積聚免疫組化(×200)照片圖3c為模型組的膠原IV積聚免疫組化(×200)照片圖3d為黃芪當(dāng)歸合劑治療組的膠原IV積聚免疫組化(×200)照片圖3e為模型組的層粘連蛋白積聚免疫組化(×200)照片圖3f為黃芪當(dāng)歸合劑治療組的層粘連蛋白積聚免疫組化(×200)照片圖3g為模型組的纖粘連蛋白積聚免疫組化(×200)照片圖3h為黃芪當(dāng)歸合劑治療組的纖粘連蛋白積聚免疫組化(×200)照片圖3i為黃芪當(dāng)歸合劑對胞外基質(zhì)積聚的影響直方4a為腎病綜合征組的TGFβ1的免疫組化(×100)照片圖4b為黃芪當(dāng)歸合劑組的TGFβ1的免疫組化(×100)照片圖4c為腎病綜合征組的TGFβ1mRNA的原位雜交(×200)照片圖4d為黃芪當(dāng)歸合劑組的TGFβ1mRNA的原位雜交(×200)照片圖4e為黃芪當(dāng)歸合劑對腎臟TGFβ1表達(dá)的影響直方5四組大鼠腎組織CTGF的Western-blot的檢測結(jié)果圖6a為骨橋蛋白和巨噬細(xì)胞(ED-1陽性)的免疫組化檢測照片圖6b為骨橋蛋白和巨噬細(xì)胞(ED-1陽性)的相關(guān)性分析曲線圖7a為正常腎組織α-平滑肌肌動蛋白的免疫組化檢測結(jié)果圖7b為正常腎組織骨橋蛋白的免疫組化檢測結(jié)果圖7c為正常腎組織ED-1陽性細(xì)胞的免疫組化檢測結(jié)果圖7d為腎病綜合征大鼠α-平滑肌肌動蛋白的免疫組化檢測結(jié)果圖7e為腎病綜合征大鼠骨橋蛋白的免疫組化檢測結(jié)果圖7f為腎病綜合征大鼠ED-1陽性細(xì)胞的免疫組化檢測結(jié)果圖7g為黃芪當(dāng)歸治療組α-平滑肌肌動蛋白的免疫組化檢測結(jié)果圖7h為黃芪當(dāng)歸治療組骨橋蛋白的免疫組化檢測結(jié)果圖7i為黃芪當(dāng)歸治療組ED-1陽性細(xì)胞的免疫組化檢測結(jié)果圖7k為α平滑肌肌動蛋白、骨橋蛋白和巨噬細(xì)胞(ED-1陽性)的各組間免疫組化檢測比較直方8為逆轉(zhuǎn)錄PCR的8％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳9為缺血再灌注不同時間點(diǎn)腎組織JNK1/JNK2活性直方10為各組大鼠肝臟白蛋白mRNA Northern雜交圖譜具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、黃芪當(dāng)歸合劑的制備黃芪當(dāng)歸合劑(A&A)稱取等量黃芪(內(nèi)蒙產(chǎn))、當(dāng)歸(甘肅產(chǎn))生藥，水煎，濃縮成每毫升相當(dāng)于黃芪、當(dāng)歸生藥各0.7g。
實(shí)施例2、黃芪當(dāng)歸合劑對腎臟的保護(hù)作用1、黃芪當(dāng)歸合劑對慢性進(jìn)展性腎臟疾病的腎組織和功能損傷的保護(hù)作用采用雄性SD大鼠，按常規(guī)方法制成慢性嘌呤霉素腎病大鼠模型，隨機(jī)分成4組，即模型組、黃芪當(dāng)歸合劑(A&A)治療組、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEi)治療組和血管緊張素受體拮抗劑(AT1Ra)治療組，并設(shè)正常對照組，經(jīng)12周灌胃給藥治療。A&A治療組A&A 3ml(含生藥各2.1g)/天，ACEi治療組依那普利10mg/kg體重/天，AT1Ra治療組Irbesartan 50mg/kg體重/天，正常組和模型組自來水3ml/天。12周末麻醉下右側(cè)股動脈插管，記錄平均動脈壓；留取血標(biāo)本；雙腎生理鹽水沖洗后摘除，進(jìn)行尿蛋白、血漿白蛋白、甘油三脂、膽固醇和尿素氮的檢測，腎小球硬化指數(shù)和小管間質(zhì)損傷指數(shù)的計算，細(xì)胞外基質(zhì)成分層粘連蛋白、纖連蛋白、III和IV型膠原的免疫組化分析。
結(jié)果如表1、圖1a-1d、圖2a-2b和圖3a-3i所示，表1表明模型組鼠呈大量蛋白尿、低白蛋白和高脂血癥伴水腫，典型的腎病綜合征改變，腎功能亦明顯受損；圖1表明腎組織病理呈慢性炎癥、腎小球硬化、小管間質(zhì)纖維化；圖2a和2b表明黃芪當(dāng)歸合劑治療組腎損傷明顯減輕，腎小球硬化指數(shù)和小管間質(zhì)損傷指數(shù)下降且與腎功能改善呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r＝0.80，P＜0.001和r＝0.85，P＜0.001；圖3a-3i表明黃芪當(dāng)歸治療組的細(xì)胞外基質(zhì)成分層粘連蛋白、纖連蛋白、III和IV型膠原明顯減少。以上腎保護(hù)作用與ACEi和AT1Ra兩治療組的結(jié)果相似。這一保護(hù)效應(yīng)在單側(cè)輸尿管結(jié)扎鼠模型和加速型腎毒血清腎炎模型中也得到證實(shí)。
表1各組血壓、尿蛋白、血漿白蛋白、甘油三脂、膽固醇和尿素氮的比較組別試驗(yàn)大鼠血壓尿蛋白血漿白蛋白甘油三酯膽固醇 尿素氮(只) (mmHg)mg/24h (g/L) (mM/L) (mM/L) (mM/L)正常組 7 128±3 20±8.0 29.8±0.61.7±0.2 0.9±0.18.2±0.3嘌呤霉素腎 6 135±3 1208±122**21.8±2.5*9.1±3.1*9.3±2.6*31.7±10.3*病模型組ACEi組7 117±8#203±590#31.0±0.5#1.3±0.2#0.9±0.1#9.3±0.4#黃芪當(dāng)歸7 130±4 743±141#29.1±2.4#4.5±1.5#5.7±1.1#11.5±1.2#合劑組注與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.001；與嘌呤霉素腎病模型組比較，#P＜0.052、黃芪當(dāng)歸合劑腎保護(hù)作用的機(jī)制(1)對腎內(nèi)腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的影響采用雄性SD大鼠，制成慢性嘌呤霉素腎病大鼠模型，隨機(jī)分成3組，即模型組、黃芪當(dāng)歸合劑(A&A)治療組和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEi)治療組，并設(shè)正常對照組，經(jīng)12周灌胃給藥治療。A&A治療組A&A 3ml(含生藥各2.1g)/天，ACEi治療組依那普利10mg/kg體重/天，正常組和模型組自來水3ml/天。于12周末活殺取腎，分離腎皮質(zhì)檢測①Ang II濃度，以0.1mol/L NaCl，0.05mol/L Na2HPO4，0.05mol/LNaH2PO4，5mmol/L 8-羥基喹啉和5mmol/LEDTA，pH7.4為勻漿緩沖液。取上清液放射免疫法測定Ang II濃度。②ACE活性，以0.02mol/L磷酸鉀(pH8.3)為勻漿緩沖液。勻漿液于4℃離心后棄上清，將沉淀混懸于5mmol/L CHAPS中，4℃過夜后離心取上清液比色法檢測ACE活性。以上檢測結(jié)果均用上清液或組織液中蛋白質(zhì)含量進(jìn)行校正。
結(jié)果如表2所示，表明血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEi)和AT1Ra(已知ACEi和AT1Ra作用于RAS的不同部位阻斷AngII的效應(yīng))的抗腎硬化纖維化作用與腎組織局部的AngII水平下降一致，而黃芪當(dāng)歸合劑組雖然有同樣的抗腎硬化纖維化作用，但腎臟組織局部的AngII水平與模型組比較卻無明顯差異(56.53±7.03 vs76.62±12.88pg/mg蛋白，P＞0.05)。提示黃芪當(dāng)歸合劑的抗腎纖維化作用不是通過常見的阻斷(抑制)RAS的環(huán)節(jié)。
表2各組腎組織腎素-血管緊張素系統(tǒng)試驗(yàn)大鼠腎素 血管緊張素AngII 醛固酮組別(ng Ang I/mg蛋白) 轉(zhuǎn)化酶活力 (pg/mg蛋白)(pg/mg蛋白)(只)(U/mg蛋白)正常組7 9.23±3.92 20.6±6.60 40.35±6.36 15.20±3.43嘌呤霉素腎6 4.98±0.84 83.75±31.2*76.62±12.88*20.50±8.05病模型組ACEi組7 14.23±3.23*#6.12±6.10#34.36±4.89#12.43±2.98黃芪當(dāng)歸 7 5.49±1.29 52.70±10.22*56.53±7.03*14.14±2.65合劑組注與正常組比較，*P＜0.05；與嘌呤霉素腎病模型組比較，#P＜0.05；黃芪當(dāng)歸合劑與嘌呤霉素腎病模型組比較P＞0.05(2)對腎內(nèi)TGF-β1的影響TGF-β1是一種多功能的細(xì)胞因子，在細(xì)胞外基質(zhì)的合成和聚積中起重要作用。采用雄性SD大鼠，制成慢性嘌呤霉素腎病大鼠模型，隨機(jī)分成2組，即模型組、黃芪當(dāng)歸合劑(A&A)治療組，并設(shè)正常對照組，經(jīng)12周灌胃給藥治療。A&A治療組A&A3ml(含生藥各2.1g)/天，正常組和模型組自來水3ml/天。TGF-β1蛋白檢測方法腎組織標(biāo)本經(jīng)10％福爾馬林固定，石蠟包埋，切片厚4μm，選用改良的SP法，一抗為兔抗鼠TGF-β1多克隆抗體，以封閉液代替一抗作為空白對照。TGF-β1mRNA檢測方法取液氮凍存標(biāo)本，4μm厚的冰凍切片，蛋白酶K消化后，經(jīng)0.2mol/L的鹽酸，0.25％乙酸酐處理，在預(yù)雜交液中于50℃預(yù)雜交1小時，以cRNA探針50℃雜交18小時，洗片，RNA酶消化，洗片，2％羊血清及牛血清白蛋白室溫封閉，以抗地高辛抗體室溫孵育后DAB顯色。以地高辛標(biāo)記的sense RNA探針雜交的標(biāo)本作為陰性對照。采用CMIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，每張標(biāo)本隨機(jī)選取5個視野，計算平均吸光度，以每組的均值進(jìn)行比較。
結(jié)果如圖4a-4e所示，表明模型組鼠腎小管細(xì)胞TGF-β1mRNA和蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，腎小球內(nèi)也有少量表達(dá)；黃芪當(dāng)歸合劑治療組TGF-β1mRNA和蛋白的表達(dá)明顯減少，兩組均與細(xì)胞外基質(zhì)聚積一致。圖4e中*表示黃芪當(dāng)歸組與腎病綜合征組比較P＜0.01。NS提示黃芪當(dāng)歸的抗纖維化治療作用與其抑制TGF-β1在腎小管的生成有關(guān)。
近年發(fā)現(xiàn)一種與組織纖維化密切相關(guān)的細(xì)胞因子，即結(jié)締組織生長因子(CTGF)，本發(fā)明組的發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)CTGF能直接誘導(dǎo)培養(yǎng)的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為促纖維化的成肌纖維細(xì)胞，進(jìn)而在單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠模型中也觀察到CTGF的高表達(dá)與成肌纖維細(xì)胞數(shù)量的增加及腎間質(zhì)纖維化程度的加重呈平行改變；而黃芪當(dāng)歸合劑治療能明顯減輕上述平行改變，如圖5和表3，進(jìn)一步支持該合劑的抗纖維化作用。表3中，S表示假手術(shù)組，UUO表示單側(cè)輸尿管結(jié)扎，UUO+E表示單側(cè)輸尿管結(jié)扎加依那普利治療組，UUO+A&A表示單側(cè)輸尿管結(jié)扎加黃芪當(dāng)歸治療組。
表3四組大鼠腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)、結(jié)締組織生長因子、α平滑肌肌動蛋白及I型膠原比較組別 試驗(yàn)大鼠 腎小管間質(zhì)損 結(jié)締組織生長因子 α平滑肌肌動 I型膠原比較傷指數(shù) 蛋白(％) (％)(只)S5 0.71±0.39 19.18±4.8 0.38±0.24 0.37±0.24UUO 5 6.61±0.81**76.69±4.9**15.0±3.2**10.67±3.26**UUO+E 6 4.53±0.79++32.19±4.4*++4.6±1.8**++5.73±0.7**++UUO+A&A 6 5.02±0.85++51.42±9.5**++▲▲5.7±0.9**++5.9±1.3**++注*P＜0.05，**P＜0.01，與假手術(shù)組比較；+P＜0.05，++P＜0.01與UUO大鼠比較，▲P＜0.05；▲▲P＜0.01與UUO加依那普利治療組比較(3)對骨橋蛋白及單核/巨噬細(xì)胞的影響骨橋蛋白是一種對單核/巨噬細(xì)胞具有趨化和黏附功能的糖蛋白。采用雄性SD大鼠，制成慢性嘌呤霉素腎病大鼠模型，隨機(jī)分成3組，即模型組、黃芪當(dāng)歸合劑(A&A)治療組和血管緊張素受體拮抗劑(AT1Ra)治療組，并設(shè)正常對照組，經(jīng)12周灌胃給藥治療。A&A治療組A&A 3ml(含生藥各2.1g)/天，AT1Ra治療組Irbesartan 50mg/kg體重/天，正常組和模型組自來水3ml/天。骨橋蛋白測定方法用ABC法，石蠟包埋腎組織經(jīng)脫蠟，3％H2O2甲醇封閉10min，微波抗原修復(fù)10min，1％小牛血清封閉20min，加入小鼠抗大鼠骨橋蛋白抗體、二抗(生物素化馬抗小鼠)及三抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈親和素)，DAB顯色。以正常非免疫血清代替一抗作為空白對照。結(jié)果用多媒體彩色病理分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，每份標(biāo)本選取15個視野，用面積比計算該成分在腎組織中的相對含量。
結(jié)果如圖6a-6b和圖7a-7k所示，圖6a和圖6b表明模型鼠腎小管骨橋蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，其周圍間質(zhì)中巨噬細(xì)胞浸潤，兩者呈明顯正相關(guān)，而且此處腎間質(zhì)纖維化亦明顯。圖6a中，褐色為骨橋蛋白，藍(lán)色為ED-1陽性巨噬細(xì)胞。圖6b的r＝0.885，p＜0.01。圖7a-7k表明黃芪當(dāng)歸合劑與ACEi、AT1Ra一樣能抑制骨橋蛋白的表達(dá)，減少單核/巨噬細(xì)胞浸潤及減輕腎間質(zhì)纖維化損傷程度。這一結(jié)果支持以往研究發(fā)現(xiàn)AngII和TGF-β1可刺激腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)骨橋蛋白，也證實(shí)骨橋蛋白介入了慢性嘌呤霉素致慢性腎損傷發(fā)病過程和黃芪當(dāng)歸合劑能抑制骨橋蛋白表達(dá)，減少炎癥細(xì)胞浸潤是其治療慢性腎臟疾病進(jìn)展機(jī)制之一。
(4)對腎臟固有細(xì)胞表型的影響單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞在腎間質(zhì)中積聚，分泌致腎纖維化細(xì)胞因子如TGF-β、PDGF等促進(jìn)間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化，腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)或直接合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)。成纖維細(xì)胞活化或腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化均表達(dá)平滑肌細(xì)胞骨架蛋白α-SMA(α平滑肌肌動蛋白)。動物模型處理同步驟(1)。α-SMA檢測方法SP法，4μm厚石蠟切片，一抗為小鼠抗人α-SMA抗體，以封閉液代替一抗作為空白對照。結(jié)果用CMIAS多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，每份標(biāo)本隨機(jī)選取10個視野，用面積比計算該成分在腎組織中的相對含量。
結(jié)果如圖7a-7k所示，模型組腎間質(zhì)內(nèi)α-SMA的表達(dá)明顯上調(diào)與單核/巨噬細(xì)胞的浸潤區(qū)一致，此處小管間質(zhì)損傷亦明顯加重。而A&A和阻斷AngII的治療組均發(fā)現(xiàn)α-SMA的表達(dá)，單核/巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)量，腎組織損傷程度呈平行減輕。提示A&A可通過抑制腎小管上皮細(xì)胞或間質(zhì)成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，起減緩腎纖維化作用。
A&A減輕腎臟進(jìn)行性慢性病變及慢性腎功能損害的作用與其對上述促纖維化細(xì)胞因子、趨化因子的抑制及阻止巨噬細(xì)胞浸潤和腎固有細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化等環(huán)節(jié)有關(guān)，而不通過AngII的作用途徑。這提示A&A是一種新的腎保護(hù)藥，臨床上同時應(yīng)用AngII阻斷劑和A&A可起協(xié)同治療作用，為中西藥聯(lián)合應(yīng)用找到結(jié)合點(diǎn)和理論依據(jù)。
(5)黃芪當(dāng)歸合劑腎臟保護(hù)作用相關(guān)基因選取雄性SD大鼠，制成慢性嘌呤霉素腎病大鼠模型，隨機(jī)分為模型組和A&A治療組，并設(shè)正常對照組，經(jīng)10周灌胃給藥治療。A&A治療組A&A 3ml(含生藥各2.1g)/天，正常組和模型組自來水3ml/天，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時留取腎組織檢測。以銀染mRNA差異顯示法對比正常大鼠腎臟、腎病綜合征腎硬化腎臟、A&A治療的腎臟的基因表達(dá)，并分離疾病狀態(tài)下表達(dá)發(fā)生改變且能被A&A治療糾正的基因。結(jié)果如圖8所示，分離、克隆了26個A&A對腎臟具有保護(hù)作用的相關(guān)基因片斷。圖8中，a為正常組；b為硬化組；c為A&A治療組；箭頭所指條帶(C4-1)為硬化組表達(dá)下調(diào)的基因。隨機(jī)選取8個進(jìn)行Northern雜交驗(yàn)證，其中一個基因被證實(shí)在腎硬化過程中表達(dá)下調(diào)；在A&A治療組中，這一下調(diào)的基因表達(dá)恢復(fù)。測序后同源性比較顯示為一新基因。這一新基因可能參與了腎臟疾病的慢性進(jìn)展，并為A&A治療作用的靶基因或相關(guān)基因？這個基因除在腎臟外還在正常鼠的肺、心、肝、脾表達(dá)，但是否在這些器官纖維化過程中它的表達(dá)也發(fā)生變化，有待證實(shí)。
實(shí)施例3、黃芪當(dāng)歸合劑在急性腎衰竭防治中的作用本實(shí)施例研究黃芪當(dāng)歸合劑對缺血/再灌注腎損傷大鼠急性腎衰竭的防治作用。
采用雄性SD大鼠，隨機(jī)分為雙側(cè)腎動脈夾閉45min的缺血再灌注損傷模型組和A&A治療組。經(jīng)股動脈插管U型汞柱血壓計測量平均動脈壓。再灌注90、120、150、180min分別留取尿標(biāo)本，兩次留取尿標(biāo)本的中點(diǎn)由股動脈插管處留取血標(biāo)本，所采血標(biāo)本離心后將血球置于等量生理鹽水中立即輸回大鼠體內(nèi)以維持血容量。再灌注180min留取尿標(biāo)本后切除左側(cè)腎臟待檢。治療組于腎動脈夾閉時給予黃芪注射液4ml/kg、當(dāng)歸注射液2ml/kg靜脈輸入，開夾再灌注時再給原藥量的1/2；模型組輸入等量生理鹽水。通過蒽酮法測定血、尿Inulin(菊粉)濃度，計算得出腎小球?yàn)V過率；以對氨基馬脲酸清除率表示腎血漿流量；用電解質(zhì)分析儀檢測鈉計算排泄分?jǐn)?shù)；稱重法測尿量；光鏡標(biāo)本常規(guī)處理后切片厚2μm，HE染色評估腎組織損傷；電鏡標(biāo)本常規(guī)處理后制成500A°的超薄切片評估腎超微結(jié)構(gòu)的變化。
結(jié)果如表4所示，表明A&A可促進(jìn)缺血/再灌注腎臟血漿流量和腎小球?yàn)V過率的恢復(fù)，減輕鈉排泄分?jǐn)?shù)的上升幅度，避免少尿的發(fā)生或縮短少尿期。以上這些腎保護(hù)作用與腎組織損傷的減輕一致，如光鏡下腎小管上皮細(xì)胞混濁腫脹、崩解脫落、管腔擴(kuò)張、間質(zhì)細(xì)胞浸潤等均明顯減輕或消失。電鏡下腎小管上皮微絨毛腫脹、斷裂、脫落等現(xiàn)象也基本消失，溶酶體數(shù)量減少，線粒體恢復(fù)正常。提示A&A對急性腎衰竭有一定保護(hù)作用。
此外，本實(shí)施例還研究了A&A對大鼠缺血/再灌注過程中與細(xì)胞增生密切相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)MAPKs。結(jié)果如圖9所示，圖9表明A&A對缺血/再灌注引起的ERK活性變化無明顯影響，圖9表明A&A對鼠腎組織JNK的激活更迅速、激活程度更高，這與隨后腎小管上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)恢復(fù)及PCNA(增殖細(xì)胞核抗原)陽性細(xì)胞增多的增殖反映一致，提示急性缺血/再灌注腎損傷早期恢復(fù)可能與MAPKs活性變化有關(guān)。尤其是腎小管上皮微絨毛于再灌后2小時開始修復(fù)，推測JNK活性變化促進(jìn)了熱休克蛋白表達(dá)而促進(jìn)損傷修復(fù)。圖9中，Sham表示假手術(shù)組，I-45min表示缺血45分鐘，R-5min表示再灌注5分鐘，R-20min表示再灌注20分鐘，R-60min表示再灌注60分鐘；*表示P＜0.05與假手術(shù)組比較；#表示P＜0.05與對照組比較。
表4黃芪當(dāng)歸合劑對大鼠缺血再灌注前后腎小球?yàn)V過率、腎血漿流量、尿鈉排泄分?jǐn)?shù)、尿量和平均動脈壓的影響比較(X±S)
組別 試驗(yàn)大鼠腎血漿流量尿鈉排泄分?jǐn)?shù)尿量 平均動脈腎小球?yàn)V過率(只) (ml·min-1·kg-1)(μl/min)壓(ml·min-1·kg-1) (mmHg)兩組的基礎(chǔ)水平 110.418±0.120 2.141±0.9210.090±0.050 7.0±2.1 85±9缺血/再灌注組90(min) 5 Δ0.341±0.051Δ1.899±0.041 1.778±0.371 5.2±3.2 86±12120(min) 5 Δ0.296±0.063Δ1.911±0.120 - 14.0±9.0 80±10150(min) 5 Δ0.322±0.062Δ1.662±0.342 - 15.0±7.0 79±11180(min) 5 Δ0.338±0.020Δ1.658±0.331 1.979±0.342 13.0±3.0 81±10缺血/再灌注給藥組90(min) 6 Δ0.360±0.041Δ1.711±0.140 1.324±0.620 12.0±7.0 85±9120(min) 6 Δ0.279±0.100Δ1.638±0.233*- 23.0±9.2 90±10150(min) 6 Δ0.244±0.041*Δ1.338±0.312 - 37.0±4.5*84±12180(min) 6 Δ0.233±0.071*Δ0.828±0.490*1.245±0.583*60.0±14.0*82±13注與缺血/再灌注組比較，*P＜0.05 Δ下降絕對值實(shí)施例4、黃芪當(dāng)歸合劑改善腎病綜合征蛋白質(zhì)代謝紊亂的機(jī)制(1)腎小球?yàn)V過膜通透性采用雄性大鼠，制成嘌呤霉素腎病大鼠模型，隨機(jī)分為模型組和A&A治療組，并設(shè)正常對照組，經(jīng)12天灌胃給藥治療。A&A治療組A&A 3ml(含生藥各2.1g)/天，正常組和模型組自來水3ml/天。以清除實(shí)驗(yàn)，用辣根過氧化物酶(一種帶陽電荷小分子蛋白)和動物自身白蛋白(一種帶陰電荷的小分子蛋白)作為標(biāo)志物進(jìn)行清除實(shí)驗(yàn)，及腎組織膠狀鐵染色(鐵帶陽電荷)半定量分析觀察腎小球內(nèi)鐵分布及含量，綜合評估腎小球?yàn)V過膜電荷、孔徑屏障受損及治療后恢復(fù)程度。
結(jié)果顯示黃芪當(dāng)歸合劑對NS的腎小球?yàn)V過屏障沒有直接的修復(fù)或減輕損傷作用，即黃芪當(dāng)歸合劑治療腎病綜合征的低白蛋白血癥不是通過減少尿蛋白途徑而實(shí)現(xiàn)。這一重要發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。
(2)總體蛋白質(zhì)代謝以腎病綜合征動物模型和特發(fā)性阿腎病綜合征患者為研究對象，采用15N-甘氨酸為示蹤劑的示蹤動力學(xué)方法和氮平衡技術(shù)。示蹤動力學(xué)方法分多次口服給予15N-甘氨酸，總劑量為1mg/kg，于36小時內(nèi)服完。給示蹤劑后，每隔6小時給患者留尿1次，測定尿量，尿素氮，尿總氮，并進(jìn)行尿質(zhì)譜分析計算尿動力學(xué)參數(shù)。采用雙庫模型進(jìn)行分析。氮平衡測定方法采用近似氮平衡方法，計算公式為NB＝TNI-(UNA-2)g/d(NB氮平衡，UNA尿素氮生成率，TNI總氮攝入率)結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芪當(dāng)歸合劑在富蛋白膳食條件下，通過促進(jìn)蛋白質(zhì)凈合成率增加，提高血漿蛋白水平，糾正NS鼠及NS患者蛋白質(zhì)代謝紊亂，改善機(jī)體健康狀態(tài)。
(3)肝臟白蛋白代謝肝臟是白蛋白合成的主要場所。采用有明顯腎病綜合征的加速腎毒血清腎炎模型。隨機(jī)分為7組對照組，黃芪當(dāng)歸組，黃芪單味組，黃芪多糖I組，黃芪多糖II組，黃芪皂甙組(給藥組灌服中藥3ml/天，對照組灌服自來水3ml/天)。15天后取動物肝組織應(yīng)用分子雜交技術(shù)測定肝白蛋白基因轉(zhuǎn)錄活性將肝細(xì)胞核懸液加入反應(yīng)底物(75mmol HEPES(N-2-羥乙基哌嗪N’-2-乙烷磺酸)，酸堿度7.5，100mmol KCl，4mmol DTT(二硫基蘇糖醇)，0.6mmol CTP(胞嘧啶)、GTP(鳥嘌呤)、ATP(腺嘌呤)、UTP(尿嘧啶)，0.04mg/ml creatine kinase(肌氨酸激酶)，8.8mmolcreatinephosphate(磷酸化肌氨酸)，100U RNase/40μCi[α-32P]-UTP)在30℃孵育60分鐘后終止反應(yīng)，再經(jīng)蛋白酶K，SDS，EDTA孵育20分鐘后，用酚/氯仿抽提及乙醇沉淀純化RNA。RNA沉淀用雜交液溶解后與點(diǎn)在尼龍膜上的白蛋白和GAPDH(3-磷酸甘油醛脫氫酶)的cDNA雜交。在X-光膠片上曝光后以雜交信號的吸光度值為統(tǒng)計量，用GAPDH為內(nèi)參照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芪當(dāng)歸合劑通過提高NS動物肝細(xì)胞內(nèi)核酸→蛋白質(zhì)的翻譯水平，促進(jìn)白蛋白合成。進(jìn)而又從白蛋白mRNA的核轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行研究，結(jié)果如圖10所示，表明黃芪當(dāng)歸合劑能使肝細(xì)胞白蛋白基因轉(zhuǎn)錄活性明顯增高。圖10中，C表示正常對照組，N表示腎病對照組，A&A表示黃芪當(dāng)歸組，A表示黃芪單味組，API表示黃芪多糖I組，APII表示黃芪多糖II組，AG表示黃芪皂甙組。
以上實(shí)驗(yàn)從分子水平證明了黃芪當(dāng)歸合劑確能治療NS鼠的蛋白質(zhì)代謝紊亂，并首次闡明其作用機(jī)理。
(4)肌肉蛋白質(zhì)代謝肌肉蛋白是機(jī)體最大的組織蛋白庫。NS時存在蛋白質(zhì)營養(yǎng)不良，肌體增加肌肉蛋白水解以維持肝臟白蛋白合成。
采用有明顯腎病綜合征的加速腎毒血清腎炎模型。隨機(jī)分為6組對照組，模型組，腎病黃芪組，腎病當(dāng)歸組，腎病黃芪當(dāng)歸組，腎病黃芪皂甙組(給藥組灌服中藥3ml/天，對照組灌服自來水3ml/天)。以3H苯丙氨酸(3H-phe)摻入法測骨骼肌蛋白合成率實(shí)驗(yàn)開始2周后麻醉大鼠，尾靜脈注射3H-phe，注射后15分鐘取右下肢腓腸肌，加入磷酸鹽緩沖液勻漿后再加入三氯醋酸沸水浴5分鐘，冰浴10分鐘，離心后將沉淀(上清備用)經(jīng)1.0mol NaOH溶解，TCA沉淀，離心，用0.3mol NaOH溶解，經(jīng)5％胰蛋白酶消化。在閃爍瓶中加入閃爍劑10ml，蛋白消化液0.5ml或上清液1ml。在液體閃爍計數(shù)器上測min-1值，計算摻入率。結(jié)果如表5所示，表明黃芪當(dāng)歸合劑能促進(jìn)NS鼠肌肉蛋白合成，從而增加整體蛋白質(zhì)儲備。
表5各組大鼠肌肉蛋白(3H-phe)摻入率及血漿白蛋白結(jié)果組別試驗(yàn)大鼠肌肉蛋白(3H-phe)摻入率血漿白蛋白(g/L)(只)正常對照組5 2.55±0.47 33.59±0.63腎病模型組5 1.12±0.37*27.98±2.07*腎病黃芪組6 2.29±0.37**30.43±2.01腎病當(dāng)歸 4 1.80±0.81***23.70±1.52腎病黃芪當(dāng)歸組6 2.10±0.47**35.69±1.00**腎病黃芪皂甙組4 2.02±0.24***29.78±1.53注與正常對照組比較，*P＜0.01；與腎病模型組比較**P＜0.01；(5)黃芪和當(dāng)歸合劑及其各組分對肝臟白蛋白合成作用的比較采用有明顯腎病綜合征的加速腎毒血清腎炎模型。分組同步驟(3)。血漿白蛋白測定應(yīng)用自動生化分析儀；肝白蛋白mRNA的轉(zhuǎn)錄活性測定方法同步驟(3)；肝白蛋白mRNA測定采用Northern雜交方法。觀察黃芪、當(dāng)歸，黃芪當(dāng)歸合劑，黃芪已分離純化的各主要水溶性組分對NS鼠血漿白蛋白，肝臟白蛋白mRNA表達(dá)和mRNA轉(zhuǎn)錄速率的影響。
結(jié)果如表6所示，表明單味當(dāng)歸沒有作用，黃芪各組分中以黃芪多糖II作用最強(qiáng)，但各組分作用均不如黃芪當(dāng)歸合劑的作用。
表6各組大鼠血漿白蛋白、肝白蛋白mRNA及其轉(zhuǎn)錄活性測定結(jié)果(X±S)組別 血漿白蛋白(g/L) 肝白蛋白mRNA(倍數(shù))肝白蛋白mRNA的轉(zhuǎn)錄活性(倍數(shù))正常對照組39.74±0.28(n＝12) 16.67±1.80(n＝12) 10.67±1.10(n＝4)腎病綜合征對照組 26.80±1.01*(n＝10) 34.72±4.75*(n＝10) 13.68±1.78(n＝4)黃芪當(dāng)歸合劑處理組34.19±1.64(n＝10)44.79±0.51(n＝10) 26.72±0.50(n＝3)黃芪處理組29.83±1.64(n＝3) 44.79±0.51(n＝2) 26.72±0.50(n＝2)當(dāng)歸處理組30.43±1.16(n＝3) 30.87±1.15(n＝2) 11.52±3.07(n＝3)黃芪多糖I處理組 28.80±0.86(n＝4)30.80±2.85(n＝4) 10.96±2.58(n＝5)黃芪多糖II處理組 30.88±0.63(n＝4) 27.45±2.82(n＝4) 15.97±2.48(n＝4)黃芪葡萄糖苷處理組29.78±1.68(n＝5)26.23±1.64(n＝3) 9.85±1.01(n＝5)注與正常對照組比較，*P＜0.01；與腎病綜合征組比較，P＜0.05
上述各項(xiàng)研究均設(shè)非腎病綜合征的正常對照組，并發(fā)現(xiàn)黃芪當(dāng)歸合劑在正常條件下不影響蛋白質(zhì)代謝。此外，黃芪當(dāng)歸合劑的上述促蛋白合成作用均在富蛋白飲食(1.2g/Kg體重/天，相當(dāng)正常人的較高蛋白攝入水平)條件下作用明顯。但單純富蛋白飲食無促蛋白合成作用。
實(shí)施例5、黃芪當(dāng)歸合劑對腎病綜合征脂質(zhì)代謝紊亂的影響及機(jī)制中藥黃芪當(dāng)歸合劑(A&A)是治療腎病綜合征取得佳效的藥物，用該合劑治療免疫或非免疫介導(dǎo)NS大鼠模型，并應(yīng)用國際公認(rèn)的他汀類降脂藥作為對照研究。
雄性SD大鼠，制成加速腎毒血清腎炎模型，隨機(jī)分為模型組和A&A治療組，并設(shè)正常對照組。以生化方法和酶法分別檢測血清脂譜、脂蛋白脂酶、卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶；Northern雜交檢測肝臟低密度脂蛋白受體(LDL-R)mRNA和羧甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoAR)mRNA表達(dá)。比較A&A治療對上述指標(biāo)的影響。從基因水平探討A&A的降脂機(jī)制。
結(jié)果如表7和表8所示，表明黃芪當(dāng)歸合劑主要通過增加脂蛋白脂酶(LPL)和卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)的活性，提高肝臟低密度脂蛋白受體(LDL-R)mRNA表達(dá)，促進(jìn)富含載脂蛋白B脂蛋白的降解、清除起降脂作用。因此，黃芪當(dāng)歸合劑不僅有普伐他汀類似的降脂作用機(jī)制，還有上調(diào)肝臟細(xì)胞表面LDL受體的作用。由于黃芪當(dāng)歸合劑具有多環(huán)節(jié)的降脂作用，它較他汀類降脂藥的降脂作用更強(qiáng)、更持久。在其降脂作用的同時，腎臟病理損傷明顯減輕和腎功能改善。
表7黃芪當(dāng)歸合劑對血漿白蛋白、脂質(zhì)和24小時尿蛋白的影響組別 免疫后 供試大 尿蛋白 血漿白蛋白 血漿脂質(zhì)(mmol/L)時間 鼠(只) (mg/24hours (g/L)(天))TC TG VLDL LDL HDL正常對照組 6 42±6 34.85±2.02 1.09±0.251.04±0.170.21±0.030.12±0.150.67±0.09腎病綜合征對照組 75 784±248**19.82±0.53**7.50±1.28**9.28±3.77**1.85±0.75**5.02±1.30**0.63±0.98……… 14 6 651±139**21.00±3.34**4.76±0.95**7.13±3.94**1.43±0.79**2.72±0.94**0.79±0.25黃芪當(dāng)歸合劑治療組 75 783±141**21.14±1.01**6.84±0.86**8.07±7.00**1.61±0.40**3.59±0.88**1.27±0.33**……… 14 6 799±166**31.37±1.89*2.2g±0.64**##2.72±1.28**#0.54±0.27*#0.55±0.28*##1.19±0.08**##注與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與腎病綜合征對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01.
表8黃芪當(dāng)歸合劑對高密度脂蛋白-2/高密度脂蛋白-3和卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶，脂蛋白脂酶活性的影響(X±S)組別供試大鼠高密度脂蛋白-2/高卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶活性脂蛋白脂酶活性(只) 密度脂蛋白-3(μmol·L-1·h-1)(μmol·L-1·h-1)FER MER正常對照組 71.53±0.63 0.51±0.14 22.9±8.0 17.7±3.6腎病綜合征對 70.39±0.19**0.35±0.12*39.6±15.0*10.9±4.8*照組黃芪當(dāng)歸合劑 60.81±0.42#0.74±0.11##84.5±21.9##16.6±4.3#組注與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與腎病綜合征對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.0權(quán)利要求
1.黃芪當(dāng)歸合劑在制備治療腎保護(hù)及進(jìn)行性腎損害藥物及其輔劑中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述黃芪當(dāng)歸合劑包括重量份數(shù)比為1∶1的黃芪和當(dāng)歸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述黃芪當(dāng)歸合劑在制備預(yù)防和/或治療腎小球硬化的藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述黃芪當(dāng)歸合劑在制備預(yù)防和/或治療腎小管、間質(zhì)纖維化的藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述黃芪當(dāng)歸合劑在制備延緩腎功能的慢性進(jìn)行性損傷的藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述黃芪當(dāng)歸合劑在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝紊亂中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述黃芪當(dāng)歸合劑在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述黃芪當(dāng)歸合劑在作為腎保護(hù)及預(yù)防和/或治療進(jìn)行性腎損害藥物輔劑中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述黃芪當(dāng)歸合劑作為腎保護(hù)藥物的輔劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述黃芪當(dāng)歸合劑作為預(yù)防和/或治療進(jìn)行性腎損害藥物的輔劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了黃芪當(dāng)歸合劑在制藥領(lǐng)域中的一種新用途。黃芪當(dāng)歸合劑可用于制備治療腎保護(hù)藥物，也可用于制備預(yù)防和/或治療進(jìn)行性腎損害藥物，還可作為腎保護(hù)及預(yù)防和/或治療進(jìn)行性腎損害藥物輔劑；此外，黃芪當(dāng)歸合劑亦作為腎病綜合癥代謝紊亂調(diào)節(jié)藥。上述黃芪當(dāng)歸合劑包括黃芪和當(dāng)歸。
文檔編號A61P13/00GK1593475SQ0315681
公開日2005年3月16日 申請日期2003年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月8日
發(fā)明者王海燕, 李驚子, 潘緝圣, 鄒萬忠, 李曉玫, 章友康, 朱世樂, 黃海長 申請人:北京大學(xué)第一醫(yī)院