專利名稱：一種止血藥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛇毒激凝酶止血藥，該藥物含有凝血因子十激活劑(RVV-X)和協(xié)同劑--蛇毒類凝酶(Thrombin-like Enzyme)。更優(yōu)選的是，該止血藥還含有血清白蛋白、例如人血清白蛋白。
背景技術(shù)：
1934年Macfarlane等發(fā)現(xiàn)蝰蛇毒具有十分顯著的凝固作用，當它稀釋1000倍時能在17秒鐘使血友病人的血液凝固(參見The Lancet，“DRS.MACFARLANE & BARNETTHAEMOSTATICPOSSIBILITIES OF SNAKE-VONOM”，Nov.3，1934，第985-987頁)。國外早期一些地區(qū)將其用作外用的局部止血，例如撥牙的止血(參見The Lancet，“CLINICAL AND LABORATORY NOTES”，F(xiàn)eb.22，1936，第428頁)，并且使用的是全毒，即未經(jīng)分離和提純的初毒，代表制品是Stypven(Wellcome UK)，該制品多用作診斷試劑(參見BloodReviews(1993)7.176-189)。
國內(nèi)臨床上也有蝰蛇毒試劑合用作診斷試劑，診斷血漿中凝血因子X是否缺乏。2000年4月5日公開的中國專利申請CN1249338A，“一種高效提取凝血因子十活化酶的方法”中介紹本品用于研究腫瘤遷移機理等科研領(lǐng)域，而將提取純化后的RVV-X用于止血目的未見報導(dǎo)。
基于上述情況，發(fā)明人開發(fā)出含有RVV-X的止血藥，并篩選了協(xié)同劑，蛇毒類凝酶及穩(wěn)定劑、例如人血清白蛋白等，另外篩選輔料制備了注射用蛇毒激凝酶。
國外進口的立止血(參見Hand b Exp.Pharm.52 Snake Venom andBlood Coagulation 1991，Reprinted by Sigma Chemical Company)是從巴西矛頭腹蛇(Bothrops atrox)中提取的類凝酶和凝血因子十激活劑的混合物，而在我國同時含有這兩種酶的蛇種缺乏，到現(xiàn)在還未發(fā)現(xiàn)哪種蛇毒中同時含有類凝酶及RVV-X。
國內(nèi)有立止血的仿制品—巴曲亭，但需要進口原料—巴西矛頭腹蛇(Bothrops atrox)毒。
發(fā)明目的本發(fā)明的一個目的是提供具有協(xié)同作用的止血藥。
本發(fā)明的另一目的是提供具有穩(wěn)定作用的止血藥。
本發(fā)明再一個目的是提供高純度RVV-X的提取方法。
本發(fā)明再一個目的是提供RVV-X的止血用途，以及RVV-X在制備治療止血藥物中的應(yīng)用。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種具有協(xié)同作用的止血藥物，該藥物含有RVV-X和類凝酶，在該藥物中RVV-X與類凝酶的單位比為100～1∶20～0.01，優(yōu)選為50～8∶5～0.5。
本發(fā)明還提供了一種具有穩(wěn)定作用的止血藥物，該藥物除含有RVV-X和類凝酶之外，還含有血清白蛋白、例如人血清白蛋白。在該藥物中RVV-X類凝酶∶血清白蛋白的單位比例為100～1∶20～0.01∶20～0.02，優(yōu)選為50～1∶6～0.2∶10～0.01(單位∶單位∶毫克)。
本發(fā)明還提供了一種RVV-X的分離純化方法，該方法是用Sephacryl系列分子篩柱粗分和Q-Sepharose系列離子交換柱精分兩個步驟實現(xiàn)的。
本發(fā)明還提供了RVV-X的止血用途，以及RVV-X在制備治療出血藥物中的應(yīng)用。


圖1RVV-X分子量測定質(zhì)譜圖(MALDI-TOF-MS) 1、初毒2、3、4半提純的RVV--X圖2ARVV-X SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜 5、RVV--X對照品6、本工藝提純的RVV-X圖2BRVV-X SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳測定分子量圖譜1、2、還原型的RVV--X圖3RVV-X HPLC高效液相色譜圖 3、標準蛋白4、～6、不同點樣量的RVV-X(非還原型)圖4RVV-X HPLC高效毛細管電泳圖譜發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種RVV-X的分離純化方法，該方法是用Sephacryl分子篩柱粗分和Q-Sepharose離子交換柱精分兩個步驟實現(xiàn)的。
將購買的蛇毒，直接上柱分離提取。
具體方法如下。
柱子2.6×100(cm)。
平衡緩沖液0.05M pH 9～6.2 tris-H3PO4緩沖液。
洗脫液(A)0.05M pH9～6.2 tris-H3PO4緩沖液。
(B)0.05M pH8～5.0 tris-H3PO4緩沖液。
上樣取蛇毒500mg用8ml平衡緩沖液溶解，以3500rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，取上清液上樣。
洗脫速度2～0.1ml/min(30ml/小時)，洗脫液0.05M pH9～6.2 tris-H3PO4緩沖液。
鑒定使用LKB核酸蛋白檢測器于280mm處檢測蛋白洗脫峰。合并活性管?？墒占?8.0～30.0ml(含90～80mg蛋白質(zhì))。
將部分純化的酶液泵入離子交換柱。所用柱子和平衡液同上。洗脫先用0.05M pH9～6.2 Tris-H3PO4緩沖液60～30ml淋洗，除去吸附的雜蛋白，然后改用0.05M pH8～5.0 Tris-H3PO4緩沖液100～60ml淋洗，當OD280＜0.005時，改用0.05M pH6.0 Tris-H3PO4緩沖液150～90ml和0.5M NaCl的同一Tris-H3PO4緩沖液進行線性梯度洗脫(5～0.1ml/min，24ml、h)，每管8～2ml進行收集，檢測同上。
將已純化的酶對蒸餾水透析兩次(脫鹽)，除菌過濾、凍干即得。
本發(fā)明方法提供了高純度的RVV-X，其純度鑒定由以下測試證實(參見The Journal of Biololcal Chemistry.269，No 14，10644-10650，1994)。用MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀測定分子量(見圖1)，測得分子量為92827D，與文獻一致。用ABI Procise 491序列測定儀測定N末端氨基酸序列(見下表1)。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳上呈現(xiàn)一條帶(見圖2A)，分子量測定為92967D(見圖2B)。HPLC高效液相色譜Progel TSK G3000SW柱上呈現(xiàn)一個峰(見圖3)。高效毛細管電泳儀測得一個峰(見圖4)。
氨基酸序列分析鑒定結(jié)果如下表1所示No.殘基1 Val2 Leu3 Asp4 Cys5 Pro6 Ser7 Gly8 Trp9 Leu10 Ser11 Tyr12 Glu13 Gln14 His15 Cys上樣程序PVDF測序儀ABI Procise 491從上述分析結(jié)果表明本發(fā)明方法制備的RVV-X為色譜純品。
本發(fā)明還提供了RVV-X的止血用途。所述RVV-X的止血作用可以通過以下試驗得以證實。
采用同類產(chǎn)品活性測定方法進行RVV-X體外凝血試驗，具體方法按下表，用50mMol/LCaCl2溶液制備RVV-X不同濃度的供試品溶液，取小試管(12×75mm)7支。預(yù)先加入人-枸櫞酸血漿(采用三人份以上的混合血漿)0.2ml，置37℃±0.5℃水浴中保溫2分鐘，加入37℃預(yù)熱的RVV-X的供試品溶液，立即混勻，計時，到血漿凝固，停止計時。結(jié)果見表2。
表2 RVV-X體外凝血試驗結(jié)果

上表表明由于血漿中因子X的濃度是固定的5μg/ml血漿，當?shù)孜锓磻?yīng)完成后，再增加酶濃度，作用則不明顯。當蛇毒激凝酶劑量大于50ng后(稀釋2.0×107)，凝固時間不再明顯縮短。
按照臨床前研究指導(dǎo)原則規(guī)定的方法小鼠斷尾法進行RVV-X體內(nèi)凝血試驗RVV-X和類凝酶單獨以及協(xié)同止血試驗。具體方法如下1.RVV-X分別配制0.05U/ml及0.1U/ml的供試品溶液2.類凝酶分別配置2.5×10-3U/ml，0.5×10-2U/ml及
2.類凝酶分別配置2.5×10-3U/ml，0.5×10-2U/ml及1.25×10-2U/ml的供試品溶液。
用斷尾法測定小鼠出血時間。
取健康小鼠，隨機分為7組，每組5只，按表中劑量小鼠尾靜脈注射0.1ml分別于注射后0.5、1、3小時，用剪刀在距小鼠尾尖0.5cm處剪斷，血液自行流出后立即計時，到血液凝固停止計時。以出血時間縮短作為判斷止血效果的指標。同時給予立止血0.1U/kg作為陽性對照，給予生理鹽水作為陰性對照。
結(jié)果見下表3～7注“-“為縮短出血時間，”+“為延長出血時間表3類凝酶(A)和RVV-X(B)單獨止血試驗結(jié)果

表4陽性對照及陰性對照止血試驗結(jié)果

表5小鼠斷尾法測定止血時間(秒)

表6小鼠斷尾法測定止血時間(秒)

結(jié)果表明隨著RVV-X劑量由0.01U/kg增加到0.015U/kg，小鼠出血時間縮短，由16.4秒增加至32.2秒，；兩者相比出血時間又縮短了15.8秒。明顯優(yōu)于立止血。證明RVV-X具有很好的止血作用。注“-”代表縮短出血時間；“+”代表延長出血時間蛇毒激凝酶在劑量明顯小于立止血的情況下(相差10倍)，其止血作用(縮短出血時間)相當，效力基本一致。
表7 RVV-X與類凝酶的協(xié)同止血試驗結(jié)果

注“-“為縮短出血時間，”+“為延長出血時間本發(fā)明提供了具有協(xié)同作用的止血藥物。該藥物含有RVV-X和類凝酶。當RVV-X與類凝酶配制成組合給藥制劑時，RVV-X的止血作用得到協(xié)同，作用得到提高。通過以下的對比試驗可以說明其協(xié)同止血作用。
從表7看出本發(fā)明提供了具有協(xié)同作用的止血藥物。該藥物含有RVV-X和類凝酶。當RVV-X與類凝酶配制成組合給藥制劑時，RVV-X的止血作用得到協(xié)同提高。通過以下試驗可以說明其協(xié)同止血作用。
從表“3”和“7”得到的結(jié)論為0.00025U/kgA+0.005U/kgB具有協(xié)同作用。如下表8所示。
表8


本發(fā)明還提供了具有穩(wěn)定作用的止血藥物。該藥物含有RVV-X、類凝酶和血清白蛋白、例如人血清白蛋白。當在含有RVV-X和類凝酶的藥物中加入血清白蛋白時，RVV-X的穩(wěn)定作用得到加強。通過以下的對比試驗可以說明血清白蛋白對于本發(fā)明協(xié)同止血藥物的穩(wěn)定作用。
表9注射用蛇毒激凝酶穩(wěn)定劑篩選

從表中數(shù)據(jù)看出處方2最穩(wěn)定，凝固時間變化最小，從而確定以人血清白蛋白作為穩(wěn)定劑，并且其含量優(yōu)選為8mg/ml。
實施例1按照上表中處方2的組成制備蛇毒激凝酶止血藥按照常規(guī)方法取類凝酶1U/ml、RVV-X 5U/ml、人血清白蛋白20mg、甘露醇30mg，將其制成凍干粉針，規(guī)格為1ml/支的注射用蛇毒激凝酶止血藥。
實施例2按照上表中處方2的組成制備蛇毒激凝酶止血藥按照常規(guī)方法取類凝酶0.8U/ml、RVV-X 1U/ml、人血清白蛋白10mg、甘露醇30mg，將其制成凍干粉針，規(guī)格為1ml/支的注射用蛇毒激凝酶止血藥。
實施例3按照上表中處方2的組成制備蛇毒激凝酶止血藥按照常規(guī)方法取類凝酶0.01U/ml、RVV-X 0.1U/ml、人血清白蛋白1mg、甘露醇30mg，將其制成凍干粉針，規(guī)格為1ml/支的注射用蛇毒激凝酶止血藥。
實施例4按照上表中處方2的組成制備蛇毒激凝酶止血藥按照常規(guī)方法取類凝酶1U/ml、RVV-X 0.1U/ml、人血清白蛋白10mg、甘露醇30mg，將其制成凍干粉針，規(guī)格為1ml/支的注射用蛇毒激凝酶止血藥。
權(quán)利要求
1.一種協(xié)同止血藥物，其特征在于含有凝血因子十激活劑和類凝酶，在該藥物中凝血因子十激活劑與類凝酶的單位比為100～1∶20～0.01。
2.按權(quán)利要求1所述的止血藥物，其中凝血因子十激活劑與類凝酶的單位比為50～8∶5～0.5。
3.按權(quán)利要求1所述的止血藥物，其中還含有血清白蛋白
4.按權(quán)利要求1所述的止血藥物，其中所述血清白蛋白是人血清白蛋白。
5.按權(quán)利要求3所述的止血藥物，其中凝血因子十激活劑∶類凝酶∶血清白蛋白為100～1∶20～0.01∶20～0.02單位∶單位∶毫克
6.按權(quán)利要求5所述的止血藥物，其中凝血因子十激活劑∶類凝酶∶血清白蛋白為50～1∶6～0.2∶10～0.01單位∶單位∶毫克。
7.按權(quán)利要求1所述的止血藥物，其凝血因子十激活劑的分離純化方法，是用Sephacryl系列分子篩柱粗分和Q-Sepharose系列離子交換柱精分兩個步驟實現(xiàn)的。
8.凝血因子十激活劑在制備止血藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種蛇毒激凝酶止血藥，該藥物含有凝血因子十激活劑(RVV－X)和協(xié)同劑——蛇毒類凝酶。更優(yōu)選的是，該止血藥還含有血清白蛋白、例如人血清白蛋白。此外，本發(fā)明還公開了高純度RVV－X的制備方法，以及RVV－X的止血用途。
文檔編號A61P7/04GK1520880SQ0310188
公開日2004年8月18日 申請日期2003年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月29日
發(fā)明者熊時澤 申請人:熊時澤