專利名稱：抗ngf抗體用于治療各種疾病的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及用抗NGF抗體治療各種NGF相關(guān)疾病的方法，所述疾病包括哮喘、關(guān)節(jié)炎和銀屑病。所述方法對(duì)于治療患者的這些疾病非常有效，且對(duì)患者的免疫系統(tǒng)沒有明顯的副作用。
相關(guān)技術(shù)的描述神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)是首先被鑒定的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白，并且良好鑒定了它在外周神經(jīng)元和中央神經(jīng)元發(fā)育和存活中的作用。已表明NGF是外周交感神經(jīng)元和胚胎感覺神經(jīng)元以及基部前腦膽堿能神經(jīng)元發(fā)育的重要的存活和維持因子(Smeyne等，Nature 368246-249(1994)；Crowley等，Cell 761001-1011(1994))。NGF正調(diào)節(jié)神經(jīng)肽在感覺神經(jīng)元中的表達(dá)(Lindsay和Harmer，Nature 337362-364(1989))，其活性由兩種不同的膜結(jié)合受體介導(dǎo)。TrkA酪氨酸激酶受體介導(dǎo)高親和結(jié)合，p75受體，其結(jié)構(gòu)與腫瘤壞死因子受體家族的其它成員相關(guān)，介導(dǎo)低親和結(jié)合(Chao等，Science 232518-521(1986))。
除了其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用，NGF越來(lái)越與神經(jīng)系統(tǒng)外圍的處理有關(guān)。例如，已表明NGF可增強(qiáng)血管滲透性(Otten等，Eur.J.Pharmacol.106199-201(1984))，增強(qiáng)T-和B-細(xì)胞的免疫應(yīng)答(Otten等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8610059-10063(1989))，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分化和肥大細(xì)胞增殖，并可使可溶性生物信號(hào)從肥大細(xì)胞中釋放(Matsuda等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.856508-6512(1988)；Pearce等，J.Physio.372379-393(1986)；Bischoff等，Blood 792662-2669(1992)；Horigome等，J.Biol.Chem.26814881-14887(1993))。
NGF由多種細(xì)胞類型產(chǎn)生，包括肥大細(xì)胞(LEON等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.913739-3743(1994))，B-淋巴細(xì)胞(Torcia等，Cell 85345-356(1996)，角質(zhì)形成細(xì)胞(Di Marco等，J.Biol.Chem.26822838-22846))和平滑肌細(xì)胞(Ueyama等，J.Hypertens.111061-1065(1993))。已在神經(jīng)系統(tǒng)外的多種細(xì)胞類型上發(fā)現(xiàn)了NGF受體。例如，在人單核細(xì)胞、T-和B-淋巴細(xì)胞以及肥大細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了TrkA。
與NGF的非神經(jīng)元作用一致，在人患者以及一些動(dòng)物模型中觀察到增加的NGF水平和各種炎性疾患之間的關(guān)系。其中包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Bracci-Laudiero等，Neuroreport 4563-565(1993))，多發(fā)性硬化(Bracci-Laudiero等，Neurosci.Lett.1479-12(1992))，銀屑病(Raychaudhuri等，Acta Derm.Venereol.7884-86(1998))，關(guān)節(jié)炎(Falcini等，Ann.Rheum.Dis.55745-748(1996))和哮喘(Braun等，Eur.J.Immunol.283240-3251(1998))。這些慢性炎性疾患是顯著的公眾健康問題。例如，估計(jì)僅在美國(guó)就有3790萬(wàn)人受到關(guān)節(jié)炎的困擾。目前對(duì)這些疾患的治療非常有限。了解NGF在這些疾病中的作用可為治療提供新的方法。
已經(jīng)觀察到應(yīng)激和銀屑病之間的相互關(guān)系?；谶@種相互關(guān)系以及與其相對(duì)稱的這種疾病帶來(lái)的皮膚損害，人們提出了與神經(jīng)系統(tǒng)之間的關(guān)系(Raychaudhuri等，Acta Derm.Venerol.7884-86(1998))。尤其提出了神經(jīng)肽在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的作用。研究者報(bào)道了末稍皮膚神經(jīng)數(shù)量的增加以及一種或多種神經(jīng)肽如P物質(zhì)(SP)、血管活性腸肽(VIP)和CGRP的正調(diào)節(jié)作用。NGF在調(diào)節(jié)皮膚中的神經(jīng)支配中起作用，還已知正調(diào)節(jié)神經(jīng)肽，這說明升高的NGF水平可能是神經(jīng)肽的正調(diào)節(jié)和在銀屑病中發(fā)現(xiàn)的升高的皮膚神經(jīng)支配的原因。實(shí)際上，在銀屑病的角質(zhì)形成細(xì)胞中觀察到增加的NGF表達(dá)(Raychaudhuri等，Acta Derm.Venercol.7884-86(1998))。這說明，由于NGF通常作為角質(zhì)形成細(xì)胞的存活因子，因此NGF的過表達(dá)會(huì)防止正常的細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致銀屑病(Pincelli等，J.derm.sci.2271-79(2000))。
大量研究表明，神經(jīng)肽如P物質(zhì)(SP)和肥大細(xì)胞釋放出的生物活性物質(zhì)如組胺也在人關(guān)節(jié)炎的自然發(fā)生中起作用，同時(shí)，在動(dòng)物模型中試驗(yàn)性地誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(參見，例如，Levine J.，Science 226547-549(1984))。已表明NGF會(huì)影響肥大細(xì)胞脫粒(Bruni等，F(xiàn)EBS Lett.138190-193(1982))和P物質(zhì)釋放(Donnerer等，Neurosci.49693-698(1992))，這說明它參與關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制。
因此，外周組織中NGF水平升高與痛覺過敏和炎癥有關(guān)，且在許多形式的關(guān)節(jié)炎中觀察到。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑膜表達(dá)高水平的NGF，而在非炎性滑膜中據(jù)報(bào)道NGF是不可檢測(cè)的(Aloe等，Arch.Rheum.35351-355(1992))。在試驗(yàn)性誘導(dǎo)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的大鼠中觀察到類似的結(jié)果(Aloe等，Clin.Exp.Rheumatol.10203-204(1992))。據(jù)報(bào)道，在轉(zhuǎn)基因關(guān)節(jié)炎小鼠中有升高的NGF水平，同時(shí)肥大細(xì)胞的數(shù)量也增加(Aloe等，Int.J.Tissue Reactions.Exp.Clin.Aspects 15139-143(1993))。然而，注射進(jìn)正常大鼠關(guān)節(jié)滑膜中的純化的NGF不會(huì)誘導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)炎癥，這說明NGF不是關(guān)節(jié)炎的病因(Aloe等，Growth Factors9149-155(1993))。
高NGF水平與過敏性炎癥有關(guān)，且已提出這與肥大細(xì)胞脫粒有關(guān)(Bonini等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9310955-10960(1996))。
在過敏性和非過敏性哮喘中也觀察到升高的NGF水平(Bonini等，同上)。肥大細(xì)胞、嗜伊紅細(xì)胞和T-淋巴細(xì)胞被認(rèn)為在這種炎性疾病中發(fā)揮作用，且NGF血清水平和總IgE抗體滴度之間的相互關(guān)系說明NGF對(duì)這種炎性免疫應(yīng)答有作用。在小鼠和人中，變應(yīng)原誘導(dǎo)的呼吸道炎癥都與增加NGF的局部產(chǎn)生有關(guān)(Braun等，Int.Arch.Allergy Immunol.118163-165(1999))。
已表明NGF可調(diào)節(jié)升高的呼吸道活動(dòng)過度反應(yīng)的發(fā)展，呼吸道活動(dòng)過度反應(yīng)是支氣管哮喘的一個(gè)特點(diǎn)(braun等，Eur.J.Immunol..283240-3251(1998))。實(shí)際上，在一項(xiàng)研究中，用抗NGF抗體治療變應(yīng)原致敏的小鼠可防止局部變應(yīng)原攻擊后的呼吸道反應(yīng)過度性的發(fā)展(Braun等，Int.Arch.Allergy Immunol.1 18163-165(1999))。
盡管在小鼠中獲得了期望的結(jié)果，所報(bào)道的中和抗NGF抗體對(duì)免疫系統(tǒng)的副作用也帶來(lái)了有關(guān)在人患者中將抗NGF抗體用于預(yù)防或治療哮喘或其它疾病的嚴(yán)重問題。尤其是，Torcia等在Cell 85345-356(1996)中鑒定NGF是記憶B淋巴細(xì)胞的自分泌存活因子，并證明在小鼠體內(nèi)施用中和抗NGF抗體會(huì)減少記憶B細(xì)胞并取消二次抗原特異性免疫應(yīng)答。Garaci等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 9614013-14018(1999)報(bào)道，NGF是一種自分泌存活因子，它可拯救人的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞避免HIV感染造成的細(xì)胞病變效應(yīng)。這一報(bào)道以及Torcia等的發(fā)現(xiàn)(同上)都說明抗NGF抗體有可能危及受治療者的免疫系統(tǒng)。
發(fā)明概述本發(fā)明是基于一意外發(fā)現(xiàn)，即體內(nèi)施用治療有效量的抗-MGF單克隆抗體(抗體911)對(duì)實(shí)驗(yàn)用變態(tài)反應(yīng)小鼠模型的免疫系統(tǒng)沒有副作用。因此，這種抗體和相關(guān)抗體很有希望用于治療人患者的NGF相關(guān)疾病，包括哮喘。
一方面，本發(fā)明涉及通過對(duì)患者施用有效量的抗人NGF(抗-hNGF)單克隆抗體而在人患者中控制NGF相關(guān)疾病的方法，這種抗體能夠以納摩爾范圍的親和力結(jié)合hNGF，并在體內(nèi)抑制hNGF與人TrkA(hTrkA)的結(jié)合，其中所述抗體對(duì)患者的免疫系統(tǒng)沒有顯著的副作用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體與hNGF的結(jié)合親和力優(yōu)選為約0.10至約0.80nM，更優(yōu)選為約0.15至約0.75nM，最優(yōu)選為約0.18至約0.72nM。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體結(jié)合與選自MAb 911、MAb 912和MAb 938的抗體實(shí)質(zhì)上相同的hNGF表位，更優(yōu)選為與MAb 911相同的表位。
在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體能夠與鼠NGF(muNGF)交叉反應(yīng)。
所述抗體也可以是抗體片段，優(yōu)選為選自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、雙體分子(diabodies)、單鏈抗體分子和由抗體片段形成的多特異性抗體的抗體片段，最優(yōu)選為單鏈Fv(scFv)分子。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是嵌合抗體。它還可被人源化或是人的。
在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是雙特異性的。所述雙特異性抗體可具有抗-IgE的特異性。
被控制的NGF相關(guān)疾病優(yōu)選與NGF對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用無(wú)關(guān)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述NGF相關(guān)疾病是炎性疾患，優(yōu)選選自哮喘，關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化，紅斑狼瘡和銀屑病。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述疾患是哮喘。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述疾患是關(guān)節(jié)炎，優(yōu)選是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述疾患是銀屑病。
在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體與其它用來(lái)治療炎性疾患的治療劑聯(lián)合施用。因此，所述抗體可以和另一種治療哮喘的治療劑聯(lián)合施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體和一種皮質(zhì)類固醇一起施用，優(yōu)選為丙酸倍氯米松(beclomethasonediproprionate)(BDP)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體與抗IgE抗體一起施用，如rhuMAb-E25或rhuMAb-E26。為治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，所述抗體可以和抗TNF抗體或一種抗體或特異性結(jié)合TNF受體的免疫粘附素聯(lián)合施用。
另一方面，本發(fā)明涉及一種含有嵌合抗體、人源化抗體或人抗人NGF單克隆抗體以及與藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)合的藥物組合物，所述抗體能夠以納摩爾范圍的親和力結(jié)合hNGF并在體內(nèi)抑制hNGF與人TrkA(hTrkA)的結(jié)合，其中所述抗體對(duì)患者的免疫系統(tǒng)沒有顯著的副作用。所述藥物組合物中的抗體可以是抗體片段，優(yōu)選為選自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、雙體分子、單鏈抗體分子和由抗體片段形成的多特異性抗體的抗體片段。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是雙特異性抗體。所述雙特異性抗體能夠與天然的人IgE或天然的人TNF或天然的人TNF受體特異性結(jié)合。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物還包括其它藥物活性成分，如適合治療炎性疾患的成分。所述炎性疾患優(yōu)先選自哮喘，多發(fā)性硬化，關(guān)節(jié)炎，紅斑狼瘡和銀屑病。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述炎性疾患是哮喘。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述炎性疾患是關(guān)節(jié)炎，優(yōu)選為od風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述炎性疾患是銀屑病。
另一方面，本發(fā)明涉及一種制造產(chǎn)品，它包括容器，含有嵌合抗體、人源化抗體或人抗人NGF單克隆抗體以及與藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)合的藥物組合物，以及用組合物來(lái)控制人患者中NGF相關(guān)疾病的裝置，所述抗體能夠以納摩爾范圍的親和力結(jié)合hNGF并在體內(nèi)抑制hNGF與人TrkA(hTrkA)的結(jié)合，其中所述抗體對(duì)患者的免疫系統(tǒng)沒有顯著的副作用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述制造產(chǎn)品還包括其它藥物活性成分，優(yōu)選適合治療炎性疾患。所述炎性疾患優(yōu)先選自哮喘，多發(fā)性硬化，關(guān)節(jié)炎，紅斑狼瘡和銀屑病。
附圖簡(jiǎn)述

圖1總結(jié)了6種抗NGF MAb(單克隆抗體)與NGF/NT-3嵌合突變體結(jié)合的能力。將各種MAb與NGF/NT3突變體的相對(duì)結(jié)合與野生型hNGF的結(jié)合進(jìn)行比較(-)，＜10％；(+)，10-30％；(++)，30-60％；(+++)，60-100％。各種MAb與hNGF結(jié)合的EC50值為MAb 908，1.8×10-10M；MAb 911，3.7×10-10M；MAB 912，1.8×10-10M；MAb 938，7.4×10-10M；MAb 14.14，5.9×10-10M。
圖2A-F顯示了MAb和野生型以及突變型hNGF的結(jié)合。將在2-5獨(dú)立ELISA中獲得的各種突變體的平均EC50值與用野生型NGF結(jié)合獲得的EC50值進(jìn)行比較。EC50值是用Kaleidagraph軟件程序(Abelbeck軟件)通過線性回歸分析(未加權(quán))確定的。條狀圖表示，突變型使MAb結(jié)合至少降低了兩倍，并標(biāo)出了起作用的殘基。
圖2A顯示了MAb 908與野生型和突變型NGF的結(jié)合。
圖2B顯示了MAb 909與野生型和突變型NGF的結(jié)合。
圖2C顯示了MAb 911與野生型和突變型NGF的結(jié)合。
圖2D顯示了MAb 912與野生型和突變型NGF的結(jié)合。
圖2E顯示了MAb 938與野生型和突變型NGF的結(jié)合。
圖2F顯示了MAb 14.14與野生型和突變型NGF的結(jié)合。
圖3A-F分別表示了NGF上抗NGF MAbs 908，909，911，912，938和14.14的MAb表位的分子模型。淺色和中灰色表示各個(gè)不同的NGF單體，通過ELISA確定影響MAb結(jié)合的殘基用黑色表示。在圖3A中標(biāo)出了各可變區(qū)。
圖4A和B顯示了抗NGF MAb與未還原的hNGF(A)和還原的hNGF(B)結(jié)合的免疫印跡分析。第一泳道為分子量標(biāo)記。泳道2和3分別顯示了緩沖液和陰性對(duì)照抗體。在未還原條件下，純化的hNGF走出了三條帶，這似乎相應(yīng)于單體，二體和部分加工的二體hNGF。
圖5總結(jié)了MAb表位作圖結(jié)果。
圖6顯示了抗NGF MAb抑制hNGF與TrkA-IgG受體免疫粘附素的結(jié)合。
圖7顯示了抗NGF MAb抑制hNGF與p75-IgG免疫粘附素結(jié)合的能力。
圖8顯示了抗NGF MAb抑制hNGF與轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞上表達(dá)的TrkA胞外域結(jié)合的能力。采用抗磷酸酪氨酸MAb，通過ELISA測(cè)量了酪氨酸磷酸化的抑制作用。
圖9顯示了抗NGF MAb抑制hNGF在胚胎大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元上存活作用的能力。最大存活是基于單用NGF獲得的信號(hào)，用加入飽和濃度的可溶性TrkA-IgG獲得的信號(hào)確定了最大抑制。
圖10證明用抗NGF MAb 911處理非顯著地增加了對(duì)卵清蛋白的免疫應(yīng)答。
圖11顯示了用雞γ-球蛋白免疫后用抗NGF MAb 911處理非顯著地降低了免疫應(yīng)答。
圖12顯示了用抗NGF MAb 911處理阻止了NGF誘導(dǎo)的熱痛覺過敏。
圖13顯示了在致敏的C57/BL6小鼠(SN)中，用抗NGF MAb 911處理可抑制用吸入的塵螨抗原攻擊后的呼吸道過度反應(yīng)性。
圖14顯示，在致敏的C57/BL6小鼠(SN)中，用抗NGF MAb處理可降低用吸入的塵螨抗原攻擊后的白血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜伊紅細(xì)胞滲透進(jìn)BAL中。
圖15顯示了盡管在抗NGF MAb處理的致敏小鼠中減少了白細(xì)胞滲透進(jìn)BAL中，但嗜伊紅細(xì)胞的比例仍高。
圖16顯示了用抗NGF MAb 911處理削弱了抗原攻擊后BAL中IL-13的增加。
圖17證明了盡管降低對(duì)變應(yīng)原的炎性反應(yīng)，但用抗NGF MAb處理不會(huì)降低體液免疫應(yīng)答，體液免疫應(yīng)答是用總血清免疫球蛋白滴定與塵螨(dust mite)的比值測(cè)定的。
圖18顯示了用抗NGF MAb處理也不會(huì)降低IgE的總血清水平。
圖19顯示了用NGF處理增加了三叉神經(jīng)神經(jīng)節(jié)中CGRP的水平，而用抗NGF MAb處理使CGRP水平降低。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述A.定義除非另有說明，這里使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)和精通本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的一般技術(shù)人員的通常理解有著相同的含義。參見，例如Singleton等，《微生物和分子生物學(xué)詞典》(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)，第二版，J.Wiley & Sons(紐約，紐約州，1994)；Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，Cold Springs Harbor Press(冷泉港，紐約州1989)。精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解許多與這里所述方法和材料類似或相同的方法和材料，它們可用來(lái)實(shí)踐本發(fā)明。實(shí)際上，本發(fā)明并不限于所描述的方法和材料。出于本發(fā)明的目的，定義了以下術(shù)語(yǔ)。
當(dāng)用在這里時(shí)，術(shù)語(yǔ)″神經(jīng)生長(zhǎng)因子″和″NGF″定義為所有哺乳動(dòng)物種類，包括人的天然序列NGF。
″NGF受體″是指被NGF結(jié)合或被NGF活化的多肽。NGF受體包括任何哺乳動(dòng)物種類，包括人的TrkA受體和p75受體。
術(shù)語(yǔ)″天然序列″與NGF或任何其它多肽結(jié)合，是指與天然來(lái)源的相應(yīng)多肽有相同氨基酸序列的多肽，與其制備模式無(wú)關(guān)?？蓮淖匀唤缰蟹蛛x這種天然序列的多肽或可通過重組和/或合成方法或這些方法的任何組合產(chǎn)生這種天然序列的多肽。術(shù)語(yǔ)″天然序列″特別包括天然產(chǎn)生的截短形式或分泌形式(例如胞外域序列)，天然產(chǎn)生的變體形式(如另路剪接形式)和天然產(chǎn)生的全長(zhǎng)多肽的等位基因變體。
“抗體”(Abs)和“免疫球蛋白”(Igs)是具有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白?？贵w顯示對(duì)特異性抗原的結(jié)合專一性，而免疫球蛋白包括抗體和缺乏抗原特異性的其它抗體樣分子。后一種的多肽，例如，由淋巴系統(tǒng)以低水平產(chǎn)生和由骨髓瘤以提高的水平產(chǎn)生。
“天然抗體”和“天然免疫球蛋白”通常是具有約150,000道爾頓的異源四聚(heterotetrameric)糖蛋白，由兩個(gè)相同的輕(L)鏈和兩個(gè)相同的重(H)鏈組成。每個(gè)輕鏈通過一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈連接，而二硫鍵的數(shù)量在不同的免疫球蛋白同種型的重鏈之間不同。每個(gè)重鏈和輕鏈通常還有規(guī)律地具有分隔的鏈內(nèi)二硫橋。每個(gè)重鏈一端具有一個(gè)可變區(qū)(VH)接著是一些恒定區(qū)。每個(gè)輕鏈一端具有一個(gè)可變區(qū)(VL)，另一端具有一個(gè)恒定區(qū)；輕鏈恒定區(qū)與重鏈的第一恒定區(qū)相匹配，輕鏈可變區(qū)與重鏈可變區(qū)相匹配。據(jù)認(rèn)為特定的氨基酸殘基形成輕鏈和重鏈可變區(qū)之間的界面(Chothia等，J.Mol.Biol.186651；Novotny和Haber，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.824592；Chothia等，Nature 342877-883)。
術(shù)語(yǔ)“可變的”指抗體中可變區(qū)的某些部分序列上存在著廣泛不同，并用于各特定抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性這一事實(shí)。然而，可變性并不均勻分布于抗體的整個(gè)可變區(qū)。它集中于輕鏈和重鏈的可變區(qū)內(nèi)，被稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或高變區(qū)的三個(gè)區(qū)段中?？勺儏^(qū)的較高保守性部分被稱為框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)各含4個(gè)FR區(qū)，大部分采取β-片層構(gòu)型，由三個(gè)CDR連接，形成環(huán)狀連接，在有些情況下形成部分的β-片層結(jié)構(gòu)。每個(gè)鏈中的CDR與來(lái)自另一鏈的CDR由于FR而密切靠近在一起，形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)(見Kabat等，(1991)，同上)。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但顯示各種效應(yīng)物功能，例如抗體參與的抗體依賴性細(xì)胞毒性。
抗體經(jīng)木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱作“Fab”片段，每個(gè)片段具有單一抗原結(jié)合位點(diǎn)，和一個(gè)殘余的“Fc”片段，其名稱反映了其易結(jié)晶的能力。木瓜蛋白酶處理產(chǎn)生一個(gè)F(ab’)2片段，它具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)并仍能交聯(lián)抗原。
“Fv”是含有完整抗原-識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。在雙鏈Fv中，該區(qū)域由一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈可變區(qū)以緊密的、非-共價(jià)結(jié)合的二聚體組成。在單鏈Fv中，重鏈和輕鏈可變區(qū)可通過柔性肽接頭共價(jià)連接，這樣輕鏈和重鏈就可以連接成類似于雙鏈Fv中的“二聚”結(jié)構(gòu)。就是在這種構(gòu)型中，每個(gè)可變區(qū)域的三個(gè)CDR相互作用，在VH-VL二聚體的表面上限定了抗原結(jié)合位點(diǎn)?？偲饋?lái)說，6個(gè)CDR賦予了抗體的抗原結(jié)合特異性。然而，即使是一個(gè)可變區(qū)(或僅含有對(duì)抗原特異的3個(gè)CDR的一半Fv)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，盡管親和力比完整結(jié)合位點(diǎn)低。
Fab片段還含有輕鏈恒定區(qū)和重鏈第一恒定區(qū)(CH1)。Fab’片段不同于Fab片段的是其重鏈CH1區(qū)的羧基末端添加了幾個(gè)殘基，包括來(lái)自抗體絞鏈區(qū)的一種或多種半胱氨酸。本文Fab’-SH指Fab’，其中恒定區(qū)的半胱氨酸殘基具有一個(gè)游離的巰基。F(ab’)2抗體片段起源于作為鏈間具有鉸鏈半胱氨酸的Fab’片段對(duì)產(chǎn)生的。還已知其它化學(xué)偶聯(lián)的抗體片段。
任何種類脊椎動(dòng)物的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可分為兩種明顯不同的類型之一，根據(jù)它們恒定區(qū)氨基酸序列稱作kappa(κ)和lambda(λ)。
根據(jù)重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白可分為不同的類。這里有5個(gè)主要的免疫球蛋白類別IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，這些類別中的幾類可進(jìn)一步分為亞類(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，IgA1和IgA2。對(duì)應(yīng)于不同類免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別被稱作α、δ、ε、γ和μ。不同類免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是熟知的。
本文術(shù)語(yǔ)“抗體”具體包括單克隆抗體，包括抗體片段克隆。
“抗體片段”含有完整抗體的一部分、通常是完整抗體的原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；雙體分子；單鏈抗體分子，包括單鏈Fv(scFv)分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體，如雙特異性抗體。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”指從基本上同源的抗體群中獲得的抗體(或抗體片段)，即該群所含的各個(gè)抗體是相同的，除了可能以很少量存在的天然產(chǎn)生的突變外。單克隆抗體是高度特異性的，針對(duì)一個(gè)抗原位點(diǎn)。而且，與常規(guī)的(多克隆)抗體制劑相反，該制劑通常包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體，每一個(gè)單克隆抗體針對(duì)抗原上的一種決定簇。除它們的特異性以外，單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)在于它們是通過雜交瘤培養(yǎng)合成的，且不被其它免疫球蛋白的污染。修飾詞“單克隆的”表示不把從基本上同種群的抗體中獲得的抗體特征認(rèn)作需要通過任何特定的方法生產(chǎn)抗體。例如，本發(fā)明所用的單克隆抗體可通過Kohler等，Nature256495(1975)首先描述的雜交瘤方法制備，或用重組DNA方法制備(見例如，美國(guó)專利號(hào)4,816,567)。例如用Clackson等，Nature 352624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.222581-597(1991)描述的方法從噬菌體抗體文庫(kù)中分離的“單克隆抗體”還包括含有抗體片段。(Fv克隆)的抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的克隆。
本文中的單克隆抗體具體包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)及其片段，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自具體牿的體中的相應(yīng)序列相同或同源，或?qū)儆谔囟ǖ目贵w類別或亞類，而鏈的剩余部分與衍生自另一種物種的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類，只要它們顯示所需的生物活性(Cabilly等，美國(guó)專利號(hào)4,816,567；和Morrison等，Pro.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855(1984))。
非人(例如小鼠)抗體的“人源化”形式是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2)或抗體的其它抗原結(jié)合序列。在很大程度上，人源化抗體是人的免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)殘基被非人物種(供體抗體)如小鼠、大鼠、或家兔具有所需特異性、親和力和能力的非人物種的CDR的殘基所取代。在一些例子中，人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基所取代。而且人源化抗體可包含既不在受體抗體又不在輸入的CDR或框架序列發(fā)現(xiàn)的殘基。進(jìn)行這些修飾以進(jìn)一步改進(jìn)和最優(yōu)化抗體的性能。通常，人源化抗體實(shí)質(zhì)上包括全部至少一個(gè)、通常兩個(gè)可變區(qū)，其中所有或基本上所有的CDR區(qū)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的CDR區(qū)，并且所有的或基本上所有的FR區(qū)是人免疫球蛋白序列的FR區(qū)。人源化抗體還任選地包括免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白恒定區(qū)的一部分。對(duì)于進(jìn)一步詳細(xì)描述，見Jone等，Nature 321522-525(1986)；Reichmann等，Nature 332323-329(1988)和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-598(1992)；和Clark，Immunol.Today 21397-402(2000)。人源化抗體包括PrimatizedTM抗體，其中抗體的抗原結(jié)合區(qū)衍生自用感興趣的抗原免疫獼猴產(chǎn)生的抗體。
“單鏈Fv”或“ScFv”抗體片段含有抗體的VH和VL區(qū)域，其中這些區(qū)域以一條多肽鏈存在。通常，ScFv多肽在VH和VL區(qū)域之間還含有一個(gè)多肽接頭，它能夠使ScFv形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。ScFv的綜述見Pluckthun，《單克隆抗體的藥理學(xué)》(The Pharmacology of Monoclonal antibody)，113卷，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag，紐約，269-315頁(yè)(1994)，Dall’Acigua和Carter，Curr.Opin.Stract.Biol.8443-450(1998)，和Hndson，Curr.Opin.Immunol.11548-557(1999)。
術(shù)語(yǔ)“雙體分子”指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，這些片段含有與相同多肽鏈(VH-VL)中輕鏈可變區(qū)(VL)相連的重鏈可變區(qū)(VH)。通過采用一個(gè)短得而不能使同一鏈上的兩個(gè)區(qū)域間配對(duì)的接頭，迫使該區(qū)域與另一鏈的互補(bǔ)區(qū)域配對(duì)且產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。例如雙體分子在EP 404.097；WO 93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448(1993)中有更全面的描述。
“分離的”抗體是已經(jīng)鑒定且與其天然環(huán)境的成分相分離和/或回收的抗體。其天然抗體環(huán)境的污染成分是可能會(huì)干擾該抗體的診斷或治療應(yīng)用的物質(zhì)，可包括酶，激素以及其它蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)溶質(zhì)。在優(yōu)選實(shí)施例中，可提純?cè)摽贵w至(1)純度用Lowry方法測(cè)定抗體95％以上(按重量計(jì))，最好99％以上(按重量計(jì))，(2)提純至足夠獲得N-未端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個(gè)殘基的程度(使用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀)，或(3)用考馬斯藍(lán)，或優(yōu)選銀染色在還原或非還原條件下，用SDS-PAGE測(cè)定為均一性。由于沒有抗體天然環(huán)境的至少一種成分，分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)原位產(chǎn)生的抗體。然而一般情況下，分離的抗體將通過至少一個(gè)純化步驟制備。
“中和性抗體”指一種抗體分子，該抗體分子能阻斷或顯著降低其所結(jié)合的靶抗原的效應(yīng)物功能。因此，“中和性”抗IFN抗體能阻斷或顯著降低效應(yīng)物功能，如IFN的受體結(jié)合和/或細(xì)胞反應(yīng)的引發(fā)?！帮@著”降低指降低靶抗原(如NCTF)的效應(yīng)物功能至少60％，優(yōu)選至少約70％，較佳至少約75％，更佳至少約80％，再佳至少約85％，最佳至少約90％。
當(dāng)抗體能夠使配體與受體的結(jié)合能力發(fā)生客觀可測(cè)的降低時(shí)，則該抗體能夠“抑制”配體與受體的“結(jié)合”。
術(shù)語(yǔ)“表位”用來(lái)指(單克隆或多克隆)抗體在蛋白質(zhì)抗原上的結(jié)合位點(diǎn)。
與特定表位結(jié)合的抗體可通過“表位作圖”確定。在這一領(lǐng)域中已知有很多方法用來(lái)作圖并表征抗原表位在蛋白質(zhì)上的位置，包括解釋抗體-抗原復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)，競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定，基因片段表達(dá)測(cè)定，以及以合成肽為基礎(chǔ)的測(cè)定，這些方法描述在(例如)Harlow和Lane的《抗體使用實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(Using Antibodie，aLaboratory Manual)的第11章中，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約州，1999。以下討論競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定。根據(jù)基因片段表達(dá)測(cè)定，編碼蛋白質(zhì)的開放閱讀框被隨意分割或被特定的遺傳構(gòu)建分割，同時(shí)確定了表達(dá)的蛋白質(zhì)片段與要測(cè)試的抗體的反應(yīng)性。(例如)基因片段可以通過PCR產(chǎn)生，然后在體外在放射性氨基酸存在下將其轉(zhuǎn)錄并翻譯到蛋白質(zhì)中。然后通過免疫沉淀和凝膠電泳確定抗體與放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)片段的結(jié)合。使用呈現(xiàn)在噬菌體顆粒(噬菌體文庫(kù))表面上的隨機(jī)肽序列的大型文庫(kù)還可以鑒別某些抗原表位。或者，可以測(cè)試確定的重疊肽片段的文庫(kù)以便在簡(jiǎn)單的結(jié)合測(cè)定中與測(cè)試抗體結(jié)合。后面一種方法適用于確定約5-15個(gè)氨基酸的線性抗原表位。
當(dāng)兩個(gè)抗體識(shí)別相同的或空間上重疊的抗原表位時(shí)，抗體結(jié)合“基本上一樣的抗原表位”作為參考抗體。最廣泛使用且快速確定兩個(gè)抗原表位是否與相同的或空間上重疊的抗原表位結(jié)合的方法是競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定，采用標(biāo)記的抗原或標(biāo)記的抗體，這種方法適用于所有不同的形式。通常，抗原被固定在96孔的平板上，用放射性標(biāo)記或酶標(biāo)記測(cè)定未標(biāo)記的抗體阻斷標(biāo)記的抗體結(jié)合的能力。
本文使用的術(shù)語(yǔ)氨基酸或氨基酸殘基是指如下面所描述的天然存在的L氨基酸或D氨基酸以及它們相應(yīng)的變體。這里使用了常用的一個(gè)或三個(gè)字母的縮寫來(lái)代表氨基酸(Bruce Alberts等，《細(xì)胞的分子生物學(xué)》(Molucular Biology of theCell)，Garland Publishing公司，紐約(第三版，1994)。
“變體”是在某些方面與天然抗體不同但保持了相同的生物活性的抗體。作為插入、缺失、修飾和/或取代天然序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的結(jié)果，變體可以有不同于天然抗體的氨基酸序列。變體可以有不同于天然抗體的糖基化模式。此外，變體也可以是經(jīng)過共價(jià)修飾的天然抗體。
“疾病”是指任何受益于按本發(fā)明方法進(jìn)行治療的疾患?！凹膊　焙汀凹不肌痹谶@里可互換使用，包括慢性和急性病癥或疾病，包括那些容易使哺乳動(dòng)物患病的病理疾患。這里將治療的疾病的非限制性例子包括紅斑狼瘡、接觸性皮炎、濕疹、帶狀皰疹、帶狀皰疹后神經(jīng)痛、痛覺過敏、慢性疼痛、刺激性腸病、克羅恩氏病、結(jié)腸炎、膀胱炎、多發(fā)性硬化、哮喘、銀屑病和關(guān)節(jié)炎，包括慢性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。優(yōu)先的用本發(fā)明方法進(jìn)行治療的疾病是炎性疾患，如哮喘、多發(fā)性硬化、關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡和銀屑病。
“炎性疾患”是一種疾患，其特征為一處或多處疼痛、發(fā)熱、發(fā)紅、腫脹和功能喪失，并且和組織損傷、感染、刺激或破損有關(guān)。
術(shù)語(yǔ)“疾病狀態(tài)”指細(xì)胞或整個(gè)哺乳動(dòng)物的一種生理狀態(tài)，該狀態(tài)中發(fā)生了細(xì)胞或身體功能系統(tǒng)或器官功能的中斷、停止或失調(diào)。
術(shù)語(yǔ)“有效量”或“治療有效量”指治療和/或預(yù)防哺乳動(dòng)物的疾病，紊亂或有害生理狀態(tài)的藥物有效量。在本發(fā)明中，“有效量”的抗IFN抗體可以防止降低、減緩或延遲自身免疫失調(diào)癥如狼瘡、多發(fā)性硬化、哮喘、銀屑病或關(guān)節(jié)炎的發(fā)作；降低、防止或抑制(即，某種程度的減緩和優(yōu)選停止)自身免疫失調(diào)癥如狼瘡、多發(fā)性硬化、哮喘、銀屑病或關(guān)節(jié)炎的發(fā)生；和/或某種程度上減輕一種或多種與這種疾病有關(guān)的癥狀。
在本發(fā)明的方法中，“對(duì)照”及其字石的變化是用來(lái)指預(yù)防、部分或完全抑制、降低、延遲或減緩不希望的事件，如生理狀況，如與哮喘等疾病有關(guān)的炎癥反應(yīng)。
“治療”是指治療處理和預(yù)防或預(yù)防性措施。需要治療的個(gè)體包括那些已經(jīng)患病的個(gè)體以及易患病的個(gè)體，或那些要預(yù)防疾病的個(gè)體。為了本發(fā)明的目的，有益或所需的臨床結(jié)果包括(但不限于)減輕癥狀、縮小疾病的范圍、穩(wěn)定(即，不再惡化)疾病的狀態(tài)，延遲或減緩疾病的進(jìn)展、改善或減輕疾病的狀態(tài)、和緩解癥狀(無(wú)論部分或全部)，無(wú)論是可檢測(cè)或是不可檢測(cè)的?！爸委煛币部梢灾概c期望的存活期相比(如果未接受治療)，延長(zhǎng)存活期。由此，需要治療的對(duì)象包括那些已經(jīng)患病的個(gè)體以及易患病的個(gè)體，或那些要預(yù)防疾病的個(gè)體。
對(duì)免疫系統(tǒng)的“顯著副作用”是危及免疫系統(tǒng)的作用和/或抑制對(duì)抗原攻擊產(chǎn)生正常免疫反應(yīng)的作用。對(duì)免疫系統(tǒng)的顯著副作用的例子或許是降低的體液免疫反應(yīng)。
“藥學(xué)上可接受的”載體、賦形劑或穩(wěn)定劑是指那些在使用劑量和濃度下對(duì)暴露于其中的細(xì)胞或哺乳動(dòng)物無(wú)毒的物質(zhì)。通常，生理上可接受的載體是pH緩沖水溶液。生理上可接受的載體的例子包括緩沖劑，如磷酸、檸檬酸和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(小于約10個(gè)殘基)多肽類；蛋白質(zhì)類，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸類，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、雙糖和包括葡萄糖、甘露糖或糊精在內(nèi)的其它碳水化合物；螯合劑，如EDTA；糖醇類，如甘露糖醇、或山梨糖醇；形成鹽的反荷離子，如鈉離子；和/或非離子表面活性劑，如TWEEN、聚乙二醇(PEG)和PLURONIC(普朗尼友，聚丙二醇與環(huán)氧乙烷的加聚物)。
“脂質(zhì)體”是由各種類型的脂質(zhì)、磷脂和/或表面活性劑構(gòu)成的小載體，它可有效地將藥物(如這里所述的抗NGF抗體和任選的化學(xué)治療劑)輸送給哺乳動(dòng)物。脂質(zhì)體的組分通常排成雙層結(jié)構(gòu)，與生物膜的脂質(zhì)排列類似。
術(shù)語(yǔ)“藥品說明書”是指通常包括在治療產(chǎn)品的商業(yè)包裝內(nèi)的說明書，它包括關(guān)于適應(yīng)癥、用法、劑量、用藥方法、禁忌癥的信息和/或與此類治療產(chǎn)品的的警告。
出于治療的目的，“哺乳動(dòng)物”是指歸類于哺乳動(dòng)物的任何動(dòng)物，包括人、家畜和農(nóng)畜、以及動(dòng)物園的動(dòng)物、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物或?qū)櫸?，比如狗類、馬類、貓類、牛類等。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物是人。
B.實(shí)施本發(fā)明的方法下面將更詳細(xì)的描述在哮喘小鼠模型中施用抗NGF單克隆抗體911可減輕呼吸道過度反應(yīng)性和炎癥，但不會(huì)降低對(duì)吸入抗原的體液免疫反應(yīng)(用總血清免疫球蛋白水平和血清IgE水平測(cè)量)。
抗NGF抗體是此領(lǐng)域已知的。用于本發(fā)明的抗NGF抗體包括多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、雙特異性抗體、異綴合抗體(heteroconjugate antibody)和抗體片段，以及修飾的抗體，包括抗體的糖基化變體，抗體的氨基酸序列變體和共價(jià)修飾的抗體。所述抗體可用此領(lǐng)域已知的任何方法制備。
因此，可使用Kohler等，Nature，256495(1975)第一次描述的雜交瘤方法制備單克隆抗體，或可使用重組DNA方法制備(美國(guó)專利4,816,567號(hào))。
在雜交瘤方法中，對(duì)小鼠或其它適當(dāng)?shù)乃拗鲃?dòng)物，例如倉(cāng)鼠或獼猴，如本文上述方法進(jìn)行免疫以誘導(dǎo)產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生與免疫所用蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體的淋巴細(xì)胞。或者，可體外免疫淋巴細(xì)胞。然后，采用合適的融合劑(例如聚乙二醇)使淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，以形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，《單克隆抗體原理和實(shí)踐》(Monoclonal AntibodyPrinciples and Practice)，55-103頁(yè)，[AcademicPress，1986])。在合適的培養(yǎng)基中接種和培育這樣制備的雜交瘤細(xì)胞，該培養(yǎng)基優(yōu)選含有一種或多種能抑制未融合細(xì)胞、親代骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的物質(zhì)。例如，如果親代骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，雜交瘤的培養(yǎng)基一般包括次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，阻止了缺乏HGPRT的細(xì)胞的生長(zhǎng)。優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是小鼠骨髓瘤細(xì)胞系，例如購(gòu)自美國(guó)加利福尼亞州圣迭戈索克研究所細(xì)胞分配中心的MOP-21和M C.-11小鼠腫瘤細(xì)胞衍生的細(xì)胞，和購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，Rockville，美國(guó)馬里蘭州)的SP-2或X63-Ag8-653細(xì)胞。對(duì)于人單克隆抗體的生產(chǎn)還報(bào)道了人骨髓瘤和小鼠-人異骨髓瘤細(xì)胞系(Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；Brodeur等，單克隆抗體的生產(chǎn)技術(shù)和應(yīng)用《(MonoclonalAntibody)Production Techniques and Applications)，51-63頁(yè)，Marcel Dekker公司，紐約，)。測(cè)試培育雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基產(chǎn)生針對(duì)抗原的單克隆抗體。較佳地，雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性可通過免疫沉淀法或體外結(jié)合試驗(yàn)，例如放射免疫試驗(yàn)(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定。例如，單克隆抗體的結(jié)合親和力可，通過Munson等，Anal.Biochem.，107220(1980)的Scatchard分析測(cè)定。鑒定到產(chǎn)生具有所需特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，可將該細(xì)胞通過有限稀釋步驟亞克隆和用標(biāo)準(zhǔn)方法培育(Goding，《單克隆抗體原理和實(shí)踐》(Monoclonal AntibodyPrinciples and Practice)，59-103頁(yè)(Academic Press，1986))。通過常規(guī)免疫球蛋白純化方法，例如蛋白質(zhì)A-瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，可合適地從培養(yǎng)基、腹水液或血清分離得到亞克隆分泌的單克隆抗體。
抗體的重組生產(chǎn)需要分離編碼抗體或抗體鏈的DNA。
容易地分離編碼單克隆抗體的DNA并用常規(guī)方法測(cè)序(例如采用能夠與編碼單克隆抗體的重鏈和輕鏈的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)。雜交瘤細(xì)胞可用作這種DNA的優(yōu)選來(lái)源。一旦分離，可將該DNA放入表達(dá)載體中，然后轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞，中華倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或不另外產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞，以在重組宿主細(xì)胞中獲得合成的單克隆抗體。還可修飾此DNA，例如，以人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列取代同源的小鼠序列，Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851(1984)，或?qū)⒎?免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價(jià)結(jié)合。以這種方式，制備了與這里的抗-NGF單克隆抗體特異性結(jié)合的“嵌合”或“雜交”抗體。
通常用這種非免疫球蛋白多肽取代本發(fā)明抗體的恒定區(qū)，或用它們?nèi)〈景l(fā)明抗體的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變區(qū)以產(chǎn)生含有一個(gè)對(duì)天然NGF多肽有特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)和另一個(gè)對(duì)不同靶(如高親和IgE受體或TNF受體)有特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)的嵌合二價(jià)抗體。還可以采用在合成蛋白質(zhì)化學(xué)中已知的方法，包括那些與交聯(lián)劑有關(guān)的方法，在體外制備嵌合抗體或雜交抗體。例如，可以彩二硫化物交換反應(yīng)或通過形成硫醚鍵來(lái)構(gòu)建免疫毒素。用于此目的的合適的試劑例子包括亞氨基硫醇鹽和甲基-4-巰基丁酰亞胺酸鹽。
非人抗體(如鼠抗體)可被人源化。通常，人源化抗體中有一個(gè)或多個(gè)非人源的氨基酸殘基被引入。這些非人的氨基酸殘基通常被稱為“輸入”殘基，它們通常取自“輸入”可變區(qū)?？梢园凑誛inter和同事的方法[Jones等，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，2391534-1536(1988)]，通過用嚙齒動(dòng)物的CDR或CDR序列取代人抗體的相應(yīng)序列，從而實(shí)質(zhì)性地進(jìn)行人源化。
重要的是，被人源化的抗體保持對(duì)抗原的高度親和力和其它良好的生物學(xué)性質(zhì)。為達(dá)到這個(gè)目的，根據(jù)優(yōu)選的方法，人源化抗體是用親本和人源化序列的三維模型，通過測(cè)定親本序列和各種概念上的人源化產(chǎn)物的方法制備的。三維免疫球蛋白模型一般可得到，且它們對(duì)于這一領(lǐng)域中的技術(shù)人員是熟悉的。圖示并顯示經(jīng)過選擇的候選免疫球蛋白序列可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序是可以獲得的。對(duì)這些顯示的檢查使得能夠分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中所起的可能的作用，即分析殘基對(duì)候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合能力的影響。用這種方法，可從共有序列和輸入序列中選擇并結(jié)合FR殘基，從而獲得所需的抗體特性，如提高了對(duì)靶抗原的親和力。通常，CDR殘基直接并最主要地參與影響抗原結(jié)合。為了解進(jìn)一步的細(xì)節(jié)可以參閱美國(guó)專利5,821,337號(hào)。
本發(fā)明還包括人抗NGF抗體。如上所述，這種人抗體可通過雜交瘤方法制備，用人骨髓瘤和小鼠-人異骨髓瘤細(xì)胞系來(lái)生產(chǎn)人單克隆抗體(例如參見Kozbor，J.Immnol.133，3001(1984)，和Brodeur等，《單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)和應(yīng)用》(Monoclonal Antibody Prodution Techniques and Applications)，51-63頁(yè)(MarcelDekker公司，紐約，(1987))。此外，還能夠生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)，該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物免疫后能夠產(chǎn)生人抗體庫(kù)而不產(chǎn)生內(nèi)源性免疫球蛋白。例如，已描述了嵌合性小鼠和種系突變小鼠中抗體重鏈接合區(qū)(JH)基因的純合缺失導(dǎo)致內(nèi)源性抗體產(chǎn)生的完全抑制。在這種種系突變小鼠中，人種系免疫球蛋白基因陣列的轉(zhuǎn)移將導(dǎo)致抗原攻擊后人抗體的生產(chǎn)。見例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551-255(1993)；Jakobovits等，對(duì)于此技術(shù)的改進(jìn)方案也可參見Nature362，255-258(1993)。Mendez等(Nature Genetics 15146-156(1997))。
另外，可采用噬菌體展示技術(shù)(McCafferty等，Nature 348552-553(1990)，從未免疫的供體獲得的免疫球蛋白可變(V)區(qū)的基因庫(kù)，體外生產(chǎn)人抗體和抗體片段。根據(jù)這一技術(shù)，可將抗體V區(qū)基因框內(nèi)克隆入絲狀噬菌體，例如M13或fd的大或小外被蛋白基因中，并在噬菌體顆粒表面上作為功能性抗體片段展示。因?yàn)榻z狀噬菌體顆粒含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，基于抗體功能特性的選擇還導(dǎo)致編碼顯示那些特性的抗體的基因的選擇。因此，噬菌體模擬了B-細(xì)胞的一些特性。噬菌體展示可以多種形式進(jìn)行；對(duì)于它們的評(píng)論見，如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，Current Opinion in Structural Biology3564-571(1993)。幾種來(lái)源的V-基因節(jié)段可用于噬菌體展示。Clackson等，Nature352624-628(1991)從衍生自免疫小鼠脾的小的隨機(jī)組合的V基因文庫(kù)分離得到了抗-唑酮抗體的多樣性陣列?？蓸?gòu)建未免疫人供體的V基因庫(kù)，可基本上依照Marks等，J.Mol.Biol.222581-597(1991)，或Griffith等，EMBO J.12725-734(1993)描述的技術(shù)分離針對(duì)抗原(包括自身抗原)多樣性陣列的抗體。在天然免疫應(yīng)答反應(yīng)中，抗體基因以高速累積突變(體細(xì)胞高突變)。引入一些變化將賦予較高的親和力，顯示高親和性表面免疫球蛋白的B-細(xì)胞在隨后的抗原攻擊中優(yōu)先復(fù)制和分化。通過采用稱為“鏈改組”的技術(shù)可模擬這一自然過程(Marks等，Bio/Technol.10779-783)。在該方法中，噬菌體展示獲得的“初級(jí)”人抗體的親和力可通過用從未免疫供體獲得的V區(qū)基因天然產(chǎn)生的變體(文庫(kù))取代重鏈和輕鏈V區(qū)基因而得以改進(jìn)。這一技術(shù)得以產(chǎn)生具有親和力nM范圍的抗體和抗體片段。制備非常大的噬菌體抗體庫(kù)[也稱作“所有文庫(kù)的母體″(the mother-of-all libraries)]的方法已由Waterhouse等，Nucl.Acids Res.212265-2266(1993)描述，從這種大的噬菌體文庫(kù)直接分離高親和力的人抗體由Griffith等，EMBO J.133245-3260(1994)報(bào)道。
基因改組也可用于從嚙齒動(dòng)物抗體產(chǎn)生人抗體，其中人抗體具有與起始的嚙齒動(dòng)物抗體相似的親和性和特異性。根據(jù)這種也稱作“表位印記”的方法，用噬菌體展示技術(shù)獲得嚙齒動(dòng)物抗體的重鏈或輕鏈V區(qū)基因用人V區(qū)基因庫(kù)取代，產(chǎn)生嚙齒動(dòng)物-人嵌合體?？乖x擇導(dǎo)致能夠恢復(fù)功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)的人可變區(qū)的分離，即，表位控制(印記)配偶體的選擇。為了取代余下的嚙齒動(dòng)物V區(qū)重復(fù)這一過程時(shí)，獲得了人的抗體(見PCT專利申請(qǐng)WO 93/06213，發(fā)表于1993年4月1日)。與傳統(tǒng)的通過CDR移植人源化嚙齒動(dòng)物抗體不同，此技術(shù)提供完全的人抗體，它不具有嚙齒動(dòng)物來(lái)源的構(gòu)架和CDR殘基。
本發(fā)明還特別地包括雙特異性抗體。通常，雙特異性抗體的重組生產(chǎn)基于兩種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)的共表達(dá)，這里的兩條重鏈有不同的特異性(Millstein和Cuello，Nature305，537-539(1983))。根據(jù)一個(gè)不同且更優(yōu)選的方法，有所需結(jié)合特異性的抗體可變區(qū)(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))被融合到免疫球蛋白恒定區(qū)序列上。最好是和含有至少部分鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合。優(yōu)選在至少一個(gè)融合體中存在含有輕鏈結(jié)合所必需的位點(diǎn)的第一個(gè)重鏈恒定區(qū)(CH1)。編碼免疫球蛋白重鏈融合體的DNA，如果需要的話，免疫球蛋白輕鏈被插入獨(dú)立表達(dá)的載體并共轉(zhuǎn)染入合適的宿主生物中。當(dāng)用于構(gòu)建比例不等的三種多肽鏈提供了最佳產(chǎn)量時(shí)，這為調(diào)節(jié)實(shí)施例中的三種多肽片段的相互比例提供了很大的靈活性。然而，當(dāng)至少兩種多肽鏈以等比例表達(dá)導(dǎo)致高產(chǎn)量，或當(dāng)這些比例不是特別重要時(shí)，也可以在一種表達(dá)載體中插入兩種或三種多肽鏈的編碼序列。對(duì)于產(chǎn)生雙特異性抗體的進(jìn)一步細(xì)節(jié)，可以參閱，例如，Suresh等，Methods inEnzymology121，210(1986)。
異綴合抗體也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。異綴合抗體由兩個(gè)共價(jià)結(jié)合的抗體組成。建議這種抗體(例如)將免疫系統(tǒng)的細(xì)胞靶向不想要的細(xì)胞(美國(guó)專利4,676,980號(hào))以及治療HIV感染(PCT申請(qǐng)公布第WO 91/00360和WO 92/200373號(hào)；歐洲專利03089號(hào))。可以用任何方便的交聯(lián)法制備異綴合抗體。合適的交聯(lián)法在本領(lǐng)域中是已知的，且在美國(guó)專利4,676,980號(hào)中公開了許多交聯(lián)技術(shù)。
抗體片段通常是通過蛋白酶解消化完整的抗體得到的(參閱，例如，Morimoto等，J.Biochem.Biophys.Methods 24107-117(1992)和Brennan等，Science22981(1985))。然而，現(xiàn)在可以直接通過重組宿主細(xì)胞生產(chǎn)這些片段。例如，F(xiàn)ab’-SH片段可以從大腸桿菌中直接回收并化學(xué)偶聯(lián)形成F(ab’)2片段(Carter等，Biol/Technology 10163-167(1992))。另一實(shí)施例中，F(xiàn)(ab’)2片段是用亮氨酸拉鏈GCN4促進(jìn)F(ab’)2分子的組裝而形成的。根據(jù)另一種方法，可以從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中直接分離Fv、Fab或F(ab’)2片段。其它生產(chǎn)抗體片段的方法對(duì)于熟練的技術(shù)人員是顯見的。
在本發(fā)明的某些實(shí)施例中可能需要修飾抗體片段以增加其血清半衰期。例如，這可以通過將補(bǔ)救受體結(jié)合的抗原表位摻入到抗體片段中實(shí)現(xiàn)(例如，通過突變抗體片段中合適的區(qū)域，或在肽標(biāo)記物中摻入抗原表位，然后再(例如)通過DNA或肽合成，將標(biāo)記物融合到抗體片段的任一端或中間)。參見公布于1996年10月17日的WO 96/32478。
補(bǔ)救受體結(jié)合的抗原表位通常含有一個(gè)區(qū)域，其中Fc域的一個(gè)或兩個(gè)環(huán)上的任何一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被轉(zhuǎn)移到抗體片段的類似位置上。更優(yōu)選的是，F(xiàn)c域的一個(gè)或兩個(gè)環(huán)上的三個(gè)或更多的殘基被轉(zhuǎn)移。再優(yōu)選的是，抗原表位取自Fc區(qū)(如來(lái)自IgG)的CH2域并被轉(zhuǎn)移到抗體的CH1、CH3或VH區(qū)或多個(gè)這種區(qū)域?；蛘?，抗原表位取自Fc區(qū)的CH2域并被轉(zhuǎn)移到抗體的CL區(qū)或VL區(qū)，或這兩個(gè)區(qū)。
通過編碼DNA中引入合適的核苷酸改變或通過肽合成制備抗NGF抗體的氨基酸序列變體，包括取代、插入和/或缺失變體。制造這些變體的方法在此領(lǐng)域是熟知的，包括，例如，Cunningham和Wells在Science，2441081-1085(1989)中所描述的“丙氨酸掃描誘變”。特定類型的抗體的氨基酸變體可改變?cè)摽贵w的原始糖基化模式。改變意味著刪除該抗體中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)糖類部分，和/或加入一個(gè)或多個(gè)該抗體中不存在的糖基化位點(diǎn)。
篩選具有所需特性的抗體用于本發(fā)明的抗體可中和NGF的活性。因此，例如，本發(fā)明的中和抗NGF抗體可通過將候選抗體和NGF一起培養(yǎng)并監(jiān)測(cè)結(jié)合和NGF的生物活性的中和作用來(lái)鑒定。結(jié)合測(cè)定可用純化的NGF多肽進(jìn)行，或用天然表達(dá)NGF多肽或轉(zhuǎn)染表達(dá)NGF多肽的細(xì)胞進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合測(cè)定是競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定，其中評(píng)價(jià)了候選抗體與已知的抗NGF抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合NGF的能力。該測(cè)定可用各種方式進(jìn)行，包括ELISA。
候選抗體中和NGF的生物活性的能力可通過，例如，監(jiān)測(cè)候選抗體抑制NGF介導(dǎo)的胚胎大鼠背根神經(jīng)節(jié)存活生物測(cè)定中存活的能力來(lái)進(jìn)行，這一過程如Hongo等所述(Hybridoma 19215-227(2000))。
為篩選與NGF(由感興趣的抗體結(jié)合)上的表位結(jié)合的抗體，進(jìn)行了常規(guī)的交叉封閉測(cè)定(cross-blocking assay)，這一方法描述在《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Antibodies)，A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Lavoratory，Harlow和David Lane編(1988)?；蛘撸虼送?，還可用此領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行表位作圖。例如，可通過Fendly等在Cancer Research 501550-1558(1990)中描述的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析法來(lái)確定被本發(fā)明的單克隆抗體結(jié)合的NGF表位。交叉封閉研究可在完整細(xì)胞上通過直接熒光進(jìn)行，用PANDEXTM篩選機(jī)來(lái)量化熒光。在該方法中用已經(jīng)建立的方法(Wofsy等，《細(xì)胞免疫的選擇方法》(Selected Methods in CellularImmunology)第287頁(yè)，Mishel和Schiigi編，舊金山，W.J.Freeman公司(1980))使單克隆抗體與異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)。將懸液中的NGF表達(dá)細(xì)胞和純化的單克隆抗體加到PANDEXTM平板的孔中并培育，并用PANDEXTM量化熒光。與不相關(guān)的單克隆抗體對(duì)照相比，如果每個(gè)單克隆抗體以50％或更大比例阻止其它抗體的結(jié)合，則單克隆抗體被認(rèn)為共享這一表位。
也可用組合文庫(kù)來(lái)鑒定用于本發(fā)明的抗NGF抗體以篩選具有所需活性的合成抗體克隆。這種方法是此領(lǐng)域熟知的。簡(jiǎn)言之，可用含有噬菌體的篩選噬菌體文庫(kù)來(lái)選擇合成的抗體克隆以展示融合到噬菌體外被蛋白上的抗體可變區(qū)(Fv)的各種片段(如Fab、F(ab’)2等)。這種噬菌體文庫(kù)用抗所需抗原的親和層析顯示。能夠結(jié)合所需抗原的表達(dá)Fv片段的克隆被吸附到抗原上，因此從文庫(kù)中未結(jié)合的克隆中分離。然后將結(jié)合的克隆從抗原中洗脫，并可通過額外的抗原吸附/洗脫循環(huán)進(jìn)一步富集。為得到用于本發(fā)明的合適的抗NGF抗體，可設(shè)計(jì)合適的抗原篩選程序以選擇感興趣的噬菌體克隆，然后用來(lái)自感興趣的噬菌體克隆的Fv序列和合適的恒定區(qū)(Fc)序列構(gòu)建全長(zhǎng)的抗NGF抗體。
在基于細(xì)胞的生物測(cè)定中獲得結(jié)果然后可在動(dòng)物(如鼠類)模型和人臨床試驗(yàn)中試驗(yàn)。重要的話，具有所需特性的鼠單克隆抗體可被轉(zhuǎn)化成嵌合抗體，或用此領(lǐng)域熟知的技術(shù)將其轉(zhuǎn)化成人源化抗體，包括美國(guó)專利5,821,337中所述的“基因轉(zhuǎn)化誘變”方法。
C.藥物制劑用于本發(fā)明抗體的治療制劑是為儲(chǔ)存制備的，方法是將有所需純度的抗體和任選的藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑《Remington制藥科學(xué)》第16版，Osol，A.編(1980))混合，制成凍干制劑或水溶液的形式。可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在用藥劑量和濃度對(duì)受體是無(wú)毒的，并且包括像磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它無(wú)機(jī)鹽之類的緩沖液；抗氧化劑包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯、氯化芐乙氧銨；酚、丁基或芐基醇；烷基對(duì)羥基苯甲酸酯類，如甲基或丙基對(duì)羥基苯甲酸酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇和間甲酚)；低分子量(小于約10個(gè)殘基)多肽類；蛋白質(zhì)類，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸類，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、雙糖和包括葡萄糖、甘露糖或糊精在內(nèi)的其它碳水化合物；螯合劑，如EDTA；糖類，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨醇；形成鹽的反荷離子，如鈉離子；金屬?gòu)?fù)合物(例如，鋅-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，如TWEEN、普朗尼克或聚乙二醇(PEG)。
本發(fā)明方法中使用的中和抗NGF抗體還可以制成免疫脂質(zhì)體。含有抗體的脂質(zhì)體是用這一領(lǐng)域中已知的方法制備的，比如在Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 823688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774030(1980)；和美國(guó)專利4,485,045和4,544,545號(hào)中描述的方法。具有提高循環(huán)時(shí)間的脂質(zhì)體公開在美國(guó)專利5,013,556號(hào)中。
特別有用的脂質(zhì)體可以和含有磷酯酰膽堿、膽固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)成分用反相蒸發(fā)法產(chǎn)生。脂質(zhì)體是通過有規(guī)定孔徑的濾膜擠出以產(chǎn)生具有所需直徑的脂質(zhì)體。如Marin等，J.Biol.Chem.257286-288(1982)中所描述的，本發(fā)明抗體的Fab’片段通過二硫化物交換反應(yīng)可以和脂質(zhì)體偶聯(lián)。脂質(zhì)體中任選地含有一種化學(xué)治療劑(比如阿霉素)。參閱Gabizon等，J.NationalCancer Inst.81(19)1484(1989)。
這種活性成分可以包載在微膠囊中，例如，可以通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合作用制備微膠囊，例如，膠體藥物傳遞系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)或大乳劑中分別有羥甲基纖維素或明膠-微膠囊和聚(甲基異丁烯酸脂)微膠囊。此類技術(shù)描述在《Remington制藥科學(xué)》第16版，Osol，A.編(1980)中。
可以制備緩釋制劑。緩釋制劑的合適的例子包括含有抗體的固態(tài)疏水聚合物的半透基質(zhì)，這些基質(zhì)呈成型物體的形式，如薄膜或微膠囊。緩釋基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-異丁烯酸脂)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國(guó)專利3,773,919號(hào))、L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸鹽的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林組成的可注射的微球體)以及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
這里的制劑還可含有一種以上的活性成分，這種活性成分是特定的治療適應(yīng)癥所必需的，優(yōu)選相互之間沒有副作用的具有互補(bǔ)活性的化合物。
例如，還可提供與NGF的不同表位或一種制劑中的NGF受體結(jié)合的抗體?；蛘?，或此外，所述組合物還可含有其它生物活性化合物，如消炎劑。這種分子以適當(dāng)?shù)膶?duì)所需目的有效的量組合存在。
用于體內(nèi)用藥的制劑必須是無(wú)菌的。這可簡(jiǎn)單地通過，例如，通過無(wú)菌濾膜過濾實(shí)現(xiàn)。
用于治療的抗NGF抗體組合物通常被置于具有無(wú)菌出口的容器中，例如，靜脈溶液袋(intravenous solution bag)或小瓶，它具有一個(gè)可被皮下注射針頭穿過的塞子。
D.用抗NGF抗體治療根據(jù)本發(fā)明，估計(jì)可以用抗NGF抗體來(lái)治療各種疾病或病癥。這些疾患或疾病的例子包括哮喘、銀屑病和關(guān)節(jié)炎。所述抗NGF抗體可用來(lái)預(yù)防疾病狀態(tài)的發(fā)生，治療目前出現(xiàn)的癥狀和治療處于潛伏期的疾病。
盡管對(duì)控制過敏反應(yīng)和改進(jìn)治療的細(xì)胞和分子機(jī)制有了更深的了解，過敏性疾病，尤其是哮喘的發(fā)生率近年來(lái)急劇增加(Beasley等，J.Allergy Clin.Immunol.105466-472(2000)；Peat和Li，J.Allergy Clin.Immunol.1031-10(1999))。例如可以用基于變應(yīng)原的疫苗接種來(lái)治療過敏性疾病，其中，變應(yīng)原的注射劑量逐年增加。大多數(shù)患者通?？赏ㄟ^吸入相對(duì)較低劑量的皮質(zhì)類固醇來(lái)控制輕度哮喘，而中度哮喘通常需要再吸入長(zhǎng)效β-拮抗劑或白三烯抑制劑。然而，治療嚴(yán)重哮喘仍是嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)問題。盡管目前正在等待FDA批準(zhǔn)的抗IgE抗體(rhuMAb-E25，XOLAIRTM，由Genentech公司、Tanox公司和Novartis醫(yī)藥公司合作開發(fā))有希望用于早期介入治療導(dǎo)致過敏性哮喘和季節(jié)性過敏性鼻炎癥狀的病癥，但仍需要開發(fā)其它控制過敏性疾病，如哮喘的治療方法和治療劑。
本發(fā)明的抗NGF抗體可用于治療哮喘和其它與呼吸道過度反應(yīng)性有關(guān)的病癥，這些病癥通常以咳嗽、哮鳴、胸悶的發(fā)作和/或呼吸問題為特征。
本發(fā)明的抗NGF抗體還可用于控制其它炎性疾患，如多發(fā)性硬化、結(jié)腸炎、炎性腸病、膀胱炎、濕疹、接觸性皮炎、關(guān)節(jié)炎(包括慢性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、克羅恩氏病和銀屑病。
此外，抗NGF抗體還可用于治療其它可能與升高的NGF水平有關(guān)的疾病，例如包括紅斑狼瘡、帶狀皰疹、帶狀皰疹后神經(jīng)痛、痛覺過敏和慢性疼痛。
所述抗NGF抗體施用于哺乳動(dòng)物，優(yōu)選是人患者，按照已知的方法，如靜脈注射，例如推注或在一段時(shí)期內(nèi)連續(xù)灌輸；通過肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑液內(nèi)、鞘內(nèi)、口服或局部途徑施用。也可通過吸入給予抗NGF抗體。市場(chǎng)上可買到的霧化器用于液體制劑，包括噴霧式霧化器和超聲霧化器來(lái)給藥。液體制劑可被直接霧化，凍干粉末可在重建后霧化?；蛘撸捎梅贾苿┖投课肫鲗⒖筃GF抗體分散霧化，或?qū)⑵渥鳛閮龈刹⒀心サ姆勰┪搿?br> 為治療哮喘和其它以呼吸道過度反應(yīng)性為特征的疾患，優(yōu)選的施用途徑是吸入。
在施用抗NGF抗體時(shí)可聯(lián)合使用其它治療方案。聯(lián)合用藥包括使用單獨(dú)制劑或單一藥物制劑的共施用(co-administration)，和連續(xù)施用，連續(xù)施用可以任何順序進(jìn)行，其中優(yōu)選在一段時(shí)間內(nèi)兩種(或所有)活性劑同時(shí)發(fā)揮其生物活性。為治療哮喘，將這里的抗體和抗IgE抗體，尤其是rhuMAb-E25(XolairTM)，或者和第二代抗體分子rhuMAb-E26(Genentech公司)聯(lián)合使用特別有利。rhuMAb-E25抗體是一種重組型人源化抗IgE單克隆抗體，它被用于過敏早期干涉過敏性過程。聯(lián)合使用還包括以下可能性，即在一種藥物制劑中使用兩種抗體，或使用具有抗NGF和抗IgE特異性的雙特異性抗體。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將這里的抗NGF抗體和吸入的皮質(zhì)類固醇(如丙酸倍氯米松(BDP))治療聯(lián)合施用。為治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或克羅恩氏病，本發(fā)明的抗體可以和其它已知治療這些疾患的治療方案聯(lián)合施用。例如，這里的抗NGF抗體可以和Remicade(Infliximab，Centocor)或Enbrel(Etanercept，Wyeth-Ayerst)聯(lián)合施用。本發(fā)明還包括靶向這些疾病的雙特異性抗體。例如，雙特異性抗體可包括與本文所述抗體的NGF結(jié)合能力結(jié)合的抗TNF特異性。
任何上述共施用試劑的合適劑量就是目前使用的劑量，并且由于試劑和抗NGF抗體的聯(lián)合作用(協(xié)同作用)且劑量可以略低。
為預(yù)防或治療疾病，抗NGF抗體的適當(dāng)劑量取決于所用的抗NGF抗體、待治療的疾病類型、該疾病的嚴(yán)重程度和過程，無(wú)論所述抗體是出于預(yù)防或治療目的而施用的，以前的治療、病從的臨床史和對(duì)抗體的反應(yīng)以及主治醫(yī)生的判斷。通常，臨床醫(yī)生會(huì)給予抗NGF抗體直到能獲得所需結(jié)果的劑量。
所述抗NGF抗體是同時(shí)或在一系列治療時(shí)適當(dāng)?shù)亟o予患者的。
根據(jù)疾病的類型和嚴(yán)重程度，給予患者的初始備選劑量約為2mg/kg抗體，例如，可以一次給予或多次單獨(dú)給予，或給予連續(xù)劑量或重復(fù)劑量。常規(guī)的日劑量約為1g/kg-100mg/kg或更多，這取決于上述因素。為在數(shù)天或更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)重復(fù)給藥，根據(jù)疾患，所述治療可持續(xù)直至疾病癥狀得到所需的控制。優(yōu)選的劑量方案包括最初給予的抗NGF抗體的劑量約為2mg/kg，然后每周給予維持課題約1mg/kg的抗NGF抗體。然而，其它劑量方案也是有效的，這取決于醫(yī)生所希望達(dá)到的藥代動(dòng)力學(xué)衰變模式。這種治療進(jìn)展容易通過常規(guī)的技術(shù)和測(cè)定方法監(jiān)控。
E.制造產(chǎn)品在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種制造產(chǎn)品，它含有用于治療上述病癥的物質(zhì)。所述制造產(chǎn)品包括容器以及位于容器上或與容器相連的標(biāo)簽或藥品說明書。合適的容器包括，例如，瓶子、小瓶、針筒等。所述容器可由各種材料制成，如玻璃或塑料。所述容器中裝有一種可有效治療上述疾患的組合物，并具有一無(wú)菌出口(例如，所述容器可以是靜脈溶液袋或小瓶，它具有一個(gè)可被皮下注射針頭穿過的蓋子)。
所述組合物中至少一種活性劑是抗NGF抗體。所述容器中還可有第二種藥物活性劑。第二種藥劑優(yōu)選適合治療炎性疾病，如哮喘，多發(fā)性硬化，關(guān)節(jié)炎，紅斑狼瘡和銀屑病。
標(biāo)簽或藥品說明書指出所述組合物是用來(lái)治療特定疾患的，如炎性疾患。在一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)簽或藥品說明書指出所述含有結(jié)合NGF的抗體的組合物可用來(lái)治療選自哮喘，多發(fā)性硬化，關(guān)節(jié)炎，紅斑狼瘡和銀屑病的炎性疾患。此外，所述標(biāo)簽或藥品說明書可指出被治療的患者患有哮喘，銀屑病，關(guān)節(jié)炎或其它疾病或病癥。此外，所述制造產(chǎn)品可包括，(a)其中含有組合物的第一個(gè)容器，其中所述組合物可包含結(jié)合NGF并抑制其生物活性的第一抗體；和(b)其中含有組合物的第二個(gè)容器，其中所述組合物包含結(jié)合NGF受體并阻斷配體活化的第二抗體。本發(fā)明實(shí)施例中的制造產(chǎn)品還可包括藥品說明書，它指明第一種和第二種組合物可用來(lái)治療哮喘，銀屑病，關(guān)節(jié)炎或其它疾病或病癥。或者，或此外，所述制造產(chǎn)品還可包含第二個(gè)(或第三個(gè))容器，其中含有藥學(xué)上可接受的緩沖液，如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸緩沖鹽溶液、林格溶液或葡萄糖溶液。還可包含從商業(yè)和用戶角度所需的其它物質(zhì)，包括其它緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭和針筒。
在以下非限制性實(shí)施方案中將進(jìn)一步說明本發(fā)明的細(xì)節(jié)。
實(shí)施例除非另有說明，實(shí)施例中提到的市售的試劑按制造商的說明書使用。細(xì)胞的來(lái)源在以下實(shí)施例中確定，在整個(gè)說明書中ATCC登記號(hào)是指位于弗吉尼亞州馬納薩斯的美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心。
實(shí)施例1抗NGF單克隆抗體的生產(chǎn)和鑒定A.抗NGF單克隆抗體的生產(chǎn)該實(shí)施例描述了可特異性結(jié)合人NGF(hNGF)的單克隆抗體的制備。
生產(chǎn)單克隆抗體的技術(shù)是此領(lǐng)域熟知的，例如，它描述在Kohler和Milstein，Nature 256495-497(1975)。實(shí)施例1和2所描述的試驗(yàn)也描述在Hongo等，Hybridoma 19215-227。
用與Hongo等在Hybridoma 14253-260中描述的方法類似的方法建立一組由23只小鼠組成的抗hNGF單克隆抗體。簡(jiǎn)言之，用溶于Ribi佐劑(Ribi ImmunochemResearch公司，Hamilton，MO)的人NGF免疫Balb/c小鼠(Charles River實(shí)驗(yàn)室，Wilmington，DE)。小鼠的脾細(xì)胞證實(shí)了抗體對(duì)固定化NGF的最高滴度，將它們與小鼠的骨髓瘤細(xì)胞融合(X63.Ag8.653；美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心，洛克維爾，馬里蘭州)。10-14天后，收獲上清液并通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)篩選抗體。將第二輪克隆后顯示最高免疫活性的克隆注射到降植烷致敏的小鼠(Hoogenraad等，J.Immunol.Methods 6317-320(1983))以在體內(nèi)生產(chǎn)MAb。收集腹水液并用建立的方法(Moks等，Eur.J.Biochem.851205-1210(1986))在葡萄球菌蛋白A(Pharmacia)上通過親和層析(Pharmacia fast protein liquid chromatography；Pharmacia，Uppsala，Sweden)純化。純化的抗體制品通過無(wú)菌過濾并于4℃在磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中保存。
B.用結(jié)構(gòu)域交換突變體進(jìn)行表位作圖最初通過評(píng)價(jià)MAb對(duì)通過同源物掃描誘變產(chǎn)生的NGF/神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3(NT-3)嵌合蛋白的結(jié)合來(lái)確定抗NGF MAb表位特異性。用這種結(jié)構(gòu)域交換突變體明顯優(yōu)于缺失突變體。域的缺失可能會(huì)破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，而在域交換突變體中，用來(lái)自相關(guān)蛋白質(zhì)的大小類似且氨基酸序列大致相似的相應(yīng)域替代某一域則可能保留二級(jí)結(jié)構(gòu)。
用導(dǎo)向寡核苷酸的誘變產(chǎn)生8個(gè)hNGF/hNT-3嵌合突變體，所述突變體在hNGF相應(yīng)的可變區(qū)中包含3-7個(gè)人NT-3(hNT-3)的殘基取代(圖1)。所述嵌合突變體在人293細(xì)胞中短暫表達(dá)，并通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)評(píng)價(jià)抗hNGF MAb與突變型NGF的結(jié)合，如下所述，將純化的MAb作為捕獲抗體并用與HRP偶聯(lián)的親和純化的兔抗hNGF多克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)。進(jìn)行2-4獨(dú)立的定量ELISA以測(cè)定抗hNGFMAb與各種NGF突變體的結(jié)合，并將其與野生型NGF的結(jié)合進(jìn)行比較。
簡(jiǎn)言之，用每孔100L 1g/ml羊抗鼠IgG(Boehringer-Mannheim，印第安納波利斯，印第安納州)涂布微量滴定板(Nunc Maxisorb，VWR Scientific，舊金山，加利福尼亞州)，在4℃過夜，洗滌，并用含有0.05％ Tween 20和0.5％牛血清白蛋白(BSA，Intergen，圣迭戈，加利福尼亞州；PBS/BSA/T20)的PBS封閉多余的結(jié)合位點(diǎn)。在適當(dāng)?shù)目字屑尤隡Ab(在PBS/BSA/T20中稀釋至1g/mL)并在室溫下培育1-2小時(shí)。洗滌平板，加入100L野生型或突變型hNGF(在PBS/BSA/T20中稀釋至60ng/mL 7.8ng/mL)，在室溫下培育1-2小時(shí)并再次洗滌。加入與辣根過氧化物酶(HRP；110,000，存在于PBS/BSA/T20)偶聯(lián)的純化的兔抗hNGF多克隆抗體(100L/孔)并培育1小時(shí)。這樣就建立了平板，在雙波長(zhǎng)上閱讀。在相同的條件下MAb與hNGF突變體的結(jié)合與野生型hNGF結(jié)合比較(設(shè)定為100％)。
6種人抗NGF單克隆抗體(MAb 908，909，911，912，938和14.14)證明對(duì)hNGF具有高親和力(MAb 908，MAb 909，MAb 911，MAb 912，MAb 938和MAb 14.14的EC50分別為0.18nM，0.18nM，0.37nM，0.18nM，0.74nM和0.59nM)，并選擇與各種嵌合突變體的結(jié)合降低了60-90％以上的單克隆抗體(圖1)作進(jìn)一步的分析。如圖1所示，3種MAb(908，909和14.14)顯示了明顯的區(qū)域結(jié)合特異性，其特征為與單個(gè)可變區(qū)的最大結(jié)合損失了60-95％(圖1)。在MAB911、912和938上觀察到了可變區(qū)突變的較少的驚人的作用，有多個(gè)NGF可變區(qū)有助于這些抗體的結(jié)合表位。然而，包含這些表位的可變區(qū)在三維結(jié)構(gòu)內(nèi)靠近(圖3A)。
C.用定點(diǎn)誘變進(jìn)行表位作圖為進(jìn)一步確定對(duì)所選6種抗NGF MAb的表位特異性，產(chǎn)生了代表一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)氨基酸點(diǎn)突變的NGF突變體，表達(dá)和表征了這些突變體，特別關(guān)注上述區(qū)域中在TrkA和p75結(jié)合和生物功能中發(fā)揮作用的殘基(Shih等，J.Biol.Chem.，269(44)27679-27686(1994))。用上述ELISA鑒定這些突變對(duì)抗NGF MAb結(jié)合的作用。用ELISA結(jié)合曲線計(jì)算抗NGF MAb與各個(gè)突變體結(jié)合的平均EC50值，并將該值與用野生型NGF結(jié)合所得EC50值進(jìn)行比較(圖2A-F)。
用所有6種MAb，hNGF點(diǎn)突變體的結(jié)合特異性通常與以前鑒別的區(qū)域有關(guān)，這些區(qū)域是通過與特異性NGF嵌合突變體的結(jié)合損失鑒定的。然而，NGF點(diǎn)突變體對(duì)MAb 911和938結(jié)合的作用相對(duì)于在其它MAb上觀察到的作用并不顯著(圖2A-F)。所述突變作用的區(qū)域特異性與NGF嵌合突變體中發(fā)生交換的可變區(qū)內(nèi)或該區(qū)域附近的殘基有關(guān)，這導(dǎo)致MAb 911或938的最大結(jié)合損失了50-60％以上。對(duì)MAb911，這些突變包括K32A+K34A+E35A，Y79A+T81K，H84A+K88A和R103A。在突變E11A，Y52A和L112A+S113A附近觀察到了其它結(jié)合的損失(圖2C)。這說明MAb 911的表位跨越了7個(gè)hNGF可變區(qū)中的4個(gè)(圖3C)。
D.用MAb結(jié)合表位的結(jié)構(gòu)依賴性為確定抗NGF MAb與hNGF的結(jié)合是否取決于hNGF上表位的結(jié)構(gòu)構(gòu)象，評(píng)價(jià)了抗NGF MAb與非還原形式和還原形式hNGF的結(jié)合。將未處理的hNGF和用巰基乙醇處理還原的hNGF進(jìn)行凝膠電泳并轉(zhuǎn)移到硝化纖維印跡上以進(jìn)行免疫印跡分析。為檢測(cè)hNGF，洗滌硝化纖維印跡并將其和第一抗體和第二抗體一起培育，室溫下與魯米諾底物(Amersham International，Amersham，U.K.)邊攪拌邊暴露1分鐘，然后對(duì)x-射線膠片(Eastman Kodak，Rochester，NY)曝光10-45秒鐘。在圖4中可以看到，一些單克隆抗NGF抗體對(duì)還原形式的hNGF有最小結(jié)合。這些抗體包括MAb 938，908，911和912，這說明它們結(jié)合的hNGF上的表位在結(jié)構(gòu)上受到電荷改變和還原作用的影響。
E.抗NGF單克隆抗體上表位的分子建模鑒定的抗NGF MAb表位的分子建模表示法(圖3A-F)是用MidasPlus程序(加州大學(xué)舊金山分校，舊金山，加利福尼亞州)產(chǎn)生的，并基于上述鼠NGF的三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)(McDonald等，Nature，354411-414(1991))。
圖5總結(jié)了MAb的表位作圖結(jié)果。
修改到此處實(shí)施例2確定抗NGF單克隆抗體的中和活性觀察到一些定位于上述區(qū)域的表位在NGF和TrkA和/或p75相互反應(yīng)時(shí)的重要性，這說明相應(yīng)的MAb可能還會(huì)阻斷這些相互反應(yīng)之一或這兩者。
A.125I-hNGF結(jié)合測(cè)定為評(píng)價(jià)一種或多種抗NGF MAb阻斷NGF與TrkA和/或p75結(jié)合的可能性，在抗NGF單克隆抗體存在時(shí)測(cè)量了125I-hNGF與TrkA IgG受體免疫粘附素的結(jié)合。
簡(jiǎn)言之，125I-hNGF是用改進(jìn)的可溶性乳過氧化物酶方法制備的，該方法最初由Marchalonis描述(Marchalonis，Biochem J.，113299-305(1969))。將最終的反應(yīng)混合物在pD-10 Sephadex G-25尺寸排阻柱(Pharmacia，Uppsala，Sweden)上分級(jí)分離并于4℃保存。用純化的兔抗人IgG-Fc特異多克隆抗體(在碳酸鹽緩沖液中稀釋至2g/ml)涂布微量滴定板(Nunc，Maxisorb)，在4℃過夜，用PBS洗滌并用150L PBS/0.5％ BSA(PBS/BSA)封閉。加入溶于PBS/BSA的人TrkA IgG或p75-IgG免疫粘附素(由Robert Pitti惠贈(zèng))(20ng/mL)(100I)并在室溫下培育1小時(shí)。然后加入稀釋于PBS/BSA的hNGF(最終濃度為150pM)(100L)并在室溫下培育1小時(shí)。平行加入hNGF(最終濃度為150pM)并按上述方法培育，所述hNGF已在4℃和抗NGF單克隆抗體(667nM 0.58nM)或不針對(duì)NGF的非相關(guān)單克隆抗體一起預(yù)培育過夜。用含有0.05％ T20的PBS洗滌平板，在γ-計(jì)數(shù)器(Packard Cobra5010型，Downers Grove，IL)上對(duì)每個(gè)孔計(jì)數(shù)1分鐘。
如圖6所見，所述抗NGF單克隆抗體抑制hNGF與TrkA-IgG受體免疫粘附素結(jié)合，如與TrkA-IgG結(jié)合的125I標(biāo)記的hNGF水平所測(cè)。在最高測(cè)試濃度時(shí)(667nM)所有MAb都顯示阻斷能力，但在低濃度時(shí)阻斷能力之間有差別。MAb 911，912和938顯示相同的阻斷效能(IC50約0.5-2nM)，在10nM MAb或更高濃度時(shí)看到80-90％的抑制。
在上述結(jié)合測(cè)定中，用p75-IgG評(píng)價(jià)了MAb抑制hNGF與低親和性p75受體結(jié)合的能力。如圖7所示，采用125I標(biāo)記的hNGF可見，抗HNGF MAb抑制hNGF與p75-IgG受體免疫粘附素結(jié)合。少于1nM的MAb存在時(shí)觀察到MAb 911，912和938有使結(jié)合減少75-90％的最高抑制活性。MAb 909也顯示了強(qiáng)的阻斷能力(10nM MAb時(shí)＞90％抑制)，而MAb 908和14.14的阻斷活性明顯不太強(qiáng)(圖7)。
B.激酶誘導(dǎo)的受體活化(KIRA)測(cè)定用激酶誘導(dǎo)的受體活化(KIRA)測(cè)定來(lái)測(cè)量轉(zhuǎn)染細(xì)胞中響應(yīng)配體(如hNGF)和/或激動(dòng)劑單克隆抗體刺激的依賴于NGF的TrkA的自身磷酸化(Sadick等，Exp.CellRes.234354-361(1997))。評(píng)價(jià)抗NGF MAb抑制hNGF與CHO轉(zhuǎn)染細(xì)胞上表達(dá)的TrkA胞外域結(jié)合的能力以及隨后TrkA上酪氨酸殘基的磷酸化(圖8)。用抗磷酸酪氨酸MAb通過ELISA測(cè)量酪氨酸殘基的磷酸化。
用1×105個(gè)表達(dá)TrkA受體胞外域的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞和單純性皰疹病毒糖蛋白D片段(gD)(這是一種作為表位標(biāo)記的由26個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽)涂布微量滴定板(Costar，Cambridge，MA)。將僅有hNGF(150pM)的樣品(作為陽(yáng)性對(duì)照)或hNGF(終濃度為150pM)樣品在4℃和各個(gè)抗NGF MAb(終濃度為667nM 0.31nM)一起預(yù)培育過夜，然后將其加到含有表達(dá)TrkA的CHO細(xì)胞的孔中(每孔50L)并在37℃培育25分鐘。將不抗NGF的非相關(guān)單克隆抗體作為陰性對(duì)照。然后用裂解緩沖液處理hNGF-刺激的細(xì)胞，在gD-MAb-涂布的微量滴定板上處理裂解物，以用類似于Sadick等描述的方法(Sadick等，Anal.Biochem.，235207-214(1996))通過ELISA檢測(cè)含有TrkA的磷酸酪氨酸。將100I生物素化的4G10(單克隆抗磷酸酪氨酸，來(lái)自Upstate Biologicals公司(UBI，Lake Placid，NY))用稀釋緩沖液(PBS，含有0.5％ BSA、0.05％ Tween 20、5mM EDTA和0.01％硫汞撒)稀釋至0.2mg/mL，將其加到各個(gè)孔中。在室溫下培育2小時(shí)后，洗滌平板并在每個(gè)孔中加入100I用稀釋緩沖液按1∶50000稀釋的HRP-偶聯(lián)的鏈霉抗生物素蛋白(Zymed實(shí)驗(yàn)室，S.舊金山，加利福尼亞州)。將平板在室溫下輕微攪拌培育30分鐘。將游離的抗生物素蛋白偶聯(lián)物洗去并在各個(gè)孔中加入100I新鮮制備的底物溶液(四甲基聯(lián)苯胺，TMB，二組分底物試劑盒，Kirkegard和Perry，Gaitehersbug，MD)。反應(yīng)進(jìn)行10分鐘，然后在每個(gè)孔中加入100I 1.0M H3PO4以終止顯色。用Vmax平板閱讀器(Molecular Devices，Palo Alto，加利福尼亞州)在650nm的參考波長(zhǎng)讀取450nm處的吸收值(A450/650)，該閱讀器由Macintosh Centris 650(Apple Computers，Cupertino，加利福尼亞州)和DELTASOFT軟件(BioMetallics公司，Princeton，新澤西州)控制。
如圖8所示，所有選擇的抗NGF單克隆抗體都抑制hNGF與CHO轉(zhuǎn)染細(xì)胞上表達(dá)的TrkA胞外域的結(jié)合和TrkA受體的酪氨酸殘基的磷酸化。在最低測(cè)試濃度(0.3nM)，用MAb 911，912和938預(yù)培育hNGF使酪氨酸磷酸化與對(duì)照MAb相比最大抑制約為60-80％。MAb 908，909和14.14不太有效。
C.胚胎大鼠背根神經(jīng)節(jié)存活生物測(cè)定另一項(xiàng)用來(lái)確定抗NGF單克隆抗體對(duì)NGF-依賴性過程的效果的測(cè)定是胚胎大鼠E14背根神經(jīng)節(jié)(DRG)存活生物測(cè)定。評(píng)價(jià)抗NGF單克隆抗體抑制胚胎大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元上hNGF存活效果的能力。(圖9)。
將獲自E15大鼠(6-8個(gè)胚胎)的背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元培養(yǎng)在F12培養(yǎng)基中，其中含有添加物(McMahon等，Nat.Med.8774-780(1995))和3ng/mL hNGF，有或沒有抗NGF單克隆抗體。在37℃培養(yǎng)72小時(shí)后細(xì)胞用甲醛固定并對(duì)存活的神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)。
圖9顯示了抗NGF單克隆抗體對(duì)DRG神經(jīng)元存活的抑制。MAb 908，909和14.14在最高濃度時(shí)(67nM；10g/ml)使存活率僅降低了20-30％，而MAb 911和912抑制了90％以上的存活，這是較低濃度(0.8-2.4nM；0.12-0.37g/ml)的約30-80倍。MAb 938也能以90％抑制存活活性，但比MAb 911和912的效力低了10-30倍。
MAb 911是NGF/TrkA反應(yīng)最有效的阻斷劑。MAb 911識(shí)別一表位，其中包含重疊NGF-TrkA和p75結(jié)合區(qū)-回轉(zhuǎn)A’-A″(V-1)和占優(yōu)勢(shì)的TrkA結(jié)合區(qū)(圖3D)。第二種最強(qiáng)的NGF/TrkA抑制劑MAb 912識(shí)別殘基K32，K34和K35，這是上面提到的對(duì)NGF/p75相互反應(yīng)的重要區(qū)域。MAb 938，TrkA和p75結(jié)合的另一個(gè)有效的阻斷劑也識(shí)別對(duì)TrkA或p75結(jié)合的重要區(qū)域，N-末端和C-末端。
所觀察到的抗體阻斷特異性的差異不是由于MAb和hNGF之間相對(duì)親和力，而是因?yàn)檫@三者中兩個(gè)最有效的阻斷抗體(911和938)對(duì)NGF的親和力比較弱的阻斷MAb要低。
對(duì)MAb 911和912結(jié)合重要的NGF區(qū)域與鑒定為對(duì)TrkA和p75結(jié)合的重要區(qū)域重疊。MAb 911和912是NGF誘導(dǎo)活性的有效阻斷劑，這說明它們或許是體內(nèi)活性的特異性拮抗劑，如炎性痛覺過敏。
實(shí)施例3抗NGF對(duì)免疫應(yīng)答的作用在第0天用10g卵清蛋白通過皮下接種免疫小鼠，然后使其愈合。在第40天再通過腹膜內(nèi)(IP)對(duì)經(jīng)過免疫的動(dòng)物注射10mg/kg抗NGF抗體911或?qū)φ瘴铮搶?duì)照物為同種型匹配的抗體。兩天后對(duì)動(dòng)物注射卵清蛋白。在第47天采集的血清樣品上進(jìn)行ELISA以測(cè)定免疫應(yīng)答。如圖10所示，接受抗NGF抗體911的動(dòng)物和接受對(duì)照抗體的動(dòng)物在免疫應(yīng)答上沒有顯著(p＞0.05)差異。然而，在用抗NGF單克隆抗體處理的動(dòng)物中有免疫應(yīng)答增加的趨勢(shì)，但不明顯。
相反，圖11顯示用雞γ-球蛋白免疫接種后，用抗NGF處理產(chǎn)生不明顯的免疫應(yīng)答降低的趨勢(shì)。在第0天用10g雞γ-球蛋白免疫動(dòng)物，并在第40天用抗NGF抗體911或?qū)φ瘴锿N型匹配的抗體(10mg/kg IP)處理。在第42天對(duì)動(dòng)物注射γ-球蛋白并在第47天取出血清樣品并用ELISA進(jìn)行分析。兩組之間的免疫應(yīng)答沒有顯著(p＞0.05)差異。然而，在用抗NGF單克隆抗體911處理的動(dòng)物中有免疫應(yīng)答降低的趨勢(shì)。
實(shí)施例4抗NGF單克隆抗體對(duì)痛覺過敏的作用研究了抗NGF抗體對(duì)NGF誘導(dǎo)的熱痛覺過敏的作用。簡(jiǎn)言之，在處理前用Hargreave試驗(yàn)訓(xùn)練成年Fischer雌性大鼠，每天兩次，至少兩天。當(dāng)熟悉設(shè)備和方法后，將動(dòng)物隨機(jī)分成對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。測(cè)試每組的基線響應(yīng)，然后在異熒烷麻醉下通過足底內(nèi)注射給予一只爪子50I體積。各組的注射物中含有1.25％角叉膠和90g抗NGF抗體或無(wú)關(guān)緊要的同種型匹配的對(duì)照抗體聯(lián)合。
在注射后第0、2、4、6和24小時(shí)時(shí)用Hargreave試驗(yàn)測(cè)量熱縮回潛伏時(shí)間(thermal withdrawal latency)。如圖12所示，在處理后第4和6小時(shí)，注射角叉膠后，熱痛覺過敏在用抗NGF單克隆抗體911處理的動(dòng)物中明顯低于對(duì)照動(dòng)物。
實(shí)施例5抗NGF單克隆抗體對(duì)變應(yīng)原響應(yīng)的作用用單克隆抗NGF抗體911(n＝16)或同種型匹配的抗gD對(duì)照抗體(1766克隆；n＝16)處理雄性C57/BL(Jackson實(shí)驗(yàn)室)。在第1天，用20mg/kg抗體處理動(dòng)物，在第6，13，20和22天用10mg/kg抗體處理它們。所有抗體處理是通過皮下注射進(jìn)頸背。
在第0天和第14天將每組中一半的小鼠通過腹膜內(nèi)注射30AU塵螨抗原(DMA；用Dulbecco’s PBS稀釋，然后用ALUM作為佐劑以1∶2稀釋，使最終濃度為300AU/ml)致敏(SN)。非致敏小鼠(NS)接受等體積Dulbecco’s PBS，并用ALUM按1∶2稀釋作為對(duì)照。
然后在第21和22天用吸入的塵螨抗原(DMA)攻擊小鼠。用Dulbecco’s PBS加0.01％ Tween-20將塵螨稀釋至6000AU/ml以供霧化。在Plexiglas餅式暴露室(pie exposure chamber)中施用所有吸入攻擊。用PARI IS-2霧化器在22PSI下驅(qū)動(dòng)將DMA氣霧化。霧化器中裝有3ml液體并在30分鐘內(nèi)輸送完畢。輸送到肺部的總沉積劑量/暴露量約為6.5AU DMA。
評(píng)定小鼠的呼吸道過度反應(yīng)性、進(jìn)入支氣管肺泡灌洗(BAL)液的細(xì)胞浸潤(rùn)、BAL中的細(xì)胞因子水平和抗塵螨的血清滴度以及血清IgE水平。簡(jiǎn)言之，在最后一次攻擊后第24，48小時(shí)將小鼠麻醉，將導(dǎo)管插入頸靜脈并切開氣管。然后用0.28mg/kg泮庫(kù)溴銨使小鼠癱瘓并加到Plexiglas流式體積描記器(flowplethysmograph)上測(cè)量胸膨脹和呼吸道壓力。用100％氧氣以170bpm的頻率給小鼠通風(fēng)，Vt等于9l/g。用Buxco XA數(shù)據(jù)獲取程序連續(xù)監(jiān)控呼吸機(jī)制(肺阻力和動(dòng)力順應(yīng)性)。給小鼠一定的體積規(guī)律(volume history)(5次呼吸，以2.5x Vt)，使其穩(wěn)定2分鐘，然后測(cè)量基線，然后用Harvard注射泵和注射應(yīng)用軟件以按體重調(diào)節(jié)的流速一次給予5秒鐘劑量的激動(dòng)劑。
控制血液(血清)、BAL和肺部。測(cè)定血清的總IgE和IgG以及特異性IgE和IgG。通過三次注射相同等份的NaCl以獲得BAL，并通過ELISA測(cè)定總IgE。由BAL細(xì)胞得到白血細(xì)胞總數(shù)和細(xì)胞微分。
用抗NGF單克隆抗體治療使呼吸通過度反應(yīng)性顯著降低(圖13)，以及通過進(jìn)入BAL的細(xì)胞浸潤(rùn)測(cè)定炎癥(圖14)。然而，在用抗NGF處理的動(dòng)物中，BAL中嗜伊紅細(xì)胞的比例仍很高(圖15)?？筃GF抗體處理還降低了BAL中Th2細(xì)胞因子IL-13的水平(圖16)。
盡管降低對(duì)變應(yīng)原的炎性反應(yīng)的能力，抗NGF抗體處理沒有降低對(duì)塵螨的體液免疫應(yīng)答，這是用總血清免疫球蛋白滴度與塵螨的比值測(cè)得的(圖17)或用IgE的血清水平測(cè)得的(圖18)。這說明抗體會(huì)阻斷NGF的生物效應(yīng)，但不會(huì)影響B(tài)-淋巴細(xì)胞存活或功能。
為證實(shí)抗NGF抗體911對(duì)NGF有明顯的功能效應(yīng)，進(jìn)行了平行試驗(yàn)，其中在第1天和第8天在小鼠頸背皮下注射0.1，1或10mg/kg抗NGF單克隆抗體911，或在第1、3、6和8天注射0.1，1或10mg/kg NGF。在第9天殺死動(dòng)物并測(cè)定三叉神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)肽CGRP的水平。用1或10mg/kg NGF處理使CGRP增加，這證明這種肽受NGF水平調(diào)節(jié)(圖19)。用1或10mg/kg抗NGF單克隆抗體911處理使神經(jīng)節(jié)中CGRP含量減少(圖19)，這證明，在上述試驗(yàn)中，當(dāng)免疫應(yīng)答發(fā)生時(shí)，此劑量明顯地在功能上封阻內(nèi)源NGF。
權(quán)利要求
1.在人患者中控制NGF相關(guān)疾病的方法，其特征在于，所述方法包括對(duì)所述患者施用有效量的抗人NGF(抗-hNGF)單克隆抗體，這種抗體能夠以納摩爾范圍的親和力結(jié)合hNGF，并在體內(nèi)抑制hNGF與人TrkA(hTrkA)的結(jié)合，其中所述抗體對(duì)所述患者的免疫系統(tǒng)沒有顯著的副作用。
2.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述抗體與hNGF的結(jié)合親和性為約0.10至約0.80nM。
3.如權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，所述抗體與hNGF的結(jié)合親和性為約0.15至約0.75nM。
4.如權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，所述抗體與hNGF的結(jié)合親和性為約0.18至約0.72nM。
5.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述抗體實(shí)質(zhì)上結(jié)合相同的hNGF表位，作為選自MAb 911，MAb 912和MAb 938的抗體。
6.如權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，所述抗體實(shí)質(zhì)上結(jié)合相同的hNGF表位，作為抗體MAb 911。
7.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述抗體還能結(jié)合鼠NGF(muNGF)。
8.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述抗體是抗體片段。
9.如權(quán)利要求8所述方法，其特征在于，所述抗體片段選自Fab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)v片段，雙體分子，單鏈抗體分子，以及由抗體片段形成的多特異性抗體。
10.如權(quán)利要求9所述方法，其特征在于，所述單鏈抗體分子是單鏈Fv(scFV)分子。
11.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述抗體是嵌合抗體。
12.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述抗體是人源化抗體。
13.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述抗體是人抗體。
14.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述抗體是雙特異性抗體。
15.如權(quán)利要求14所述方法，其特征在于，所述雙特異性抗體具有抗IgE特異性。
16.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述NGF相關(guān)疾病不是和NGF對(duì)神經(jīng)元系統(tǒng)的作用有關(guān)的病癥。
17.如權(quán)利要求16所述方法，其特征在于，所述NGF相關(guān)疾病是炎性疾患。
18.如權(quán)利要求17所述方法，其特征在于，所述炎性疾患選自哮喘，多發(fā)性硬化，關(guān)節(jié)炎，紅斑狼瘡和銀屑病。
19.如權(quán)利要求18所述方法，其特征在于，所述疾患是哮喘。
20.如權(quán)利要求18所述方法，其特征在于，所述疾患是關(guān)節(jié)炎。
21.如權(quán)利要求20所述方法，其特征在于，所述關(guān)節(jié)炎是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
22.如權(quán)利要求18所述方法，其特征在于，所述疾患是銀屑病。
23.如權(quán)利要求17所述方法，其特征在于，所述抗體和用來(lái)治療所述炎性疾患的其它治療劑聯(lián)合施用。
24.如權(quán)利要求19所述方法，其特征在于，所述抗體和皮質(zhì)類用醇聯(lián)合施用。
25.如權(quán)利要求24所述方法，其特征在于，所述皮質(zhì)類用醇是丙酸倍氯米松(BDP)。
26.如權(quán)利要求19所述方法，其特征在于，所述抗體和抗IgE抗體聯(lián)合施用。
27.如權(quán)利要求26所述方法，其特征在于，所述抗IGE抗體是rhuMAb-E25或rhuMAb-E26。
28.如權(quán)利要求21所述方法，其特征在于，所述抗體與用來(lái)治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的其它治療劑聯(lián)合施用。
29.如權(quán)利要求28所述方法，其特征在于，所述其它治療劑是抗TNF抗體或抗體或特異性結(jié)合TNF受體的免疫粘附素。
30.一種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物含有嵌合抗體、人源化抗體或人抗人NGF(抗hNGF)單克隆抗體與藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)合，所述抗體能夠以納摩爾范圍的親和力結(jié)合hNGF并在體內(nèi)抑制hNGF與人TrkA(hTrkA)的結(jié)合，其中所述抗體對(duì)患者的免疫系統(tǒng)沒有顯著的副作用。
31.如權(quán)利要求30所述藥物組合物，其特征在于，所述抗體是抗體片段。
32.如權(quán)利要求31所述藥物組合物，其特征在于，所述抗體片段選自Fab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)v片段，雙體分子，單鏈抗體分子，以及由抗體片段形成的多特異性抗體。
33.如權(quán)利要求30所述藥物組合物，其特征在于，所述抗體是雙特異性抗體。
34.如權(quán)利要求33所述藥物組合物，其特征在于，所述雙特異性抗體能夠特異性結(jié)合天然人IgE。
35.如權(quán)利要求33所述藥物組合物，其特征在于，所述雙特異性抗體能夠特異性結(jié)合天然人TNF或天然人TNF受體。
36.如權(quán)利要求30所述藥物組合物，其特征在于，還含有其它藥物活性成分。
37.如權(quán)利要求36所述藥物組合物，其特征在于，所述其它藥物活性成分適合治療炎性疾患。
38.如權(quán)利要求37所述藥物組合物，其特征在于，所述炎性疾患選自哮喘，多發(fā)性硬化，關(guān)節(jié)炎，紅斑狼瘡和銀屑病。
39.如權(quán)利要求38所述藥物組合物，其特征在于，所述炎性疾患是哮喘。
40.如權(quán)利要求38所述藥物組合物，其特征在于，所述炎性疾患是關(guān)節(jié)炎。
41.如權(quán)利要求40所述藥物組合物，其特征在于，所述關(guān)節(jié)炎是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
42.如權(quán)利要求41所述藥物組合物，其特征在于，所述炎性疾患是銀屑病。
43.一種制造產(chǎn)品，其特征在于，所述制造產(chǎn)品包括容器；權(quán)利要求30所述的藥物組合物；和將物質(zhì)的組合物用于控制人患者中NGF相關(guān)疾病的說明書。
44.如權(quán)利要求43所述制造產(chǎn)品，其特征在于，含有第二種藥物活性成分。
45.如權(quán)利要求43所述制造產(chǎn)品，其特征在于，所述第二種藥物活性成分適合治療炎性疾患。
46.如權(quán)利要求45所述制造產(chǎn)品，其特征在于，所述炎性疾患選自哮喘，多發(fā)性硬化，關(guān)節(jié)炎，紅斑狼瘡和銀屑病。
47.如權(quán)利要求43所述制造產(chǎn)品，其特征在于，還包括其中含有組合物的第二個(gè)容器，其中所述組合物包含結(jié)合NGF受體并阻斷配體活化的第二抗體。
全文摘要
本發(fā)明一般涉及用抗NGF抗體治療各種NGF相關(guān)疾病的方法，所述疾病包括哮喘、關(guān)節(jié)炎和銀屑病。所述方法有效治療患者中的這些疾病，且對(duì)患者的免疫系統(tǒng)沒有明顯的副作用。
文檔編號(hào)A61P29/00GK1684708SQ02814992
公開日2005年10月19日 申請(qǐng)日期2002年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月30日
發(fā)明者D·L·謝爾頓 申請(qǐng)人:基因技術(shù)股份有限公司