專利名稱：腫瘤壞死因子受體－免疫球蛋白的融合蛋白用于急性肺損傷藥物的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及藥物領域，更具體地涉及腫瘤壞死因子受體-免疫球蛋白的融合蛋白(簡稱為“TNFR-Ig融合蛋白”)在治療急性肺損傷方面的用途。
背景技術：
自從嚴重急性呼吸綜合征(Severe Acute Respiratory Syndromes，SARS)發(fā)生以后，曾波及全球30多個國家，總發(fā)病人數(shù)已經超過7500人，死亡超過600人。SARS具有強烈的傳染性，可迅速向周邊地區(qū)播散和暴發(fā)流行，死亡率可高達到14％-15％，影響了世界各國的政治和經濟的發(fā)展。
SARS是一種新的病原物，致死率高，傳染性強。對其流行病學、病原學、免疫學等方面的了解還非常有限，臨床治療還沒有確切有效的藥物，疫苗的開發(fā)還剛剛起步。因此，WHO和各國科學家均認為，這種狀況顯然還要持續(xù)相當長一段時間，并且不排除再次爆發(fā)的可能性。因此，研制SARS防治藥物，特別是能夠有效降低死亡率的藥物，已成為全球關注的焦點。
大部分SARS感染者病情惡化后會表現(xiàn)出急性呼吸困難綜合癥(ARDS，Acute Respiratory Distress Syndrome)和急性肺損傷(ALI，Acute Lung Injury)，一些重癥的患者還會出現(xiàn)休克或多器官功能障礙綜合征(MODS)。正是這些肺部的急性病變和嚴重損傷導致了SARS患者的最終死亡。
因此，本領域迫切需要開發(fā)新的有效治療急性肺損傷的藥物。
腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor alpha，TNF-α)是機體內的一種多功能免疫調節(jié)分子，它可以和細胞膜上的受體結合發(fā)揮作用，往往引起靶細胞的死亡或招引免疫效應細胞在局部的聚集，參與多種生理、病理與免疫過程。
對TNF受體(TNF receptor，TNFR)的研究表明，有I型、II型兩種腫瘤壞死因子受體，均為I型跨膜糖蛋白。其中以II型分布更為廣泛，與腫瘤壞死因子的親和力更強。兩種受體雖然需位于細胞膜上才可以發(fā)揮向細胞內傳遞信號的功能，但仍有部分從細胞表面脫落至體液內，稱為可溶性受體。進一步的研究表明，這種可溶性的受體可以中和TNF，在體內對TNF的活性起負調節(jié)作用。
TNFR-Ig融合蛋白是將基因工程和免疫學技術相結合，利用受體-免疫球蛋白融合技術(又稱“免疫粘附”技術(Immunoadhesion Technology))，生產出重組人II型TNFR-Ig融合蛋白。其原理是利用基因工程技術，將受體的細胞外區(qū)與免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)的Fc段基因融合，在體外表達出相應的融合蛋白。
然而，迄今為止尚沒有將TNFR-Ig融合蛋白用于治療急性肺損傷的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就是一種有效治療急性肺損傷的藥物，所述藥物的活性成分是TNFR-Ig融合蛋白。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種腫瘤壞死因子受體-免疫球蛋白的融合蛋白的用途，用于制備治療急性肺損傷的藥物。
在一優(yōu)選例中，所述的急性肺損傷是由SARS冠狀病毒感染引起的。
在另一優(yōu)選例中，所述藥物中TNFR-Ig融合蛋白的重量含量為1-99％。
在另一優(yōu)選例中，所述的TNFR-Ig融合蛋白的N-末端的235個氨基酸殘基為人II型腫瘤壞死因子受體細胞外段的序列，其C-末端的232個氨基酸殘基為人免疫球蛋白γ1鏈的可結晶片段序列。
在另一優(yōu)選例中，所述藥物的給藥途徑是靜脈注射或靜脈滴注。
在另一優(yōu)選例中，所述藥物的給藥劑量是每天0.1-3mg TNFR-Ig融合蛋白/千克體重。更佳地，所述藥物的給藥劑量是每天0.5-2mg TNFR-Ig融合蛋白/千克體重。
具體實施例方式
本發(fā)明人經過深入而廣泛的研究發(fā)現(xiàn)，TNFR-Ig融合蛋白可以非常有效地治療急性肺損傷，在此基礎上完成了本發(fā)明。
如本文所用，術語“TNFR-Ig融合蛋白”指由腫瘤壞死因子受體的細胞外段與免疫球蛋白的Fc片段所形成的融合蛋白。優(yōu)選的TNFR是II型腫瘤壞死因子受體。此外，在TNFR和Ig部分之間宜具有長度為10-30個氨基酸的肽接頭。
TNFR-Ig融合蛋白的制法和結構是已知，例如美國Immunex公司產品EnbrelTM就是一種人II型TNFR-Ig融合蛋白，其N-末端的235個氨基酸殘基為人II型腫瘤壞死因子受體細胞外段的序列；其C-末端的232個氨基酸殘基為人免疫球蛋白γ1鏈的可結晶片段序列(IgG1 Fc)，對于TNFR-Ig融合蛋白的制備方法，可參見中國專利申請01132074.5(2001年10月31日申請，申請人上海中信國健藥業(yè)有限公司)。
將TNFR-Ig融合蛋白配制成藥物的技術、方法、某些適應癥都是本領域中已知的。例如，在本領域中，TNFR-Ig融合蛋白已用于治療類風濕性關節(jié)炎。
如本文所用，術語“本發(fā)明的藥物組合物”指用于治療急性肺損傷的，含有TNFR-Ig融合蛋白和藥學上可接受的載體的組合物。
在使用藥物組合物時，是將安全有效量的TNFR-Ig融合蛋白施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內的。
配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)靜脈滴注、肌內、靜脈內、皮下、皮內、或局部給藥。
TNFR-Ig融合蛋白可有效治療急性肺損傷的機理可能如下所述。然而，應理解，本發(fā)明的范圍并不受該治療機理的限制。
通過對TNF-α與胸肺良惡性疾病關系研究證明，TNF與胸肺良惡性疾病的發(fā)生、發(fā)展均有一定關系。研究已表明，肺泡巨噬細胞可產生TNF，TNF與胸肺疾病的發(fā)生、發(fā)展有著較為密切的關系。在另一方面，TNF對其他繼發(fā)性細胞因子的釋放有重要作用。當各種TNF作用過重過久，肺毛細血管內皮細胞、肺間質和肺泡上皮細胞嚴重損害，最終產生ARDS。調控體內TNF的水平對肺損傷的防治有重要作用。SARS最終將導致患者肺部急性損傷，而正是TNF-α在人體內水平的異常升高直接引發(fā)了肺部的炎癥。因此，如果能減低SARS患者免疫系統(tǒng)的反應和降低對肺部造成的損傷，降低SARS患者體內的TNF-α水平到正常的幅度，將能正確處理以及有效治療和緩解ARDS和ALI的肺部損傷癥狀程度，同時又能最大程度地減少治療藥物可能對患者產生的副作用，這將對SARS的治療大有裨益，有助于提高治療效果，降低SARS患者死亡率。
TNFR-Ig融合蛋白作為一種半衰期長的能夠結合TNF的物質，在體內可以與細胞表面上的TNFR競爭性地結合周圍的TNF，從而減少結合于細胞上TNFR的TNF的數(shù)目，從而減少或消除由TNF所引發(fā)的炎癥反應，從而有效抑制由SARS等因素導致的急性肺損傷。
本發(fā)明的試驗結果已表明，TNFR-Ig融合蛋白可非常有效地治療急性肺損傷。此外，通過有效中和體內過高的TNF，可大大緩解SARS的臨床病癥，因此，應用重組人II型TNFR-Ig融合蛋白來治療SARS，對SARS的治療大有裨益，有助于提高治療效果，降低SARS患者死亡率。因此本發(fā)明的藥物組合物是一種有效降低SARS死亡率的藥物。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1臨床前藥效學研究本實施例中使用的TNFR-Ig融合蛋白(也稱為“rh-TNFRFc”)，其N-末端的235個氨基酸殘基為人II型腫瘤壞死因子受體細胞外段的序列；其C-末端的232個氨基酸殘基為人免疫球蛋白γ1鏈的可結晶片段序列(IgG1 Fc)。本制品是采用中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)無血清連續(xù)灌注發(fā)酵技術生產，經超濾濃縮、多步層析法純化后獲得純化的蛋白，最終凍干為臨床研究用制劑(參見CN01132074.5)。本品與美國Immunex公司產品EnbrelTM具有相同的分子結構和體外活性、免疫反應性。
本制品為凍干粉針劑，每支含12.5mg TNFR-Ig融合蛋白。應避光保存于2～8℃，避免潮濕。使用前用1毫升含無菌注射用水溶解，用法為靜脈滴注。
(a)急性肺損傷試驗對rh-TNFRFc進行臨床前藥效學研究。使用內毒素來誘導大鼠，使之產生急性肺損傷癥狀，然后用rh-TNFRFc融合蛋白靜脈注射大鼠。
結果表明，在本試驗中，該藥物最低在1mg/kg體重時可產生明顯的藥效作用。
(b)小鼠注射致死劑量TNF-α和TNFR-Ig融合蛋白的試驗在本試驗中，通過小鼠注射致死劑量TNF-α模型，研究了皮下注射TNFRFc的體內中和TNFα的情況。
結果顯示，給予小鼠腹腔注射重組人TNF-α(R&D systems)1μg/只，小鼠均在24h內死亡(20/20)。而24h前皮下注射rhTNFRFc融合蛋白(50μg/只)組小鼠則無動物死亡(0/20)。該結果證明，rhTNFRFc融合蛋白確實可在體內起到中和TNF-α的作用，且該藥物經皮下注射后，至少24h后仍有藥理作用。另外兩組動物TNF-α給藥劑量提高至2μg，結果rhTNFRFc組動物死亡8只(存活率60％)，EnbrelTM組動物死亡7只(存活率65％)；經χ2檢驗，兩組動物存活率無顯著差異。
綜上所述，靜脈注射TNFR-Ig融合蛋白可對內毒素誘導的大鼠急性肺損傷起到防治作用，其作用與劑量呈正相關。
實施例2安全性檢測利用貓對中試產品進行的一般藥理學研究表明，皮下注射4mg/kg或12mg/kg的TNFR-Ig融合蛋白，動物在接下來的6小時內呼吸、血壓、心律、心率、心電圖方面無明顯改變。應用Irwin行為分級法、爬桿法、開闊法、傾斜法等四種方法，觀察皮下注射rh-TNFRFc20mg/kg及40mg/kg對小鼠精神神經系統(tǒng)的影響。
結果TNFR-Ig融合蛋白與賦形劑陰性對照組無顯著差別。說明使用本發(fā)明的方法進行急性肺損傷治療是安全的。
實施例3藥物動力學試驗委托國家上海新藥安全評價研究中心，利用大鼠進行了TNFR-Ig融合蛋白(包括CN01132074.5中的TNFR-Ig融合蛋白和EnbrelTM)的藥物動力學比較研究。皮下給予大鼠3mg/kg本藥或EnbrelTM，于給藥后不同時間采血，然后利用夾心ELISA檢測了大鼠血清中的藥物濃度進行分析。
結果提示，CN01132074.5中TNFR-Ig融合蛋白與EnbrelTM在藥時曲線下面積、半衰期、峰值濃度等指標上均無顯著差異，兩者藥時曲線接近重合。該結果說明，本品在藥物動力學性質上與Enbrel十分接近。
給予小鼠一次性靜脈注射160mg/kg(推薦臨床應用劑量的400倍)的研究藥物，在14天的觀察期內，全部動物存活且體重增加，無異常毒性反應現(xiàn)象。
實施例4長期毒性試驗此外，用恒河猴進行了本品的4周長期毒性試驗，以觀察恒河猴皮下注射rh-TNFRFc 4周后對機體產生的毒性反應及其嚴重程度，提供毒性反應的靶器官及其損害的可逆性，確定無毒性反應的劑量，為擬定人用安全劑量提供參考。
結果顯示，在給予劑量分別為0、1、5和15mg/kg，每周注射2次，連續(xù)注射4周，動物的一般征狀、血液學和血清生化指標、尿液分析、心電圖和病理檢查等均未發(fā)現(xiàn)有明顯異常，僅見給藥2周后部分動物血清中抗體產生。上述結果與美國FDA公布的關于ENBRELTM的猴4周長期毒性試驗的結果非常接近。因此在本試驗條件下，猴給藥4周是較安全的，安全劑量為15mg/kg。
實施例5給藥劑量和方式鑒于rh-TNFRFc用于類風濕性關節(jié)炎采用的是皮下給藥，為了使其更快地起效，優(yōu)選采用靜脈滴注用于SARS、創(chuàng)傷等引起的急性肺損傷，推薦劑量為皮下注射的一半。
藥代動力學和生物利用度試驗方法如下在健康志愿者中sc給予10mg和iv給予10mg(N＝6；兩組各3人)。對于70kg的個體10mg相當于5.7mg/m2。此研究被認為是給藥途徑的交叉研究，因為受試者先給予sc隨后是iv。注射間隔28天。用非房室模型法測定藥代動力學終點。用梯形法則計算AUC；半衰期是-log(2)/β。對于iv給藥用72h以后的時間，而sc用144h以后的時間估算回歸系數(shù)(β)。通過不同途徑AUC的比值(sc/iv)計算生物利用度。
結果表明，皮下注射的達峰時間為66h，半衰期為92h，而靜脈注射達峰時間為0.8h，半衰期為72h；皮下注射的生物利用度為58％。可見，采用靜注12.5mg/次，每周兩次的劑量是可行的，也是安全的。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1.一種腫瘤壞死因子受體-免疫球蛋白的融合蛋白的用途，其特征在于，用于制備治療急性肺損傷的藥物。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的急性肺損傷是由SARS冠狀病毒感染引起的。
3.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述藥物中TNFR-Ig融合蛋白的重量含量為1-99％。
4.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的TNFR-Ig融合蛋白的N-末端的235個氨基酸殘基為人II型腫瘤壞死因子受體細胞外段的序列，其C-末端的232個氨基酸殘基為人免疫球蛋白γ1鏈的可結晶片段序列。
5.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述藥物的給藥途徑是靜脈注射或靜脈滴注。
6.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述藥物的給藥劑量是每天0.1-3mg TNFR-Ig融合蛋白/千克體重。
7.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述藥物的給藥劑量是每天0.5-2mg TNFR-Ig融合蛋白/千克體重。
全文摘要
本發(fā)明涉及藥物領域，更具體地涉及腫瘤壞死因子受體－免疫球蛋白的融合蛋白(簡稱為“TNFR－Ig融合蛋白”)在治療急性肺損傷方面的用途。含有TNFR－Ig融合蛋白的藥物組合物可非常有效地治療由SARS等因素引起的急性肺損傷。
文檔編號A61P31/00GK1565631SQ03129569
公開日2005年1月19日 申請日期2003年6月27日 優(yōu)先權日2003年6月27日
發(fā)明者劉慶法, 王皓, 李晶, 李春澍, 李銳 申請人:上海中信國健藥業(yè)有限公司