專利名稱：選擇性地與p-選擇蛋白結(jié)合的肽化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及選擇性地與粘著分子人P-選擇蛋白結(jié)合的化合物，這些化合物的制備方法，這些化合物在治療或診斷方法以及在藥物組合物中的用途，編碼含有所述化合物的氨基酸序列的蛋白質(zhì)材料的核酸，包含這些核酸的基因送遞載體，與所述化合物結(jié)合的結(jié)合分子，和一種測定化合物是否能夠與P-選擇蛋白結(jié)合的方法。
背景技術(shù)：
近年來，細(xì)胞表面的粘著分子已被公認(rèn)為是許多細(xì)胞過程(包括細(xì)胞生長、分化、免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)移遷移和應(yīng)答，以及癌轉(zhuǎn)移)中的關(guān)鍵介質(zhì)。已鑒定了4大類的粘著分子免疫球蛋白超家族細(xì)胞粘著分子(CAMs)、鈣粘著蛋白、整聯(lián)蛋白和選擇蛋白。選擇蛋白代表了一類目前3個跨膜、結(jié)合碳水化合物的糖蛋白“內(nèi)皮”E-選擇蛋白、“白細(xì)胞”L-選擇蛋白和“血小板”P-選擇蛋白。所有這3個選擇蛋白都是二價陽離子(例如鈣)依賴性的并且具有帶碳水化合物識別基序(一種表皮生長因子樣基序)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，以及一些較小且與補體調(diào)節(jié)蛋白有關(guān)的結(jié)構(gòu)域。
人P-選擇蛋白(也稱之為GMP-140、LECAM-3、PADGEM、CD62、CD62P)是由血小板和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的。當(dāng)在這些細(xì)胞的表面上表達(dá)時，其最顯著的作用是在白細(xì)胞離開毛細(xì)管并進(jìn)入毛細(xì)血管后小靜脈時減慢這些白細(xì)胞，后者代表了白細(xì)胞-內(nèi)皮粘著的主要部位。這種減慢過程被觀察為白細(xì)胞滾動，表示最初粘著的親和力相對低。滾動白細(xì)胞的牢固粘著主要是通過整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的。
在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，P-選擇蛋白貯存在懷布爾-帕拉德體上；在血小板中，以α-顆粒找到。激活之后，P-選擇蛋白響應(yīng)多種炎性或血栓形成劑而在幾分鐘內(nèi)動員到細(xì)胞表面。內(nèi)皮P-選擇蛋白的主要功能是將白細(xì)胞募集到毛細(xì)血管后小靜脈內(nèi)，而血小板P-選擇蛋白還導(dǎo)致形成血栓。目前已知的P-選擇蛋白的一個天然配體是PSGL-1(P-選擇蛋白糖蛋白配體-1)，它是一個160kDa唾液蛋白，在白細(xì)胞表面上表達(dá)，在那里在尾肢濃縮。對p-選擇蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的更詳細(xì)描述在許多文獻(xiàn)中可以找到，例如J.Panes，Pathophysiology 5，271(1999)；F.Chamoun等人，F(xiàn)rontiers in Bioscience 5，e103(2000年11月1日)；S.-I.Hayachi，Circulation 102，1710(2000)。
P-選擇蛋白還表現(xiàn)出更直接地參與血小板聚集，如最近對P-選擇蛋白與3-硫酸化的半乳糖苷神經(jīng)酰胺(也稱之為硫苷脂)的Ca-非依賴性相互作用的研究中所示的。這種相互作用可能在P-選擇蛋白的不同結(jié)合部位發(fā)生，因為這種結(jié)合可以受到抗體WASP12.2的抑制，但是不受AK4的抑制，而天然P-選擇蛋白配體PSGL-1(其參與白細(xì)胞粘著)的結(jié)合既受到WASP12.2的阻斷也受到AK4的阻斷。然而，似乎結(jié)合部位是重疊的。假設(shè)硫苷脂相互作用穩(wěn)定血小板聚集物。
炎癥和炎癥性過程在許多疾病和病癥的病理生理學(xué)中起著重要作用。發(fā)現(xiàn)其中選擇蛋白水平增加并且因此可能涉及選擇蛋白-介導(dǎo)的病理生理學(xué)事件的腦病癥包括嚴(yán)重外傷性腦損傷、復(fù)發(fā)-緩解的多發(fā)性硬化癥、腦動脈閉塞、局部缺血和中風(fēng)。提示選擇蛋白在其中起作用的心臟病癥包括急性心肌梗塞、動脈損傷，例如因血管成形術(shù)產(chǎn)生的，以及局部缺血。類似地，選擇蛋白在腎病癥中涉及，例如因局部缺血和再灌注引起的腎損傷，和腎衰竭。而且，選擇蛋白表現(xiàn)出在器官移植排斥、冷缺血、出血性休克、敗血癥性休克、腫瘤轉(zhuǎn)移、慢性炎癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、動脈粥樣硬化、再狹窄、血管生成、播散性血管內(nèi)凝血、成人呼吸窘迫綜合征和循環(huán)休克中起作用。
因此，通過特異性地打斷P-選擇蛋白級聯(lián)來改善涉及激活內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞特別是P-選擇蛋白動員和表達(dá)的這些和其他病癥似乎是可行的?？梢赃@樣實現(xiàn)，例如通過給予與人P-選擇蛋白選擇性地結(jié)合但是不具有其生物活性的配體。通過這種方法，可以使動員的P-選擇蛋白失活并防止白細(xì)胞-誘導(dǎo)的組織損傷。潛在地，通過基因治療可以獲得相同的效果，條件是P-選擇蛋白配體或拮抗劑是一種肽或者經(jīng)修飾的肽，根據(jù)該方法，需要這種治療的人的體細(xì)胞將用載有編碼P-選擇蛋白拮抗劑的DNA序列的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
P-選擇蛋白配體或拮抗劑也可用于預(yù)防上述疾病和病癥。而且，這些配體也可用于在體內(nèi)或體外診斷這些疾病。
近年進(jìn)行了許多嘗試來鑒定或創(chuàng)建這些P-選擇蛋白的選擇性配體。迄今為止，測定了許多物質(zhì)，但是還沒有臨床研究得出結(jié)論性證據(jù)證實任何這些化合物產(chǎn)生所需的臨床效果而在副作用方面可以耐受。
例如，在動物模型中產(chǎn)生并測定的P-選擇蛋白的抗體，發(fā)現(xiàn)它可保護(hù)腎免受缺血-再灌注損傷(H.C.Rabb等人，JASN 5，907，1997；US-A-6,033,667)。在另一研究中，使用重組可溶形式的P-選擇蛋白糖蛋白配體-1(rPSGL-Ig)抑制貓中的血栓形成(M.J.Eppihimer等人，Arteriosclerosis，Thrombosis，and Vascular Biology 20，2483，2000)。
WO-A-96/09309公開了為E-和P-選擇蛋白的配體的寡糖結(jié)構(gòu)。
WO-A-99/41363公開了與選擇蛋白結(jié)合的足糖萼蛋白樣蛋白質(zhì)。
WO-A-00/41711描述了多種較小的肽或肽序列，它們與人選擇蛋白家族的成員結(jié)合；這些序列中的大多數(shù)包括一個或多個亮氨酸或異亮氨酸單元。
作為抑制P-選擇蛋白級聯(lián)的另一種方法，發(fā)現(xiàn)得自選擇蛋白家族的凝集素結(jié)構(gòu)域的多種肽抑制嗜中性粒細(xì)胞與P-選擇蛋白粘著(例如US-A-6,111,065和US-A-5,916,876)；這些肽可能與白細(xì)胞上的P-選擇蛋白受體結(jié)合。
在WO-A-94/05269中，描述了抑制選擇蛋白如P-選擇蛋白、E-選擇蛋白和L-選擇蛋白結(jié)合的肽。這些肽具有P-選擇蛋白、E-選擇蛋白或L-選擇蛋白的11-18個氨基酸序列的部分作為其核心區(qū)域。而且，WO-A-95/31210涉及結(jié)合選擇蛋白(包括內(nèi)皮白細(xì)胞粘著分子1(ELAM-1))的肽和化合物。為了抑制炎癥的目的，將這些肽用于阻斷白細(xì)胞與選擇蛋白即特別是E-選擇蛋白但是也包括與P-選擇蛋白或L-選擇蛋白粘著。
盡管進(jìn)行了這些嘗試，但是仍然需要對P-選擇蛋白具有選擇性親和力的物質(zhì)，所述物質(zhì)可用于制備診斷、預(yù)防和治療涉及白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞或者與血小板粘著的多種疾病和病癥用的藥物組合物。還需要P-選擇蛋白配體，它可用作藥物組合物中的靶向分子或部分，用于將藥物或遺傳物質(zhì)靶向引導(dǎo)到表達(dá)P-選擇蛋白的組織。
發(fā)明目的因此本發(fā)明的目的是提供對人P-選擇蛋白有親和力的化合物。
具體地說，本發(fā)明的目的是提供起P-選擇蛋白的拮抗劑或部分拮抗劑作用的化合物。
本發(fā)明的另一目的是提供起靶向配體作用的化合物，它具有將藥物和遺傳物質(zhì)靶向引導(dǎo)到表達(dá)P-選擇蛋白的細(xì)胞和組織的能力。
本發(fā)明的再一目的是提供這些化合物的制備方法。
再一目的是提供這些化合物以及含有這些化合物的組合物的用途。
本發(fā)明的其它目的在以下描述的基礎(chǔ)上將顯而易見。
發(fā)明概述在第一個方面，本發(fā)明提供了對人P-選擇蛋白具有選擇性親和力的化合物。本發(fā)明的化合物是肽或功能等價物，例如經(jīng)修飾的肽、肽類似物或者肽模擬物。它們包含序列XAxA3A1A2A1Y，其中A1是選自如下的D-或L-氨基酸半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)和纈氨酸(V)或其類似物或模擬物；A2是選自天冬氨酸(D)或其類似物或模擬物的D-或L-氨基酸；并且A3是選自如下的D-或L-氨基酸苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)或其類似物或模擬物；Ax是任意的D-或L-氨基酸或其類似物或模擬物；X是任意的N-端基團(tuán)或序列；并且Y是任意的C-端基團(tuán)或序列。這些化合物與人P-選擇蛋白的親和常數(shù)通常在微摩爾范圍內(nèi)，但是當(dāng)它們作為具有2或更高價的多聚體構(gòu)型時其親和力大大增加。
在WO-A-00/34303中，描述了一種含有610個氨基酸的序列，它包含序列Asn-Val-Val-Glu-Cys(NVVEC)和Gly-Phe-Val-Glu-Cys(GFVEC)。在該WO-A-00/34303中沒有提及P-選擇蛋白。給出的這兩個序列不是本發(fā)明化合物的類似物或模擬物。
在第二個方面，本發(fā)明提供了這些化合物的制備方法。這些方法包括化學(xué)和酶促連接氨基酸單體或寡聚體以裝配這些化合物。它們還包括使用載體將核酸序列轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)編碼這些化合物的核酸序列。
另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的這些化合物用于制備藥物或診斷組合物的用途，這些組合物適于在體外和體內(nèi)抑制白細(xì)胞與血小板和內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，以及適于直接抑制血小板聚集。作為藥物，這些組合物可用于治療并預(yù)防涉及激活P-選擇蛋白-介導(dǎo)的白細(xì)胞與血小板和內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的病癥和障礙，例如血栓疾病、局部缺血、再狹窄、動脈粥樣硬化、腎衰竭、寄生蟲病、腫瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移；而且，這些化合物和組合物可用于診斷、預(yù)防和治療涉及血小板聚集的疾病和病癥，例如血栓形成、中風(fēng)和心臟病發(fā)作。含有本發(fā)明化合物的藥物組合物可以適合各種給藥路徑，例如腸胃外、經(jīng)口、經(jīng)粘膜、經(jīng)鼻或肺。它們還可以含有靶向劑、生物利用率提高劑、或除本發(fā)明化合物之外的活性成分，并提供立即或改進(jìn)的釋放。
再一方面，本發(fā)明涉及測定一種分子是否包括對P-選擇蛋白的結(jié)合親和力的方法，包括將P-選擇蛋白或其功能等價物與所述分子和與本發(fā)明的化合物接觸，接著測定所述化合物與所述P-選擇蛋白或其功能類似物的結(jié)合是否降低。
此外，本發(fā)明還涉及一種編碼蛋白質(zhì)分子的核酸，所述蛋白質(zhì)分子包含氨基酸序列XAxA3A1A2A1Y，其中Ax、A3、A1和A2如本文上面所定義，并且其中X是所述序列的N-端側(cè)，Y是所述序列的C-端側(cè)，或其功能等價物。正如本文所用的，蛋白質(zhì)分子是基于氨基酸序列的化合物，例如蛋白質(zhì)和寡肽或多肽，及其衍生物或類似物。所述核酸可用于制備一種藥物，而另外包括所述核酸的基因送遞載體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
再一方面，本發(fā)明還包括能夠特異性地結(jié)合本發(fā)明化合物的結(jié)合分子。
而且，本發(fā)明涉及一種測定化合物是否能夠與人P-選擇蛋白結(jié)合的方法，包括在本發(fā)明的化合物中，用一個氨基酸置換一個保守氨基酸并測定所得化合物是否能夠與所述P-選擇蛋白結(jié)合。
發(fā)明詳述本發(fā)明的化合物具有對人P-選擇蛋白(一種膜糖蛋白，由血管內(nèi)皮細(xì)胞和血小板表達(dá)，涉及白細(xì)胞與內(nèi)皮和血小板粘著)的親和力?；衔锱cP-選擇蛋白的親和力或結(jié)合特性可以定量，例如以親和常數(shù)(IC50)。通常，親和常數(shù)為約50-100μM或更小將被認(rèn)為是親和力和結(jié)合的證據(jù)。對于配體而言更理想的是親和常數(shù)為約10μM或更小的物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，在相互作用或結(jié)合中起作用的非共價型鍵可以獲得的最高親和常數(shù)是約10-15M。然而，通常親和常數(shù)高于約10-12M，大多數(shù)情況下高于約10-9M。
而且，本發(fā)明的化合物包括一種肽或者與肽相關(guān)的分子結(jié)構(gòu)，本文稱之為功能等價物。
肽定義為由兩個或更多的氨基酸通過一個酸的氨基與另一個的羧基結(jié)合獲得的酰胺(Merriam Webster Medical Dictionary2001)。正如本文所用的，肽也可指在分子內(nèi)的肽結(jié)構(gòu)。通常，肽是由天然存在的L-α-氨基酸組成的，這些氨基酸為丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、組氨酸(His或H)、異亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、賴氨酸(Lys或K)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、絲氨酸(Ser或S)、蘇氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和纈氨酸(Val或V)。
本發(fā)明的肽的功能等價物是蛋白質(zhì)分子，包含種類性質(zhì)相同的人P-選擇蛋白結(jié)合活性，但是量不一定相同，并且可以是例如經(jīng)修飾的肽、類肽、肽類似物或肽模擬物。
經(jīng)修飾的肽是由肽通過引入天然存在的氨基酸中沒有的取代基或官能團(tuán)而獲得的分子。該術(shù)語還包括通過肽與其它化學(xué)類別的分子反應(yīng)獲得的化合物，無論這些分子是否天然存在。例如，生物素化的肽、糖蛋白和脂蛋白經(jīng)常在自然界中找到，而用聚乙二醇修飾的肽，例如聚乙二醇化(pegylated)干擾素α-2b(Peg-Intron)，是已經(jīng)過設(shè)計以改變一部分但不是所有的肽性能的化學(xué)修飾肽的實例。
類肽，如同肽一樣，通常是兩個或多個氨基酸的酰胺。然而，它們經(jīng)常不是直接由天然存在的氨基酸獲得的，而是由各種類型的化學(xué)合成的L-或D-氨基酸獲得的。
肽模擬物，在其最廣義范圍內(nèi)，是其功能結(jié)構(gòu)或多或少與肽相似的化合物，但是在主鏈中可能還含有非肽鍵，或者D-氨基酸。一般說來，肽模擬物作為在與受體和酶相互作用中天然肽的替代物(Pharmaceutical Biotechnology，D.J.A.Crommelin和R.D.Sindelar編輯，Harwood Academic Publishers，1997，第138頁)。假肽是一類肽模擬物，它們是含有酰胺鍵電子等排物而不是酰胺鍵的化合物(出處同上，第137-140頁)。
本發(fā)明的化合物還包括肽或功能等價物的鹽，例如藥用可接受的酸-或堿加成鹽。它們還包括肽或功能等價物的多聚體。
本發(fā)明的化合物的特征在于它們包含序列XAxA3A1A2A1Y，其中A1是D-或L-半胱氨酸(C)、D-或L-甲硫氨酸(M)、D-或L-纈氨酸(V)或其類似物；A2是D-或L-天冬氨酸(D)或其類似物；A3是D-或L-苯丙氨酸(F)、D-或L-酪氨酸(Y)或者D-或L-色氨酸(W)或其類似物；Ax是D-或L-氨基酸，并且其中X標(biāo)記所述序列的N-端側(cè)，Y標(biāo)記所述序列的C-端側(cè)，或者其中X和Y在一起可以形成一環(huán)狀體系。更具體地說，X是氫或者包含1-6個D-或L-氨基酸的殘基；Y是羥基或者包含1-11個D-或L-氨基酸且以羥基終止的殘基。
根據(jù)本發(fā)明，在該序列中的2個A1單元獨立地選擇；它們彼此可以相同或不同。優(yōu)選，至少一個A1單元代表纈氨酸(V)。更優(yōu)選兩個A1單元都是纈氨酸(V)。在另一個實施方案中，A1是半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)或纈氨酸(V)的類似物或模擬物。選擇天然存在的氨基酸的適宜類似物或模擬物的技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。例如，假肽方案旨在獲得較高化學(xué)或酶穩(wěn)定性的肽，同時保持其生物活性。在體內(nèi)經(jīng)受快速降解的肽鍵被其它官能團(tuán)替換以產(chǎn)生生物電子等排物或酰胺鍵代用品。生物電子等排基團(tuán)的實例是N-甲基酰胺、硫酯、硫代酰胺、酮亞甲基、亞甲基氨基、逆-反酰胺、亞甲基硫代和亞甲基氧基團(tuán)(出處同上，第138-139頁)。一種改進(jìn)肽的選擇性的方法是向主鏈中引入構(gòu)象限制，這樣使?jié)撛诘氖荏w或酶相互作用的數(shù)量降低。這些限制最經(jīng)常是通過引入碳-碳雙鍵(烯烴類似物)和環(huán)結(jié)構(gòu)實現(xiàn)的(出處同上)。鑒定類似物(其模擬氨基酸如半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)或纈氨酸(V)的功能結(jié)構(gòu))的另一方法是計算機(jī)輔助建模。優(yōu)選的模擬物結(jié)構(gòu)具有電荷或電負(fù)性、疏水性以及空間定向與所述氨基酸相似的側(cè)鏈。在另一實施方案中，一個或兩個A1單元是半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)或纈氨酸(V)的D-氨基酸類似物。
正如所述的，本發(fā)明還包括所述肽的功能等價物。等價物尤其可以使用保守氨基酸變化通過氨基酸置換找到。具體地說，本發(fā)明還包括一種測定化合物是否能夠結(jié)合人P-選擇蛋白的方法，包括在本發(fā)明的化合物中用一氨基酸置換一保守氨基酸并測定所得化合物是否能夠與所述P-選擇蛋白結(jié)合。據(jù)此，已發(fā)現(xiàn)，并且也是本發(fā)明的一部分，該肽的精確氨基酸組成-至少對氨基酸A2和A3而言-隨著肽中氨基酸數(shù)目增加，變得多少不太重要。例如，已發(fā)現(xiàn)，包含10個以上，優(yōu)選12個以上氨基酸，包含苯丙氨酸(F)而不是色氨酸(W)作為A3的肽，能夠特異性地與人P-選擇蛋白結(jié)合。然而，當(dāng)該肽包括6個氨基酸時，所述色氨酸被苯丙氨酸置換不會獲得特異性結(jié)合的肽。本發(fā)明的等價物的另一實例是這樣一種肽，它包含氨基酸序列XAxA3A1A2A1Y并包括15個氨基酸，在位置A2包括谷氨酸(E)而不是天冬氨酸(D)，得到特異性的P-選擇蛋白結(jié)合。然而，當(dāng)該肽鏈僅有6個氨基酸時，相同的置換不能得到特異性結(jié)合肽。例如，序列EWVEVA具有1600μM結(jié)合親和力，而具有所述序列的15-聚體的結(jié)合親和力小于10μM。盡管不希望受任何理論的約束，但是假定肽長度的影響與肽的構(gòu)象有關(guān)，它對結(jié)合能力有影響。當(dāng)本發(fā)明的肽是至少十聚體時，或者優(yōu)選至少十二聚體時，A3和A2可以分別代表F和E。
根據(jù)本發(fā)明，A2是一種D-或L-氨基酸，其溶劑接觸的側(cè)鏈在生理pH下帶負(fù)電，該氨基酸選自天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)、或其類似物或模擬物。在優(yōu)選實施方案中，A2或者是L-谷氨酸(E)或者是L-天冬氨酸(D)。在其它實施方案中，A2是與天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)有關(guān)的類似結(jié)構(gòu)。為了鑒定合適的類似物，適用與就A1所述相同的原理。
A3是一種帶有芳香側(cè)鏈的D-或L-氨基酸，它選自苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)、或其類似物或模擬物。更優(yōu)選A3是一種選自該組的L-氨基酸。最優(yōu)選是色氨酸(W)。在其它實施方案中，A3是一種如上所定義的與苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)有關(guān)的類似結(jié)構(gòu)。
Ax可以是任意的D-或L-氨基酸、或其類似物或模擬物。然而要求有Ax存在，因為已發(fā)現(xiàn)沒有Ax的化合物通常顯示與P-選擇蛋白結(jié)合差(與含有Ax的類似化合物相比)。在一個優(yōu)選實施方案中，Ax是一種選自如下的D-或L-氨基酸天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)、或其類似物或模擬物。在該實施方案中，Ax的特性與A2的相似；該化合物可以定義為包含序列XA2A3A1A2A1Y。應(yīng)注意的是，2個A2單元(如同2個A1單元一樣)獨立選擇，即它們彼此可以相同或不同。
X定義為任意的N-端基團(tuán)或序列。例如，X可以簡單地是氫。更優(yōu)選X是一個或多個氨基酸、或其類似物或模擬物的序列。在一個優(yōu)選實施方案中，X包括至少兩個氨基酸。更優(yōu)選X包括一個纈氨酸(D)，它優(yōu)選與Ax經(jīng)由由一個其它氨基酸組成的間隔相連。
Y定義為任意的C-端基團(tuán)或序列。如果在Y內(nèi)沒有包含氨基酸或類似物，那么C-端基團(tuán)可以是羥基。在一個優(yōu)選實施方案中，Y是多至約5個氨基酸單元的序列。也優(yōu)選至少一個具有帶負(fù)電側(cè)鏈的氨基酸存在于Y中，優(yōu)選它與其余XAxA3A1A2A1序列通過1-3個氨基酸分隔開。被P-選擇蛋白識別對在C-端的取代比在N-端的取代更能耐受。本領(lǐng)域技術(shù)人員有能力發(fā)現(xiàn)這方面的合適氨基酸。
本發(fā)明的化合物可以具有一個環(huán)狀或者以其它方式限制的主鏈。在這種情況下，X+Y在一起可以適宜地經(jīng)cys-cys結(jié)合相連。當(dāng)然，盡管也可以有其它類型的(化學(xué))鍵，例如酰胺結(jié)合，硫醚結(jié)合、氨基甲酸酯結(jié)合或酯結(jié)合。
基團(tuán)X+Y的長度并不特別關(guān)鍵，只要核心序列被P-選擇蛋白識別。通常，X+Y的最小長度相當(dāng)于5-6個氨基酸的長度。
在其中一個實施方案中，本發(fā)明提供了這樣的化合物，它除了如上所述的結(jié)構(gòu)特性之外，在C-或N-末端還具有一個A4單元，其中A4是具有親水側(cè)鏈的D-或L-氨基酸、或其類似物或模擬物。優(yōu)選A4是絲氨酸(S)、甘氨酸(G)、賴氨酸(K)、精氨酸(R)、或谷氨酸(E)。最優(yōu)選是絲氨酸(S)。A4的優(yōu)選位置在Y和序列的剩余部分之間，如序列XAxA3A1A2A1A4Y和XA2A3A1A2A1A4Y所示。
本發(fā)明的化合物具有直鏈、支鏈、環(huán)狀或受限制的主鏈。例如，具有至少兩個半胱氨酸(C)單元的肽或功能等價物可以經(jīng)氧化環(huán)化。如果化合物經(jīng)這種二硫鍵環(huán)化，那么優(yōu)選參與的半胱氨酸單元分別是X和Y的成員。環(huán)狀結(jié)構(gòu)事實上是構(gòu)象受限制的主鏈的一個實例。其它類型的受限制的結(jié)構(gòu)也可以引入以降低該化合物的構(gòu)象柔性。特別是在主鏈中存在烯鍵或小環(huán)結(jié)構(gòu)用于該目的。在PharmaceuticalBiotechnology，D.J.A.Crommelin和R.D.Sindelar編輯，HarwoodAcademic Publishers，1997，第139f頁中給出了這種限制的實例。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的化合物以肽或功能等價物的多聚體提供。正如本文所用的，多聚體，在肽化學(xué)中也稱作寡聚體，指肽、蛋白質(zhì)、類肽、肽模擬物、或其類似物，其由一個以上的肽鏈組成。例如，發(fā)現(xiàn)包含序列XAxA3A1A2A1Y的生物素化肽的四聚體與P-選擇蛋白的親和力比組成它們的肽的親和力高得多。本發(fā)明優(yōu)選的多聚體對P-選擇蛋白的親和常數(shù)低于相應(yīng)肽的親和常數(shù)的1/20，特別是1/100。
在可以創(chuàng)建以形成本發(fā)明化合物的另一類多聚體中，單一的肽或類肽鏈與可生物相容的蛋白質(zhì)例如人血清白蛋白、人源化抗體、脂質(zhì)體、微膠粒、合成聚合物、納米粒子和噬菌體相偶聯(lián)。多聚體也可以代表經(jīng)由間隔物彼此連續(xù)偶聯(lián)的肽序列，即多聯(lián)體、或樹狀體、或簇。
這些化合物通?？梢酝ㄟ^制備肽和類似物質(zhì)已知的方法制得。僅含有幾個氨基酸或類似單元，優(yōu)選不超過30-50個單元的較小化合物能夠經(jīng)化學(xué)或酶促連接技術(shù)制得，或者使用在溶液和懸液中進(jìn)行反應(yīng)的經(jīng)典方法，或者通過使用更流行的固相方法，其中將該肽進(jìn)行裝配同時固定在固體表面如聚合物珠上。較大的化合物通常是通過自動固相肽合成器合成的。
或者，這些化合物可以通過已知的基因工程技術(shù)制得。如果該化合物的確是肽或者是略微修飾的肽的話，該方法特別有效。例如，編碼該化合物的DNA序列可以與能夠轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表達(dá)載體相聯(lián)合或組合。在該方法的另一步驟中，通過在能夠發(fā)生轉(zhuǎn)染的條件下將細(xì)胞與載體和載體結(jié)合的DNA接觸，用所述DNA轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞或靶細(xì)胞。在另一步驟中，將該宿主或靶細(xì)胞在允許表達(dá)該化合物的條件下培養(yǎng)。接著，可以將該化合物分離。如果該化合物本身不能被編碼或者表達(dá)，但是與可以編碼或表達(dá)的肽非常相似，那么可以使用該方法制備與該化合物相似的肽，接著通過一個或多個將該肽經(jīng)化學(xué)或酶技術(shù)進(jìn)行修飾的步驟制備該化合物。
為此目的使用多種載體，例如病毒載體、lipoplexes、polyplexes、微球體、毫微球、樹狀體、裸露DNA、肽送遞體系、脂質(zhì)，特別是陽離子脂質(zhì)、或由其制得的脂質(zhì)體、聚合物載體，特別是由聚陽離子聚合物制得的。優(yōu)選的病毒載體有逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、單純性皰疹病毒、和病毒體。優(yōu)選的非病毒載體包括脫乙酰殼多糖、SPLP、基于PLGA的聚合物體系、聚乙烯亞胺類、聚賴氨酸類、聚磷酰胺化物、聚(甲基)丙烯酸酯類、聚磷腈類；DOPE、DOTAP、和DOTMA。
對可用于制備這些化合物的方法的一些更為全面的概括描述在W.F.Anderson，Nature 392 Supp.，1998年4月30日，第25-30頁；Pharmaceutical Biotechnology，D.J.A.Crommelin和R.D.Sindelar編輯，Harwood Academic Publishers，1997，第53-70、167-180、123-152、8-20頁；Protein SynthesisMethods and Protocols，R.Martin編輯，Humana Press，1998，第1-442頁；Solid-Phase Peptide Synthesis，G.B.Fields編輯，Academic Press，1997，第1-780頁；Amino Acid andPeptide Synthesis，Oxford University Press，1997，第1-89頁。
肽或功能等價物的鹽是通過已知方法制得的，它通常包括將該肽或類肽與藥用可接受的酸混合形成酸加成鹽，或者與藥用可接受的堿混合形成堿加成鹽。酸或堿是否是藥用可接受的可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員考慮該化合物的特定用途之后容易地判斷。例如，不是所有對于體外診斷組合物可以接受的酸和堿都可用于治療組合物。根據(jù)所需用途，藥用可接受的酸包括有機(jī)和無機(jī)酸如甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、羥乙酸、草酸、丙酮酸、琥珀酸、馬來酸、丙二酸、肉桂酸、硫酸、鹽酸、氫溴酸、硝酸、高氯酸、磷酸和硫氰酸，它們與肽和功能等價物的游離氨基形成銨鹽。藥用可接受的堿，與肽和功能等價物的游離羧基形成羧酸鹽，它們包括乙胺、甲胺、二甲胺、三乙胺、異丙胺、二異丙胺、和其它一-、二-和三烷基胺以及芳基胺。而且，還包括藥用可接受的溶劑化物、絡(luò)合物或加合物，例如水合物或ethurates。
多聚體例如可以通過將肽或類肽鏈的N-端生物素化接著與鏈霉抗生物素復(fù)合。由于鏈霉抗生物素能夠高親和力地結(jié)合4個生物素分子或者綴合物，通過該方法可以形成非常穩(wěn)定的四聚體肽復(fù)合物。多聚體可以由相同或不同的肽或功能等價物組成。然而，優(yōu)選本發(fā)明的多聚體由兩個或多個相同的肽或功能等價物組成。
本發(fā)明的另一方面涉及所公開的化合物的用途。由于這些化合物選擇性地與P-選擇蛋白結(jié)合，因此根據(jù)結(jié)合之后其與p-選擇蛋白相互作用的類型，它們可以起拮抗劑、部分拮抗劑的作用，或者僅僅起靶向工具的作用將綴合物質(zhì)靶向引導(dǎo)到表達(dá)P-選擇蛋白的細(xì)胞和組織上。因此，這些化合物可以有利地用于藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明，還提供這種藥物組合物。
正如本文所用的，術(shù)語“藥物組合物”是指治療和診斷組合物，以及含有這種組合物的藥物和診斷劑。治療組合物和藥物用于預(yù)防或治療需要改善的哺乳動物的疾病和其它病癥。診斷劑和診斷組合物用于在體內(nèi)和體外診斷這些疾病。
這些化合物的優(yōu)選用途是用于制備預(yù)防或改善涉及白細(xì)胞如單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮和與血小板粘著以及進(jìn)一步涉及血小板聚集的疾病和病癥的治療組合物或藥物。這些化合物也可用于治療希望抑制P-選擇蛋白-介導(dǎo)的胞內(nèi)發(fā)信號的疾病的組合物。
例如，含有一種或多種本發(fā)明化合物的組合物可以有助于控制白細(xì)胞-介導(dǎo)的炎癥過程。已知激活的白細(xì)胞釋放毒性分子，該毒性分子可以破壞正常組織。這些炎癥反應(yīng)，其中一些還涉及P-選擇蛋白-介導(dǎo)的血小板激活，是幾種病理情況的一部分，例如移植排斥、冷缺血、出血性休克、敗血癥性休克、腫瘤轉(zhuǎn)移、慢性炎癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、動脈粥樣硬化、再狹窄、血管生成、播散性血管內(nèi)凝血、成人呼吸窘迫綜合征、循環(huán)休克、嚴(yán)重外傷性腦損傷、復(fù)發(fā)-緩解的多發(fā)性硬化癥、腦動脈閉塞、局部缺血、中風(fēng)、急性心肌梗塞、動脈損傷，例如因血管形成術(shù)產(chǎn)生的，心肌局部缺血、因局部缺血和再灌注導(dǎo)致的腎損傷、和腎衰竭。
在另一實施方案中，這些化合物可用于制備診斷組合物或產(chǎn)品。這些組合物可用于體外測定以定量體液中的P-選擇蛋白濃度作為上述疾病和病癥的標(biāo)記。它們也可用于體內(nèi)診斷成像過程以監(jiān)控P-選擇蛋白介導(dǎo)的動脈粥樣硬化、動脈瘤、經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)之后的再狹窄(PTCA后的再狹窄)，以及選自其中P-選擇蛋白被動員的其它病癥。作為這些用途的一個選擇，本發(fā)明的化合物可以與螯合劑綴合，接著與各向同性的標(biāo)記(可以通過所選的監(jiān)測系統(tǒng)檢測)絡(luò)合。
這些化合物的另一用途是作為研究工具。例如，它們可用于測定分子與P-選擇蛋白或P-選擇蛋白的功能等價物的結(jié)合親和力。為了進(jìn)行該測定方法，P-選擇蛋白或P-選擇蛋白的功能等價物將與待測定結(jié)合親和力的分子和與本發(fā)明的化合物接觸并溫育。本發(fā)明化合物的降低的結(jié)合將指示該分子與P-選擇蛋白的親和力。
本發(fā)明人還已發(fā)現(xiàn)，P-選擇蛋白可以被天然存在的鈣蛋白酶家族的成員切割。感興趣的是，鈣蛋白酶家族中的一些蛋白酶似乎是包含本發(fā)明化合物的優(yōu)選肽序列之一的僅有天然多肽結(jié)構(gòu)，所述序列是核心基序EWVDV。鈣蛋白酶1和鈣蛋白酶2過度激活很有可能與神經(jīng)疾病如阿爾茨海默氏病、外傷性腦損傷、中風(fēng)和內(nèi)障有關(guān)。鈣蛋白酶3活性可能涉及一些類型的肌萎縮癥，鈣蛋白酶9活性可能涉及胃癌，而鈣蛋白酶8和10似乎在2型糖尿病中起作用。在多種人類疾病中涉及鈣蛋白酶的其它方面由Y.Huang和K.Wang描述在綜述文章中The calpain familiy and human disease，Trends Mol.Med.7，355-362，2001，將其引入本文作為參考。
而且，已發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的化合物可抑制鈣蛋白酶引起的對L-選擇蛋白和P-選擇蛋白的切割，對P-選擇蛋白具有高得多的親和力-通常為約100倍。從機(jī)械論的角度，這暗示鈣蛋白酶參與選擇蛋白的激活。更具體地說，這些選擇蛋白從它們被表達(dá)的細(xì)胞表面上的脫落可通過鈣蛋白酶誘導(dǎo)。因此，本發(fā)明的化合物可用于希望抑制P-選擇蛋白和鈣蛋白酶之間相互作用的任何應(yīng)用。
這些化合物還可用作靶向分子或者綴合物在藥物組合物中用于將藥物或基因物質(zhì)靶向引導(dǎo)到表達(dá)P-選擇蛋白的組織上。作為綴合物，這些化合物可以直接與待送遞到這些組織的活性分子或核酸偶聯(lián)。另外，可以將它們引入到脂質(zhì)體或其它脂質(zhì)載體、乳液小滴、聚合物、毫微顆粒和微粒子中或者將它們固定到其表面上，從而獲得待送遞到表達(dá)P-選擇蛋白的組織的藥物或遺傳物質(zhì)的靶向載體。
這些藥物組合物優(yōu)選含有一種或多種本文中公開的具有P-選擇蛋白親和力的化合物以及至少一種載體或賦形劑。正如本文所用的，載體或賦形劑是任意藥用可接受的物質(zhì)或者物質(zhì)的混合物，其沒有實質(zhì)性藥理活性，可以用作載體或者作為輔助物質(zhì)，從而將化合物配制成穩(wěn)定且易于給藥的劑型。藥用可接受的賦形劑的實例可在所有主要藥典的專論中找到。
在一個實施方案中，該組合物經(jīng)配制并加工用于腸胃外注射，優(yōu)選用于血管內(nèi)注射，例如靜脈內(nèi)或動脈內(nèi)，但是也用于肌內(nèi)、皮下、病損內(nèi)、腹膜內(nèi)或其它腸胃外給藥路徑。規(guī)定其它藥物用于這些給藥途徑的制劑的相同原理也將教導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員如何制備這些組合物。例如，腸胃外劑型的一個要求是其無菌。其它要求描述在所有主要藥典中，例如在USP24中，在專論″General Requirements for Testsand Assays.1.Injections″，第1775-1777頁中。為了增加腸胃外制劑的穩(wěn)定性，可能需要提供干的劑型，在可以將其給藥之前必須重新配制。這種劑型的一個實例是凍干制劑。
可能希望以腸胃外控釋劑型給予本發(fā)明的化合物，從而避免頻繁注射并提高這種治療的效力和便利性。已知有各種制備這種長效制劑的方法。通過固體植入物、毫微顆粒、毫微膠囊、微粒、微膠囊、乳液、懸液、油性溶液、脂質(zhì)體或類似結(jié)構(gòu)，可以提供延長的釋放。
特別適用于制備腸胃外制劑的賦形劑是溶劑、助溶劑和液體或半固體載體，例如無菌水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、丁二醇、脂肪油、短鏈和中鏈甘油三酯、卵磷脂、聚氧乙烯蓖麻油衍生物；調(diào)節(jié)重量摩爾滲透壓濃度和pH的物質(zhì)，例如糖，特別是葡萄糖，糖醇，特別是甘露醇，氯化鈉、碳酸鈉、檸檬酸、乙酸鹽、磷酸鹽、磷酸、鹽酸、氫氧化鈉等；穩(wěn)定劑、抗氧化劑和防腐劑，例如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉、EDTA、芐醇等；其它賦形劑和凍干助劑，例如白蛋白、葡聚糖等。
或者，這些藥物組合物可以設(shè)計成用于口服并相應(yīng)加工。適宜的口服劑型包括片劑、硬膠囊、軟膠囊、粉劑、顆粒、口服崩解劑型、糖漿、滴劑、懸液、泡騰片、可咀嚼的片劑、口服薄膜、凍干劑型、持續(xù)釋放的劑型、控制釋放的劑型。在一個優(yōu)選實施方案中，口服劑型是一種包腸溶衣固體劑型以在胃的酸性和蛋白質(zhì)水解環(huán)境中保護(hù)該化合物。
以經(jīng)粘膜劑型給予本發(fā)明的化合物可能也是有益的。這種給藥路徑為非侵入性且對患者友善；同時它可以提高該化合物的生物利用率(與口服相比)，特別是如果該化合物在消化系統(tǒng)的液體中不穩(wěn)定時，或者如果它太大不能從腸道有效吸收時。經(jīng)粘膜給藥例如可以經(jīng)鼻、口腔、舌下、牙齦或陰道劑型實現(xiàn)。這些劑型可以通過已知技術(shù)制得；它們可以經(jīng)過配制呈現(xiàn)鼻滴劑或噴劑、插入物、薄膜、貼劑、凝膠、軟膏或片劑。優(yōu)選，用于經(jīng)粘膜劑型的賦形劑包括一種或多種提供粘膜附著性的物質(zhì)，由此延長該劑型與吸收部位的接觸時間，并因此潛在地增加吸收程度。
在另一實施方案中，這些化合物經(jīng)肺途徑給藥，使用計量的吸入器、噴霧器、氣溶膠噴劑或干粉吸入器。適宜的制劑可以通過已知方法和工藝制得。透皮、直腸、或眼給藥在某些情況下也是可行的。
使用先進(jìn)的藥物送遞或靶向方法更有效地送遞本發(fā)明的化合物可能是有益的。例如，如果選擇的是非腸胃外給藥路徑，適宜的劑型可以含有生物利用率提高劑，它可以是增加該化合物的利用率的任何物質(zhì)或其混合物。這可以通過例如防止該化合物降解來實現(xiàn)，例如通過酶抑制劑或抗氧化劑。更優(yōu)選該增強(qiáng)劑通過增加吸收屏障(通常為粘膜)的滲透性來增加該化合物的生物利用率。滲透增強(qiáng)劑可以經(jīng)各種機(jī)理起作用；一些增加粘膜的流動性，而另一些將粘膜細(xì)胞之間的間隙連接打開或擴(kuò)寬。另外一些降低了覆蓋粘膜細(xì)胞層的粘液的粘性。優(yōu)選的生物利用率增強(qiáng)劑有兩親物質(zhì)如膽酸衍生物、磷脂類、乙醇、脂肪酸、油酸、脂肪酸衍生物、EDTA、卡波姆、聚卡波非和脫乙酰殼多糖。
另一方面，能夠與上面公開的化合物結(jié)合的分子都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，可以使用標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)制備對化合物特異性的單克隆抗體。可以利用其它技術(shù)設(shè)計和制備能夠與本發(fā)明的化合物結(jié)合的更小分子。
以下實施例打算進(jìn)一步描述本發(fā)明，但是并不將其范圍限于本文提供的實施方案。
實施例1使用HBTU/HOBt作活化劑經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)Fmoc化學(xué)法在自動合成器上通過固相合成制備以下肽.....AxA3A1A2A1.....
TM1 C P E F V D V E G D P G A L L A CTM2 C G W V D V I A S G D T A T L A CTM11 C D V E W V D V S S L E W D L P CTM16C P D W V D V F K L V E G V M L CTM17C L M G C W C D V G V G G E S L CSH31 V G L D P R D W V D V S D Y ASH32 D W V D V R E V L T G E Q R VA17 C D V E W V D V S CA18 C D V E W V D V SA19 D V E W V D V SA27 D V E W V D V A通過向每一肽序列的N-端綴合Ahx接頭接著將該綴合物偶聯(lián)到生物素上來將這些肽生物素化。還通過氧化將TM11制成環(huán)狀構(gòu)型，由此在N-和C-端半胱氨酸之間形成二硫鍵。通過將10μM鏈霉抗生物素與生物素化的肽以1∶4摩爾比在室溫(RT)下溫育2小時而得到TM11和SH31的四聚體。通過質(zhì)譜分析和HPLC檢測這些肽的質(zhì)量。
使用適合的ELISA法研究這些化合物與P-選擇蛋白的親和力。將鏈霉抗生物素-辣根過氧化物酶(strepPO)與TM11-生物素以1∶4摩爾比在RT下溫育2小時，由此形成四聚體肽strepPO-復(fù)合物。為了競爭研究，將微量滴定孔用嵌合人p-選擇蛋白包被，如分離p-選擇蛋白結(jié)合噬菌體所述。然后將孔與2.5nM TM11-strepPO復(fù)合物于測定緩沖液中4℃下溫育1小時，在有滴定量的肽的存在下，以競爭與人p-選擇蛋白結(jié)合。在有防止聚集體形成的DTT存在的情況下測定線性化合物。用測定緩沖液洗滌6次之后，在室溫下將這些孔與100μlTMB/H2O2溫育15分鐘。用1MH2SO4使反應(yīng)終止，并讀出450nm下的吸光度。由這些結(jié)果計算親和常數(shù)親和力生物素-TM1 82μM生物素-TM2 49μM生物素-TM11 2μM生物素-TM11(環(huán)狀) 2μM生物素-TM16 12μM生物素-TM17 7μM生物素-SH31 19μM生物素-A17 0.1μM生物素-A19 12μM四聚體TM11 10.7nM四聚體SH31 61.3nM通過細(xì)胞粘著試驗證實這些化合物的親和力，其中在有滴定量的這些化合物存在的情況下將表達(dá)人P-選擇蛋白的中國倉鼠卵巢細(xì)胞與表達(dá)PSGL-1的HL60細(xì)胞一起培養(yǎng)。
實施例2(對比實施例)如實施例1制備以下化合物并測定其與人P-選擇蛋白的親和力。應(yīng)注意到盡管這些化合物與實施例1的化合物非常相似，但是它們不完全滿足權(quán)利要求1的結(jié)構(gòu)要求，因此不是本發(fā)明的化合物
親和力[μM]D V E A V D V S 400,000D V E W A D V S 1,400D V E W V A V S 21,000D V E W V D A S 13,000E W V K V A 13,000實施例3對血小板聚集的抑制如實施例1所述制備以下化合物并測定其抑制血小板聚集的效果。
人血小板通過ADV激活，并在有或者沒有含EWVDV的肽的情況下測定血小板聚集程度。顯示DVEWVDVS(A19)和CDVEWVDVSC(A17)顯著削弱第二相的血小板聚集，聚集分別降低約45％和25％。
實施例4化合物與硫苷脂脂質(zhì)體的相互作用如實施例1所述制備下面的化合物并測定它們與帶有22％硫苷脂的脂質(zhì)體的相互作用。應(yīng)注意的是，這些化合物與硫苷脂的相互作用是本發(fā)明化合物活性的附加且任選的方面。不與硫苷脂相互作用的化合物可能仍然代表本發(fā)明的化合物，只要它們與P-選擇蛋白結(jié)合并包含權(quán)利要求1定義的共有基序。
通過超聲處理由蛋黃磷酯酰膽堿、膽固醇和硫苷脂制備脂質(zhì)體，這些原料都溶解在氯仿/甲醇(1∶1，v/v)中，其重量比為4∶0.8∶1.33。加入痕量的[3H]-膽固醇(1.3×108dpm)，并在氮氣流下將該混合物干燥。所得脂質(zhì)層在PBS中渦旋，接著經(jīng)過超聲處理，獲得平均粒徑為59-62nm的脂質(zhì)體。
將在包被緩沖液(50mM NaHCO3，pH9.6)中的Fc-特異性山羊抗-人IgG于高度結(jié)合96孔平板中溫育。第二天，用測定緩沖液(20mMHEPES，150mM NaCl，1mM CaCl2，pH7.4)洗滌這些孔并用封閉緩沖液(3％BSA在測定緩沖液中)溫育。洗滌之后，用人P-選擇蛋白-IgG溫育這些孔，洗滌，接著用[3H]-膽固醇標(biāo)記的脂質(zhì)體在有或者沒有下面的化合物和抗體的情況下于4℃下溫育2小時。將未結(jié)合的脂質(zhì)體除去之后，收集結(jié)合的脂質(zhì)體并使用閃爍計數(shù)器計數(shù)。
發(fā)現(xiàn)化合物DVEWVDVS、DVEWVDVA和CDVEWVDVSC顯著地抑制硫苷脂與P-選擇蛋白的結(jié)合，而化合物DVEAVDVS和EWVDV對該結(jié)合沒有抑制?？雌饋沓松厦娑x的核心序列之外，在核心序列之外兩個位置的天冬氨酸(下劃線的D)是有效抑制硫苷脂的必要特征。
權(quán)利要求
1.一種對人P-選擇蛋白具有親和力的化合物，包含具有氨基酸序列XAxA3A1A2A1Y的肽，或者所述肽的功能等價物，其中A1是D-或L-半胱氨酸(C)、D-或L-甲硫氨酸(M)、D-或L-纈氨酸(V)或其類似物或模擬物；A2是D-或L-天冬氨酸(D)或其類似物或模擬物；A3是D-或L-苯丙氨酸(F)、D-或L-酪氨酸(Y)或者D-或L-色氨酸(W)或其類似物或模擬物；Ax是D-或L-氨基酸或其類似物或模擬物；并且其中X標(biāo)志所述序列的N-端側(cè)；Y標(biāo)志所述序列的C-端側(cè)，或者其中X和Y在一起可以形成環(huán)狀體系。
2.如權(quán)利要求1的化合物，其中所述序列在N-端或C-端還包含氨基酸A4，其中A4是包含親水側(cè)鏈的D-或L-氨基酸或者這種氨基酸的類似物。
3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的化合物，其中Ax代表D-或L-谷氨酸(E)或者包括A2。
4.如權(quán)利要求1或2的化合物，其中A1是纈氨酸(V)。
5.如前述權(quán)利要求任一項的化合物，其中A3是色氨酸(W)。
6.如前述權(quán)利要求任一項的化合物，其中X包含至少兩個氨基酸，其中一個是天冬氨酸(D)。
7.如前述權(quán)利要求任一項的化合物，包含環(huán)狀或者受限制的主鏈結(jié)構(gòu)。
8.如前述權(quán)利要求任一項的化合物，包含至少兩個所述肽或其功能等價物，所述化合物與P-選擇蛋白結(jié)合的親和常數(shù)低于一個所述肽的親和力的1/20，優(yōu)選低于其1/100。
9.如權(quán)利要求1-8任一項的化合物的制備方法，其中通過化學(xué)或酶促連接裝配氨基酸單體、氨基酸寡聚體、或者氨基酸類似物或模擬物的單體或寡聚體，所述方法在液相中和/或在官能化固相的界面上進(jìn)行。
10.如權(quán)利要求1-8任一項的化合物的制備方法，包括步驟(a)將編碼該化合物或者與該化合物類似的肽的核酸序列與能夠轉(zhuǎn)染細(xì)胞的載體相結(jié)合，所述載體例如有病毒載體、脂質(zhì)載體或聚合物載體；(b)用該載體和與其結(jié)合的核酸序列轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞；(c)在允許表達(dá)該化合物或者與該化合物類似的肽的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；(d)將該化合物或者與該化合物類似的肽分離；和，任選地，(e)修飾與該化合物相似的肽以獲得該化合物。
11.如權(quán)利要求1-8任一項的化合物的制備方法，包括步驟(a)將編碼該化合物或者與該化合物類似的肽的核酸序列與能夠轉(zhuǎn)染細(xì)胞的載體相結(jié)合，所述載體例如病毒載體、脂質(zhì)載體或聚合物載體；(b)用該載體和與其結(jié)合的核酸序列轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞是活的人類有機(jī)體的一部分。
12.如權(quán)利要求1-8任一項的化合物的制備方法，包括步驟(a)將編碼該化合物的核酸序列與能夠轉(zhuǎn)染細(xì)胞的載體相結(jié)合，所述載體例如病毒載體、脂質(zhì)載體或聚合物載體；(b)用該載體和與其結(jié)合的核酸序列轉(zhuǎn)染活的人類有機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞。
13.如權(quán)利要求1-8任一項的化合物作為藥物或診斷劑的用途。
14.如權(quán)利要求1-8任一項的化合物用于制備抑制白細(xì)胞與血小板和/或內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的藥物、或者抑制P-選擇蛋白與鈣蛋白酶家族的成員之間相互作用的藥物的用途。
15.如權(quán)利要求13或14的用途，用于制備治療、預(yù)防、或者診斷慢性炎性疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、多發(fā)性硬化癥、動脈粥樣硬化、再狹窄、局部缺血、再灌注損傷包括腎衰竭、腫瘤轉(zhuǎn)移、細(xì)菌性膿毒癥、播散性血管內(nèi)凝血、成人呼吸窘迫綜合征、中風(fēng)、血管生成、移植排斥、血栓形成或循環(huán)休克的藥物。
16.藥物組合物，包含如權(quán)利要求1-8任一項的化合物和一種或多種藥用可接受的載體或賦形劑。
17.如權(quán)利要求16的藥物組合物，其被配制并加工用于腸胃外給藥，優(yōu)選用于血管內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、或病損內(nèi)注射。
18.如權(quán)利要求16的藥物組合物，配制并加工用于經(jīng)口給藥，優(yōu)選以片劑、膠囊、顆粒、腸道固體劑型、提供持續(xù)或控制釋放的固體劑型、或者經(jīng)口崩解的劑型的形式。
19.如權(quán)利要求16的藥物組合物，配制并加工用于經(jīng)粘膜給藥，例如經(jīng)鼻、口腔、舌下、或陰道給藥。
20.如權(quán)利要求15的藥物組合物，配制并加工用于通過計量的劑量吸入器、噴霧器、氣溶膠噴霧分散器或干粉吸入器經(jīng)肺給藥。
21.如權(quán)利要求16-20任一項的藥物組合物，還包含藥物靶向劑和/或生物利用率增強(qiáng)劑。
22.一種測定分子是否包括對P-選擇蛋白的結(jié)合親和力的方法，包括將P-選擇蛋白或其功能等價物與所述分子和與權(quán)利要求1-8任一項的化合物接觸，并測定所述化合物與所述P-選擇蛋白或其功能類似物的結(jié)合是否降低。
23.一種編碼蛋白質(zhì)分子的核酸，所述蛋白質(zhì)分子包含氨基酸序列XAxA3A1A2A1Y，或其功能等價物，其中A1是D-或L-半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)或其類似物或模擬物；A2是D-或L-天冬氨酸(D)或其類似物或模擬物；A3是D-或L-苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)或其類似物或模擬物；Ax是D-或L-氨基酸；并且其中X標(biāo)志所述序列的N-端側(cè)；Y標(biāo)志所述序列的C-端側(cè)。
24.如權(quán)利要求23的核酸，其中所述氨基酸序列在N-端或C-端還包含氨基酸A4，其中A4是包含親水側(cè)鏈的D-或L-氨基酸或者這種氨基酸的類似物。
25.如權(quán)利要求23或權(quán)利要求24的核酸用于制備藥物的用途。
26.一種基因送遞載體，包含如權(quán)利要求24或權(quán)利要求25的核酸。
27.一種能夠特異性地結(jié)合如權(quán)利要求1-8任一項的化合物的結(jié)合分子。
28.如權(quán)利要求27的結(jié)合分子，包括抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物。
29.一種測定化合物是否能夠結(jié)合人P-選擇蛋白的方法，包括在如權(quán)利要求1-8任一項的化合物中，用氨基酸置換保守氨基酸并測定所得化合物是否能夠與所述P-選擇蛋白結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明涉及選擇性地與粘著分子人P－選擇蛋白結(jié)合的化合物，特別是包含具有氨基酸序列XA
文檔編號A61P29/00GK1549824SQ02817193
公開日2004年11月24日 申請日期2002年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月3日
發(fā)明者T·J·M·莫勒納爾, J·柯伊伯, T·J·C·范貝克爾, E·A·L·比森, C 范貝克爾, L 比森, T J M 莫勒納爾, 斂 申請人:山之內(nèi)歐洲有限公司