專利名稱：海兔(Aplysia punctata)的細(xì)胞毒性cyplasin、其cDNA克隆及生物反應(yīng)性重組體的表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼稱為“cyplasin”的蛋白質(zhì)的一種核酸，cyplasin示出對自主生長的哺乳動物細(xì)胞具有優(yōu)先毒性。由這種蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡與凋亡和壞死均不同。當(dāng)在細(xì)胞培養(yǎng)物中重組制備cyplasin時(shí)發(fā)生的胞內(nèi)細(xì)胞死亡可以通過除去cyplasin序列中的分泌信號而避免。這種修飾使得可以在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)基中表達(dá)cyplasin，其優(yōu)選是所獲得蛋白的糖基化模式。因此，本發(fā)明還涉及一種在真核細(xì)胞，優(yōu)選在哺乳動物細(xì)胞中，重組產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)的方法，所述蛋白質(zhì)當(dāng)外部應(yīng)用時(shí)對所述細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。
海洋生物是一類基本未開發(fā)的潛在生物學(xué)和/或藥物學(xué)的令人感興趣的基因和代謝產(chǎn)物的原料庫(1，2，3)。迄今為止，關(guān)于衍生自海洋生物的天然產(chǎn)物的文獻(xiàn)主要涉及細(xì)胞毒性的低分子量化合物。許多這種天然藥物被臨床應(yīng)用或者作為潛在的抗癌藥物被評估(1，2，3)。相反，關(guān)于海洋生物的可開發(fā)的基因及其產(chǎn)物的報(bào)道很罕見。來自水母Aequorea Victoria的綠色熒光蛋白例如是基礎(chǔ)生物學(xué)令人感興趣的基因，其作為報(bào)道基因廣泛用于生物工程學(xué)中以在活細(xì)胞中研究基因表達(dá)和蛋白質(zhì)定位(4)。
海兔(Sea hare)看起來代表了另一個(gè)產(chǎn)生令人感興趣的高分子量基因產(chǎn)物的物種。最初軟體動物Aplysia的毒性是由于衍生自藻類食物的低分子量代謝物而發(fā)現(xiàn)的(5)。然而，在海兔Aplysia kurodai，Aplysia juliana和Dolabella auricularia的高分子量生物化學(xué)分離物中可以檢測到細(xì)胞溶解的、抗微生物及抗真菌的活性。由此提示這些生物體也許產(chǎn)生藥理學(xué)上令人感興趣的水溶性基因表達(dá)的生物聚合物(5，6)。另外，這些生物化學(xué)研究提示海兔產(chǎn)生許多密切相關(guān)的不同大小及不同生物活性的糖蛋白。首先嘗試在序列水平定性這些蛋白質(zhì)導(dǎo)致一個(gè)Aplysia kurodai衍生的cDNA的分子克隆，其示出與編碼由大非洲蝸牛Achatina fulica產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的cDNA具有顯著序列相同性(7)。然而，未獲得克隆的Aplysia kurodai cDNA編碼的蛋白質(zhì)與任何生物學(xué)活性之間的明確關(guān)聯(lián)。這最可能是由于所述生物活性分子是糖蛋白而且在大腸桿菌中的重組表達(dá)產(chǎn)生生物活性喪失的蛋白質(zhì)。
因此，本發(fā)明的潛在技術(shù)難題是提供重組產(chǎn)生生物活性形式的細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)如來自Aplysia的cyplasin的方法。
所述技術(shù)難題的解決通過提供具有權(quán)利要求書所述特征的實(shí)施方案而實(shí)現(xiàn)。
Aplysia衍生的蛋白質(zhì)的潛在藥理學(xué)價(jià)值促使本發(fā)明人在序列水平鑒別歐洲海兔Aplysia punctata的細(xì)胞毒性活性。生物活性測定引導(dǎo)的分級分離得到蛋白腺分泌的粘液所釋放的一種56kDa的糖蛋白，其在納摩爾濃度對自主生長的細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞毒性作用?；谄浼?xì)胞毒性，對瘤形成的可能作用以及其源自Aplysia，將該蛋白質(zhì)命名為cyplasin。Cyplasin示出對自主生長轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞優(yōu)先的毒性。由這個(gè)蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡與凋亡和壞死均不同。該細(xì)胞毒性作用是不可逆的而且以細(xì)胞類型依賴性方式在納摩爾濃度即顯而易見。相反，以微摩爾濃度注射入小鼠是耐受的，無明顯陰性結(jié)果。對該56kDa的蛋白質(zhì)的微量測序釋放一個(gè)肽序列，其相應(yīng)的核苷酸序列用作探針以篩選基于Aplysia punctata RNA的cDNA，并選擇編碼包含靶肽的多肽的cDNA克隆。檢測兩個(gè)密切相關(guān)的cDNA。編碼長度為558aa的多肽的cDNA認(rèn)為是反映編碼所述細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)的真正的克隆。將其蛋白質(zhì)編碼節(jié)段再克隆到分別適于在大腸桿菌、哺乳動物細(xì)胞及昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的載體中。大腸桿菌表達(dá)的多肽是生物學(xué)失活的。轉(zhuǎn)染的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)一個(gè)細(xì)胞毒性因子而導(dǎo)致其死亡，正如用所述真的細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)處理一樣。相反，被證明對用真蛋白質(zhì)的處理敏感性低得多的轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞毒性因子并持續(xù)增殖，使得可以建立表達(dá)足夠量的細(xì)胞毒性因子的穩(wěn)定昆蟲細(xì)胞系以進(jìn)一步定性。最后，可以看出當(dāng)使用編碼無分泌信號序列的蛋白質(zhì)的DNA序列時(shí)，可以在哺乳動物細(xì)胞中重組產(chǎn)生生物活性蛋白質(zhì)。


圖1通過生物活性測定引導(dǎo)的分級分離而從A.punctata的分泌粘液分離的cyplasin的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。
該圖示出加載有最強(qiáng)活性組分的12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠(cyplasin泳道)。蛋白質(zhì)樣物質(zhì)遷移具有的表觀分子量為56kDa。泳道M加樣標(biāo)志蛋白。
圖2(a)衍生自包含編碼(未記錄的)內(nèi)部肽SGDYILIASYAD的核苷酸亞序列的A.punctata cDNA的前體蛋白的氨基酸序列上方的序列(558aa殘基)衍生自編碼稱為cyplasin-L的多肽的cDNA的核苷酸序列，下方序列(421aa殘基)衍生自編碼稱為cyplasin-S的多肽的cDNA的核苷酸序列。所述核苷酸序列在數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)，登記號為AJ304802(cyplasin-L cDNA)和AJ304801(cyplasin-S cDNA)。除了這些明顯可區(qū)分的轉(zhuǎn)錄物，還可能存在具有額外差異的其它mRNA。使用總cDNA作為模板及cyplasin-L特異性引物對進(jìn)行PCR，產(chǎn)生與克隆的cyplasin-L及cyplasin-S編碼cDNA序列略不同的一些序列。通過PCR程序檢測的氨基酸置換在括號中表示。Asn-連接的糖基化位點(diǎn)在N-151、N-271、N-401、N-416和N-422位發(fā)現(xiàn)。推定分泌信號序列的切割點(diǎn)在aa 52(S)和aa 53(A)之間。
(b)蛋白質(zhì)Cypl-Mut-Sig.Seq)的核苷酸序列。
圖3用表達(dá)cyplasin-L-EGFP的pIZ載體驅(qū)動的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞(Sf9)上圖示出在明場中的Sf9細(xì)胞，下圖示出在熒光模式(515nm)下的相同部分，標(biāo)尺10μm。
圖4在從SF9細(xì)胞中釋放的細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)級分中重組cyplasin-L-EGFP融合蛋白的富集(enrichment)如材料與方法章節(jié)所述，從表達(dá)cyplasin-L-EGFP的SF9細(xì)胞中制備含有細(xì)胞毒性因子的提取物。在12％聚丙烯酰胺凝膠上分離相同的樣品。在平行凝膠組上跑膠的多肽與一種蛋白質(zhì)大小標(biāo)記一起通過銀染色程序或者印跡于一PVDF膜上而觀測。所述膜用抗EGFP抗體探查，應(yīng)用堿性磷酸酶偶聯(lián)的二級抗體觀測形成的免疫復(fù)合物。(a)示出蛋白質(zhì)大小標(biāo)記，(b)示出在提取物中存在的顯著多肽，(c)示出通過EGFP特異性抗體檢測的抗原。應(yīng)注意抗EGFP抗體檢測到一個(gè)70kDa的多肽，其顯著大于EGFP(27kDa)。這個(gè)結(jié)果表明在細(xì)胞毒性級分中富集EGFP標(biāo)記的融合蛋白。經(jīng)計(jì)算cyplasin-L前體蛋白(57.2kDa)和EGFP之間的融合蛋白的分子量為84.2kDa。缺失信號序列的加工cyplasin-L計(jì)算分子量為41.6kDa，當(dāng)與EGFP融合時(shí)分子量為68.6kDa，這與在印跡上檢測的融合蛋白大小很相近。因此，推測所述細(xì)胞毒性提取物含有EGFP標(biāo)記的及經(jīng)加工的cyplasin-L。
圖5天然(genuine)的cyplasin-L-EGFP及重組cyplasin-L-EGFP的細(xì)胞毒性作用將四種不同的細(xì)胞系用天然(genuine)的cyplasin及來自穩(wěn)定表達(dá)cyplasin-L-EGFP的SF9細(xì)胞中的標(biāo)準(zhǔn)提取物(實(shí)施例1)處理4小時(shí)。天然的cyplasin人原代皮膚成纖維細(xì)胞(HSF)與50nM cyplasin溫育。在此濃度HSF細(xì)胞示出微弱但典型的反應(yīng)，提示細(xì)胞膜退縮與部分脫附。在此濃度未觀測到細(xì)胞死亡，細(xì)胞恢復(fù)并持續(xù)增殖。取自活組織檢查的人原代黑素瘤細(xì)胞與HSF細(xì)胞相比對cyplasin的細(xì)胞毒性作用更敏感。在加入cyplasin(2nM)之后，細(xì)胞示出典型的cyplasin誘導(dǎo)的膜改變并最終死亡。源自大鼠胚胎腦皮質(zhì)的永久細(xì)胞系的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞當(dāng)用cyplasin處理時(shí)最敏感。加入0.5nM cyplasin足以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。袋鼠(rat kangaroo)PtK細(xì)胞需要2nM cyplasin才表現(xiàn)死亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)。重組cyplasin-L-EFGP在平行培養(yǎng)中，重組cyplasin-L-EFGP的標(biāo)準(zhǔn)提取物(100μl/500μl培養(yǎng)基)的標(biāo)準(zhǔn)提取物示出基本相同的和梯度的細(xì)胞毒性作用。標(biāo)尺10μM。
圖6各種細(xì)胞系的cyplasin劑量應(yīng)答曲線神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是對cyplasin最敏感的細(xì)胞。小于1nM的cyplasin足以將其大部分殺死。人原代黑素瘤細(xì)胞及PtK細(xì)胞也示出對cyplasin高度敏感，而HSF則更耐受，只有當(dāng)cyplasin劑量高達(dá)100nm時(shí)才殺死這些細(xì)胞。
圖7由星形孢菌素誘導(dǎo)的凋亡及由天然的cyplasin誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡將PtK細(xì)胞用10nM cyplasin處理5小時(shí)(上圖)，或者用1μg/ml星形孢菌素處理3小時(shí)(下圖)。將細(xì)胞用FITC標(biāo)記的AnnexinV與碘化丙啶的混合物染色(8)。FITC-AnnexinV染色示出磷脂酰絲氨酸從質(zhì)膜內(nèi)至質(zhì)膜外的特征性易位。在cyplasin處理的細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)FITC-AnnexinV染色，其示出特征性cyplasin誘導(dǎo)的形態(tài)學(xué)改變。星形孢菌素和cyplasin均不可使細(xì)胞通透，這一點(diǎn)通過核沒有被碘化丙啶染色而證實(shí)，標(biāo)尺10μM。
圖8在用2nM天然的cyplasin處理1小時(shí)的培養(yǎng)物中存在的PtK細(xì)胞的分裂后期進(jìn)展從左上到右下未觀測到對分裂后期過程的干擾，分裂后期以一種表觀正常的胞質(zhì)分裂而終止。在進(jìn)入分裂間期后，這個(gè)細(xì)胞示出典型的cyplasin誘導(dǎo)的形態(tài)學(xué)改變。標(biāo)尺10μm。
圖9cyplasin對人原代黑素瘤細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架的作用Cyplasin(10nM)導(dǎo)致肌動蛋白纖維快速解聚，例外的是皮質(zhì)區(qū)中1-肌動蛋白持續(xù)染色(箭頭所指處)。(a)未處理的對照組；(b)30分鐘cyplasin溫育；(c)60分鐘cyplasin溫育；(d)90分鐘cyplasin溫育；(e)120分鐘cyplasin溫育；(f)150分鐘cyplasin溫育。標(biāo)尺10μm。
圖10在cyplasin的N末端氨基酸序列中信號肽及其剪切位點(diǎn)的預(yù)測剪切的最高概率是在氨基酸位置19和20之間或者(較低概率)在氨基酸位置52和53之間。
圖11除去了分泌前導(dǎo)序列的cyplasin的氨基酸序列在用編碼這種蛋白質(zhì)的cyplasin變體(仍具有細(xì)胞毒性)的cDNA轉(zhuǎn)染的人體細(xì)胞中，所述變體存在于該細(xì)胞的胞質(zhì)中。
圖12用修飾的cyplasin cDNA轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞的顯微照相下圖明場；上圖在熒光模式中的相同區(qū)域。所有細(xì)胞均含有EGFP及作為結(jié)果的，cyplasin。
因此，本發(fā)明涉及一種分離的核酸分子，其編碼缺失或無功能性分泌信號序列的蛋白質(zhì)cyplasin或者表現(xiàn)其生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)，所述核酸選自如下組中(a)編碼包含圖2(a)氨基酸位置20或53至558的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸分子；(b)包含圖2(b)的核苷酸序列的核酸分子；(c)一種核酸分子，其核酸序列由于遺傳密碼的簡并衍生自(a)或(b)中所述序列；(d)一種核酸分子，其代表(a)，(b)或(c)中所述核酸序列的片段、衍生物或等位基因變體。
正如本文所使用的，表現(xiàn)cyplasin的生物學(xué)性質(zhì)的蛋白質(zhì)是指一種蛋白質(zhì)，其具有cyplasin的至少一種生物學(xué)活性，例如細(xì)胞毒性。
正如本文所使用的，術(shù)語“分離的核酸分子”包括本質(zhì)上沒有前體的核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物或其天然相關(guān)的其它材料的核酸分子。例如，分離的核酸分子可以是載體或者組合物的一部分，或者可以包含在細(xì)胞內(nèi)，但仍然是“分離的”，因?yàn)檩d體、組合物或者特定的細(xì)胞不是所述核酸分子的初始環(huán)境。
本發(fā)明的核酸分子可以是DNA和RNA分子。合適的DNA分子例如是基因組或cDNA分子。應(yīng)理解所述分子還包括編碼全部或部分cyplasin的所有核酸分子，只要它們編碼具有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)即可。本發(fā)明的核酸分子可以從天然原料中分離或者可以根據(jù)已知方法合成。
本發(fā)明的核酸分子還包括具有由于遺傳密碼簡并的序列的分子。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了核酸分子，其包含上述編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸分子的片段、衍生物和等位基因變體。“片段”是指所述編碼所述蛋白質(zhì)之一的足夠長的一部分核酸分子。這些片段包含與本發(fā)明核酸分子的轉(zhuǎn)錄物特異性雜交的核酸分子。這些核酸分子可以例如用作診斷分析和/或試劑盒中的探針或引物，優(yōu)選是長度為至少15個(gè)、更優(yōu)選至少50個(gè)核苷酸的寡核苷酸。本發(fā)明的核酸分子和寡核苷酸也可以用作例如PCR反應(yīng)的引物。
文中術(shù)語“衍生物”是指這些分子的序列與上述核酸分子的序列在一或幾個(gè)位置不同，但與這些序列具有高水平相同性。在此相同性是指至少40％、特別是60％、優(yōu)選80％或85％以上及特別優(yōu)選90％、92％、95％或98％以上的序列相同性。由所述核酸分子編碼的這些蛋白質(zhì)與圖2所示權(quán)利要求的氨基酸序列的相同性為至少60％或70％，優(yōu)選80％或85％，特別優(yōu)選90％、95％、97％和99％以上。上述核酸分子的衍生物可以通過缺失、代換、插入或重組而產(chǎn)生。
與上述分子同源的或者代表這些分子的衍生物的核酸分子通常是這些分子的變體，其代表具有相同生物學(xué)功能的修飾。它們可以天然發(fā)生變化，例如來自其它生物體的序列，或者可以是天然發(fā)生的或通過特異性誘變而導(dǎo)入的突變。而且，所述變體可以是合成產(chǎn)生的序列。等位基因變體可以是天然發(fā)生的變體或者合成產(chǎn)生的變體或者通過重組DNA方法產(chǎn)生的變體。
一般地，通過常規(guī)分子生物學(xué)方法(例如Sambrook等，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，NY)可以在本發(fā)明的核酸分子中導(dǎo)入不同的突變。
為通過遺傳工程操作原核細(xì)胞，本發(fā)明的核酸分子或這些分子的一部分可以導(dǎo)入質(zhì)粒中，使得可以通過重組DNA序列而誘變或修飾所述序列。通過常規(guī)方法(例如Sambrook等，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，NY，美國)，可以置換堿基及可以加入天然或合成的序列。為將所述DNA片段彼此連接，可在片段中加入連接物或接頭。此外，可以進(jìn)行操作以提供合適的剪切位點(diǎn)或者除去多余的DNA或剪切位點(diǎn)，優(yōu)選除去分泌信號。如果可以插入、缺失或代換，則可以進(jìn)行體外誘變、引物修復(fù)、限制或連接。通常使用的分析方法是序列分析、限制分析及其它生物化學(xué)或分子生物學(xué)方法。
由本發(fā)明核酸分子的各種變體編碼的蛋白質(zhì)示出一些共有特性，如酶活性、分子量、免疫反應(yīng)性或者構(gòu)象或物理性質(zhì)如電泳遷移性、層析行為、沉降系數(shù)、溶解性、光譜學(xué)性質(zhì)、穩(wěn)定性；最佳pH、最佳溫度。
而且本發(fā)明涉及包含本發(fā)明核酸分子的載體。優(yōu)選它們是質(zhì)粒、粘粒、病毒、噬菌體及遺傳工程領(lǐng)域通常使用的其它載體。適用于本發(fā)明的載體包括但非限于針對在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7的表達(dá)載體，針對在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體及針對在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的桿狀病毒衍生載體。優(yōu)選本發(fā)明的核酸分子在本發(fā)明的重組載體中可操縱地與調(diào)節(jié)元件連接，這樣保證RNA在可翻譯的原核和/或真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄及合成。轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列可以可操縱地與一個(gè)啟動子連接，如T7、金屬硫蛋白I或多角體蛋白啟動子。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及瞬時(shí)或穩(wěn)定含有本發(fā)明的核酸分子或載體的重組宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞是指一種生物體，其能吸收體外重組DNA，而且如果是這種情況則可以合成本發(fā)明的核酸分子編碼的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，這些細(xì)胞是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，例如哺乳動物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或酵母細(xì)胞。本發(fā)明的宿主細(xì)胞優(yōu)選特征在于導(dǎo)入的本發(fā)明的核酸分子與轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是異源的，即在這些細(xì)胞中不是天然發(fā)生的，或者位于與相應(yīng)天然發(fā)生的序列不同的基因組位置。
本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案涉及表現(xiàn)cyplasin生物學(xué)性質(zhì)的由本發(fā)明核酸分子編碼的分離的蛋白質(zhì)及其產(chǎn)生方法，優(yōu)選其中正常發(fā)生的分泌序列已經(jīng)除去或者是無功能的cyplasin。從而例如將本發(fā)明的宿主細(xì)胞在允許所述蛋白質(zhì)合成的條件下培養(yǎng)，隨后將所述蛋白質(zhì)從培養(yǎng)的細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中分離。重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的分離和純化可以通過常規(guī)方法進(jìn)行，包括制備層析及包括用單克隆或多克隆抗體親和層析的親和性與免疫性分離。正如本文所使用的，術(shù)語“分離的蛋白質(zhì)”包括基本沒有其它蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、碳水化合物或其天然相關(guān)的其它材料的蛋白質(zhì)。然而這種蛋白質(zhì)不僅包含重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，而且還包含分離的天然發(fā)生的蛋白質(zhì)、合成產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、或者通過這些方法組合產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域熟知制備這種蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明的蛋白質(zhì)優(yōu)選是本質(zhì)上純化的形式。
除了cyplasin之外，有許多種蛋白質(zhì)對腫瘤細(xì)胞是細(xì)胞毒性的，因此可能具有治療價(jià)值。為獲得足夠數(shù)量/質(zhì)量的這種蛋白質(zhì)，它們是重組產(chǎn)生的。優(yōu)選所述蛋白質(zhì)應(yīng)在哺乳動物細(xì)胞中生產(chǎn)，優(yōu)選在人體細(xì)胞中，以保證對細(xì)胞毒性活性所必需的如糖基化等的二級修飾存在。然而，在所述蛋白質(zhì)從宿主細(xì)胞中分泌而且細(xì)胞毒性僅在細(xì)胞膜的外側(cè)起反應(yīng)的情況中，不能實(shí)現(xiàn)所述蛋白質(zhì)的重組產(chǎn)生，因?yàn)榉置诘牡鞍踪|(zhì)殺死其宿主細(xì)胞。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這個(gè)問題可以克服，即如果其在合成之后從宿主細(xì)胞中的輸出被阻斷，則這種細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)可以在哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生。這可以通過表達(dá)編碼無分泌前導(dǎo)序列的蛋白質(zhì)的基因而實(shí)現(xiàn)。這種修飾的蛋白質(zhì)保留在其宿主細(xì)胞中，并因此對宿主細(xì)胞不再有細(xì)胞毒性。在細(xì)胞裂解/同質(zhì)化之后，所述蛋白質(zhì)釋出并可以通過如細(xì)胞毒性化合物那樣確定的生物化學(xué)方法分離并純化(見實(shí)施例11，該實(shí)施例是關(guān)于在HeLa細(xì)胞中重組產(chǎn)生除去分泌信號前導(dǎo)序列的cyplasin)。
因此，本發(fā)明還涉及在真核宿主細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞(例如HeLa細(xì)胞)中產(chǎn)生蛋白質(zhì)的一種通常方法，所述蛋白質(zhì)當(dāng)外部應(yīng)用于細(xì)胞時(shí)對所述細(xì)胞是細(xì)胞毒性的，所述方法包括如下(a)在所述蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下，培養(yǎng)用一種核酸序列轉(zhuǎn)染的一種宿主細(xì)胞，所述核酸序列編碼缺失或沒有功能性分泌信號序列的蛋白質(zhì)，(b)從所述細(xì)胞中回收所述蛋白質(zhì)。
轉(zhuǎn)染細(xì)胞、在細(xì)胞中重組產(chǎn)生蛋白質(zhì)及回收蛋白質(zhì)的方法已經(jīng)在上文加以描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過熟知的方法例如體外誘變方法產(chǎn)生一種核酸序列，所述核酸序列編碼不再從宿主細(xì)胞中分泌的蛋白質(zhì)。確定分泌信號序列的位置(location/position)的方法也為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，例如在參考文獻(xiàn)19-22中所述。
最后，本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，其包含(i)一種核酸分子，優(yōu)選編碼有或無分泌前導(dǎo)序列的蛋白質(zhì)的核酸分子，或者(ii)本發(fā)明的蛋白質(zhì)與一種藥物學(xué)可接受的賦形劑、稀釋劑或者載體的組合，本發(fā)明還涉及所述化合物在制備治療癌癥的藥物組合物中的應(yīng)用。
本領(lǐng)域熟知適宜的藥物載體等，包括磷酸鹽緩沖溶液、水、乳劑如油/水乳劑、各種類型的增濕劑、滅菌溶液等。這種載體可以通過常規(guī)方法配制，并可以以適當(dāng)劑量給予治療對象?？梢酝ㄟ^不同方式給予合適的組合物，例如通過靜脈內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥、皮下給藥、肌內(nèi)給藥、局部給藥或皮內(nèi)給藥。當(dāng)然給藥途徑依賴于腫瘤的性質(zhì)、其位置及藥物組合物中含有的化合物類型。使用的劑量方案由臨床醫(yī)生及其它臨床因素決定。正如醫(yī)學(xué)領(lǐng)域所熟知的，任一患者的使用劑量依賴于許多因素，包括患者的體重、體表面積、年齡、性別、給予的特定化合物、給藥時(shí)間和途徑、腫瘤的性質(zhì)和階段、一般健康狀況及同時(shí)施用的其它藥物。
本發(fā)明核酸分子的輸送可以通過直接應(yīng)用或者優(yōu)選通過使用一種重組表達(dá)載體而實(shí)現(xiàn)，所述重組表達(dá)載體如含有這些化合物的嵌合病毒或者膠體分散系。本發(fā)明核酸分子可以作為膠體分散系例如通過彈道輸送或者通過動脈導(dǎo)管直接應(yīng)用于靶位點(diǎn)。可用于輸送上述核酸分散分子的膠體分散系包括大分子復(fù)合物、毫微囊劑、微球、磁性微球、珠以及基于脂質(zhì)的系統(tǒng)包括水包油乳劑(混合的)、微團(tuán)、脂質(zhì)體和lipoplexes。優(yōu)選的膠體系是脂質(zhì)體。脂質(zhì)體的組合物通常是磷脂和類固醇尤其是膽固醇的組合物。技術(shù)人員能夠選擇適于輸送所希望的核酸分子的脂質(zhì)體?？梢允褂闷鞴偬禺愋曰蚣?xì)胞特異性脂質(zhì)體以輸送至指定的腫瘤。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以應(yīng)用已知的方法進(jìn)行脂質(zhì)體靶向。這種靶向包括被動靶向(例如應(yīng)用脂質(zhì)體的天然趨向性使之分布于含有竇樣毛細(xì)管的器官的RES的細(xì)胞中)或主動靶向(例如通過熟知方法將所述脂質(zhì)體與一特異性配體偶聯(lián)，所述配體為抗體、受體、糖、糖脂、蛋白質(zhì)等)。在本發(fā)明中優(yōu)選使用單克隆抗體通過特異性細(xì)胞表面配體將脂質(zhì)體靶向于特定腫瘤。
用于基因治療的優(yōu)選的重組載體是病毒載體，例如腺病毒、皰疹病毒、牛痘病毒，或者更優(yōu)選的，是一種如逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA病毒。更優(yōu)選所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是鼠或禽類逆轉(zhuǎn)錄病毒的衍生物?？捎糜诒景l(fā)明的這種逆轉(zhuǎn)錄病毒例如是莫洛尼鼠類白血病毒(MoMuLV)、Harvey鼠類肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳癌病毒(MuMTV)及勞氏肉瘤病毒(RSV)。最優(yōu)選地，應(yīng)用一種非人靈長類動物逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，如長臂猿白血病毒(GaLV)，與鼠載體相比提供更廣泛的宿主范圍。由于重組逆轉(zhuǎn)錄病毒是缺陷的，因此需要加以輔助以產(chǎn)生可感染的顆粒。這種輔助可例如通過使用含有編碼在LTR內(nèi)的調(diào)節(jié)序列控制下的逆轉(zhuǎn)錄病毒的所有結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)粒的輔助細(xì)胞系來提供。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知合適的輔助細(xì)胞系。所述載體可額外含有編碼一種可選擇標(biāo)記的一種基因，以便可以鑒別轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。另外，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒可以以使其成為靶向特異性的方式修飾。這可以通過例如插入一種編碼糖、糖脂或蛋白質(zhì)，優(yōu)選一種抗體的多核苷酸而實(shí)現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知產(chǎn)生靶特異性載體的其它的方法。體外或體內(nèi)基因治療的其它合適的載體和方法在文獻(xiàn)中加以描述并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知，例如WO94/29469或WO97/00957。
為實(shí)現(xiàn)僅在靶器官例如所治療的特定腫瘤中表達(dá)，本發(fā)明的核酸分子可以與組織特異性啟動子連接并用于基因治療。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這種啟動子(見例如Zimmermann等(1994)Neuron12，11-24；Vidal等(1990)EMBO J.9，833-840；Mayford等(1995)，細(xì)胞81，891-904；Pinkeret等(1987)，Gene&Dev.1，268-76)。
如下實(shí)施例例證了本發(fā)明。
概括而言，實(shí)施例的結(jié)果支持了先前關(guān)于Aplysia物種產(chǎn)生并分泌高分子量的細(xì)胞毒性物質(zhì)的觀點(diǎn)(5，6)。A.punctata分泌的粘液的蛋白質(zhì)級分當(dāng)加入不依賴于增殖控制活性的細(xì)胞例如培養(yǎng)的細(xì)胞中時(shí)示出細(xì)胞毒性及最終的殺傷活性。這些因子之一已經(jīng)在肽序列水平定性并稱為cyplasin。令人感興趣地，cyplasin示出對培養(yǎng)細(xì)胞的梯度細(xì)胞毒性。其對建立的細(xì)胞系具有高度細(xì)胞毒性，如對神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系和PtK細(xì)胞，以及許多原代腫瘤細(xì)胞如受試的人黑素瘤細(xì)胞具有高度細(xì)胞毒性。人皮膚成纖維細(xì)胞示出顯著的較高耐受性。由于受試的其它腫瘤細(xì)胞也是高度敏感的(未示出)，表明cyplasin對建立的細(xì)胞系及原代腫瘤細(xì)胞尤其具有細(xì)胞毒性。人原代成纖維細(xì)胞的不同應(yīng)答可能由于這些細(xì)胞不能被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞，盡管它們自主生長(17)。因此，cyplasin可用于在生物體中特異性消除非所需的細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞。
這種觀點(diǎn)通過初步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)支持。當(dāng)在正常小鼠中注射時(shí)，甚至當(dāng)使用高濃度cyplasin時(shí)，也未發(fā)現(xiàn)注射的cyplasin有毒性作用。
Cyplasin的天然來源有限，因此其重組產(chǎn)生看起來是其作為抗癌藥物的潛在應(yīng)用的先決條件。在第一個(gè)步驟中，我們尋找一種cDNA，其可以被認(rèn)為編碼表觀分子量為56kDa的蛋白質(zhì)，其已經(jīng)通過生物活性引導(dǎo)測定的分級分離程序分離。使用這種蛋白質(zhì)的亞序列作為探針以及使用常規(guī)的PCR和cDNA克隆技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)有一種以上的A.punctata轉(zhuǎn)錄物包含用作特異性探針的亞序列。在序列水平上可以鑒別編碼具有不同羧基末端的多肽的兩種cDNA。進(jìn)而，當(dāng)基于完整的A.punctata cDNA文庫模板以及適應(yīng)于第一步鑒別的cDNA編碼區(qū)的引物對而制備的PCR產(chǎn)物被克隆時(shí)，各個(gè)cDNA克隆示出略微不同的核苷酸序列。實(shí)際上，迄今為止研究的所有克隆均示出略微不同的核苷酸序列，結(jié)果導(dǎo)致相應(yīng)多肽中一或多個(gè)氨基酸交換。所有這些轉(zhuǎn)錄物均源自A.punctata中不同的基因是非常不可能的。翻譯后加工如可變剪接、差別性聚腺苷酸化及RNA編輯可產(chǎn)生編碼不同多肽的轉(zhuǎn)錄物。
在此階段尚未知在轉(zhuǎn)錄水平鑒別的不同多肽是否均表現(xiàn)相同功能。在這種情況中看起來需要選擇僅僅一種cDNA(編碼稱為cyplasin-L的蛋白質(zhì))，及研究這個(gè)序列是否編碼一種細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)。發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中產(chǎn)生的重組多肽是沒有生物學(xué)活性的。然而，用表達(dá)該選擇的cDNA或者該cDNA與EGFP編碼核苷酸序列的融合體的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞產(chǎn)生一種細(xì)胞毒性因子，其在未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或者在cyplasin-S轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中不存在。用pIZ驅(qū)動的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞(Sf9)變得尤為有用。在這種情況下，可以建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，其能夠制備生物學(xué)活性的EGFP標(biāo)記的cyplasin-L，其數(shù)量足以使重組蛋白的生物學(xué)活性與從A.punctata分泌粘液中生物化學(xué)分離的材料進(jìn)行對比。通過生物化學(xué)分離物及通過重組表達(dá)的蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)的非常相似的形態(tài)學(xué)作用提示所選擇的cDNA是一個(gè)有效克隆，其編碼表現(xiàn)A.punctata的天然(genuine)的cyplasin的細(xì)胞毒性的蛋白質(zhì)。最后，可以示出當(dāng)使用編碼沒有分泌信號序列的蛋白質(zhì)的DNA序列時(shí)，生物學(xué)活性的cyplasin可以在HeLa細(xì)胞中重組產(chǎn)生。獲得了生物活性的重組cyplasin之后，現(xiàn)在可以評價(jià)其潛在的抗腫瘤的治療價(jià)值。
實(shí)施例1材料和方法(A)cyplasin的生物化學(xué)分離海兔A.punctata的蛋白腺的粘液可以在產(chǎn)卵季節(jié)期間當(dāng)它們到達(dá)海岸時(shí)(在大約4月，在約島(Ile d’Yeu))從動物上得到。通過輕輕擠壓動物，排泄出紫色粘液(大約2.5ml)，當(dāng)暴露于空氣中時(shí)形成凝膠。將其立即用磷酸鹽緩沖液(PBS，150mMNaCl，10mM NaH2PO4，pH7.2)稀釋(1∶1，v/v)并在4℃放置。在2-3小時(shí)后，所述混合物成為完全可溶的。隨后通過在10000×g在4℃離心15分鐘以除去碎片。上清可以冷凍并保持在-80℃而不喪失活性。為進(jìn)一步純化，將粘液用1000體積的50mM MOPS，1mM二硫赤蘚糖醇，0.5mMEDTA，5mM KCl，pH7.2在4℃透析24小時(shí)。含有所述細(xì)胞毒活性的蛋白質(zhì)級分通過用硫酸銨分級分離沉淀而分離。在收集的沉淀物中檢測細(xì)胞毒活性分別在33％/50％(沉淀1)和50％/66％(沉淀2)飽和度之間。通常在沉淀1中發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞毒活性。為進(jìn)行細(xì)胞毒性測試，將所述沉淀溶解于300μl PBS中，用上述緩沖液透析。大多數(shù)活性級分包含在SDS-PAGE凝膠上形成一條單帶遷移的蛋白質(zhì)(圖1)。
(B)在細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)的級分中SGDYILIASYAD肽的鑒別用于微量測序程序的材料在包含50mM MOPS，1mM二硫赤蘚糖醇，0.5mM EDTA，5mM KCl，pH7.2的緩沖液中通過凝膠過濾(G-200層析柱，Sigma-Aldrich，Taufkirchen，德國)進(jìn)一步純化。將透析及凍干的流出物進(jìn)行SDS-PAGE并印跡于PVDF膜(ProtoBlot，Applied Biosystems)上。含有令人感興趣的區(qū)域的部分通過WITAGmbH(德國柏林)進(jìn)行的微量測序程序分析。
(C)細(xì)胞毒性測試測試溶解于300μl PBS中的每一沉淀的等分試樣對自主生長細(xì)胞的毒性作用。術(shù)語“自主生長細(xì)胞”用于表示能在體外增殖的所有細(xì)胞，對比與在生物體內(nèi)增殖的細(xì)胞。用袋鼠(rat kangaroo)細(xì)胞系PtK2及人細(xì)胞系HeLa進(jìn)行常規(guī)測試。將細(xì)胞種植于含有500μl培養(yǎng)基/孔的24孔平板中，使用在24小時(shí)后達(dá)到約50％鋪滿的細(xì)胞密度。此時(shí)加入溶解的沉淀的未稀釋等分試樣(5μl)，將平行孔中的細(xì)胞培養(yǎng)物補(bǔ)加系列稀釋液的等分試樣(5μl)。
(D)由天然的cyplasin誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的鑒定經(jīng)cyplasin誘導(dǎo)的死亡的細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變通過光學(xué)顯微鏡記錄。另外通過將cyplasin處理的細(xì)胞與0.5μg/ml非膜通透性化合物H33257(SIGMA-ALDRICH，Taufkirchen，Germany)或者1μg/ml碘化丙啶(Boehringer Ingelheim，Germany)溫育。認(rèn)為核染色是與壞死或者凋亡的最后階段相關(guān)的病理學(xué)通透性改變的指征。為區(qū)分死亡的凋亡形式，將cyplasin處理的細(xì)胞與5μg/ml FITC標(biāo)記的AnnexinV(Boehringer Ingelheim，Germany)在含有Ca2+的緩沖液中溫育20分鐘，使用合適的濾光片通過熒光顯微鏡評價(jià)潛在的磷脂酰絲氨酸-Annexin復(fù)合物的存在情況(8)。作為對照，細(xì)胞凋亡用0.2μg/ml星形孢菌素溫育3小時(shí)誘導(dǎo)，這種處理誘導(dǎo)磷脂酰絲氨酸明顯轉(zhuǎn)位至質(zhì)膜的外表面，因此變得易與FITC-Annexin結(jié)合(9)；另一方面，星形孢菌素的濃度足夠低以防止細(xì)胞核與碘化丙啶的染色平行進(jìn)行。
(E)A.punctata cDNA利用Qiagen RNA分離試劑盒從海兔A.punctata的蛋白腺中分離總RNA。使用Clontech SMART II PCR cDNA合成試劑盒(K1052-1)將100ng總RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA。第一鏈合成使用所述試劑盒中的修飾的寡-dT引發(fā)，用推薦的Rnase H-點(diǎn)突變逆轉(zhuǎn)錄酶(Superscript II，Gibco BRL)進(jìn)行引物延伸。在第一鏈反應(yīng)中包括SMART II寡聚物在5’末端誘導(dǎo)模板開關(guān)。根據(jù)試劑盒使用說明進(jìn)行這些反應(yīng)及利用修飾的寡聚物(dT)和SMART II引物進(jìn)行第一鏈cDNA的PCR擴(kuò)增。
(F)編碼包含肽SGDYILIASYAD的蛋白質(zhì)的cDNA的分子克隆擴(kuò)增的cDNA用作模板，使用相應(yīng)于搜索序列的特異性引物及非特異性引物的組合例如分別為修飾的寡-dT和Smart II進(jìn)行PCR。將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入pBluescript衍生的T突出端載體中并測序。這些序列的真實(shí)性通過用相應(yīng)于特異性SGDYILIASYAD編碼引物上游和下游序列的寡脫氧核苷酸引發(fā)的PCR反應(yīng)證實(shí)。這些探針非依賴性產(chǎn)物含有編碼肽SGDYILIASYAD的核苷酸序列。發(fā)現(xiàn)除了文中所述幾個(gè)堿基交換之外，在SGDYILIASYAD編碼序列上游的序列是單一序列。相反，可以檢測到兩個(gè)3’末端序列長度不同(L和S)。
(G)融合及表達(dá)構(gòu)建體將蛋白質(zhì)編碼部分用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以將合適的限制位點(diǎn)置于擴(kuò)增產(chǎn)物的5’和3’末端。在用相應(yīng)的限制酶消化后，將產(chǎn)物直接克隆入表達(dá)載體pcDNA3(Invitrogen，以在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá))、pQE30(Qiagen，以在大腸桿菌中表達(dá))、pIZ/V5-His(Invitrogen，以在昆蟲細(xì)胞中表達(dá))，或者與在pBluescript載體的XhoI/NotI位點(diǎn)中制備的EGFP編碼的cDNA(Clontech)融合。EGFP標(biāo)記的片段的切除及在pcDNA3載體或pIZ/V5-His載體的合適位點(diǎn)中克隆分別產(chǎn)生相應(yīng)的cyplasin-EGFP表達(dá)構(gòu)建體，分別適于在哺乳動物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞中表達(dá)熒光標(biāo)記的融合蛋白。
(H)轉(zhuǎn)染及重組蛋白質(zhì)表達(dá)將大腸桿菌M15細(xì)胞用在所述載體的His標(biāo)記的讀框中含有cyplasin-L和cyplasin-S編碼插入體的pQE30質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。表達(dá)的His標(biāo)記的蛋白質(zhì)利用Ni-NTA瓊脂糖根據(jù)Qiagen提供的方案分離。將HeLa細(xì)胞利用Effectene轉(zhuǎn)染試劑盒(Qiagen)用含有EGFP-標(biāo)記的或者未標(biāo)記的cyplasin-L和cyplasin-S編碼插入體的pcDNA3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。用含有編碼cyplasin-L或cyplasin-L-EGFP的插入體的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不能長期存活。然而，這種培養(yǎng)物的上清含有文中所述細(xì)胞毒性因子。將SF9細(xì)胞使用另外的Effectene轉(zhuǎn)染試劑盒(Qiagen)用含有EGFP標(biāo)記的或未標(biāo)記的cyplasin-L編碼插入體的pIZ/V5-His質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。與哺乳動物細(xì)胞相反，轉(zhuǎn)染的昆蟲細(xì)胞存活。表達(dá)之后通過熒光顯微鏡觀測存活細(xì)胞或者測試胞質(zhì)提取物的細(xì)胞毒性因子的存在情況。
(I)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SF9細(xì)胞以大規(guī)模生產(chǎn)cyplasin-L-EGFP將用質(zhì)粒pIZ/V5-His-cyplasin-L-EGFP轉(zhuǎn)染的SF9細(xì)胞在26℃在補(bǔ)加10％胎牛血清、5mM Glutamax(LIFE Technologies，Karlsruhe，Germany)和100μg/ml zeocin(Invitrogen，Groningen，The Netherlands)的TNM-FH昆蟲培養(yǎng)基(Applichem，Darmstadt，Germany)中作為半貼壁細(xì)胞生長3個(gè)月。將細(xì)胞培養(yǎng)物間隔4天以1∶3稀釋。初始的轉(zhuǎn)染效率未大約10％，在3個(gè)月之后5％的細(xì)胞保持熒光。認(rèn)為后者是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的。將這部分細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀(Beckton-Dickinson)分離。在4周后進(jìn)行的第二次分選之后，可以將所得培養(yǎng)物以幾升規(guī)模旋動培養(yǎng)生長，90％的這些細(xì)胞表達(dá)cyplasin-L-EGFP融合蛋白。
(J)從穩(wěn)定表達(dá)cyplasin-L-EGFP的SF9細(xì)胞中回收細(xì)胞毒性因子EGFP-標(biāo)記的cyplasin-L不是分泌入SF9的培養(yǎng)基中。通常地，將1-2×108穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Sf9細(xì)胞懸浮及離心(1000×g，3分鐘)而洗滌，一次在PBS中，一次在50mM MES、lmM EDTA、5mM KCl、0.1％巰基乙醇，pH6.0中。將它們在5ml的后一緩沖液中勻漿。勻漿及隨后的步驟均在4℃進(jìn)行。在純化步驟中使用蛋白酶抑制劑混合物(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)。將所述勻漿離心(100000×g，60分鐘)，將上清用于已經(jīng)用上述緩沖液平衡的DEAE-Cellulose柱(DE52，Sigma Aldrich，Taufkirchen，Germany)中。將該柱使用用于平衡的緩沖液充分洗滌，隨后應(yīng)用NaCl梯度(0-200mM)洗滌。將100μl每個(gè)級分加入到500μl培養(yǎng)基中生長的指示細(xì)胞(PtK)中，測試洗脫的級分中所述細(xì)胞毒性因子的存在情況。如果存在所述細(xì)胞毒性因子，則在大約5小時(shí)后觀測到細(xì)胞毒性作用。含有所述因子的級分在60和80mM NaCl之間洗脫。認(rèn)為具有這些特性的級分是“標(biāo)準(zhǔn)”提取物，并用于其它生物學(xué)測試中，例如在圖5所述那些測試。
(K)分離自穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SF9細(xì)胞的細(xì)胞毒性提取物中cyplasin-L-EGFP的鑒別將如上所述分離的并具有細(xì)胞毒性活性的蛋白質(zhì)級分濃縮，通過12.5％SDS-PAGE分離。在同一凝膠上分離兩個(gè)相同的樣品(包括一種蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物)。將一部分凝膠使用銀染程序染色，另一部分電印跡(半干印跡設(shè)備，Biometra，Gottingen，Germany)到PVDF轉(zhuǎn)移膜(Western，Schleicher&Schuell，Dassel，Germany)上。緩沖液成分為3.03g硼酸、200ml甲醇、800ml H2O，pH9.0。在用BLOTTO封閉后(10)，將該膜與含有0.1％BSA、1∶2000稀釋的抗GFP抗體(ABCAM，Cambridge，U.K.)，pH7.2的PBS中溫育3小時(shí)。在PBS中延長漂洗后，利用一種堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗兔抗體(Dianova，Hamburg，Germany)進(jìn)行免疫檢測，所述抗體在26℃，以在含有0.1％BSA的PBS，pH7.2中1∶12000稀釋液應(yīng)用3小時(shí)。將印跡在PBS中漂洗并置于由100mM TRIS、5mM MgCl2、0.3mg/ml硝基四氮唑藍(lán)、0.15mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽，pH9.5組成的染色溶液中。
(L)動物實(shí)驗(yàn)將DBA2小鼠在尾靜脈(1組)或皮下(2組)注射300μl(10μM)天然的cyplasin。Cyplasin已經(jīng)先在4℃用大體積的PBS透析24小時(shí)，并在立即注射之前通過將PtK細(xì)胞與10nM cyplasin溫育測試陽性細(xì)胞毒性。重組cyplasin也用PBS透析，也在注射之前測試確定的細(xì)胞毒性，并將300μl注射入尾靜脈中。將小鼠在標(biāo)準(zhǔn)條件下維持并觀測4周。
(M)用于大規(guī)模生產(chǎn)無分泌信號序列的cyplasin-L-EGFP的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞在用相應(yīng)限制酶消化之后，將cyplasin L-(-Sig.Seq)編碼cDNA與在pBluescript載體的XhoI/NotI位點(diǎn)制備的EGFP編碼cDNA(Clontech，Heidelberg，Germany)融合。切除EGFP-標(biāo)記的片段并再克隆入pcDNA3載體(Invitrogen)的合適位點(diǎn)中，導(dǎo)致在哺乳動物細(xì)胞中熒光標(biāo)記的融合蛋白的相應(yīng)Cyplasin-L-(-Sig.Seq)-EGFP表達(dá)。使用G-418-硫酸鹽抗性選擇成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
(N)其它方法利用HUSAR程序包(DKFZ)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫查詢和序列分析，所述程序包是基于GCG公司(Madsion，WI.，美國)開發(fā)的GCG程序包的序列分析工具的集合。為鑒別所述分泌信號序列，我們應(yīng)用McGeoch掃描程序(11)。利用373A型自動DNA測序儀(AppliedBiosystems)由A.Hunziker(德國癌癥研究中心)進(jìn)行DNA測序。
實(shí)施例2cyplasin編碼cDNA的分子克隆從A.punctata的蛋白腺的RNA中制備的cDNA包含一個(gè)以上的編碼肽SGDYILIASYAD的轉(zhuǎn)錄物?？寺【幋a羧基末端部分顯著不同但均包含靶序列的蛋白質(zhì)的兩個(gè)cDNA(圖2)。這些cDNA之一編碼具有558個(gè)氨基酸殘基分子量為62.4kDa的蛋白質(zhì)(稱為cyplasin-L)，而另一個(gè)cDNA反映一個(gè)編碼較短的蛋白質(zhì)(421個(gè)氨基酸殘基，分子量為46.9kDa，稱為cyplasin-S)的轉(zhuǎn)錄物。另外，用cyplasin-L特異性引物對對總cDNA進(jìn)行PCR產(chǎn)生序列與分別編碼cyplasin-L和cyplasin-S的那些序列不同的DNA片段。因此，看起來存在一些既與cyplasin-L不同又與cyplasin-S不同的mRNA。這些序列的微不均一性提示A.punctata產(chǎn)生未知數(shù)目的非常相似但不是100％相同的包含靶序列的蛋白質(zhì)?；诳衫玫臄?shù)據(jù)不能確定這些不同的mRNA和蛋白質(zhì)是否例如通過可變剪接與RNA編輯組合而衍生自單個(gè)基因，或者是否存在非常相似但不是100％相同的一簇基因。
實(shí)施例3由克隆的cDNA編碼的蛋白質(zhì)cyplasin-L和cyplasin-S的序列特征生物化學(xué)數(shù)據(jù)(未示出)提示天然發(fā)生的cyplasin是一種糖蛋白。Cyplasin-L cDNA衍生的氨基酸序列包含5個(gè)在氨基酸位置N-151、N-271、N-401、N-416和N-422的Asn連接(N-X-S或N-X-T)的糖基化位點(diǎn)，這與所述生物化學(xué)數(shù)據(jù)一致。糖基化位點(diǎn)1-4在衍生自cyplasin-S cDNA的多肽中不發(fā)生變化，而N-422位在較短的序列中缺失。
N末端以高概率的疏水性分泌信號序列開始，推定的切割位點(diǎn)在氨基酸位置52(Ser)和53(Ala)之間。因此，成熟的及具有期望功能的蛋白質(zhì)的分子量分別為57.2kDa和41.6kDa。這些成熟蛋白質(zhì)的計(jì)算等電點(diǎn)為cyplasin-L是5.54(電荷-13)，cyplasin-S是6.20(電荷-5)數(shù)據(jù)庫查詢核苷酸序列揭示與兩個(gè)其它Aplysia序列的相似性，所述兩個(gè)其它Aplysia序列即編碼aplysianin-A前體的A.kurodai蛋白腺mRNA((12)，70.9％相同性，D83255)及編碼achacin的A.fulicaFerussac mRNA((7)，52.2％相同性，X64584)。數(shù)據(jù)庫查詢cyplasin亞序列揭示出上述Aplysia物種的一些氨基酸序列及許多具有較長一串局部相同性或同源性的蛋白質(zhì)序列。后面的這些序列均屬于單胺氧化酶類別。表1示出具有真核及原核單胺氧化酶亞序列的一個(gè)顯著的cyplasin肽串。令人感興趣地注意到數(shù)據(jù)庫查詢這個(gè)及其它c(diǎn)yplasin典型序列揭示與其它類別的蛋白質(zhì)無明顯一致。
表1數(shù)據(jù)庫查詢pCyplasin衍生的氨基酸序列產(chǎn)生多個(gè)反映單胺氧化酶的序列的查詢結(jié)果序列 準(zhǔn)入號no 生物體-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------62 NIGVFEFCDRVGGRLFT 78 Cyplasin A.punctata+ V E DRVGGR FTI51346Rainbow trout+ V E +RVGGR +TOXLA_CROADCrotalusN+ V E +RVGGR +TAOFA_BOVINBovin++ V E D VGGR +TAOFB_RAT Rat++ V E DRVGGR +TAOFA_HUMANHumanN+ V E DRVGGR +TAOFB_HUMANHuman++ FE +RVGGR+F+T08202Prokaryotic+FE DR+GGR+++T22714Prokaryotic+ VFE DRVGGR TAOFH_MYCTUProkaryotic++ +FE +VGGR TTR2M_AGRVIProkaryotic++ V+E DR+GG+L++TR2M_AGRRAProkaryotic++ ++E DRVGG+L++A20966Prokaryotic+ + E R GGR+ TE69899Prokaryotic++ ++E DRVGG+L++TR2M_AGRT3Prokaryotic+ V E DRVGGR ++PUO_MICRU Prokaryotic實(shí)施例4生物學(xué)失活的重組體在大腸桿菌中的表達(dá)Cyplasin編碼cDNA序列在pQE/大腸桿菌M15系統(tǒng)中的重組表達(dá)產(chǎn)生完全不溶解于不含去污劑的緩沖液的多肽，當(dāng)這種重組表達(dá)的多肽的懸浮液與培養(yǎng)的細(xì)胞一起溫育時(shí)不能發(fā)揮任何細(xì)胞毒性作用(未示出)。這種無細(xì)胞毒活性推測是由于在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)的多肽的不正確折疊和/或缺乏翻譯后修飾所致。
實(shí)施例5在哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生生物活性的重組體相反，哺乳動物細(xì)胞例如HeLa S3懸浮細(xì)胞，當(dāng)用指定的cyplasin-L或EGFP-標(biāo)記的cyplasin-L的CMV載體驅(qū)動的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染時(shí)，產(chǎn)生一種細(xì)胞毒性因子。這個(gè)因子在未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)物中或在用表達(dá)cyplasin-S的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)物中檢測不到。所述細(xì)胞毒性因子的產(chǎn)生很明顯，因?yàn)楫a(chǎn)生因子的培養(yǎng)物中的所有細(xì)胞最后均以典型方式死亡，這在用分離自A.punctata的粘液中的天然的cyplasin處理哺乳動物細(xì)胞時(shí)觀測到的方式相一致。因?yàn)樵谶@種培養(yǎng)物中只有一部分細(xì)胞被轉(zhuǎn)染，隨后所述細(xì)胞毒性因子必須從生產(chǎn)細(xì)胞中釋放，結(jié)果生產(chǎn)和非生產(chǎn)細(xì)胞均死亡。細(xì)胞毒性因子的釋放與在cDNA衍生的氨基酸序列的氨基末端的推定的分泌信號非常一致(圖2)。
盡管這種自身破壞系統(tǒng)不適于產(chǎn)生顯著量的生物活性重組體，但其揭示了cDNA克隆方案的有效性，以及表明由具有較長插入體的cDNA編碼的因子示出cyplasin的典型特征。
實(shí)施例6生物活性cyplasin-L和cyplasin-L-EGFP在昆蟲細(xì)胞中的重組表達(dá)已知昆蟲細(xì)胞(例如Sf9)能進(jìn)行與哺乳動物細(xì)胞相似的翻譯后修飾。由于Sf9細(xì)胞被證實(shí)對天然的cyplasin制品的敏感性更低(未示出)，因此它們尤為適于生產(chǎn)進(jìn)行生物學(xué)測試足夠量的重組cyplasin。用表達(dá)cyplasin-L或EGFP標(biāo)記的cyplasin-L的pIZ載體驅(qū)動的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染SF9細(xì)胞不能影響SF9細(xì)胞的增殖速度。另外，用cyplasin指定的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的SF9細(xì)胞的用過的培養(yǎng)基含有針對哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物的顯著的細(xì)胞毒性活性，其示出cyplasin-L的分泌信號在昆蟲細(xì)胞中也起作用。
相反，從用EGFP標(biāo)記的cyplasin-L指定的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的SF9細(xì)胞中無細(xì)胞毒性因子釋放。所述cyplasin-L-EGFP融合蛋白在SF9細(xì)胞中明顯表達(dá)，這也通過EGFP依賴性熒光示出(圖3)，但在用過的旋動培養(yǎng)的培養(yǎng)基中未檢測到足夠量的細(xì)胞毒性因子。令人感興趣地，圖4中示出的Western印跡表明所述融合蛋白的cyplasin-L部分中缺失信號序列。這個(gè)切割必須以截短的融合蛋白保留細(xì)胞溶質(zhì)的方式發(fā)生。或者，假定從ER向胞質(zhì)逆向運(yùn)輸。這種逆向運(yùn)輸先前在其它系統(tǒng)中已經(jīng)觀測到(13，14，15，16)。
然而，當(dāng)與EGFP融合時(shí)重組表達(dá)的截短的cyplasin-L的細(xì)胞毒活性仍保留。發(fā)現(xiàn)勻漿的表達(dá)cyplasin-L-EGFP的SF9細(xì)胞的高速上清含有對培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞具有細(xì)胞毒性的因子。結(jié)果，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的表達(dá)cyplasin-L-EGFP的Sf9細(xì)胞系通過流式細(xì)胞儀(FACS)分選產(chǎn)生，這種培養(yǎng)物的高速上清部分含有所述cyplasin-L-EGFP融合蛋白(圖4)并表現(xiàn)圖5所示生物學(xué)活性。
實(shí)施例7cyplasin依賴性細(xì)胞毒性的特點(diǎn)正在增殖的哺乳動物細(xì)胞當(dāng)用經(jīng)生物化學(xué)方法從A.punctata中分離的天然的cyplasin處理時(shí)表現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴性的形態(tài)學(xué)改變(圖5)。天然的cyplasin的細(xì)胞毒性作用在例如PtK細(xì)胞中在少于1小時(shí)在50nM變得可觀測到。就此細(xì)胞系而言，最小細(xì)胞毒性cyplasin濃度為2nM，然而在此濃度所述細(xì)胞毒性作用在24小時(shí)之后看起來最明顯。一旦誘導(dǎo)，則cyplasin作用不可逆，而且甚至將含有cyplasin的培養(yǎng)基置換為新鮮培養(yǎng)基時(shí)也可觀測到細(xì)胞死亡。其它培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞示出較低(人皮膚成纖維細(xì)胞)或者甚至較高的敏感性(人黑素瘤細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)(圖5)。
Cyplasin誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的形態(tài)學(xué)時(shí)特異性的。細(xì)胞如果以單層或成群生長則從基層脫離，皺縮并彼此分離，有時(shí)候出現(xiàn)許多小漿泡。這種類型的形態(tài)學(xué)改變在經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞中也觀測到，但是缺失凋亡的典型指征，包括細(xì)胞核斷裂而且外膜上磷脂酰絲氨酸的暴露(圖6)。
另外，cyplasin只對分裂間期的細(xì)胞發(fā)揮其細(xì)胞毒性作用。在當(dāng)同一培養(yǎng)基中大多數(shù)分裂間期的細(xì)胞已經(jīng)示出cyplasin典型形態(tài)學(xué)變化時(shí)，有絲分裂的細(xì)胞仍能完成分裂后期和胞質(zhì)分裂(圖7)。然而，在完成有絲分裂之后，當(dāng)再進(jìn)入分裂間期時(shí)這些細(xì)胞也死亡。細(xì)胞通透性和微管骨架及細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平均不受cyplasin影響(未示出)。
實(shí)施例8生物活性的重組cyplasin-L-EGFP的評價(jià)生物化學(xué)分離的天然的cyplasin與重組cyplasin-L-EGFP的徹底并排對比遇見的問題是所述重組體目前僅在豐富的提取物水平才可獲得。盡管提取物數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，但顯然從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SF9細(xì)胞中提取的cyplasin-L-EGFP表現(xiàn)與通過生物化學(xué)分離的天然的cyplasin誘導(dǎo)的非常相似的細(xì)胞毒活性。圖5并列示出天然的cyplasin和重組cyplasin-L-EGFP對四種不同的細(xì)胞系的作用，所述細(xì)胞系確定對天然的cyplasin具有不同敏感性。使用從表達(dá)cyplasin-L-EGFP的SF9細(xì)胞中提取的常量提取物，顯而易見人皮膚成纖維細(xì)胞(HSF)對重組cyplasin-L-EGFP相對不敏感，其對生物化學(xué)分離的天然的cyplasin也如此。當(dāng)用天然的cyplasin(50nM)或含有cyplasin-L-EGFP的標(biāo)準(zhǔn)提取物處理時(shí)，這些細(xì)胞僅示出略微開始收縮及微弱的皺縮趨向。最后，這些細(xì)胞恢復(fù)并持續(xù)增殖。HSF細(xì)胞的死亡僅在100nM濃度的cyplasin觀測到(未示出)。相反，衍生自人黑素瘤活檢組織的細(xì)胞當(dāng)與天然的cyplasin(20nM)及與標(biāo)準(zhǔn)提取物溫育時(shí)表現(xiàn)顯著較高的敏感性。用天然的cyplasin或者用重組cyplasin-L-EGFP處理的黑素瘤細(xì)胞示出典型的cyplasin誘導(dǎo)的收縮、液泡形成及最后細(xì)胞死亡。這個(gè)圖的其它部分示出衍生自大鼠胚胎皮層的建立細(xì)胞系的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。這些細(xì)胞在目前研究的所有細(xì)胞中表現(xiàn)最高的cyplasin敏感性。典型的cyplasin作用在低如0.2nM的濃度觀測到，在5小時(shí)的觀測期間內(nèi)觀測到細(xì)胞完全死亡。大袋鼠品系PtK的細(xì)胞與2nM天然的cyplasin溫育5小時(shí)后在5小時(shí)內(nèi)不可逆轉(zhuǎn)地?fù)p害。在用標(biāo)準(zhǔn)提取物處理后觀測到相似的作用。這些細(xì)胞中顯著的漿泡和膜改變由天然的cyplasin以及由重組cyplasin-L-EGFP誘導(dǎo)。
概括而言，這些結(jié)果示出分子克隆方案揭示了一種cDNA，其編碼表現(xiàn)與在A.punctata的分泌粘液中檢測的細(xì)胞毒性相似活性的因子，所述重組蛋白質(zhì)的細(xì)胞毒性作用沒有因與EGFP的融合而喪失。
實(shí)施例9cyplasin作用的靶位點(diǎn)目前還未證實(shí)cyplasin及重組cyplasin的細(xì)胞毒性作用的精確機(jī)制。然而，細(xì)胞吸收這種大小的蛋白質(zhì)繼而發(fā)揮負(fù)性細(xì)胞內(nèi)的影響是不太可能的。對cyplasin處理的細(xì)胞進(jìn)行長期觀測表明細(xì)胞毒性作用的第一個(gè)跡象發(fā)生在細(xì)胞膜外，此時(shí)內(nèi)部細(xì)胞形態(tài)無異常表現(xiàn)。這個(gè)觀測結(jié)果提示cyplasin停靠于細(xì)胞膜外觸發(fā)一系列仍未知的事件，最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這個(gè)觀點(diǎn)也與其它觀察結(jié)果一致。用cyplasin-L或EGFP標(biāo)記的cyplasin-L的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的哺乳動物細(xì)胞最初存活，它們能產(chǎn)生所述細(xì)胞毒性因子。然而，一旦所述細(xì)胞毒性因子在用過的培養(yǎng)基中可檢測到，則它們表現(xiàn)改變的形態(tài)。這個(gè)結(jié)果提示胞外cyplasin是細(xì)胞毒性的，而胞內(nèi)cyplasin則是非毒性的。最后，用自穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SF9細(xì)胞中提取的cyplasin-L-EGFP融合蛋白處理的哺乳動物細(xì)胞變?yōu)榄h(huán)繞有一圈微弱的熒光融合蛋白，所述細(xì)胞隨后特征性收縮及皺縮。
實(shí)施例10cyplasin沒有體內(nèi)毒性為測試cyplasin在體內(nèi)是否也示出細(xì)胞毒性作用，將天然的cyplasin或重組cyplasin注射入三組小鼠中。1組由12只DBA2小鼠組成，在其尾靜脈中注射高濃度的cyplasin。所使用的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過發(fā)現(xiàn)在體外有毒性的濃度。然而，所有小鼠均存活至少達(dá)到4周。當(dāng)在第2組中對12只小鼠在相同條件下皮下注射cyplasin時(shí)，獲得相同結(jié)果。它們均存活而且在觀測期間未發(fā)現(xiàn)有負(fù)性作用。最后，為第3組(6只小鼠)經(jīng)尾靜脈注射重組的cyplasin。同樣，所有小鼠均存活。
實(shí)施例11在HeLa細(xì)胞中無分泌前導(dǎo)序列的重組cyplasin產(chǎn)生Cyplasin如果是分泌的則對宿主細(xì)胞是細(xì)胞毒性的。因此，現(xiàn)在研究這個(gè)問題是否可以通過使用在人細(xì)胞中重組產(chǎn)生cyplasin而克服，產(chǎn)生編碼沒有分泌信號序列的cyplasin的一種DNA。使用“信號P程序”(19-22)分析cyplasin的氨基酸序列(圖2)。在所述氨基酸序列的N末端部分發(fā)現(xiàn)信號序列的兩個(gè)潛在的剪切位點(diǎn)，其使cyplasin定性為分泌的蛋白質(zhì)(見圖10)。推定的剪切位點(diǎn)在氨基酸位置19和20之間(最高概率)或者52和53之間(較低概率)。為保證除去完全的信號序列，將編碼從氨基酸位置1-52的信號肽的DNA序列從上述實(shí)施例1(F，G)所述cyplasin編碼質(zhì)粒的插入體中除去。將包含EGFP標(biāo)記的修飾的DNA序列在pcDNA3載體的合適位點(diǎn)克隆，產(chǎn)生相應(yīng)的cyplasin-L-(Sig-Seq)-EGFP表達(dá)構(gòu)建體。然后用此構(gòu)建體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。為鑒別轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，使該構(gòu)建體另外能表達(dá)作為標(biāo)記的編碼綠色熒光蛋白(GFP)的基因。在使用抗生素G418-硫酸鹽正確選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞之后及將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)幾周以選擇載體穩(wěn)定整合入其基因組中的轉(zhuǎn)化體之后，進(jìn)行單一細(xì)胞克隆。如圖12所示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)cyplasin。Cyplasin如實(shí)施例1(J，K)所述分離，使用實(shí)施例1(C，D)所述方法可以示出其與分離自Aplysia punctata的天然cyplasin表現(xiàn)相同的細(xì)胞毒活性。
含有無信號序列的cyplasin的編碼序列的質(zhì)粒(pcDNA3-Cytoplasin.Mut-(-Sig.Seq)-EGFP)，根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2002年8月22日保藏在DSMZ(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen Gmbh，Mascheroder Weg 2，Braunschweig，Germany)。
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權(quán)利要求
1.一種分離的核酸分子，其編碼具有缺失的或無功能的分泌信號序列的蛋白質(zhì)cyplasin或者表現(xiàn)其生物學(xué)性質(zhì)的蛋白質(zhì)，所述核酸分子選自如下一組(a)編碼包含圖2(a)所示從第20位或第53位至第558位的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的一種核酸分子；(b)包含圖2(b)所示序列的一種核酸分子；(c)一種核酸分子，其核酸序列由于遺傳密碼簡并而衍生自(a)或(b)中所述核酸序列；(d)一種核酸分子，其代表(a)、(b)或(c)中所述核酸序列的片段、衍生物或者等位基因變體。
2.一種重組載體，其含有權(quán)利要求1的核酸分子。
3.權(quán)利要求2的重組載體，其中所述核酸分子可操作性地與調(diào)節(jié)元件連接，使得可以在原核和/或真核宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄及合成一種可翻譯的RNA。
4.一種重組的宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求2或3的重組載體。
5.權(quán)利要求4的重組宿主細(xì)胞，其是哺乳動物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或酵母細(xì)胞。
6.一種分離的蛋白質(zhì)，其表現(xiàn)權(quán)利要求1的核酸分子編碼的cyplasin的生物學(xué)性質(zhì)。
7.一種生產(chǎn)表現(xiàn)cyplasin生物學(xué)性質(zhì)的蛋白質(zhì)的方法，包括如下步驟(a)在使所述蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求4的重組宿主細(xì)胞；(b)回收所述蛋白質(zhì)。
8.一種在真核宿主細(xì)胞中生產(chǎn)一種蛋白質(zhì)的方法，當(dāng)所述蛋白質(zhì)中從所述細(xì)胞中分泌或者從外部施用時(shí)對所述細(xì)胞有細(xì)胞毒性，所述方法包括如下步驟(a)在使所述蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下培養(yǎng)用編碼具有缺失或無功能的分泌信號序列的所述蛋白質(zhì)的核酸序列轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，；(b)回收所述蛋白質(zhì)。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述真核細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。
10.通過權(quán)利要求7或8的方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)。
11.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1的核酸分子或者權(quán)利要求6或10的蛋白質(zhì)。
12.權(quán)利要求1的核酸或者權(quán)利要求6或10的蛋白質(zhì)在制備治療癌癥的藥物組合物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明描述了編碼稱為“cyplasin”的蛋白質(zhì)的一種核酸，cyplasin示出對自主生長的哺乳動物細(xì)胞的優(yōu)先毒性。由這種蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡與凋亡和壞死均不同。在細(xì)胞培養(yǎng)物中重組制備cyplasin時(shí)發(fā)生的胞內(nèi)細(xì)胞死亡可以通過除去cyplasin序列中的分泌信號而避免。這種修飾使得可以在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)cyplasin，這對于所獲得的蛋白質(zhì)的糖基化模式是優(yōu)選的。因此，本發(fā)明還涉及一種在真核細(xì)胞、優(yōu)選在哺乳動物細(xì)胞中重組生產(chǎn)一種蛋白質(zhì)的方法，所述蛋白質(zhì)當(dāng)從外部施用時(shí)對所述細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。
文檔編號A61K38/00GK1622956SQ02828469
公開日2005年6月1日 申請日期2002年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月7日
發(fā)明者克里斯蒂安·佩策爾特 申請人:克里斯蒂安·佩策爾特