專利名稱：一種硫脲衍生物在制備治療眼黃斑變性藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種一氧化氮供體硫脲衍生物在藥學(xué)上的應(yīng)用，具體為反式硫脲衍生物在防治年齡相關(guān)性眼病方面的用途。
背景技術(shù)：
年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)是一種常見老年病，僅美國(guó)就有200～300萬患者，在我國(guó)人數(shù)更多，約有1200～1500萬。AMD的特征性表現(xiàn)是黃斑區(qū)出現(xiàn)玻璃疣，伴有脈絡(luò)膜新生血管(CNV)形成或地圖樣萎縮斑。近來，視網(wǎng)膜光凝用于低視力患者中心凹旁和復(fù)發(fā)性CNV的治療。然而，這種治療能否預(yù)防視力損害尚不清楚。至于那些視力尚好的中心凹旁CNV患者(大多數(shù)熒光血管造影為典型AMD者)通過光動(dòng)力治療(PDT)，有半數(shù)患者取得了效果。目前，對(duì)地圖樣萎縮斑的AMD沒有治療辦法。換言之，只有三分之一或更少的AMD患者可以進(jìn)行PDT治療，而其中只有一半患者經(jīng)過治療保留視力而不至于失明。
在大多數(shù)AMD患者中，CNV形成的主要原因是AMD早期的脈絡(luò)膜循環(huán)障礙。要預(yù)防AMD發(fā)生，必須改善和促進(jìn)脈絡(luò)膜血流。因此，當(dāng)務(wù)之急是尋找能選擇性增加脈絡(luò)膜血流的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是尋找一種能夠防治AMD的藥物，其能夠選擇性地促進(jìn)眼的脈絡(luò)膜血流，消除脈絡(luò)膜循環(huán)障礙，抑制AMD的脈絡(luò)膜新生血管形成。
為解決上述問題，本發(fā)明提供下述技術(shù)方案。
反式-1-苯基-3-{3-甲氧基-2-丙氧基-5-[4-(3，4，5-三甲氧基苯基)-1，3-二氧戊環(huán)-2-基]苯基}硫脲在制備治療或預(yù)防年齡相關(guān)性黃斑變性的藥物中的應(yīng)用；其特征在于用于制備選擇性改善脈絡(luò)膜血流的藥物；其特征在于用于制備抑制脈絡(luò)膜新生血管形成的藥物。
前述反式-1-苯基-3-{3-甲氧基-2-丙氧基-5-[4-(3，4，5-三甲氧基苯基)-1，3-二氧戊環(huán)-2-基]苯基}硫脲在制備治療或預(yù)防年齡相關(guān)性黃斑變性的藥物中的應(yīng)用，其特征在于用于制備外用眼藥。
反式-1-苯基-3-{3-甲氧基-2-丙氧基-5-[4-(3，4，5-三甲氧基苯基)-1，3-二氧戊環(huán)-2-基]苯基}硫脲在制備促使細(xì)胞釋放一氧化氮的藥物中的應(yīng)用；尤其是在制備促使眼細(xì)胞釋放一氧化氮的藥物中的應(yīng)用。
發(fā)明人對(duì)一氧化氮供體(NO Donor)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，N-苯基取代的硫脲類化合物(代號(hào)ZX-5)，化學(xué)名稱為反式-1-苯基-3-{3-甲氧基-2-丙氧基-5-[4-(3，4，5-三甲氧基苯基)-1，3-二氧戊環(huán)-2-基]苯基}硫脲，能引起培養(yǎng)細(xì)胞釋放多量NO，并能增加兔眼脈絡(luò)膜血流，但對(duì)虹膜和睫狀體血流沒有影響。其異構(gòu)體(代號(hào)ZX-4)順式-1-苯基-3-{3-甲氧基-2-丙氧基-5-[4-(3，4，5-三甲氧基苯基)-1，3-二氧戊環(huán)-2-基]苯基}硫脲，既不引起NO釋放，也不增加眼組織血流。
脈絡(luò)膜血流的增加可能是NO在脈絡(luò)膜釋放的結(jié)果。ZX-5點(diǎn)眼能選擇性改善脈絡(luò)膜血流很有價(jià)值，因?yàn)槊}絡(luò)膜位于眼球后部，說明藥物點(diǎn)眼后，通過全身循環(huán)或鞏膜—葡萄膜—視神經(jīng)途徑，能快速到達(dá)脈絡(luò)膜，對(duì)AMD的脈絡(luò)膜新生血管形成有抑制作用，可望用于早期AMD的治療或預(yù)防。
1.化學(xué)合成ZX-4和ZX-5的合成以沒食子醛1為起始原料，經(jīng)相轉(zhuǎn)移催化反應(yīng)得環(huán)氧化合物2，2經(jīng)水解得二醇3，3與硝基芳醛縮合得二氧戊環(huán)化合物4，柱色譜分離得順反異構(gòu)體5和6，它們經(jīng)還原分別得相應(yīng)的氨基物7和8。7和8與異硫氰酸苯酯反應(yīng)得ZX-4和ZX-5。合成路線參見下頁圖示。
1-(3，4，5-三甲氧基苯基)環(huán)氧乙烷(2)的合成將沒食子醛(39.2g，200mmol)、溴化四丁基銨(1.58g，4.91mmol)、CH2Cl280mL投入圓底燒瓶中，攪拌使其溶解，滴入冷的50％NaOH溶液80mL，約15分滴畢，再加入碘化三甲基锍(40.8g，200mmol)，回流反應(yīng)15h。加水180mL，分出油層，水層以CH2Cl2萃取，無水硫酸鎂干燥，蒸去溶媒，固化得微黃色固體，甲醇重結(jié)晶，得白色結(jié)晶33.98g，收率81.3％，mp54～56℃。
1-(3，4，5-三甲氧基苯基)乙烷-1，2-二醇(3)的合成將化合物2(11.2g，0.053mol)、蒸餾水(200mL)加入500mL三頸瓶中，室溫機(jī)械攪拌，緩慢滴加0.8mL高氯酸，劇烈攪拌反應(yīng)5h，溶液逐漸澄清透明，停止反應(yīng)。用NaHCO3調(diào)pH值約為7，用乙酸乙酯(50mL×4)提取，合并有機(jī)相，用飽和食鹽水(50mL×3)洗滌，無水MgSO4干燥過夜，濃縮，得淡黃色油狀物10.1g，收率82.2％。
順/反-2-(3-甲氧基-5-硝基-4-正丙氧基苯基)-4-(3，4，5-三甲氧基苯基)-1，3-二氧戊環(huán)(5，6)的合成將化合物3(5.6g，24.6mmol)、5-硝基香蘭醛(3.2g，13.38mmol)、PPTS(2.8g，11.1mmol)和60mL干燥苯加入100ml三頸瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流分水8小時(shí)完畢?？焖僬羧ゴ蟛糠直剑磻?yīng)液中加100mL乙酸乙酯，用飽和食鹽水(50mL×3)洗滌除去PPTS，無水硫酸鎂干燥，過濾，濾液濃縮得4，柱色譜[乙酸乙酯/石油醚(60～90℃)，V∶V＝1∶4]，得白色粉末狀固體(反式，6)1.9g，收率31.7％，mp46～48℃；順式產(chǎn)物(5)為淡黃色油狀物1.12g，收率18.7％。 合成路線圖順/反-2-正丙氧基-3-甲氧基-5-[4-(3，4，5-三甲氧基苯基)-1，3-二氧戊環(huán)-2-]苯胺(7，8)的合成將順式硝基物5(200mg，0.445mmol)溶于20mLTHF中，加入水20mL，鐵粉(56mg，1mmol)、氯化銨(53.5mg，1mmol)，加熱回流6h，稍冷，分出上層有機(jī)層，水層用乙酸乙酯(20ml×3)提取，合并有機(jī)層，用無水硫酸鈉干燥過夜，過濾，蒸干濾液，得一淡黃色油狀物125.7mg，收率67.4％。參照7的合成方法得淡黃色油狀反式苯胺化合物8(104.3mg，收率56％)。
ZX-4和ZX-5的合成將化合物7和8(0.048mmol)分別與異硫氰酸酯苯酯(0.1mmol)、四氫呋喃(5mL)混合，于70℃時(shí)攪拌反應(yīng)12h后，濃縮，柱色譜分離[乙酸乙酯/石油醚(60～90℃)/二氯甲烷，V∶V∶V＝1∶3∶1]即得產(chǎn)品ZX-4和ZX-5。
MS化合IR vmp/℃ (ESI)1HNMR(CDCl3)δ物 /cm-1(M+H)+ZX-4oil555.233110.9(t，3H，CH3，J＝7.3Hz)，1.57～1.64(m，2H，CH2)，3.63～15953.90(m，15H，4OCH3，OCH2，C-5CH)，4.27～4.32(m，1H，C-5CH)，5.12～5.16(m，1H，C-4CH)，5.87(s，1H，C-2CH)，6.71～7.82(m，9H，ArH)ZX-543～46 555.2 33190.92(t，3H，CH3，J＝6.9Hz)，1.60～1.65(m，2H，CH2)，15933.66～3.91(m，15H，4OCH3，OCH2，C-5CH)，4.48～4.52(m，1H，C-5CH)，5.12～5.16(m，1H，C-4 CH)，6.1(s，1H，C-2CH)，6.7 1～7.77(m，9H，ArH)化合物 元素分析(％)Found(Calcd.)N C HZX-4 5.04(5.05)，62.43(62.82)，6.10(6.14)ZX-5 5.13(5.05)，62.65(62.82)，6.08(6.14)


圖1ZX-5與ZX-4促使NO生成的量效曲線具體實(shí)施方式
實(shí)施例藥理試驗(yàn)1、RLG細(xì)胞培養(yǎng)選擇永生代兔淚腺腺泡上皮細(xì)胞(RLG細(xì)胞)的原因是它的作用類似于血管上皮細(xì)胞，能增加C-GMP的生成，從而分別增加淚液和血流。細(xì)胞培養(yǎng)在37℃、5％CO2的孵箱中進(jìn)行。培養(yǎng)基為DMEM/F-12，附加5％Nu血清IV、1μM地塞米松、0.1mg/ml大豆胰蛋白酶抑制劑、10μl/ml胰島素、5.5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、6.7ng/ml亞硒酸鈉、10ng/mlEGF和10μg/ml慶大霉素(Sigma，St.Louis，MO)。用襯以基質(zhì)膠的培養(yǎng)皿結(jié)合0.25％胰蛋白酶-EDTA和刮除法進(jìn)行細(xì)胞傳代。
2、細(xì)胞活力測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞的活力用MTT細(xì)胞增殖法測(cè)定。MTT測(cè)定(細(xì)胞活力和細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù))原理是有活力的細(xì)胞能把MTT從水溶性黃色染料還原成不溶的深藍(lán)色Formazan。MTT溶于(5mg/ml)PBS中，無菌過濾。此后，6孔培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基換成500μl無酚紅培養(yǎng)基，每孔加入50μlMTT溶液，搖晃混勻，放入孵箱4小時(shí)后，吸去上清。每孔加1mlDMSO溶解Formazan，搖晃2分鐘混勻。用波長(zhǎng)570nm的板式分光光度計(jì)測(cè)量培養(yǎng)皿每孔光吸收力，空白孔是500μl相同培養(yǎng)基和50μlMTT，移去培養(yǎng)基后加1mlDMSO。
繪制570m波長(zhǎng)光MTT吸收力與細(xì)胞數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。把長(zhǎng)滿的細(xì)胞從100cm培養(yǎng)皿平移到6孔培養(yǎng)皿。次日，每個(gè)培養(yǎng)皿中3孔做MTT測(cè)定，另3孔用Trypan blueexclusion法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞計(jì)數(shù)前，先消化和刮離細(xì)胞。從2ml細(xì)胞混懸液中吸取500μl，加入200μl Trypan blue染料混合。取10μl混合液放在血液計(jì)數(shù)板上，在顯微鏡下放大100倍進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)算3孔細(xì)胞均數(shù)，使之與另3孔的MTT平均吸收力相對(duì)應(yīng)。此后，對(duì)另外5個(gè)培養(yǎng)皿重復(fù)上述操作，測(cè)定后5天細(xì)胞生長(zhǎng)情況，繪制6點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3、NO生成測(cè)定采用硝酸/亞硝酸鹽比色測(cè)定試劑盒(Cayman Chemical，AnnArbor，MI)測(cè)定培養(yǎng)基中NO的濃度。試劑盒中含有硝酸鹽還原酶(專用濃度)，硝酸鹽還原酶輔助因子(專用濃度)，試劑緩沖液，硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)，亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)和Griess試劑。在與藥物或溶媒培養(yǎng)24小時(shí)，6孔培養(yǎng)皿中80％細(xì)胞融合時(shí)，測(cè)定培養(yǎng)液中硝酸和亞硝酸產(chǎn)物含量。從6孔培養(yǎng)皿中每孔采80μl等量物加入96孔微量測(cè)定板，用重復(fù)進(jìn)樣器將10μl硝酸鹽還原酶和10μl輔助因子制劑(按試劑盒中說明預(yù)先配制)快速加入標(biāo)本孔和標(biāo)準(zhǔn)孔中。微量測(cè)定板覆膜后室溫培養(yǎng)3小時(shí)，隨后將50μl Griess試劑R1和R2加入每個(gè)標(biāo)本孔和標(biāo)準(zhǔn)孔中，室溫培養(yǎng)10分鐘。用波長(zhǎng)540nm板式分光光度計(jì)測(cè)得微量測(cè)定板的讀數(shù)。通過標(biāo)定已知硝酸鹽濃度比A540，為每組實(shí)驗(yàn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。每份樣本中硝酸鹽+亞硝酸鹽的最后濃度用μM/106細(xì)胞表示。
4、兔眼血流測(cè)定新西蘭白兔，重2.5～3.0公斤，用35mg/kg氯胺酮和5mg/kg甲苯噻嗪混合后肌注麻醉，每小時(shí)用起始量的一半肌注維持麻醉。升高左眼眼壓至40mmHg，這一眼壓使眼血流降至正常值的1/3。經(jīng)右頸動(dòng)脈插管至左心室，用于注射微球；股動(dòng)脈插管用于采血。1％藥物或溶媒50μl點(diǎn)左眼，點(diǎn)藥后0、30、60和120分鐘用彩色微球技術(shù)測(cè)定高眼壓兔眼的眼血流。在每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，注入0.2ml(含2百萬)微球，微球注入后立即經(jīng)股動(dòng)脈采血60秒整，并置于肝素化抗凝管，記錄采血量。最后一次采血后，用100mg/kg的苯巴比妥靜注處死動(dòng)物，摘取左眼球，分離視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜、虹膜和睫狀體，記錄組織重量。
標(biāo)本處理和微球計(jì)數(shù)的具體操作方法由E-Z Trac公司提供。簡(jiǎn)要敘述如下溶血因子加入血樣管，混勻后以6000rpm的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，移去上清后，加入組織/血液消化因子I和II，加蓋混勻后，以同樣速度離心15分鐘，棄上清，微球計(jì)數(shù)因子使微球保持懸浮，用血液計(jì)數(shù)板進(jìn)行微球計(jì)數(shù)。
將組織/血液消化因子I加到組織標(biāo)本管，加蓋后95℃水浴15分鐘，震蕩混勻30秒后再加熱，至組織完全溶解。乘熱加入組織/血液消化因子II，加蓋混勻后，以6000rpm的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，以后的操作和微球計(jì)數(shù)與血液標(biāo)本相同。
每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)組織血流的計(jì)算用以下公式Qm＝(Cm×Qr)/Cr。其中Qm代表組織血流，單位μl/分/mg；Cm是每毫克組織微球數(shù)；Qr是血液流量，單位μl/分；Cr是作為參照的血液微球數(shù)。
5、結(jié)果ZX-5使NO生成顯著增加通過RLG細(xì)胞培養(yǎng)，檢測(cè)到ZX-5使NO生成明顯增加，并與ZX-5的濃度相關(guān)(圖1)。另一方面，使用ZX-4時(shí)的量效曲線平坦(圖1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果清楚顯示，反式結(jié)構(gòu)有生成NO活性，而順式?jīng)]有。
ZX-5選擇性地增加眼的脈絡(luò)膜血流與對(duì)照組相比，在所有觀察時(shí)間點(diǎn)(30、60、120分鐘)，均測(cè)得ZX-5能顯著增加脈絡(luò)膜血流(表1)。另一方面，ZX-4點(diǎn)眼后，在任何觀測(cè)點(diǎn)均未測(cè)出其對(duì)脈絡(luò)膜血流有影響(表2)。有趣的是，ZX-5僅僅增加脈絡(luò)膜血流，而對(duì)虹膜(表3)和睫狀體(表4)血流沒有影響。一般認(rèn)為，白兔子的視網(wǎng)膜近乎無血管組織，所以很難觀測(cè)到血流改變。ZX-5選擇性增加脈絡(luò)膜血流(表1)而不影響虹膜(表3)和睫狀體(表4)血流有重要意義，它可能被用于AMD(年齡相關(guān)性黃斑變性)的治療或預(yù)防。
表1 ZX-5(1％50μl)選擇性增加白免眼脈絡(luò)膜血流時(shí)間 TreatmentNMean±SE P值(分) (μl/分/mg) (two tails)0 對(duì)照組 514.1±1.8治療組 523.3±4.5 0.1130 對(duì)照組 58.1±1.7治療組 516.4±2.5* 0.0360 對(duì)照組 54.2±0.7治療組 514.3±2.9* 0.02120對(duì)照組 53.1±0.4治療組 510.5±1.8* 0.01*表示與對(duì)照組相比顯著增加表2ZX-4(1％50μl)對(duì)白免眼脈絡(luò)膜血流的影響時(shí)間 TreatmentN Mean±SE P值(分) (μl分/mg) (two tails)0 對(duì)照組 5 14.1±1.8治療組 5 22.4±4.9 0.1830對(duì)照組 5 8.1±1.7治療組 5 11.1±2.9 0.4060對(duì)照組 5 4.2±0.7治療組 5 11.3±3.4 0.10120 對(duì)照組 5 3.1±0.4治療組 5 6.8±1.7 0.09表3ZX-5(1％50μl)對(duì)白免眼虹膜血流的影響時(shí)間 Treatment N Mean±SE P值(分) (μl分/mg) (two tails)0 對(duì)照組 5 2.6±0.4治療組 5 3.4±0.9 0.4230 對(duì)照組 5 1.7±0.4治療組 5 2.6±0.7 0.2760 對(duì)照組 5 1.4±0.3治療組 5 2.1±0.6 0.32120對(duì)照組 5 0.9±0.2治療組 5 1.4±0.5 0.33表4 ZX-5(1％50μl)對(duì)白免眼睫狀體血流的影響時(shí)間 Treatment N Mean±SE P值(分) (μl分/mg) (two tails)0 對(duì)照組 5 3.0±0.2治療組 5 9.0±4.3 0.2430 對(duì)照組 5 2.0±0.5治療組 5 5.4±1.8 0.1360 對(duì)照組 5 1.3±0.3治療組 5 4.9±1.7 0.10120對(duì)照組 5 1.2±0.3治療組 5 3.8±1.3 0.1權(quán)利要求
1.反式-1-苯基-3-{3-甲氧基-2-丙氧基-5-[4-(3，4，5-三甲氧基苯基)-1，3-二氧戊環(huán)-2-基]苯基}硫脲在制備治療或預(yù)防年齡相關(guān)性黃斑變性的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述硫脲在制備治療或預(yù)防年齡相關(guān)性黃斑變性的藥物中的應(yīng)用，其特征在于用于制備選擇性改善脈絡(luò)膜血流的藥物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述硫脲在制備治療或預(yù)防年齡相關(guān)性黃斑變性的藥物中的應(yīng)用，其特征在于用于制備抑制脈絡(luò)膜新生血管形成的藥物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3之一所述硫脲在制備治療或預(yù)防年齡相關(guān)性黃斑變性的藥物中的應(yīng)用，其特征在于用于制備外用眼藥。
5.反式-1-苯基-3-{3-甲氧基-2-丙氧基-5-[4-(3，4，5-三甲氧基苯基)-1，3-二氧戊環(huán)-2-基]苯基}硫脲在制備促使細(xì)胞釋放一氧化氮的藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述硫脲在制備促使眼細(xì)胞釋放一氧化氮的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
反式－1－苯基－3－{3－甲氧基－2－丙氧基－5－[4－(3，4，5－三甲氧基苯基)－1，3－二氧戊環(huán)－2－基]苯基}硫脲(ZX－5)，能引起細(xì)胞釋放一氧化氮，選擇性增加眼脈絡(luò)膜血流，對(duì)虹膜和睫狀體血流沒有影響，能對(duì)老年性常見眼病AMD(年齡相關(guān)性黃斑變性)的脈絡(luò)膜新生血管形成有抑制作用，可用于早期AMD的治療或預(yù)防。
文檔編號(hào)A61K31/357GK1437938SQ0311304
公開日2003年8月27日 申請(qǐng)日期2003年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月24日
發(fā)明者張奕華, 彭司勛, 宣波, 徐新榮, 夏曉明 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)