專利名稱：在乳腺癌和膀胱癌中差異表達(dá)的基因及編碼的多肽的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及在人乳腺癌和膀胱癌中差異表達(dá)的新的人基因。本發(fā)明尤其涉及編碼名為C35的新的人多肽的多核苷酸。本發(fā)明還涉及C35多肽及其載體、宿主細(xì)胞、C35多肽的抗體，及其重組制備方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及檢測癌的診斷方法，包括人乳腺癌和膀胱癌。本發(fā)明另外涉及C35基因及多肽在免疫原性組合物或疫苗中的組成和應(yīng)用，以誘導(dǎo)針對表達(dá)C35基因的靶細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)的抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。本發(fā)明還涉及鑒定C35活性的激動劑和拮抗劑的篩選方法。
背景技術(shù)：
在美國，每年約有一百二十萬人受癌癥折磨。其中大約50％的癌癥可以利用手術(shù)、放療和化療進(jìn)行醫(yī)治。盡管這三種療法取得了顯著的技術(shù)進(jìn)步，僅美國每年仍有500,000以上的人死于癌癥(Jaffee，E.M.，Ann.N.Y.Acad.Sci.88667-72(1999))。多數(shù)在遠(yuǎn)端例如肝、腦、骨和肺復(fù)發(fā)，故急需改善系統(tǒng)療法。
癌癥治療的目標(biāo)在于發(fā)展特異性針對腫瘤細(xì)胞的方法，從而避免對正常組織不必要的副作用。免疫療法有可能為多數(shù)類型的癌癥提供一種可選擇的系統(tǒng)療法。免疫療法較之放療和化療的優(yōu)勢在于，它可以特異性作用于腫瘤，而不引起正常組織損傷。疫苗是免疫療法的一種形式，它還可以提供主動免疫接種，從而放大免疫應(yīng)答，所以格外引人注意。此外，疫苗可以產(chǎn)生記憶型免疫應(yīng)答。
開發(fā)癌癥疫苗的努力基礎(chǔ)是改變腫瘤細(xì)胞的特性，使免疫系統(tǒng)識別為非我，從而誘導(dǎo)保護(hù)性免疫的可能性。此策略是否可行，取決于如何改變轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特性。由突變在腫瘤轉(zhuǎn)化中重要作用的理解得出假說，腫瘤抗原是遺傳不穩(wěn)定細(xì)胞隨機(jī)突變的結(jié)果。雖然隨機(jī)突變可產(chǎn)生免疫原性，但可以預(yù)計(jì)其將誘導(dǎo)每種腫瘤所特有的特異性免疫。這不利于開發(fā)廣泛有效的腫瘤疫苗。但另一假說認(rèn)為，腫瘤抗原可能是與轉(zhuǎn)化過程有關(guān)的、系統(tǒng)性及可再生性組織特異性基因失調(diào)的結(jié)果。這可以引起某些類型腫瘤中共有抗原表達(dá)的的質(zhì)或量的差異，這些抗原可能是免疫治療的合適目標(biāo)。早期研究結(jié)果證明，某些實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤的免疫原性可以回溯到隨機(jī)突變(De Plaen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852274-2278(1988)；Srivastava，&Old，Immunol.Today 978(1989))，顯然支持第一種假說。但無法解釋隨機(jī)突變和系統(tǒng)性基因失調(diào)不能均引起腫瘤表達(dá)新免疫原的原因。實(shí)際上，近來實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤(Sahasrabudhe等，J linmunol.1516202-6310(1993)；Torigoe等，J.Immunol.1473251(1991))以及人黑素瘤(van Der Bruggen等，Science 2541643-1647(1991)；Brichard等，J.Exp.Med.178489-495(1993)；Kawakami等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA913515-3519(1994)；Boel等，Immunity 2167-175(1995)；Van denEynde等，J.Exp.Med.182689-698(1995))的研究清楚表明，由失調(diào)的正?；蚓幋a的腫瘤共有抗原表達(dá)。MAGE-1及其它各種人黑素瘤共有抗原的鑒定，為今后開發(fā)多種腫瘤疫苗帶來巨大希望。
盡管黑素瘤取得了進(jìn)展，但對于其它人類腫瘤來說，能為細(xì)胞毒性T細(xì)胞識別的共有抗原幾乎未被描述過。主要是技術(shù)性難題。鑒定唯有腫瘤細(xì)胞表達(dá)的免疫原性分子，最普遍以及迄今最成功的方法是篩選腫瘤特異性CTL(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞)的cDNA文庫。已經(jīng)應(yīng)用此策略鑒定了數(shù)個(gè)主要在人黑素瘤中表達(dá)的基因家族。然而此方法的兩個(gè)主要局限是，(1)篩選需要繁重的轉(zhuǎn)染工作，將眾多重組DNA小庫轉(zhuǎn)染到分離的目標(biāo)群體(為表達(dá)抗原遞呈所需的一種或多種MHC分子，其本身經(jīng)常需要修飾)，以測定由某些庫的微量組分產(chǎn)生的T細(xì)胞刺激；(2)可能除腎細(xì)胞癌以外，難以從其它類型腫瘤(特別是包含80％以上人類腫瘤的上皮細(xì)胞癌)病人的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)或PBL中分離腫瘤特異性CTL。似乎是存在組織特異性特征，其導(dǎo)致黑素瘤中腫瘤特異性CTL被隱蔽。
用腫瘤特異性基因產(chǎn)物直接免疫，對于誘導(dǎo)針對某些腫瘤共有抗原的免疫應(yīng)答是必要的。已有人爭辯說，如果腫瘤表達(dá)強(qiáng)抗原，則在其具有臨床表現(xiàn)之前應(yīng)已被根除?；蛟S腫瘤只表達(dá)弱抗原。免疫學(xué)者一直對是什么使抗原弱或強(qiáng)的問題感興趣。有兩個(gè)主要假說。弱抗原可能沒有很好加工，不能有效遞呈給T細(xì)胞?；蛘?，生物體中具有適當(dāng)特異性的T細(xì)胞數(shù)量可能不足以產(chǎn)生強(qiáng)有力的應(yīng)答(所謂″hole in therepertoire″)。闡明抗原性肽聯(lián)合MHC分子以轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面并呈遞給T細(xì)胞的復(fù)雜細(xì)胞過程，是現(xiàn)代免疫學(xué)的勝利。實(shí)驗(yàn)清楚證實(shí)，加工缺陷或其它肽的競爭作用所引起的遞呈失敗，可以降低特定肽的免疫原性。反之，由于技術(shù)原因，更難證實(shí)T細(xì)胞庫中典型克隆的頻率是低水平應(yīng)答的重要機(jī)制。然而最近研究表明，T細(xì)胞受體轉(zhuǎn)基因小鼠中蛋白質(zhì)抗原的免疫顯性和隱性肽之間關(guān)系的變化提示，肽特異性T細(xì)胞的相對頻率確實(shí)是T細(xì)胞應(yīng)答中特定肽是隱性或顯性的決定性因素。這促進(jìn)了疫苗開發(fā)。使用目前方法修飾腫瘤抗原肽加工及T細(xì)胞遞呈的方式，是復(fù)雜和困難的。然而可以通過在預(yù)先接種，直接并有效地增加特異性T細(xì)胞的相對頻率。因此這是使原先隱性的應(yīng)答得到免疫保護(hù)的關(guān)鍵。隱性或亞顯性抗原的這些方面，與腫瘤可能通過誘導(dǎo)耐受而逃避免疫特別有關(guān)。現(xiàn)有證據(jù)提示，腫瘤宿主的腫瘤特異性T細(xì)胞沒有反應(yīng)性，可能是在非專司APC上遞呈抗原的結(jié)果(Morgan，D.J.等，J.Immunol.163723-27(1999)；Sotomayor，E.M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9611476-81(1999)；Lee，P.P.等，NatureMedicine 5677-85(1999)).因此，腫瘤免疫顯性抗原的特異性T細(xì)胞預(yù)先耐受可能導(dǎo)致了難以開發(fā)癌癥免疫治療的成功策略。這些結(jié)果提示，免疫顯性腫瘤抗原的特異性T細(xì)胞對于既成腫瘤的免疫治療不大可能有效，因?yàn)樗鼈兒芸赡芤呀?jīng)耐受了。因此，亞顯性抗原的特異性T細(xì)胞或最初以較低頻率存在的T細(xì)胞可能會更為有效，因?yàn)樗鼈儽苊饬松L中腫瘤耐受的影響。
開發(fā)廣泛有效的人類疫苗所關(guān)心的另一主要方面是，HLA I類分子的高度多態(tài)性。MHC I類細(xì)胞肽復(fù)合物是特異性CD8+CTL的靶抗原。細(xì)胞肽由內(nèi)源合成的蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生，移位到前高爾基小室，在此與I類MHC分子結(jié)合，轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面。CD8分子有助于T細(xì)胞和目標(biāo)通過結(jié)合I類重鏈α3結(jié)構(gòu)域而相互作用的親和力。因?yàn)樗袃?nèi)源性蛋白質(zhì)都轉(zhuǎn)變，來源于任何胞質(zhì)或核蛋白的肽可能結(jié)合MHC分子并轉(zhuǎn)運(yùn)，呈遞于細(xì)胞表面。這使T細(xì)胞比抗體針對的細(xì)胞蛋白質(zhì)群體更大，抗體只局限于識別那些分泌的或整合于細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)的構(gòu)象決定簇。
T細(xì)胞受體的抗原結(jié)合位點(diǎn)與肽以及周圍MHC的決定簇相互作用。因此必須按照MHC肽復(fù)合物來確定T細(xì)胞的特異性。肽結(jié)合MHC分子的特異性很廣，與特異性抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)相比，其親和力相對較低。I類分子結(jié)合的肽一般長為8-10個(gè)殘基，并調(diào)節(jié)氨基酸側(cè)鏈，限定某些關(guān)鍵位點(diǎn)的多樣性，以匹配MHC肽結(jié)合位點(diǎn)的口袋。結(jié)合特定MHC分子的肽的這些主要特征，構(gòu)成肽結(jié)合基序。
因此，需要促進(jìn)人類腫瘤、癌癥和感染細(xì)胞的特異性T細(xì)胞誘導(dǎo)和分離的方法，以及有效篩選編碼由這些處于適當(dāng)MHC環(huán)境下的T細(xì)胞識別的主要靶抗原的基因的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及在人乳腺癌和膀胱癌中差異表達(dá)的新的多核苷酸C35及其編碼多肽。本發(fā)明另外涉及載體、宿主細(xì)胞、抗體，以及產(chǎn)生C35多肽和多核苷酸的重組方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及C35多肽和多核苷酸在免疫原性組合物中的組成和應(yīng)用，以針對表達(dá)C35基因產(chǎn)物的靶細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)，誘導(dǎo)抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。還提供檢測C35基因和多肽相關(guān)疾病的診斷方法，包括用作癌癥(例如人乳腺癌)的預(yù)后標(biāo)志，以及上述疾病的治療方法。本發(fā)明另外涉及鑒定C35的結(jié)合配偶體的篩選方法。
附圖簡述

圖1(圖A-B).圖A顯示C35 DNA編碼序列(SEQ ID NO1)。緊接預(yù)測的ATG起始密碼子上游的序列如小寫字母所示，符合Kozak，M.，J.Biol.Chem.266(30)19867-19870(1991)所述預(yù)期特征。圖B顯示推斷的C35氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖2.(圖A-C).圖AC35在乳腺腫瘤細(xì)胞系中過表達(dá)。上圖將3周齡人胸腺、病人21的正常乳腺上皮細(xì)胞系H16N2、以及一年后取自同一病人21的原發(fā)或轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的4個(gè)乳腺腫瘤細(xì)胞系21NT、21PT、21MTl和21MT2的300ng的poly-A RNA，用1％瓊脂糖/甲醛凝膠分離，轉(zhuǎn)到GeneScreen膜。印跡與32P標(biāo)記的C35探針雜交。將印跡在膠片上曝光15小時(shí)，進(jìn)行雜交檢測。下圖為測定RNA載樣量，切下相同印記，與32P標(biāo)記的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的探針重雜交。根據(jù)GAPDH信號歸一化每個(gè)樣品的C35信號。數(shù)字代表每個(gè)樣品相對于H16N2的C35表達(dá)倍數(shù)。圖BC35在正常組織中低水平表達(dá)。包含1ug每種指定的成人正常組織poly-A RNA(Clontech)的印跡，與32P標(biāo)記的C35探針雜交。印跡在膠片上曝光15小時(shí)(上圖)或96小時(shí)(下圖)，進(jìn)行雜交檢測。圖C.C35在原發(fā)乳腺腫瘤中過表達(dá)。包含3種原發(fā)浸潤乳腺導(dǎo)管癌T1、T2、T3和1種正常乳腺上皮細(xì)胞N(Invitrogen)的2μgpolyA RNA的印跡，與32P標(biāo)記的C35探針雜交。雜交混合物中包括32P標(biāo)記的β-肌動蛋白探針，以歸一化載樣量。印跡在膠片上曝光6小時(shí)，進(jìn)行雜交檢測。數(shù)字代表每個(gè)樣品中相對于正常乳腺上皮細(xì)胞的C35表達(dá)倍數(shù)。
圖3.C35在乳腺腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)。C35在各種乳腺腫瘤細(xì)胞系中過表達(dá)。上圖BT474(ATCC HYB-20，乳腺導(dǎo)管癌)、SKBR3(ATCCHTB-30，乳腺腺癌)、T47D(ATCC HTB-133，乳腺導(dǎo)管癌)、病人21的正常乳腺上皮細(xì)胞系H16N2以及來源于同一病人21的原發(fā)腫瘤結(jié)節(jié)的乳腺腫瘤細(xì)胞系21-NT的300ng poly-A RNA，經(jīng)1％瓊脂糖/甲醛凝膠分離，轉(zhuǎn)到GeneScreen膜。印跡與32P標(biāo)記的C35探針雜交。將印跡在膠片曝光15小時(shí)，進(jìn)行雜交檢測。下圖為測定RNA載樣量，切下同一印跡，與32P標(biāo)記的β-肌動蛋白的探針重雜交。根據(jù)肌動蛋白信號歸一化每個(gè)樣品的C35信號。數(shù)字代表每個(gè)樣品中相對于H16N2的C35表達(dá)倍數(shù)。
圖4(圖A-C)流式細(xì)胞術(shù)檢測C35蛋白質(zhì)的表面表達(dá)。用3.5ulBALB/c小鼠的針對Line 1小鼠腫瘤細(xì)胞(轉(zhuǎn)導(dǎo)有編碼人C35的逆轉(zhuǎn)錄病毒)的抗血清，或放血前的BALB/c血清作對照，染色1×105個(gè)乳腺腫瘤細(xì)胞。溫育30分鐘后，用染色緩沖液(PAB)洗滌細(xì)胞兩次，與FITC-山羊抗小鼠IgG(1ug/樣品)溫育30分鐘。洗滌樣品，用EPICS Elite流式細(xì)胞儀分析。圖A21NT圖BSKBR3。圖CMDA-MB-231。選擇這三個(gè)乳腺腫瘤細(xì)胞系代表Northern印跡中高、中和低水平表達(dá)C35 RNA的腫瘤細(xì)胞(參見圖3)?？s寫nms，ns，正常小鼠血清；C35，C35免疫血清。
圖5(圖A和B).CML選擇的重組牛痘cDNA克隆刺激腫瘤特異性CTL。圖A測定CML選擇的牛痘克隆在感染B/C.N后，刺激腫瘤特異性CTL分泌γ干擾素的能力。ELISA測定細(xì)胞因子的量，以O(shè)D490表示(14)。OD490為1.4近似等于4ng/ml IFNg，OD490為0.65近似等于1ng/ml IFNg。圖BCML選擇的克隆使宿主細(xì)胞對腫瘤特異性CTL的裂解敏感。指定牛痘病毒克隆按moi＝1感染6孔板中的單層B/C.N。感染14小時(shí)后收獲感染細(xì)胞和指定的對照靶細(xì)胞，用51Cr標(biāo)記。靶細(xì)胞按指定比例與腫瘤特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞37℃溫育4小時(shí)，測定特異性裂解的百分率(15)。此實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次，得到相似結(jié)果。
圖6(圖A和B).腫瘤抗原由核糖體蛋白質(zhì)L3基因編碼。H2.16和rpL3的序列為45-56位氨基酸。圖AcDNA克隆rpL3的氨基酸(單字母表示)和核苷酸序列(GenBank入藏號Y00225)。圖B相對于發(fā)表的L3核糖體等位基因，H2.16腫瘤cDNA中的C170T單核苷酸置換是唯一的序列改變。此置換導(dǎo)致蛋白質(zhì)中氨基酸T54I的置換。
圖7(圖A和B).鑒定腫瘤特異性CTL識別的肽表位。圖ACML分析鑒定腫瘤特異性CTL識別的肽。用51Cr標(biāo)記靶細(xì)胞(15)。在51Cr溫育期間，B/C.N細(xì)胞樣品與1μM肽L348-56(I54)、100μM L348-56(T54)或100μM肽L345-54(I54)溫育。靶細(xì)胞與指定比例的腫瘤特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞37℃溫育4小時(shí)，測定特異性裂解的百分率。此實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次，得到相似結(jié)果。圖B肽L348-56(I54)的滴定。用51Cr標(biāo)記靶細(xì)胞。在51Cr溫育期間，B/C.N細(xì)胞樣品在不加入肽(D)或與指定濃度(1μM、10nM、1nM)的L348-56(I54)(■)溫育，BCA 39細(xì)胞用作陽性對照(▲)。靶細(xì)胞與指定比例的腫瘤特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞37℃溫育4小時(shí)，測定特異性裂解的百分率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次，結(jié)果相似。
圖8(圖A-C).各個(gè)細(xì)胞系表達(dá)的L3的分析。圖A公開的rpL3和H2.16.的Sau3AI圖譜。首先所示為公開的核糖體蛋白質(zhì)L3基因(上圖)和H2.16(下圖)的Sau3AI限制性圖譜。公開的L3序列cDNA經(jīng)消化產(chǎn)生200、355、348、289和84bp的片段。除了C170T所致168位另一Sau3AI位點(diǎn)以外，H2.16的圖譜相同。該置換產(chǎn)生168bp消化產(chǎn)物，而不是200bp片段。圖BBCA腫瘤表達(dá)L3的兩個(gè)等位基因。利用L3特異性引物，從各個(gè)細(xì)胞系或vH2.16中獲得RT-PCR產(chǎn)物，然后用Sau3AI消化，3％瓊脂糖凝膠80伏分離2小時(shí)。圖C免疫原性L3等位基因在B/C.N、BCB13和胸腺中的表達(dá)水平大幅降低。利用32P末端標(biāo)記的5’PCR引物，從各個(gè)指定樣品中獲得L3特異性RT-PCR產(chǎn)物。以各個(gè)樣品的RNA為PCR模板，不經(jīng)cDNA合成，則無PCR產(chǎn)物，表明樣品沒有污染基因組DNA。凝膠純化PCR產(chǎn)物，保證其純度，用Sau3AI消化，3％瓊脂糖凝膠60伏分離15小時(shí)。不加入模板的對照PCR樣品沒有觀察到PCR產(chǎn)物。此結(jié)果共重復(fù)3次。
圖9(圖A-C).用iL3免疫具有免疫保護(hù)性。圖A用H2.16免疫誘導(dǎo)了腫瘤特異性CTL。通過皮下注射5×106pfu的vH2.16或?qū)φ蛰d體v7.5/tk，免疫Balb/c小鼠(2只/組)。7天后收獲脾細(xì)胞，用肽L348-56(I54)再刺激(26)。第二次再刺激五天后，如圖11所述進(jìn)行鉻釋放分析試驗(yàn)測定淋巴細(xì)胞。L348-56(I54)肽使用濃度為1μM，L348-56(T54)肽使用濃度為100μM。重復(fù)該免疫實(shí)驗(yàn)，獲得相似結(jié)果。圖B和C雌性Balb/cByJ小鼠按指定方法免疫(27)。腹壁SC注射200,000個(gè)活BCA 34腫瘤細(xì)胞，激發(fā)小鼠。激發(fā)后35天獲取數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)代表4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
圖10(圖A和B).圖A翻譯的C35編碼序列；5’和3’非翻譯區(qū)用小寫字母表示。方框中為預(yù)測的3’端異戊二烯化位點(diǎn)CVIL。圖BC35基因在染色體17上的基因組排列。
圖11(圖A和B).C35在乳腺癌中的表達(dá)。通過隨機(jī)引發(fā)反應(yīng)用32P標(biāo)記C35，并按106cpm/ml進(jìn)行Northern印跡雜交。切下每個(gè)印跡，用GAPDH或β肌動蛋白再探查，以歸一化mRNA載量。數(shù)字表示相對GAPDH/β-肌動蛋白歸一化的密度測定法比值。指定正常細(xì)胞系H16N2的值為1，所有數(shù)值都相對于該標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系的表達(dá)水平。圖AC35在乳腺上皮細(xì)胞系中的表達(dá)。圖BC35在原發(fā)乳腺組織/腫瘤中的表達(dá)。將300ng mRNA進(jìn)行0.8％堿性瓊脂糖凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)印到Genescreen Plus，圖B最左側(cè)圖例外，其上樣來自3個(gè)原發(fā)腫瘤和1個(gè)正常組織對照的1ugmRNA(Real Tumor Blots，Invitrogen)。所示對所有印跡同樣的曝光結(jié)果。
圖12.C35在膀胱癌中的表達(dá)。C35通過隨機(jī)引發(fā)反應(yīng)標(biāo)記上32P，按106cpm/ml與腫瘤和正常RNA進(jìn)行Northern印跡雜交。切下印跡，用β-肌動蛋白重探查，以歸一化mRNA載量。數(shù)字表示相對β-肌動蛋白歸一化的光密度法比值。數(shù)值相對于正常膀胱樣品的表達(dá)水平。將300ngmRNA進(jìn)行0.8％堿性瓊脂糖凝膠電泳，然后印跡到Genescreen Plus。
圖13(圖A和B).利用抗C35抗體進(jìn)行FACS分析。圖A利用經(jīng)Line 1細(xì)胞(用C35重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的)免疫的小鼠的血清(上圖)以及2C3純化的單克隆抗體(下圖)或同型對照，染色乳腺細(xì)胞系。圖B利用2C3純化的單克隆抗體或同型對照染色膀胱細(xì)胞系。
圖14.2C3抗體存在下的腫瘤生長抑制。21NT乳腺腫瘤細(xì)胞或H16N2正常乳腺上皮細(xì)胞與所示濃度的2C3抗C35單克隆抗體或非特異性同型對照抗體溫育。在有或無抗體的情況下溫育72小時(shí)后，利用XTT試驗(yàn)測定細(xì)胞生長。
圖15(圖A和B).由表達(dá)C35的樹突狀細(xì)胞刺激的CTL特異性溶解C35+乳腺(21NT)和膀胱(ppT11A3)腫瘤細(xì)胞系，對正常乳腺(MEC)、永生化的生瘤乳腺(H16N2)和膀胱(SV-HUC)細(xì)胞系、或NK敏感細(xì)胞系(K562)具有較小的活性。圖AT細(xì)胞株系4自正常人PBL產(chǎn)生。圖B從株系4中篩選C35特異活性的T細(xì)胞克隆10G3。靶細(xì)胞系MEC、ppT11A3和SV-HUC為天然HLA-A2陽性。靶細(xì)胞系21NT和H16N2用HLA-A2轉(zhuǎn)染，以提供所需MHC限制成分。
圖16(圖A和B).在靶物質(zhì)的刺激下T細(xì)胞克隆10G3釋放細(xì)胞因子。圖AIFN-γ分泌。圖BTNF-α分泌。乳腺和膀胱靶細(xì)胞系區(qū)別在于是否表達(dá)HLA-A2和C35腫瘤抗原、C35的氨基末端50個(gè)氨基酸片段(C35-50aa)或無關(guān)的小鼠L3核糖體蛋白質(zhì)。每個(gè)標(biāo)志或?yàn)閮?nèi)源性表達(dá)的，或通過轉(zhuǎn)染HLA-A2.1構(gòu)建體(pSV2.A2)或感染C35(vv.C35、vv.C35-50aa)、L3(vv.L3)或HLA-A2(vv.A2)的重組牛痘疫苗而引入的。
發(fā)明詳述定義提供下列定義，以幫助對本說明書所用某些術(shù)語的理解。
本發(fā)明中″分離″是指物質(zhì)從其天然環(huán)境分離(例如，如果其為天然產(chǎn)生時(shí)的自然環(huán)境)，并因而人工改變其自然狀態(tài)。例如，分離的多核苷酸可以是載體或物質(zhì)組合物的部分，或者包含于細(xì)胞中，但仍然是″分離″的，因?yàn)檩d體、物質(zhì)組合物或特定細(xì)胞并非該多核苷酸的原始環(huán)境。
本發(fā)明中″膜″C35蛋白質(zhì)是通過直接或者間接與脂雙層連接(尤其包括通過羧基末端氨基酸基序的異戊二烯化)而表達(dá)于細(xì)胞表面的一種蛋白質(zhì)。異戊二烯化包括通過加入法呢基或香葉基香葉基類異戊二烯共價(jià)修飾蛋白質(zhì)。異戊二烯化發(fā)生在蛋白質(zhì)羧基末端附近的半胱氨酸殘基上。C35多肽112-115位包含氨基酸Cys-Val-Ile-Leu，其C末端殘基為Leu?；駽ys-X-X-Leu(其中″X″代表任何脂肪族氨基酸)導(dǎo)致在Cys殘基上加入20碳的香葉基香葉基基團(tuán)。一般在加入該脂類以后，3個(gè)末端氨基酸殘基將從多肽上斷裂，脂類基團(tuán)甲基化。異戊二烯化促進(jìn)大多數(shù)蛋白質(zhì)(其多肽中具有參與將該異戊二烯化蛋白質(zhì)導(dǎo)向原生質(zhì)、核或高爾基膜的序列基序)的膜定位。異戊二烯化在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中起作用，許多異戊二烯化蛋白質(zhì)與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。異戊二烯化蛋白質(zhì)的例子包括Ras和核纖層蛋白B。(Zhang，F(xiàn).L.and Casey，P.J.，Ann.Rev.Biocheni.65241-269(1996)).利用小鼠抗人C35抗血清進(jìn)行熒光分析，已經(jīng)在兩個(gè)乳腺腫瘤細(xì)胞系表面上檢測到C35蛋白質(zhì)(圖4)。
本發(fā)明中″分泌″的C35蛋白質(zhì)是指能夠通過信號序列導(dǎo)向到ER、分泌小泡或細(xì)胞間隙的蛋白質(zhì)，以及釋放到細(xì)胞間隙的不一定包含信號序列的C35蛋白質(zhì)。如果C35分泌蛋白質(zhì)釋放到細(xì)胞間隙，則其可經(jīng)胞外加工，產(chǎn)生″成熟″C35蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^許多機(jī)制釋放到細(xì)胞間隙中，包括胞吐作用和蛋白水解裂解。
此處所用C35″多核苷酸″是指具有SEQ ID NO1中包含的核酸序列的分子。例如，C35多核苷酸可包含全長cDNA的核苷酸序列，包括5’和3’非翻譯序列、編碼區(qū)、有或者沒有信號序列、分泌蛋白質(zhì)的編碼區(qū)，以及該核酸序列的片段、表位、結(jié)構(gòu)域和變體。此外，此處所用C35″多肽″廣義是指具有由多核苷酸翻譯的氨基酸序列的分子。
特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸長度少于300nt、200nt、100nt、50nt、15nt、10nt或7nt。另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸包含C35編碼序列中至少15個(gè)連續(xù)核苷酸，但不包含任何C35內(nèi)含子的全部或部分。另一實(shí)施方案中，包含C35編碼序列的該核酸，不包含基因組側(cè)翼基因的編碼序列(即在基因組中C35基因的5’或3’)。
本發(fā)明全長C35編碼序列如SEQ ID NO1所示。
C35″多核苷酸″也指編碼C35多肽的分離的多核苷酸，及其緊密相關(guān)的多核苷酸。
C35″多核苷酸″也指編碼SEQ ID NO2所示氨基酸序列或其生物學(xué)活性片段的分離的多核苷酸。
C35″多核苷酸″還包括能夠在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件下，與SEQ ID NO1所含序列、其互補(bǔ)序列或保藏克隆中的cDNA雜交的多核苷酸。″嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件″是指在包含50％甲酰胺、5xSSC(750mM NaCl、75mM檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5x Denhardt’s液、10％硫酸葡聚糖和20ug/ml變性斷裂鮭魚精DNA的溶液中42℃溫育過夜，然后用0.1xSSC約65℃洗膜。
當(dāng)然，″多核苷酸″的定義中不包括僅與polyA+序列(例如cDNA的任何3’端polyA+區(qū))或T(或U)殘基互補(bǔ)的序列雜交的多核苷酸，因?yàn)檫@種多核苷酸可以與任何包含poly(A)區(qū)或其互補(bǔ)序列的核酸分子(例如特別是任何雙鏈cDNA克隆)雜交。
C35多核苷酸可由任何多聚核糖核苷酸或多聚脫氧核糖核苷酸組成，可以是未修飾或者修飾的RNA或DNA。例如，C35多核苷酸可由單鏈和雙鏈DNA、單雙鏈區(qū)混合的DNA、單鏈和雙鏈RNA、單雙鏈區(qū)混合的RNA以及包含單鏈或一般為雙鏈或單雙鏈區(qū)混合的DNA和RNA的雜合分子組成。此外，C35多核苷酸可由包含RNA、或DNA、或RNA和DNA的三鏈區(qū)組成。C35多核苷酸還可包含因穩(wěn)定性或其它原因而修飾的一個(gè)或多個(gè)修飾堿基或DNA或RNA主鏈?！逍揎棥鍓A基包括，例如三苯甲基化堿基以及稀有堿基，例如次黃苷。可對DNA和RNA進(jìn)行多種修飾；因此″多核苷酸″包含化學(xué)、酶學(xué)或代謝修飾的形式。
C35多肽可由通過肽鍵或修飾的肽鍵彼此相連的氨基酸(即肽同排體)組成，并可包含除基因編碼的20種氨基酸以外的氨基酸?？梢酝ㄟ^天然過程(例如翻譯后加工)或者本領(lǐng)域熟知的化學(xué)修飾技術(shù)修飾C35多肽。在基礎(chǔ)教科書中詳盡的專題論文及長篇研究文獻(xiàn)中詳細(xì)闡述了上述修飾。可以在C35多肽的任何位點(diǎn)進(jìn)行修飾，包括肽主鏈、氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基末端。應(yīng)當(dāng)理解，相同類型的修飾可以相同或不同程度位于給定C35多肽的數(shù)個(gè)位點(diǎn)。此外，給定的C35多肽可包含多種修飾。C35多肽可以是分枝的，例如通過泛素化引起的，也可是環(huán)狀、有或沒有分枝。可利用翻譯后天然過程或合成方法產(chǎn)生環(huán)狀、分枝以及分枝的環(huán)狀C35多肽。修飾包括乙?；Ⅴ；?、ADP-核糖基化、酰胺化、共價(jià)連接黃素、共價(jià)連接血紅素部分、共價(jià)連接核苷酸或核苷酸衍生物、共價(jià)連接脂類或脂類衍生物、共價(jià)連接磷脂酰肌醇、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、脫甲基化、形成共價(jià)交聯(lián)、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲?；?、γ-羧基化、糖基化、形成GPI錨、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化(pegylation)、蛋白水解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、硒代化(selenoylation)、硫酸化、轉(zhuǎn)移RNA介導(dǎo)的氨基酸向蛋白質(zhì)的添加，例如精氨?；头核鼗?例如參見Proteins-Structure And Molecular Properties，2nd Ed.，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York(1993)；Posttranslational Covalent Modification of Proteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，pgs.1-12(1983)；Seifter等人，Meth Enzymol 182626-646(1990)；Rattan等人，AnnNYAcad Sci 66348-62(1992).)″SEQ ID NO1″是指C35多核苷酸序列，而″SEQ ID NO2″是指C35多肽序列。
″具有生物學(xué)活性″的C35多肽是指在有或沒有劑量依賴性的情況下，按照特定生物學(xué)方法測定，具有與C35多肽(包括成熟形式)的活性相似而不一定相同的活性的多肽。在有劑量依賴性的情況下，不必與C35多肽相同，而是與C35多肽相比，基本上類似于劑量依賴性的給定活性(即，候選多肽活性高于C35多肽活性、或不低于其活性的約25倍以上、優(yōu)選不低于約十倍以上、最優(yōu)選不低于約三倍以上。)C35多核苷酸和多肽最初利用衍生自同一原發(fā)和浸潤乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌病人的腫瘤和正常乳腺上皮細(xì)胞系中的poly-A RNA消減雜交分離348bp C35片段。Band，V等人，Cancer Res.507351-7357(1990)。根據(jù)該序列及其重疊的EST序列(登入號W57569)設(shè)計(jì)引物，從BT-20乳腺腫瘤細(xì)胞系(ATCCHTB-19)擴(kuò)增和克隆包括全長C35編碼序列的cDNA。該C35 cDNA包含SEQID NO1所示的全部編碼區(qū)。除348bp編碼序列之外，C35克隆還包括167bp 3’非翻譯區(qū)。開放閱讀框架開始于N端1位核苷酸的甲硫氨酸，終止于348位核苷酸的終止密碼子(圖1)。包含全部或大部分SEQ IDNO1序列的典型克隆于2000年8月1日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(″ATCC″)，ATCC保藏號為PTA-2310。ATCC位于10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209，USA。按照國際承認(rèn)的以專利程序?yàn)槟康倪M(jìn)行微生物保藏的布達(dá)佩斯條約條款，在ATCC進(jìn)行保藏。
因此，SEQ ID NO1和翻譯的SEQ ID NO2十分精確，適用于本領(lǐng)域熟知的以及下文進(jìn)一步描述的各種用途。例如，SEQ ID NO1可用于設(shè)計(jì)核酸雜交探針，以檢測SEQ ID NO1所示核酸序列或者保藏克隆包含的cDNA。這些探針也可與生物樣品中的核酸分子雜交，從而建立本發(fā)明的各種法醫(yī)學(xué)及診斷方法。類似地，SEQ ID NO2確定的多肽可用來產(chǎn)生特異性結(jié)合C35的抗體，或者與細(xì)胞表面MHC分子結(jié)合刺激對C35衍生肽具有特異性的T細(xì)胞。
然而，通過測序反應(yīng)獲得的DNA序列可能含有測序錯(cuò)誤。所得DNA序列的錯(cuò)誤包括核苷酸識別錯(cuò)誤、或者核苷酸插入或缺失。錯(cuò)誤插入或缺失的核苷酸會引起所預(yù)測的氨基酸序列的閱讀框架發(fā)生移碼。這種情況下，即使獲得的DNA序列與實(shí)際的DNA序列的同一性大于99.9％(例如1000個(gè)堿基以上的開放閱讀框架中，插入或缺失1個(gè)堿基)，所預(yù)測的氨基酸序列也不同于實(shí)際的氨基酸序列。
因此，對于要求精確的核苷酸序列或氨基酸序列的應(yīng)用，本發(fā)明不僅提供SEQ ID NO1所示得到的核苷酸序列和SEQ ID NO2所示預(yù)測的翻譯的氨基酸序列。根據(jù)已知方法，將保藏的克隆測序，很容易確定保藏的C35克隆的核苷酸序列。因而能從上述保藏物證實(shí)預(yù)測的C35氨基酸序列。此外，還可以通過肽測序，或者在包含保藏的人C35 cDNA的適當(dāng)宿主細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)、收集該蛋白質(zhì)并確定其序列，以直接確定保藏克隆編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
本發(fā)明還涉及對應(yīng)于SEQ ID NO1或者保藏克隆的C35基因?？梢园凑找阎椒ǎ么颂幑_的序列信息分離C35基因。上述方法包括根據(jù)公開序列制備探針或引物，以及從合適來源的基因組物質(zhì)中鑒定或擴(kuò)增C35基因。
本發(fā)明還提供了C35的物種同系物?？梢愿鶕?jù)此處提供序列制備合適的探針或引物，并于合適的核酸源中篩選目的同系物，由此分離和鑒定物種同系物。
″C35多肽″是指此處描述的所有形式的C35蛋白質(zhì)和多肽?？梢圆捎萌魏芜m當(dāng)?shù)姆绞街苽銫35多肽。這些多肽包括分離的天然多肽、重組制備的多肽、合成制備的多肽或者綜合使用這些方法制備的多肽。制備這些多肽的方法本領(lǐng)域眾所周知。
C35多肽可能是膜蛋白質(zhì)或分泌蛋白質(zhì)形式(包括成熟形式)，或者可能是大蛋白質(zhì)(例如融合蛋白質(zhì))的一部分(參見下文)。包括附加的氨基酸序列通常是有利的，其中包含分泌或前導(dǎo)序列、前-序列、有助純化的序列(例如多個(gè)組氨酸殘基)或者為了重組制備期間穩(wěn)定性的附加序列。
C35多肽優(yōu)選地以分離形式提供，并優(yōu)選地以基本上純化的形式提供?？梢岳肧mith和Johnson，Gene 6731-40(1988)所述一步法基本純化重組制備的C35多肽(包括分泌多肽)。還可以利用本發(fā)明的針對C35蛋白質(zhì)的抗體，按照本領(lǐng)域所熟知的方法，從天然或重組來源中純化C35多肽。
多核苷酸和多肽變體″變體″是指與C35多核苷酸或多肽不同、但保持其基本特征的多核苷酸或多肽。一般來說，變體與C35多核苷酸或多肽總體非常類似、并且很多區(qū)域相同。
具有與本發(fā)明的參考核苷酸序列例如至少95％″同一性″的核苷酸序列的多核苷酸，是指除了該多核苷酸序列可以在編碼C35多肽的參考核苷酸序列的每100個(gè)核苷酸中可包括至多5個(gè)突變點(diǎn)以外，該多核苷酸的核苷酸序列與參考序列相同。換言之，為了獲得具有與參考核苷酸序列至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸，參考序列中至多5％的核苷酸可被刪除或用其它核苷酸置換，或者參考序列中可能插入至多參考序列總核苷酸數(shù)5％的若干核苷酸。查詢序列可能是SEQ ID NO1所示全部序列、ORF(開放閱讀框架)或者此處所述的任何指定片段。
實(shí)際上，任何特定的核酸分子或者多肽，都可以利用已知的計(jì)算機(jī)程序，按常規(guī)確定其是否與本發(fā)明的核苷酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。可以利用基于Brutlag等人，Comp.App.Biosci.6237-245(1990)算法的FASTDB計(jì)算機(jī)程序，確定用于確定查詢序列(本發(fā)明的序列)和目標(biāo)序列之間最佳總體匹配的優(yōu)選方法，也稱為整體序列比對。在序列比對中，查詢和目標(biāo)序列都是DNA序列。將U變?yōu)門可以比較RNA序列。所述整體序列比對的結(jié)果表示為同一性百分比。在DNA序列的FASTDB比對中，計(jì)算同一性百分比所用的優(yōu)選參數(shù)是矩陣＝一元的、k-tuple＝4、錯(cuò)配罰分＝1、連接罰分＝30、隨機(jī)組長度＝0、分值閾值(Cutoff Score)＝1、空位罰分＝5、空位大小罰分0.05、窗口大小＝500或者目標(biāo)核苷酸序列的長度(采用其中較短者)。
如果由于5’或3’缺失而不是由于內(nèi)部缺失，使目標(biāo)序列短于查詢序列，必須對結(jié)果進(jìn)行手工修正。這是因?yàn)樵谟?jì)算同一性百分比時(shí)，F(xiàn)ASTDB程序不解釋5’和3’端截短的目標(biāo)序列。對于5’或3’末端截短的目標(biāo)序列，通過計(jì)算目標(biāo)序列5’和3’不匹配/比對的查詢序列堿基數(shù)目占查詢序列堿基總數(shù)的百分比，校正其相對于查詢序列的同一性百分比。通過FASTDB序列比對結(jié)果確定核苷酸是否匹配/比對。然后從利用以上FASTDB程序按指定參數(shù)計(jì)算的同一性百分比中減去該百分比，得到最后的同一性百分比分值。該校正的分值用于本發(fā)明。為了手工調(diào)整同一性百分比分值，只計(jì)算通過FASTDB比對顯示的位于目標(biāo)序列5’和3’以外、與查詢序列不匹配/比對的堿基。
例如，將90個(gè)堿基的目標(biāo)序列與100個(gè)堿基的查詢序列比對，以確定同一性百分比。目標(biāo)序列5’存在缺失，因此FASTDB比對不顯示5’端前10個(gè)堿基的匹配/比對。該10個(gè)未配對堿基代表序列的10％(不匹配的5’和3’端堿基數(shù)/查詢序列的堿基總數(shù))，所以從FASTDB程序計(jì)算的同一性百分比分值中減去10％。如果其余的90個(gè)堿基完全匹配，最后的同一性百分比應(yīng)是90％。另一個(gè)例子，90個(gè)堿基的目標(biāo)序列與100個(gè)堿基的查詢序列相比較。這次缺失是內(nèi)部缺失，所以目標(biāo)序列的5’或3’沒有與查詢序列不匹配/比對的堿基。在這種情況下，對FASTDB計(jì)算的同一性百分比不進(jìn)行手工校正。再一次，只手工校正與查詢序列不匹配/比對的目標(biāo)序列的5’和3’堿基。不為本發(fā)明做其它的手工校正。
具有與本發(fā)明的查詢氨基酸序列例如至少95％″同一性″的氨基酸序列的多肽，是指除該目標(biāo)多肽序列可以在查詢氨基酸序列的每100個(gè)氨基酸中包括至多5個(gè)氨基酸改變以外，該目標(biāo)多肽的氨基酸序列與查詢序列相同。換言之，為了獲得與查詢氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列的多肽，目標(biāo)序列中至多5％的氨基酸殘基可被插入、缺失或用其它氨基酸置換。參考序列的改變可以發(fā)生在參考氨基酸序列的氨基端或羧基端或者該末端之間的任何位置，分別散布于參考序列的殘基之中或者在參考序列內(nèi)分布成一個(gè)或多個(gè)連續(xù)組。
實(shí)際上，任何特定的多肽，都可以利用已知的計(jì)算機(jī)程序，按常規(guī)確定其是否與例如SEQ ID NO2所示氨基酸序列或者由保藏的DNA克隆編碼的氨基酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性?？梢岳没贐rutlag等人，Comp.App.Biosci.6237-245(1990)算法的FASTDB計(jì)算機(jī)程序，確定用于確定查詢序列(本發(fā)明的序列)和目標(biāo)序列之間最佳總體匹配的優(yōu)選方法，也稱為整體序列比對。在序列比對中，查詢序列和目標(biāo)序列都是核苷酸序列，或者都是氨基酸序列。所述整體序列比對的結(jié)果表示為同一性百分比。用于FASTDB氨基酸比對的優(yōu)選參數(shù)是矩陣＝PAM 0、k-tuple＝2、錯(cuò)配罰分＝1、連接罰分＝20、隨機(jī)組長度＝0、分值閾值＝1、窗口大小＝序列長度、空位罰分＝5、空位大小罰分＝0.05、窗口大?。?00或者目標(biāo)氨基酸序列的長度(采用其中較短者)。
如果由于N-或C-端缺失而不是內(nèi)部缺失，使目標(biāo)序列短于查詢序列，必須對結(jié)果進(jìn)行手工修正。這是因?yàn)樵谟?jì)算整體同一性百分比時(shí)，F(xiàn)ASTDB程序不考慮目標(biāo)序列的N-和C-端截短。對于N-或C-端截短的目標(biāo)序列，通過計(jì)算目標(biāo)序列N-和C-端與對應(yīng)目標(biāo)殘基不匹配/比對的查詢序列殘基數(shù)目占查詢序列堿基總數(shù)的百分比，校正其相對于查詢序列的同一性百分比。通過FASTDB序列比對結(jié)果確定殘基是否匹配/比對。然后從利用以上FASTDB程序按指定參數(shù)計(jì)算的同一性百分比中減去該百分比，得到最后的同一性百分比分值。該最后的同一性百分比分值用于本發(fā)明。為了手工調(diào)整同一性百分比分值，只考慮目標(biāo)序列N-和C-末端與查詢序列不匹配/比對的殘基。即，只查詢目標(biāo)序列最N-和C-末端殘基以外位置的殘基。
例如，將90個(gè)氨基酸殘基的目標(biāo)序列與100個(gè)氨基酸殘基的查詢序列比對，以確定同一性百分比。目標(biāo)序列的N-端發(fā)生缺失，因此FASTDB比對不顯示N-端前10個(gè)殘基的匹配/比對。該10個(gè)未配對殘基代表序列的10％(不匹配的N和C-端殘基數(shù)/查詢序列的殘基總數(shù))，所以從FASTDB程序計(jì)算的同一性百分比分值中減去10％。如果其余的90個(gè)殘基完全匹配，最后的同一性百分比應(yīng)是90％。另一個(gè)例子，90個(gè)殘基的目標(biāo)序列與100個(gè)殘基的查詢序列相比較。這次缺失是內(nèi)部缺失，所以目標(biāo)序列的N-或C端沒有與查詢序列不匹配/比對的殘基。在這種情況下，不對FASTDB計(jì)算的同一性百分比進(jìn)行手工校正。再次重申，只手工校正FASTDB比對中顯示的與查詢序列不匹配/比對的目標(biāo)序列N-和C端以外位置的殘基。不為本發(fā)明做其它的手工校正。
C35變體的編碼區(qū)、非編碼區(qū)或兩者都可以包含改變。特別優(yōu)選的是包含產(chǎn)生沉默置換、添加或缺失的改變，而不改變編碼多肽性質(zhì)或活性的多核苷酸變體。優(yōu)選由遺傳密碼簡并性所致沉默置換產(chǎn)生的核苷酸變體。此外，還優(yōu)選其中5-10、1-5或1-2氨基酸以任何組合置換、缺失或添加的變體?？梢蚋鞣N理由制備C35多核苷酸變體，例如為了優(yōu)化特定宿主表達(dá)的密碼子(將人mRNA密碼子改為細(xì)菌宿主如E.coli偏性密碼子)。
天然存在的C35變體稱為″等位基因變體″，是指占據(jù)生物體染色體給定基因座的基因的幾個(gè)不同形式之一(Genes II，Lewin，B.，ed.，John Wiley & Sons，New York(1985).)。等位基因變體也能以″串聯(lián)等位基因″的形式存在，是存在于生物體染色體不同基因座的高度同源序列。這些等位基因變體可以在多核苷酸和/或多肽水平上不同。另外，利用誘變技術(shù)或直接合成，可制備非天然產(chǎn)生的變體。
利用已知的蛋白質(zhì)工程和重組DNA技術(shù)方法，可能產(chǎn)生C35多肽特性提高或改變的變體。例如，可以將分泌蛋白質(zhì)N-端或C-端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失，而基本上不損失生物學(xué)功能。Ron等人，J.Biol.Chem.2682984-2988(1993)報(bào)告了甚至在缺失氨基端3、8或27個(gè)氨基酸殘基后仍具有肝素結(jié)合活性的KGF蛋白質(zhì)變體。類似地，缺失羧基端8-10氨基酸殘基后，γ干擾素顯示高達(dá)10倍的活性(Dobeli等，J.Biotechnology 7199-216(1988))。
此外，充分證據(jù)表明變體通常保持與天然蛋白質(zhì)類似的生物學(xué)活性。例如，Gayle及合作者(J.Biol.Diem 26822105-22111(1993))對人細(xì)胞因子IL-1a進(jìn)行了廣泛的突變分析。他們利用隨機(jī)誘變產(chǎn)生了3,500個(gè)以上獨(dú)立的IL-1a變體，每個(gè)變體分子全長中平均有2.5個(gè)氨基酸改變。在每個(gè)可能的氨基酸位置檢測出多個(gè)突變。研究者發(fā)現(xiàn)″可以改變分子的大部分，而對其結(jié)合或生物學(xué)活性沒有影響″(參見摘要)。事實(shí)上，在檢測的超過3,500個(gè)核苷酸序列中，只有23個(gè)獨(dú)特的氨基酸序列，產(chǎn)生了活性顯著不同于野生型的蛋白質(zhì)。
此外，即使多肽N-端或C-端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失引起一種或多種生物學(xué)功能的改變或喪失，仍然可以保留其它的生物學(xué)活性。例如，從N-端或C-端除去分泌形式的少數(shù)殘基時(shí)，缺失變體誘導(dǎo)和/或結(jié)合識別分泌形式抗體的能力可被保留。利用此處所述及本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法，很容易確定缺少蛋白質(zhì)N-或C-端殘基的特定多肽是否保留上述免疫原性活性。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步包括顯示基本生物學(xué)活性的C35多肽變體。該變體包括根據(jù)本領(lǐng)域已知的一般規(guī)則選擇的不影響活性的缺失、插入、倒位、重復(fù)和置換。例如，Bowie J.U.等人，Science2471306-1310(1990)提供了有關(guān)制備表型沉默的氨基酸置換的指南，其中作者指出研究預(yù)改變的氨基酸序列耐受性有兩種主要的策略。
第一種策略利用進(jìn)化過程中的自然選擇產(chǎn)生氨基酸置換的耐受性。通過比較不同物種的氨基酸序列，可以鑒定保守的氨基酸。這些保守的氨基酸對于蛋白質(zhì)功能可能是重要的。相反，通過自然選擇而耐受的置換的氨基酸位點(diǎn)，表明其對于蛋白質(zhì)功能不重要。因此，可以修飾耐受的氨基酸置換的位點(diǎn)，而仍然保持該蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。
第二種策略利用基因工程在克隆的基因的特定位點(diǎn)引入氨基酸改變，以鑒定對于蛋白質(zhì)功能重要的區(qū)域。例如，可以使用定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(alanine-scanning mutagenesis)(在分子中的每個(gè)殘基引入單個(gè)丙氨酸突變)。(Cunningham and Wells，Science2441081-1085(1989).)然后測試產(chǎn)生的突變分子的生物學(xué)活性。
如作者所述，這兩種策略揭示了蛋白質(zhì)非常耐受氨基酸置換。作者進(jìn)一步指出蛋白質(zhì)某些氨基酸位點(diǎn)的氨基酸改變很可能是容許的。例如，最隱蔽(蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)內(nèi)部)的氨基酸殘基需要非極性側(cè)鏈，而一般很少保留表面?zhèn)孺湹奶卣?。此外，耐受的保守氨基酸包括脂肪族或疏水性氨基酸Ala、Val、Leu和Ile的置換；羥基殘基Ser和Thr的置換；酸性殘基Asp和Glu的置換；酰胺殘基Asn和Gln的置換，堿性殘基Lys、Arg和His的置換；芳香族殘基Phe、Tyr和Trp的置換，以及小氨基酸Ala、Ser、Thr、Met和Gly的置換。
除了保守氨基酸置換，C35的變體還包括(i)用一個(gè)或多個(gè)非保守氨基酸殘基置換，其中被置換的氨基酸殘基可能是或不是由遺傳密碼編碼的，或者(ii)用一個(gè)或多個(gè)具有取代基團(tuán)的氨基酸殘基置換，或者(iii)成熟多肽與另一化合物的融合，例如增強(qiáng)多肽穩(wěn)定性和/或可溶性的化合物(例如聚乙二醇)，或者(iv)多肽與另外的氨基酸的融合，例如IgG Fc融合區(qū)肽、或前導(dǎo)或分泌序列、或便于純化的序列?？梢哉J(rèn)為本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)此處教導(dǎo)可以理解該多肽變體。
例如，包含氨基酸置換(用其它帶電荷的或中性的氨基酸置換帶電荷的氨基酸)的C35多肽變體，可以制備具有較好特性的蛋白質(zhì)，例如較少聚集的蛋白質(zhì)。藥物制劑聚集因聚集物的免疫原性活性而使活性減低、清除率提高。(Pinckard等人，Clin.Exp.Immunol.2331-340(1967)；Robbins等人，Diabetes 36838-845(1987)；Cleland等人，Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems 10307-377(1993).)多核苷酸和多肽片段本發(fā)明中″多核苷酸片段″是指具有保藏的克隆所含的或SEQ IDNO1所示的核酸序列的短的多核苷酸。該短核苷酸片段長度優(yōu)選至少約15nt、再優(yōu)選至少約20nt、更優(yōu)選至少約30nt、最優(yōu)選至少約40nt。例如“至少20nt長”的片段是指包括保藏克隆所含cDNA序列或者SEQ IDNO1所示核苷酸序列中20個(gè)或更多連續(xù)的堿基。這些核苷酸片段用作此處所述的診斷探針和引物。當(dāng)然優(yōu)選大片段(例如至少50、100、150、200、250、300個(gè)核苷酸)。
此外，C35多核苷酸片段的典型例子包括，例如具有SEQ ID NO1或者保藏的克隆所含cDNA中大約核苷酸編號為1-50、51-100、101-150、151-200、201-250、251-300或301到終點(diǎn)的序列的片段。其中″大約″包括所述的特定范圍，可以在一端或兩端多或少幾個(gè)(5、4、3、2或1)核苷酸。優(yōu)選地，這些片段編碼具有生物學(xué)活性的多肽。更優(yōu)選地，這些多核苷酸可以用作此處所述的探針或引物。
本發(fā)明中″多肽片段″是指SEQ ID NO2所示或保藏克隆所含cDNA所編碼的短氨基酸序列。蛋白質(zhì)片段可能是″獨(dú)立的″或包含在大的多肽內(nèi)，形成其部分或區(qū)域，最優(yōu)選地作為單個(gè)連續(xù)區(qū)域。本發(fā)明多肽片段的典型例子包括，例如大約氨基酸編號為1-20、21-40、41-60、61-80、81-100或101到編碼區(qū)終點(diǎn)的片段。此外，多肽片段長度可以為9、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100個(gè)氨基酸。其中″大約″包括所述的特定范圍，可以在一端或兩端多或少幾個(gè)(5、4、3、2或1)氨基酸。
優(yōu)選多肽片段包括分泌的C35蛋白質(zhì)及其成熟形式。更優(yōu)選片段包括氨基或羧基末端或兩者都有一系列連續(xù)缺失的殘基的分泌的C35蛋白質(zhì)或成熟形式。
如上所述，即使蛋白質(zhì)N-端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失引起該蛋白質(zhì)的一種或多種生物學(xué)功能改變或喪失，仍然可以保留其它的生物學(xué)活性。因此，從N-端除去完全或成熟多肽的少數(shù)殘基時(shí)，短的C35突變蛋白質(zhì)通常可保留誘導(dǎo)和/或結(jié)合識別完整或成熟形式多肽的抗體的能力。利用此處所述及本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法，很容易確定缺少完整多肽N端殘基的特定多肽是否保留上述免疫學(xué)活性。N端氨基酸殘基大量缺失的C35突變蛋白質(zhì)并非不太可能保留某些生物學(xué)或免疫原性活性。實(shí)際上，僅由9個(gè)氨基酸殘基組成的肽通?？赡苷T發(fā)免疫應(yīng)答。
因此，本發(fā)明還提供在SEQ ID NO2所示C35氨基酸序列的氨基端缺失一個(gè)或多個(gè)殘基、直至位點(diǎn)編號105的蘇氨酸殘基的多肽以及編碼該多肽的多核苷酸。
還如上所述，即使蛋白質(zhì)C-端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失引起該蛋白質(zhì)的一種或多種生物學(xué)功能改變或喪失，仍然可以保留其它的生物學(xué)活性。因此，從C-端除去完全或成熟多肽的少數(shù)殘基時(shí)，短的C35突變蛋白質(zhì)通常可保留誘導(dǎo)和/或結(jié)合識別完整或成熟形式多肽的抗體的能力。利用此處所述及本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法，很容易確定缺少完整多肽C端殘基的特定多肽是否保留上述免疫學(xué)活性。C端氨基酸殘基大量缺失的C35突變蛋白質(zhì)并非不太可能保留某些生物學(xué)或免疫原性活性。
因此，本發(fā)明還提供在SEQ ID NO2所示C35羧基酸序列的羧基端缺失一個(gè)或多個(gè)殘基、直至位點(diǎn)編號10的纈氨酸殘基的多肽以及編碼該多肽的多核苷酸。
此外，本發(fā)明還提供在氨基和羧基端都缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸的多肽。優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有SEQ ID NO2的殘基S-9到V-17；V-10到V-17；E-16到V-23；E-16到R-24；E-16到I-25；S-21到F-35；C30到T-38；E-31到Y(jié)-39；E-36到A-43；A-37到A-45；A-37到V-46；Y-39到V-46；S-44到1-53；A-45到1-53；G-52到L-59；E-54到T-62；S-57到F-75；R-58到1-67；G-61到1-69；G-63到F-83；E-66到L-73；E-66到V-74；F-83到E103；D-88到A-96；L-89到A-96；A-92到T-101；R-95到L-102；A-96到K-104；K-104到V-113；1-105到V-113；1-105到1-114的多肽以及編碼該多肽的多核苷酸。
可以通過序列數(shù)據(jù)庫公開地獲得和利用很多的多核苷酸序列，例如EST序列。
在EST數(shù)據(jù)庫的BLAST檢索中，鑒定了下述人EST序列。這些序列被認(rèn)為是所述GenBank登錄號鑒定的cDNA插入片段的部分序列。在所述的GenBank數(shù)據(jù)庫的檢索中，沒有鑒定到同源序列。期望值(E)是描述在檢索特定大小的數(shù)據(jù)庫時(shí)，″期望″只是偶然發(fā)現(xiàn)的命中(hit)數(shù)的參數(shù)。它隨著代表兩個(gè)序列之間匹配的分值(S)而指數(shù)性下降。本質(zhì)上，E值描述因序列之間匹配而產(chǎn)生的隨機(jī)背景噪聲。BLAST 2.0中，還利用期望值代替P值(概率)報(bào)告匹配顯著性。例如，將一個(gè)命中的E值賦為1可以解釋為，是指在當(dāng)前大小的數(shù)據(jù)庫中，可以期待僅僅偶然發(fā)現(xiàn)類似分值的一個(gè)匹配。
例如，下列序列與SEQ ID NO1有關(guān)，GenBank登錄號AA971857(SEQ ID NO3)；W57569(SEQ ID NO4)；A1288765(SEQ ID NO5)；W65390(SEQ ID NO6)；W37432(SEQ ID NO7)；N42748(SEQ IDNO8)；AA971638(SEQ ID NO9)；R22331(SEQ ID NO10)；AA308370(SEQ ID NO11)；AA285089(SEQ ID NO12)；R68901(SEQ ID NO13)；AA037285(SEQ ID NO14)；H94832(SEQ ID NO15)；H96058(SEQ ID NO16)；H56522(SEQ ID NO17)；AA935328(SEQ ID NO18)；AW327450(SEQ ID NO19)；AW406075(SEQ ID NO20)；AW406223(SEQ ID NO21)；A1909652(SEQ ID NO22)；AA026773(SEQ ID NO23)；H96055(SEQ ID NO24)；H12836(SEQ ID NO25)；R22401(SEQID NO26)；N34596(SEQ ID NO27)；W32121(SEQ ID NO28)；T84927(SEQ ID NO29)；R63575(SEQ ID NO30)；R23139(SEQ ID NO31)；AA337071(SEQ ID NO32)；AA813244(SEQ ID NO33)；AA313422(SEQID NO34)；N31910(SEQ IDNO35)；N42693(SEQ ID NO36)；N32532(SEQ IDNO37)；AA375119(SEQ ID NO38)；R32153(SEQ ID NO39)；R23369(SEQ ID NO40)；AA393628(SEQ ID NO41)；H12779(SEQ IDNO42)；A1083674(SEQ ID NO43)；AA284919(SEQ ID NO44)；AA375286(SEQ ID NO45)；AA830592(SEQ ID NO46)；H95363(SEQID NO47)；T92052(SEQ ID NO48)；A1336555(SEQ ID NO49)；A1285284(SEQ ID NO50)；AA568537(SEQ ID NO51)；A1041967(SEQID NO52)；W44577(SEQ ID NO53)；R22332(SEQ ID NO54)；N27088(SEQ ID NO55)；H96418(SEQ ID NO56)；A1025384(SEQ ID NO57)；AA707623(SEQ ID NO58)；AI051009(SEQ ID NO59)；AA026774(SEQID NO60)；W51792(SEQ ID NO61)；A1362693(SEQ ID NO62)；AA911823(SEQ ID NO63)；H96422(SEQ ID NO64)；A1800991(SEQID NO65)；A1525314(SEQ ID NO66)；A1934846(SEQ ID NO67)；A1937133(SEQ ID NO68)；AW006797(SEQ ID NO69)；A1914716(SEQID NO70)；A1672936(SEQ ID NO71)；W61294(SEQ ID NO72)；A1199227(SEQ ID NO73)；A1499727(SEQ ID NO74)；R32154(SEQID NO75)；A1439771(SEQ ID NO76)；AA872671(SEQ ID NO77)；AA502178(SEQ ID NO78)；N26715(SEQ ID NO79)；AA704668(SEQID NO80)；R68799(SEQ ID NO81)；H56704(SEQ ID NO82)；A1360416(SEQ ID NO83).
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含此處所述多核苷酸片段以及全長多核苷酸(例如編碼區(qū)域)、而不包括一種或多種上述EST的多核苷酸。
還優(yōu)選以結(jié)構(gòu)域或功能域?yàn)樘卣鞯腃35多肽和多核苷酸片段。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案包括含有MHC結(jié)合表位和異戊二烯化位點(diǎn)的片段。
其它優(yōu)選片段為生物學(xué)活性的C35片段。生物學(xué)活性片段應(yīng)具有與C35多肽的活性類似而不一定相同的活性的片段。片段的生物學(xué)活性可以包括提高的需要的活性，或降低的不合需要的活性。
表位&抗體由內(nèi)源合成的蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生的細(xì)胞肽，被移位到前高爾基小室，在此與I類MHC分子結(jié)合，以轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面。這些I類MHC肽復(fù)合物是特異性CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的靶抗原。因?yàn)樗袃?nèi)源性蛋白質(zhì)都″轉(zhuǎn)變″，來源于任何胞質(zhì)或核蛋白的肽可能結(jié)合MHC分子并轉(zhuǎn)運(yùn)，以呈遞于細(xì)胞表面。這使T細(xì)胞比抗體針對的細(xì)胞蛋白質(zhì)群體更大，抗體只局限于識別那些分泌的或整合于細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)的構(gòu)象決定簇。T細(xì)胞受體的抗原結(jié)合位點(diǎn)與肽以及周圍MHC的決定簇相互作用。因此必須按照MHC肽復(fù)合物來確定T細(xì)胞的特異性。肽結(jié)合MHC分子的特異性很廣，與特異性抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)相比，其親和力相對較低。結(jié)合I類分子的肽一般長為8-10個(gè)殘基，并在某些關(guān)鍵位點(diǎn)容忍有限多樣性的、可以匹配MHC肽結(jié)合位點(diǎn)的口袋的氨基酸側(cè)鏈。與特定MHC分子結(jié)合的肽的這些主要特征，構(gòu)成肽結(jié)合基序。
已經(jīng)描述了許多計(jì)算機(jī)算法，來鑒定大蛋白質(zhì)中符合特異性MHC I類或MHC II類分子的肽結(jié)合基序要求的肽。由于MHC分子的廣泛多態(tài)性，不同的肽常常結(jié)合不同的MHC分子。表1-3列出了利用三種不同算法預(yù)測的MHC結(jié)合肽。特別地，利用在SYFPEITHI網(wǎng)站(wysiwyg//35/http//134.2.96.221/scriptslhlaserver.dll/EpPredict.htm)發(fā)現(xiàn)的規(guī)則，并根據(jù)Rammensee，H.G.，Bachmann，J.和Stevanovic，S.(Chapman & Hall，New York 1997)的著作″MHC Ligandsand Peptide Motifs″預(yù)測的C35 HLA I類和II類表位，列于表1和5。利用網(wǎng)上得到的NIH BIMAS程序(http//bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform)預(yù)測的來源于C35序列的MHC結(jié)合肽，列于表2。最后，表3和6所列為利用Tepitope程序(該程序用于預(yù)測可與多個(gè)不同的MHC II類分子結(jié)合的肽)預(yù)測的C35肽。利用Tepitope，確定出四種C35肽為結(jié)合各種HLA II類分子的可能候選者。通常這些肽比結(jié)合HLA I類的肽長，在結(jié)合多種HLA II類分子方面更為簡并。
表1SYFPEITIH網(wǎng)站預(yù)測的C35肽(分值反映連接強(qiáng)度)I類MHCHLA-A*0201九聚體(nonamers)位置 分值1 2 3 4 5 6 7 8 99S V A P P P E E V2388D L I E A I R R A21
37A T Y L E L A S A1997S N G E T L E K I18105I T N S R P P C V182S G E P G Q T S V1745A V K E Q Y P G I1738T Y L E L A S A V1661G T G A F E I E I1685Y E K D L I E A I1665F E I E I N G Q L15107N S R P P C V I L1541E L A S A V K E Q1458R L G G T G A F E1459L G G T G A F E I1466E I E I N G Q L V14
68E I N G Q L V F S1481G G F P Y E K D L1494R R A S N G E T L14HLA-A*0201十聚體(decamers)位置 分值1 2 3 4 5 6 7 8 9 058R L G G T G A F E I2296A S N G E T L E K I19104K I T N S R P P C V1937A T Y L E L A S A V1817V E P G S G V R I V1733C G F E A T Y L E L1644S A V K E Q Y P G I1692A I R R A S N G E T1639Y L E L A S A V K E15
53I E I E S R L G G T1565F E I E I N G Q L V15105I T N S R P P C V I151M S G E P G Q T S V1463G A F E I E I N G Q1468E I N G Q L V F S K1469I N G Q L V F S K L1483F P Y E K D L I E A1488D L I E A I R R A S1493I R R A S N G E T L1472Q L V F S K L E N G1389L I E A I R R A S N138T S V A P P P E E V1216E V E P G S G V R I12
50Y P G I E I E S R L1260G G T G A F E I E I1281G G F P Y E K D L I12106T N S R P P C V I L12HLA-A*0203九聚體位置 分值1 2 3 4 5 6 7 8 935F E A T Y L E L A12HLA-A*0203十聚體位置 分值1 2 3 4 5 6 7 8 9 036E A T Y L E L A S A18HLA-A1九聚體位置 分值1 2 3 4 5 6 7 8 977K L E N G G F P Y29
2S G E P G Q T S V1821S G V R I V V E Y1816E V E P G S G V R1729Y C E P C G F E A1742L A S A V K E Q Y1731E P C G F E A T Y1634G F E A T Y L E L1639Y L E L A S A V K1484P Y E K D L I E A1466E I E I N G Q L V1313P P E E V E P G S1246V K E Q Y P G I E1252G I E I E S R L G1296A S N G E T L E K12
HLA-A1十聚體位置 分值1 2 3 4 5 6 7 8 9 020G S G V R I V V E Y2029Y C E P C G F E A T1976S K L E N G G F P Y182S G E P G Q T S V A1752G I E I E S R L G G1766E I E I N G Q L V F1741E L A S A V K E Q Y1646V K E Q Y P G I E I1616E V E P G S G V R I1530C E P C G F E A T Y1539Y L E L A S A V K E1577K L E N G G F P Y E1486E K D L I E A I R R14
98N G E T L E K I T N1434G F E A T Y L E L A1264A F E I E I N G Q L12101T L E K I T N S R P12HLA-A26九聚體位置 分值1 2 3 4 5 6 7 8 968E I N G Q L V F S24100E T L E K I T N S2488D L I E A I R R A2354E I E S R L G G T2241E L A S A V K E Q2145A V K E Q Y P G I2031E P C G F E A T Y1934G F E A T Y L E L19
73L V F S K L E N G1916E V E P G S G V R1877K L E N G G F P Y1866E I E I N G Q L V1721S G V R I V V E Y1637A T Y L E L A S A1624R I V V E Y C E P159S V A P P P E E V1422G V R I V V E Y C1451P G I E I E S R L1470N G Q L V F S K L1457S R L G G T G A F1365F E I E I N G Q L1325I V V E Y C E P C12
48E Q Y P G I E I E1267I E I N G Q L V F1275F S K L E N G G F1281G G F P Y E K D L12104K I T N S R P P C12105I T N S R P P C V12HLA-A26十聚體位置 分值1 2 3 4 5 6 7 8 9 041E L A S A V K E Q Y2766E I E I N G Q L V F2668E I N G Q L V F S K2326V V E Y C E P C G F2116E V E P G S G V R I2088D L I E A I R R A S19
100E T L E K I T N S R1974V F S K L E N G G F1833C G F E A T Y L E L1754E I E S R L G G T G1756E S R L G G T G A F1720G S G V R I V V E Y1631E P C G F E A T Y L1664A F E I E I N G Q L1569I N G Q L V F S K L1561G T G A F E I E I N1473L V F S K L E N G G149S V A P P P E E V E1325I V V E Y C E P C G1345A V K E Q Y P G I E13
72Q L V F S K L E N G1377K L E N G G F P Y E1379E N G G F P Y E K D134E P G Q T S V A P P127Q T S V A P P P E E1230C E P C G F E A T Y1236E A T Y L E L A S A1237A T Y L E L A S A V1276S K L E N G G F P Y1289L I E A I R R A S N12HLA-A3九聚體位置 分值1 2 3 4 5 6 7 8 939Y L E L A S A V K2877K L E N G G F P Y25
16E V E P G S G V R2458R L G G T G A F E2267I E I N G Q L V F1996A S N G E T L E K1892A I R R A S N G E179S V A P P P E E V16101T L E K I T N S R1622G V R I V V E Y C1531E P C G F E A T Y1545A V K E Q Y P G I1572Q L V F S K L E N1521S G V R I V V E Y1468E I N G Q L V F S1469I N G Q L V F S K14
88D L I E A I R R A1491E A I R R A S N G1425I V V E Y C E P C1337A T Y L E L A S A1355I E S R L G G T G1357S R L G G T G A F1379E N G G F P Y E K1387K D L I E A I R R13104K I T N S R P P C1324R I V V E Y C E P1242L A S A V K E Q Y1266E I E I N G Q L V1289L I E A I R R A S1290I E A I R R A S N12
94R R A S N G E T L12HLA-A3十聚體位置 分值1 2 3 4 5 6 7 8 9 068E I N G Q L V F S K2216E V E P G S G V R I2038T Y L E L A S A V K2041E L A S A V K E Q Y2066E I E I N G Q L V F209S V A P P P E E V E1958R L G G T G A F E I1939Y L E L A S A V K E1892A I R R A S N G E T1895R A S N G E T L E K1845A V K E Q Y P G I E17
54E I E S R L G G T G1688D L I E A I R R A S1689L I E A I R R A S N1626V V E Y C E P C G F1537A T Y L E L A S A V1522G V R I V V E Y C E1477K L E N G G F P Y E1493I R R A S N G E T L1425I V V E Y C E P C G1330C E P C G F E A T Y1352G I E I E S R L G G1376S K L E N G G F P Y1378L E N G G F P Y E K13101T L E K I T N S R P13
104K I T N S R P P C V1324R I V V E Y C E P C1272Q L V F S K L E N G12HLA-B*0702九聚體位置 分值1 2 3 4 5 6 7 8 918E P G S G V R I V19107N S R P P C V I L184E P G Q T S V A P1511A P P P E E V E P1531E P C G F E A T Y1434G F E A T Y L E L1394R R A S N G E T L1312P P P E E V E P G1219P G S G V R I V V12
32P C G F E A T Y L1283F P Y E K D L I E12106T N S R P P C V I12HLA-B*0702十聚體位置 分值1 2 3 4 5 6 7 8 9 031E P C G F E A T Y L2450Y P G I E I E S R L2118E P G S G V R I V V2083F P Y E K D L I E A164E P G Q T S V A P P1511A P P P E E V E P G1593I R R A S N G E T L14106T N S R P P C V I L1469I N G Q L V F S K L13
33C G F E A T Y L E L1264A F E I E I N G Q L12HLA-B*08八聚體(octamers)位置 分值1 2 3 4 5 6 7 883F P Y E K D L I2566E I E I N G Q L1652G I E I E S R L1518E P G S G V R I1454E I E S R L G G1491E A I R R A S N1495R A S N G E T L14100E T L E K I T N1433C G F E A T Y L1245A V K E Q Y P G12
58R L G G T G A F1268E I N G Q L V F1271G Q L V F S K L1275F S K L E N G G1282G F P Y E K D L12107N S R P P C V I12108S R P P C V I L12HLA-B*08九聚體位置 分值1 2 3 4 5 6 7 8 975F S K L E N G G F1983F P Y E K D L I E1945A V K E Q Y P G I1885Y E K D L I E A I18107N S R P P C V I L17
100E T L E K I T N S1554E I E S R L G G T1465F E I E I N G Q L1491E A I R R A S N G1420G S G V R I V V E1234G F E A T Y L E L1251P G I E I E S R L1281G G F P Y E K D L12HLA-B*1510九聚體位置 分值1 2 3 4 5 6 7 8 9107N S R P P C V I L1534G F E A T Y L E L1351P G I E I E S R L1381G G F P Y E K D L13
94R R A S N G E T L13HLA-B*2705九聚體位置 分值1 2 3 4 5 6 7 8 957S R L G G T G A F2694R R A S N G E T L2567I E I N G Q L V F1987K D L I E A I R R1951P G I E I E S R L1781G G F P Y E K D L1765F E I E I N G Q L1669I N G Q L V F S K1696A S N G E T L E K1616E V E P G S G V R1534G F E A T Y L E L15
50Y P G I E I E S R1570N G Q L V F S K L15101T L E K I T N S R1523V R I V V E Y C E1432P C G F E A T Y L1439Y L E L A S A V K1479E N G G F P Y E K1493I R R A S N G E T1421S G V R I V V E Y1327V E Y C E P C G F1375F S K L E N G G F1386E K D L I E A I R13107N S R P P C V I L1317V E P G S G V R I12
31E P C G F E A T Y1277K L E N G G F P Y12HLA-B*2709九聚體位置 分值1 2 3 4 5 6 7 8 994R R A S N G E T L2557S R L G G T G A F2081G G F P Y E K D L1634G F E A T Y L E L1451P G I E I E S R L1365F E I E I N G Q L1323V R I V V E Y C E12107N S R P P C V I L12
HLA-B*5101九聚體位置 分值1 2 3 4 5 6 7 8 918E P G S G V R I V2181G G F P Y E K D L2151P G I E I E S R L2070N G Q L V F S K L2019P G S G V R I V V1931E P C G F E A T Y192S G E P G Q T S V1842L A S A V K E Q Y1859L G G T G A F E I1821S G V R I V V E Y1483F P Y E K D L I E1497S N G E T L E K I14
13P P E E V E P G S1338T Y L E L A S A V1345A V K E Q Y P G I1363G A F E I E I N G1394R R A S N G E T L1312P P P E E V E P G1233C G F E A T Y L E1250Y P G I E I E S R1266E I E I N G Q L V1285Y E K D L I E A I1295R A S N G E T L E12105I T N S R P P C V12
HLA-B*5101八聚體位置 分值1 2 3 4 5 6 7 883F P Y E K D L I2595R A S N G E T L2310V A P P P E E V2118E P G S G V R I2133C G F E A T Y L2198N G E T L E K I1919P G S G V R I V1860G G T G A F E I1862T G A F E I E I1863G A F E I E I N1471G Q L V F S K L1448E Q Y P G I E I1367I E I N G Q L V13
106T N S R P P C V12II類MHCHLA-DRB1*0101十五聚體(15-mers)位置 分值1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 572Q L V F S K L E N G G F P Y E2937A T Y L E L A S A V K E Q Y P2626V V E Y C E P C G F E A T Y L2563G A F E I E I N G Q L V F S K2524R I V V E Y C E P C G F E A T2436E A T Y L E L A S A V K E Q Y2439Y L E L A S A V K E Q Y P G I2453I E I E S R L G G T G A F E I2456E S R L G G T G A F E I E I N2414P E E V E P G S G V R I V V E23
43A S A V K E Q Y P G I E I E S2320G S G V R I V V E Y C E P C G2062T G A F E I E I N G Q L V F S2032P C G F E A T Y L E L A S A V1947K E Q Y P G I E I E S R L G G1964A F E I E I N G Q L V F S K L1982G F P Y E K D L I E A I R R A1934G F E A T Y L E L A S A V K E1854E I E S R L G G T G A F E I E1890I E A I R R A S N G E T L E K1899G E T L E K I T N S R P P C V1831E P C G F E A T Y L E L A S A1749Q Y P G I E I E S R L G G T G1758R L G G T G A F E I E I N G Q17
66E I E I N G Q L V F S K L E N1767I E I N G Q L V F S K L E N G1768E I N G Q L V F S K L E N G G1784P Y E K D L I E A I R R A S N1786E K D L I E A I R R A S N G E1735F E A T Y L E L A S A V K E Q1674V F S K L E N G G F P Y E K D1687K D L I E A I R R A S N G E T1691E A I R R A S N G E T L E K I161M S G E P G Q T S V A P P P E154E P G Q T S V A P P P E E V E1511A P P P E E V E P G S G V R I1512P P P E E V E P G S G V R I V1529Y C E P C G F E A T Y L E L A15
5P G Q T S V A P P P E E V E P146G Q T S V A P P P E E V E P G1444S A V K E Q Y P G I E I E S R1452G I E I E S R L G G T G A F E1461G T G A F E I E I N G Q L V F1350Y P G I E I E S R L G G T G A12HLA-DRB1*0301(DR17)十五聚體位置 分值1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 564A F E I E I N G Q L V F S K L2639Y L E L A S A V K E Q Y P G I2572Q L V F S K L E N G G F P Y E2362T G A F E I E I N G Q L V F S2224R I V V E Y C E P C G F E A T1971G Q L V F S K L E N G G F P Y19
86E K D L I E A I R R A S N G E197Q T S V A P P P E E V E P G S1823V R I V V E Y C E P C G F E A1850Y P G I E I E S R L G G T G A1890I E A I R R A S N G E T L E K1820G S G V R I V V E Y C E P C G1787K D L I E A I R R A S N G E T1799G E T L E K I T N S R P P C V1628E Y C E P C G F E A T Y L E L1537A T Y L E L A S A V K E Q Y P1448E Q Y P G I E I E S R L G G T1478L E N G G F P Y E K D L I E A1414P E E V E P G S G V R I V V E1370N G Q L V F S K L E N G G F P13
43A S A V K E Q Y P G I E I E S1252G I E I E S R L G G T G A F E1254E I E S R L G G T G A F E I E1274V F S K L E N G G F P Y E K D1282G F P Y E K D L I E A I R R A12HLA-DRB1*0401(DR4Dw4)十五聚體位置 分值1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 536E A T Y L E L A S A V K E Q Y2862T G A F E I E I N G Q L V F S2886E K D L I E A I R R A S N G E2687K D L I E A I R R A S N G E T2690I E A I R R A S N G E T L E K2672Q L V F S K L E N G G F P Y E2282G F P Y E K D L I E A I R R A22
50Y P G I E I E S R L G G T G A2099G E T L E K I T N S R P P C V2026V V E Y C E P C G F E A T Y L1632P C G F E A T Y L E L A S A V1647K E Q Y P G I E I E S R L G G1680N G G F P Y E K D L I E A I R1614P E E V E P G S G V R I V V E1420G S G V R I V V E Y C E P C G1422G V R I V V E Y C E P C G F E1437A T Y L E L A S A V K E Q Y P1439Y L E L A S A V K E Q Y P G I1456E S R L G G T G A F E I E I N1464A F E I E I N G Q L V F S K L1466E I E IN G Q L V F S K L E N14
10V A P P P E E V E P G S G V R1212P P P E E V E P G S G V R I V1216E V E P G S G V R I V V E Y C1229Y C E P C G F E A T Y L E L A1230C E P C G F E A T Y L E L A S1231E P C G F E A T Y L E L A S A1234G F E A T Y L E L A S A V K E1235F E A T Y L E L A S A V K E Q1242L A S A V K E Q Y P G I E I E1248E Q Y P G I E I E S R L G G T1249Q Y P G I E I E S R L G G T G1253I E I E S R L G G T G A F E I1258R L G G T G A F E I E I N G Q1259L G G T G A F E I E I N G Q L12
61G T G A F E I E I N G Q L V F1263G A F E I E I N G Q L V F S K1267I E I N G Q L V F S K L E N G1268E I N G Q L V F S K L E N G G1269I N G Q L V F S K L E N G G F1285Y E K D L I E A I R R A S N G1293I R R A S N G E T L E K I T N1294R R A S N G E T L E K I T N S1296A S N G E T L E K I T N S R P1297S N G E T L E K I T N S R P P12
表2HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列 (長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
表3

NT表示性能未測試。
表4

NT表示性能未測試。
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
HLA肽基序檢索結(jié)果


響應(yīng)的用戶肽序列(長度＝115個(gè)殘基)
表3HLA肽基序檢索結(jié)果重要提示Tepitope設(shè)計(jì)為按Ala評價(jià)Cys殘基，由于合成和分析的限制，不可能系統(tǒng)地測試包含Cys的肽。所以，只要預(yù)測序列包含Cys殘基，我們建議您用Ala殘基代替Cys進(jìn)行合成。
文件名稱C35預(yù)測參數(shù)定量閾值[％]3抑制閾值[變化倍數(shù)的對數(shù)]-1抑制殘基[數(shù)]10--------30----DRB1*0101 SGVRIVVEYCEPCGFDRB1*0301 SGVRIVVEYCEPCGFDRB1*0401 SGVRIVVEYCEPCGFDRB1*0701 SGVRIVVEYCEPCGFDRB1*0801 SGVRIVVEYCEPCGFDRB1*1101 SGVRIVVEYCEPCGFDRB1*1501 SGVRIVVEYCEPCGFDRB5*0101 SG PCGF(包含一個(gè)抑制殘基的B5*0101的結(jié)合框架-100倍)------------------------------------定量分析 ′SGVRIVVEYCEPCGF′閾值(％) 10 09 08 07 06 05 04 03 02 01DRB1*0101 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX....
DRB1*0102 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX....
DRB1*0301 XXXXXXXXXXXXXXXXXX....................
DRB1*0401 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDRB1*0402 XX....................................
DRB1*0404 XXXXXXXXXXXXXXXXXX....................
DRB1*0405 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX............
DRB1*0410 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX........
DRB1*0421 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX....
DRB1*0701 XXXXXXXXXX............................
DRB1*0801 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX............
DRB1*0802 XXXXXX................................
DRB1*0804 XXXXXXXXXXXXXX........................
DRB1*0806 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX........
DRB1*1101 XXXXXXXXXX............................
DRB1*1104 XXXXXXXXXX............................
DRB1*1106 XXXXXXXXXX............................
DRB1*1107 XXXXXXXXXXXXXXXXXX....................
DRB1*1305 XXXXXXXXXXXXXXXXXX....................
DRB1*1307 XXXXXXXXXX............................
DRB1*1311 XXXXXXXXXX............................
DRB1*1321 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX........
DRB1*1501 XXXXXXXXXX............................
DRB1*1502 XXXXXXXXXX............................
DRB5*0101 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX........
文件名稱C35預(yù)測參數(shù)定量閾值[％]3抑制閾值[變化倍數(shù)的對數(shù)]-1抑制殘基[數(shù)]1---60--------70----DRB1*0101SRLGGTGAFEIEINGQLVFDRB1*0301SRLGGTGAFEIEINGQLVFDRB1*0401SRLGGTGA VFDRB1*0701SRLGGTGAFEIEINGQLVFDRB1*0801SRLGGTGAFEIEINGQLVFDRB1*1101SRLGGTGAFEIEINGQLVFDRB1*1501SRLGGTGAFEIEINGQLVFDRB5*0101SRLGGTGAFEIEINGQLVF(包含一個(gè)抑制殘基的B5*0101的結(jié)合框架-100倍)-----------------------------------定量分析 ′SRLGGTGAFEIEINGQLVF′閾值(％) 10 09 08 07 06 05 04 03 02 01DRB1*0101 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX................
DRB1*0102 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX............
DRB1*0301 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX................
DRB1*0401 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX....
DRB1*0402 XXXXXXXXXX............................
DRB1*0404 ......................................
DRB1*0405 XXXXXXXXXX............................
DRB1*0410 XX.....................................
DRB1*0421 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX....
DRB1*0701 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDRB1*0801 ......................................
DRB1*0802 ......................................
DRB1*0804 XXXXXX................................
DRB1*0B06 XXXXXX................................
DRB1*1101 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX................
DRB1*1104 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX............
DRB1*1106 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX............
DRB1*1107 XX....................................
DRB1*1305 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX........
DRB1*1307 XX....................................
DRB1*1311 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX............
DRB1*1321 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX................
DRB1*1501 XXXXXXXXXXXXXXXXXX....................
DRB1*1502 XXXXXXXXXXXXXXXXXX....................
DRB5*0101 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX........
-------------------------------文件名稱C35預(yù)測參數(shù)定量閾值[％]3抑制閾值[變化倍數(shù)的對數(shù)]-1抑制殘基[數(shù)]1-------70--------80--DRB1*0101GAFEIEINGQLVFSKLENGGFDRB1*0301GAFEIEINGQLVFSKLENGGFDRB1*0401GA VFSKLENGGFDRB1*0701GAFEIEINGQLVFSKLENGGFDRB1*D801GAFEIEINGQLVFSKLENGGFDRB1*1101GAFEIEINGQLVFSKLENGGFDRB1*1501GAFEIEINGQLVFSKLENGGFDRB5*0101GAFEIEINGQLVFSKLENGGF(包含一個(gè)抑制殘基的B5*0101的結(jié)合框架-100倍)----------------------------------------------定量分析 ′GAFEIEINGQLVFSKLENGGF′閾值(％) 10 09 08 07 06 05 04 03 02 01DRB1*0101 XXXXXXXXXXXXXXXXXX....................
DRB1*0102 XXXXXXXXXXXXXX........................
DRB1*0301 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX....
DRB1*0401 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX....
DRB1*0402 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX............
DRB1*0404 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX............
DRB1*0405 XXXXXXXXXX............................
DRB1*0410 XXXXXX................................
DRB1*0421 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX....
DRB1*0701 XXXXXXXXXXXXXXXXXX....................
DRB1*0801 ......................................
DRB1*0802 ......................................
DRB1*0804 XXXXXX................................
DRB1*0806 XXXXXX................................
DRB1*1101 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX................
DRB1*1104 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX............
DRB1*1106 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX............
DRB1*1107 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX....
DRB1*1305 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX........
DRB1*1307 XXXXXXXXXXXXXXXXXX....................
DRB1*1311 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX............
DRB1*1321 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX................
DRB1*1501 XXXXXXXXXXXXXX........................
DRB1*1502 XXXXXXXXXXXXXX........................
DRB5*0101 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX............
--------------------------------文件名稱C35預(yù)測參數(shù)定量閾值[％]5抑制閾值[變化倍數(shù)的對數(shù)]-1抑制殘基[數(shù)]1-------90--------100-DRB1*0101FPYEKDLIEAIRRASNGETLEDRB1*0301FPYEKDLIEAIRRASNGETLEDRB1*0401FPYEKDLIEA LEDRB1*0701FPYEKDLIEAIRRASNGETLEDRB1*0801FPYEKDLIEAIRRASNGETLEDRB1*1101FPYEKDLIEAIRRASNGETLEDRB1*1501FPYEKDLIEAIRRASNGETLEDRB5*0101FPYEKDLIEAIRRASNGETLE(包含一個(gè)抑制殘基的B5*0101的結(jié)合框架-100倍)--------------------------------------------定量分析 ′FPYEKDLIEAIRASNGETLE′閾值(％) 10 09 08 07 06 05 04 03 02 01DRB1*0101 XXXXXXXXXXXXXXXXXX.................
DRB1*0102 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX............
DRB1*0301 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX................
DRB1*0401 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX............
DRB1*0402 XXXXXXXXXXXXXXXXXX....................
DRB1*0404 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX............
DRB1*0405 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX............
DRB1*0410 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX........
DRB1*0421 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX............
DRB1*0701 XXXXXXXXXX............................
DRB1*0801 XXXXXXXXXXXXXXXXXX....................
DRB1*0802 XXXXXXXXXXXXXXXXXX....................
DRB1*0804 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX................
DRB1*0806 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX................
DRB1*1101 XXXXXXXXXX............................
DRB1*1104 XXXXXXXXXXXXXXXXXX....................
DRB1*1106 XXXXXXXXXXXXXXXXXX....................
DRB1*1107 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX................
DRB1*1305 XXXXXX................................
DRB1*1307 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX................
DRB1*1311 XXXXXXXXXXXXXXXXXX....................
DRB1*1321 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX................
DRB1*1501 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX........
DRB1*1502 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX........
DRB5*0101 XXXXXXXXXXXXXX........................
改變的肽配基利用特異性人T細(xì)胞系鑒定C35的MHC I類抗原免疫顯性表位，是其成功用于癌癥疫苗的關(guān)鍵。包含在MHC結(jié)合殘基處氨基酸置換的修飾的C35肽，有可能用于增強(qiáng)免疫功能。上述改變的肽配基或不規(guī)則肽甚至在低于原始肽100倍的濃度下，也可成為強(qiáng)的T細(xì)胞激動劑(Dressel，A.等，″Autoantigen recognition by human CD8 T Cell clonesenhanced agonist response induced by alteredpeptideligand，″J.Immunol.1594943-51(1997)。這些改變的肽配基可以具有兩種形式增強(qiáng)T細(xì)胞受體與肽的接觸(必須由實(shí)驗(yàn)確定)的修飾以及通過改進(jìn)錨定殘基增強(qiáng)HLA對肽的結(jié)合的修飾。表4詳細(xì)說明了通過引入有利的錨定殘基或置換有害殘基而增強(qiáng)HLA I類結(jié)合的修飾。
表4增強(qiáng)HLA I類結(jié)合的修飾(除非另有陳述，實(shí)例適用于9個(gè)氨基酸的肽；對于10聚體，忽略位置5的氨基酸，評價(jià)其余的9聚體(http//bimas.dcrt.nih.gov/cgibin/molbio/hla_coefficientviewing_page)。下列修飾是根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中的當(dāng)時(shí)數(shù)據(jù)例舉的，決不是包括了與全部潛在HLA分子結(jié)合的所有可能的肽改變，無論迄今其是否已知。)HLA A*0101任何一種改變的肽，其2位為S或T任何一種改變的肽，其3位為D或E任何一種改變的肽，其4位為P任何一種改變的肽，其7位為A、F、I、L、M、P、V或Y任何一種改變的肽，其錨位9為F、K、R或Y任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換P1P
P2D，E，F(xiàn)，G，H，K，M，N，P，Q，R，W，YP3E，K，R，WP4K，RP7D，E，G，RP9D，E，PHLA A*0201任何一種改變的肽，其1位為F、I、K、L、M、V、W或Y任何一種改變的肽，其錨位2為I、L、M、Q或V任何一種改變的肽，其3位為F、L、M、W或Y任何一種改變的肽，其4位為D或E任何一種改變的肽，其5位為F任何一種改變的肽，其輔助錨位6為F、I、L、M、V、W或Y任何一種改變的肽，其7位為F或W任何一種改變的肽，其8位為F、W或Y任何一種改變的肽，其錨位9為I、L、T或V任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換P1D，E，H，PP2C，F(xiàn)，H，K，N，P，R，S，W，YP3D，E，K，RP7D，E，G，RP8I，VP9D，E，F(xiàn)，G，H，K，N，P，Q，R，S，W，YHLA-A*0205任何一種改變的肽，其1位為F、I、K、L、M、V、W或Y任何一種改變的肽，其錨位2為E、I、L、M、Q或V任何一種改變的肽，其3位為F、L、M、W或Y任何一種改變的肽，其4位為D或E
任何一種改變的肽，其5位為F、Y任何一種改變的肽，其輔助錨位6為F、I、L、M、V、W或Y任何一種改變的肽，其7位為F或W任何一種改變的肽，其8位為F、W或Y任何一種改變的肽，其錨位9為I、L、T或V任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換P1D，E，PP2C，D，F(xiàn)，G，H，K，N，P，R，S，W，YP3D，E，K，RP7D，E，RP9D，E，F(xiàn)，G，H，K，N，P，Q，R，S，W，YHLA-A*03任何一種改變的肽，其1位為G或K任何一種改變的肽，其錨位2為I、L、M、Q、T或V任何一種改變的肽，其3位為F、I、L、M、V、W或Y任何一種改變的肽，其4位為E、G或P任何動力種改變的肽，其5位為F、I、P、V、W、Y任何一種改變的肽，其6位為F、I、L、M或V任何一種改變的肽，其7位為F、I、L、M、W或Y任何一種改變的肽，其錨位9為F、I、K、L、Q或Y任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換P1D，E，PP2D，E，F(xiàn)，G，H，K，N，R，S，W，YP7G，K，RP9D，E，G，H，N，P，Q，S，THLA-A*1101任何一種改變的肽，其1位為G、K或R
任何一種改變的肽，其錨位2為I、L、M、Q、T、V、Y任何一種改變的肽，其3位為F、I、L、M、V、W、Y任何一種改變的肽，其7位為F、I、L、M、W或Y任何一種改變的肽，其錨位9為K或R任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換P1D，E，PP2D，E，G，H，K，N，R，S，WP7K，RP9C，D，E，G，N，P，Q，S，THLA-A24任何一種改變的肽，其1位為K或R任何一種改變的肽，其錨位2為F或Y任何種改變的肽，其3位為E、I、L、M、N、P、Q或Vat任何一種改變的肽，其4位為D、E或P任何一種改變的肽，其5位為I、L或V任何一種改變的肽，其6位為F任何一種改變的肽，其7位為N或Q任何一種改變的肽，其8位為E或K任何一種改變的肽，其錨位9為F、I、L或M任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換P1PP2D，E，H，K，RP9D，E，G，H，K，P，Q，RHLA A*3101任何一種改變的肽，其1位為K或R任何一種改變的肽，其錨位2為F、I、L、M、Q、T、V或Y任何一種改變的肽，其3位為F、I、L、M、V、W或Y
任何一種改變的肽，其6位為F、I、L、M或V任何一種改變的肽，其7位為F、I、L、M、W或Y任何一種改變的肽，其錨位9為K或R任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換PID，E，PP2D，E，G，H，K，N，R，SP7K，RP9C，G，N，P，Q，S，THLA A*3302任何一種改變的肽，其1位為D或E任何一種改變的肽，其錨位2為I、L、M、S、V或Y任何一種改變的肽，其錨位9為R任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換P1K，P，RP2D，E，K，RP9D，E，F(xiàn)，G，N，P，W，YHLA-B7任何一種改變的肽，其1位為A任何一種改變的肽，其錨位2為A、P或V任何一種改變的肽，其3位為M或R任何一種改變的肽，其5位為P任何一種改變的肽，其6位為R任何一種改變的肽，其錨位9為I、L、M或V任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換P1PP2D，E，F(xiàn)，H，K，R，W，YP3D，E
P9D，E，F(xiàn)，G，H，K，N，P，Q，R，S，W，YHLA-B8任何一種改變的肽，其1位為D或E任何一種改變的肽，其錨位2為A、C、L或P任何一種改變的肽，其3位為K或R任何一種改變的肽，其4位為D或E任何一種改變的肽，其5位為K或R任何一種改變的肽，其錨位9為I、L、M或V任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換PIK，P，RP2D，E，F(xiàn)，G，H，K，Q，R，W，或YP3D，EP5D，EP9D，E，F(xiàn)，G，H，K，N，P，Q，R，S，W，YHLA-B8(8聚體肽)任何一種改變的肽，其1位為D或E任何一種改變的肽，其錨位2為A、C、L或P任何一種改變的肽，其3位為K或R任何一種改變的肽，其4位為D或E任何一種改變的肽，其5位為K或R任何一種改變的肽，其錨位8為I、L、M或V任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換P1K，P，RP2D，E，F(xiàn)，G，H，K，Q，R，W，或YP3D，EP5D，EP8D，E，F(xiàn)，G，H，K，N，P，Q，R，S，W，Y
HLA-B14任何一種改變的肽，其1位為D或E任何一種改變的肽，其錨位2為K或R任何一種改變的肽，其3位為F、I、L、M、P、V、W、Y任何一種改變的肽，其5位為H或R任何一種改變的肽，其6位為I、L、M、R或V任何一種改變的肽，其7位為T任何一種改變的肽，其錨位9為I、L、M或V任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換P1PP2D，E，F(xiàn)，W，或YP3E，RP5E，W，YP9D，E，G，H，K，N，P，Q，RHLA-B*2702任何一種改變的肽，其1位為K或R任何一種改變的肽，其錨位2為E、L、M、N、Q或R任何一種改變的肽，其3位為F、W或Y任何一種改變的肽，其錨位9為F、I、L、W或Y任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換P1D，E，PP2D，F(xiàn)，G，H，K，W，或YP7KP9D，E，G，K，N，P，Q，R，SHLA-B27*05(8聚體肽)任何一種改變的肽，其1位為K或R
任何一種改變的肽，其錨位2為E、L、M、N、Q或R任何一種改變的肽，其3位為F、W或Y任何一種改變的肽，其錨位8為F、I、K、L、M、R、V或Y任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換P1D，E，PP2D，F(xiàn)，G，H，K，W，或YP7KP9D，E，G，K，N，P，Q，R，SHLA-B*3501(8聚體肽)任何一種改變的肽，其1位為K或R任何一種改變的肽，其錨位2為A、P或S任何一種改變的肽，其3位為K或R任何一種改變的肽，其4位為D或E任何一種改變的肽，其5位為D或E任何一種改變的肽，其錨位8為F、I、L、M、V、W或Y任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換P1PP2D，E，F(xiàn)，H，K，R，W，YP3D，EP8D，E，F(xiàn)，G，H，K，P，Q，RHLA-B*3701任何一種改變的肽，其錨位2為D或E任何一種改變的肽，其5位為I或V任何一種改變的肽，其8位為F、L或M任何一種改變的肽，其錨位9為F、I、L、M、V或Y任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換P1P
P9D，E，G，H，K，P，Q，RHLA-B*3801任何一種改變的肽，其錨位2為F、H、P、W或Y任何一種改變的肽，其第3位為D或E任何一種改變的肽，其4位為D、E或G任何一種改變的肽，其5位為A、I、L、M或V任何一種改變的肽，其8位為K或Y任何一種改變的肽，其錨位9為F、I、L、M或V任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換P1PP2D，E，K，RP3K，RP9D，E，G，H，K，P，Q，RHLA-B*3901(8聚體肽)任何一種改變的肽，其錨位2為H或R任何一種改變的肽，其3位為D、E、F、I、L、M、V、W或W任何一種改變的肽，其4位為D或E任何一種改變的肽，其6位為I、L、M或V任何一種改變的肽，其錨位8為I、L、M或V任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換P1PP2D，EP3K，RP6D，E，K，RP8D，E，G，H，K，P，Q，RHLA-B*3902
任何一種改變的肽，其錨位2為K或Q任何一種改變的肽，其5位為F、I、L、M、V、W或Y任何一種改變的肽，其錨位9為F、L或M任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換P1P P2D，EP3K，RP9D，E，G，H，K，P，Q，RHLA-B40任何一種改變的肽，其1位為A或G任何一種改變的肽，其錨位2為D或E任何一種改變的肽，其3位為A、F I、L、M、V、W或Y任何一種改變的肽，其4位為P任何一種改變的肽，其5位為P任何一種改變的肽，其錨位9為A、L、M或W任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換P1PP2F，H，I，K，L，M，Q，R，V，W，或YP3D，E，K，RP9D，E，G，H，K，N，P，Q，RHLA-B44*03任何一種改變的肽，其1位為A、D或S任何一種改變的肽，其錨位2為D或E任何一種改變的肽，其3位為A、I、L、M或V任何一種改變的肽，其4位為F、I或P任何一種改變的肽，其5位為A、K或V任何一種改變的肽，其6位為A、L、T或V任何法種改變的肽，其7位為F、K或T
任何一種改變的肽，其8位為K任何一種改變的肽，其錨位9為F、W或Y任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換P1PP2F，H，I，K，L，M，Q，R，V，W，YP9D，E，G，H，K，N，P，Q，RHLA-B*5101(8聚體肽)任何一種改變的肽，其1位為D、E、F、I、L、M、V或Y任何一種改變的肽，其錨位2為A、G或P任何一種改變的肽，其3位為F、W或Y任何一種改變的肽，其4位為D、E、G、I、K或V任何一種改變的肽，其5位為A、G、S、T或V任何一種改變的肽，其6位為I、K、L、N或Q任何一種改變的肽，其7位為D、K、Q或R任何一種改變的肽，其錨位8為I、L、M或V任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換P1K，P，RP2D，E，H，KP8D，E，F(xiàn)，G，H，K，N，P，Q，R，S，W，YHLA-B*5102任何一種改變的肽，其1位為F或Y任何一種改變的肽，其錨位2為A、G或P任何一種改變的肽，其3位為F、I、L、V、W或Y任何一種改變的肽，其4位為E、G、H、K、L、N、Q、R或T任何一種改變的肽，其5位為G、N、Q、T或V任何一種改變的肽，其6位為I、N、Q或T任何一種改變的肽，其7位為E、K、Q或R
任何一種改變的肽，其8位為K、R、T或Y任何一種改變的肽，其錨位9為I、L、M或V任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換P1PP2D，E，H，K，RP3D，E，K，RP9D，E，F(xiàn)，G，H，K，N，P，Q，R，S，W，YHLA-B*5102(8聚體肽)任何一種改變的肽，其1位為F或Y任何一種改變的肽，其錨位2為A、G或P任何一種改變的肽，其3位為F、I、L、V、W或Y任何一種改變的肽，其4位為E、G、H、K、L、V、W或Y任何一種改變的肽，其5位為G、N、Q、T、V任何一種改變的肽，其6位為I、N或Q任何一種改變的肽，其7位為Q或R任何一種改變的肽，其8位為I、L、M或V任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換P1PP2D，E，H，K，RP3D，E，K，RP8D，E，F(xiàn)，G，H，K，N，P，Q，R，S，W，YHLA B*5103任何一種改變的肽，其1位為D、T或V任何一種改變的肽，其錨位2為A、G或P任何一種改變的肽，其3位為D、F、L或Y任何一種改變的肽，其4位為E、G、L、N、Q、R、T或V任何一種改變的肽，其5位為A、G、M、N、Q、R、K或V
任何一種改變的肽，其6位為I、K或T任何一種改變的肽，其7位為M或V任何一種改變的肽，其錨位9為I、L、M或V任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換P1PP2D，E，H，K，RP9D，E，F(xiàn)，G，H，K，N，P，Q，R，S，W，YHLA B*5201(8聚體肽)任何一種改變的肽，其1位為I、L、M或V任何一種改變的肽，其錨位2為G、P或Q任何一種改變的肽，其3位為D、F、I、L、P、W或Y任何一種改變的肽，其4位為A、E、I、K、L、P或V任何一種改變的肽，其5位為A、F、G、I、L、M、T或V任何一種改變的肽，其6位為K、L、N、S或T任何一種改變的肽，其7位為E、K、Q或Y任何一種改變的肽，其錨位8為F、I、L、M或V任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換P1PP2H，K，RP3RP8D，E，G，H，K，N，P，Q，R，SHLA-B*5801任何一種改變的肽，其1位為I、K或R任何一種改變的肽，其錨位2為A、S或T任何一種改變的肽，其3位為D任何一種改變的肽，其4位為E、K或P任何一種改變的肽，其5位為F、I、L、M或V
任何一種改變的肽，其6位為F、I、L或V任何一種改變的肽，其7位為L、M、N或Y任何一種改變的肽，其8位為K、N、R或T任何一種改變的肽，其錨位9為F、W或Y任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換P1D，E，PP2D，E，F(xiàn)，H，I，K，L，M，N，Q，R，V，W，YP9D，E，G，H，K，N，P，Q，R，SHLA-B*60任何一種改變的肽，其錨位2為D或E任何一種改變的肽，其3位為A、I、L、M、S或V任何一種改變的肽，其5位為L、I或V任何一種改變的肽，其7位為I、L、M、V或Y任何一種改變的肽，其8位為K、Q或R任何一種改變的肽，其錨位9為I、L、M或V任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換P1PP2F，H，I，K，L，M，Q，R，V，W，YP9D，E，F(xiàn)，G，H，K，N，P，Q，R，S，W，YHLA-B*61任何一種改變的肽，其1位為G或R任何一種改變的肽，其錨位2為D或E任何一種改變的肽，其3位為A、F I、L、M、T、V、W或Y任何一種改變的肽，其6位為I任何一種改變的肽，其7位為Y任何一種改變的肽，其錨位9為A、I、L、M或V任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換
P1PP2F，H，I，K，L，M，Q，R，V，W，YP9D，E，F(xiàn)，G，H，K，N，P，Q，R，S，W，YHLA-B*61(8聚體肽)任何一種改變的肽，其1位為G或R任何一種改變的肽，其錨位2為D或E任何一種改變的肽，其3位為A、F I、L、M、T、V、W或Y任何一種改變的肽，其6位為I任何一種改變的肽，其7位為Y任何一種改變的肽，其錨位8為A、I、L、M或V任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換P1PP2F，H，I，K，L，M，Q，R，V，W，YP8D，E，F(xiàn)，G，H，K，N，P，Q，R，S，W，YHLA-B*62任何一種改變的肽，其1位為I任何一種改變的肽，其錨位2為I、L、Q任何一種改變的肽，其3位為G、K、R任何一種改變的肽，其4位為D、E、G或P任何一種改變的肽，其5位為F、G、I、L或V任何氚種改變的肽，其6位為I、L、T、V任何一種改變的肽，其7位為T、V或Y任何一種改變的肽，其錨位9為F、W、Y任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換P1PP2D，E，F(xiàn)，H，K，N，R，S，W，YP3D，E
P6D，E，K，RP9D，E，G，H，K，N，P，Q，R，SHLA-Cw0301任何一種改變的肽，其錨位2為A或R任何一種改變的肽，其3位為F、I、L、M、V或Y任何一種改變的肽，其4位為E、P或R任何一種改變的肽，其5位為N任何一種改變的肽，其6位為F、M或Y任何一種改變的肽，其7位為K、M、R或S任何一種改變的肽，其8位為T任何一種改變的肽，其錨位9為F、I、L、M任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換PIPP3D，K，RP6D，E，K，RP9D，E，G，H，K，N，P，Q，R，S，HLA-Cw0401任何一種改變的肽，其錨位2為F、P、W或Y任何一種改變的肽，其3位為D或H任何一種改變的肽，其4位為D或E任何一種改變的肽，其5位為A、H、M、R或T任何一種改變的肽，其6位為I、L、M或V任何一種改變的肽，其7位為A任何一種改變的肽，其8位為H、K或S任何一種改變的肽，其錨位9為F、I、L、M、V或Y任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換P1P
P2D，E，H，K，RP9D，E，G，H，K，N，P，Q，R，SHLA-Cw0602任何一種改變的肽，其1位為F、I、K或Y任何一種改變的肽，其錨位2為A、P、Q或R任何一種改變的肽，其5位為F、I、K、L或M任何一種改變的肽，其位為I、L或V任何一種改變的肽，其7位為K、N、Q或R任何一種改變的肽，其錨位9為I、L、M、V或Y任何一種改變的肽，其下列位置的有害殘基被置換P1PP9D，E，G，H，K，N，P，Q，R，S
預(yù)測的人I類MHC結(jié)合肽的例子-續(xù)排位 起始位點(diǎn) 亞序列 分值(估計(jì)的解離半衰期)從C35氨基酸序列預(yù)測人I類MHC結(jié)合肽及其可能如何變化以加強(qiáng)結(jié)合的例子HLA-A*0101排位 起始位點(diǎn) 亞序列分值(估計(jì)的解離半衰期)1 77KLENGGRPY 225.0002 16EVEPGSGVR 90.0003 29YCEPCGFEA 45.0004 39YLELASAVK 36.0005 2 SGEPGQTSV 2.250在P2位是G是有害的改善的肽的例子 STEPGQTSV 22.50在P2位用T置換G改善的肽的例子 STEPGQISY 5625.00在P9位用Y置換V，P7被增強(qiáng)HLA-A*0101(10聚體肽)1 66EIEINGQLVF45.0002 16EVEPGSGVRI18.0003 29YCEPCGFEAT9.0004 26VVEYCEPCGF9.0005 52GIEIESRLGG2.250改善的肽的例子 GTEPSRLGY 1125.000在P2位用T置換I在P9位用Y置換GP5被P增強(qiáng)HLA-A*0201(9聚體肽)1 9 SVAPPPEEV 2.9822 104 KITNSRPPC 2.3913 105 ITNSRPPCV 1.6424 25IVVEYCEPC 1.485
預(yù)測的人I類MHC結(jié)合肽的例子-續(xù)排位 起始位點(diǎn) 亞序列 分值(估計(jì)的解離半衰期)5 65FEIEINGQL1.018改善的肽的例子 FLIEINWYL16619.000HLA-A*0201(10聚體肽)1 58RLGGTGAFEI 60.5102 104 KITNSRPPCV 33.4723 65FEIEINGQLV 25.5064 83FPYEKDLIEA 4.502在P2位是P是有害的改善的肽的例子 FLYEKDLIEA 689.606在P2位用L置換P改善的肽的例子 FLYEKDLIEV 9654.485在P9位用V置換A5 33CGFEATYLEL 3.173HLA-A*02051 65FEIEINGQL8.8202 25IVVEYCEPC3.0603 9 SVAPPPEEV2.0004 104 KITNSRPPC1.5005 81GGFPYEKDL1.260在P2位是G是有害的改善的肽的例子 GVFPYEKDL50.400在P2位用V置換GHLA-A*0205(10聚體肽)1 33CGEFATYLEL 6.300在P2位是G是有害的改善的肽的例子 CVEFATYLEL 11.200在P2位用V置換G2 104 KITNSRPPCV 6.0003 65FEIEINGQLV 2.520
預(yù)測的人I類MHC結(jié)合肽的例子-續(xù)排位 起始位點(diǎn) 亞序列分值(估計(jì)的解離半衰期)4 53IEIESRLGGT1.4285 83FPYEKDLIEA1.350在P2位是P是有害的改善的肽的例子 FVYEKDLIEA54.000在P2位用V置換PHLA-A241 34GFEATYLEL 33.0002 49QYPGIEIES 11.550改善的肽的例子 QYPGIEIEL 462.000增強(qiáng)P93 70NGQLZFSKL 11.0884 38TYLELASAV 10.8005 82GFPYEKDLI 7.500HLA-A24(10聚體肽)1 64AFEIEINGQL42.0002 74VFSKLENGGF10.0003 84PYEKDLIEAI9.0004 69INGQLVFSKL7.392改善的肽的例子 IYGQLVFSKL369.6增強(qiáng)P25 28EYCEPCGFEA6.600HLA-A31 77KLENGGFPY 36.000改善的肽的例子 KLENGGFPK 180.000增強(qiáng)P92 39YLELASAVK 20.0003 101 TLEKITNSR 6.0004 61GTGAFEIEI 0.540
預(yù)測的人I類MHC結(jié)合肽的例子-續(xù)排位 起始位點(diǎn) 亞序列分值(估計(jì)的解離半衰期)5 69INGQLVFSK 0.360在P2位是N是有害的改善的肽的例子 ILGQLVFSK 180.000在P2位用L置換NHLA-A3(10聚體肽)1 68EINGQLVFSK8.1002 58RLGGTGAFEI2.7003 41ELASAVKEQY1.8004 78LENGGFPYEK0.810在P2位是E是有害的改善的肽的例子 LLNGGFPYEK270.000在P2位用L置換E5 95RASNGETLEK0.400HLA-A*11011 39YLELASAVK 0.4002 69INGQLVFSK 0.120在P2位是N是有害的改善的肽的例子 IVGQLVFSK 6.000在P2位用V置換N3 16EVEPGSGVR 0.1204 101 TLEKITNSR 0.0805 61GTGAFEIEI 0.060HLA-A*1101(10聚體肽)1 95RASNGETLEK1.2002 38TYLELASAVK0.6003 68EINGGLVFSK0.3604 78LENGGFPYEK0.120在P2位是E是有害的改善的肽的例子 LVNGGFPYEK4.000在P2位用V置換E5 100 ETLEKITNSR0.090
預(yù)測的人I類MHC結(jié)合肽的例子-續(xù)排位 起始位點(diǎn) 亞序列分值(估計(jì)的解離半衰期)HLA-A*31011 101 TLEKITNSR 2.0002 16EVEPGSGVR 0.6003 50YPGIEIESR 0.4004 87KDLIEAIRR 0.240在P2位是D是有害的改善的肽的例子 KILIEAIRR 12.000在P2位用I置換D5 39YLELASAVK 0.200HLA-A*33021 16EVEPGSGVR 45.0002 101 TLEKITNSR 9.0003 50YPGIEIESR 3.0004 66EIEINGQLV 1.5005 56ESRLGGTGA 1.500HLA-A*3302(10聚體肽)1 49QYPGIEIESR15.0002 100 ETLEKITNSR9.0003 16EVEPGSGVRI1.5004 28EYCEPCGFEA1.5005 68EINGQLVFSK1.500HLA-A68.11 16EVEPGSGVR 900.0002 9 SVAPPPEEV 12.0003 50YPGIEIESR 10.000
預(yù)測的人I類MHC結(jié)合肽的例子-續(xù)排位 起始位點(diǎn) 亞序列分值(估計(jì)的解離半衰期)改善的肽的例子 YVGIEIESR 400.000增強(qiáng)P24 96ASNGETLEK 9.0005 101 TLEKITNSR 5.000HLA-A68.1(10聚體肽)1 100 ETLEKITNSR300.0002 16EVEPGSGVRI18.0003 68EINGGLVFSK9.0004 15EEVEPGSGVR9.000在P2位是E是有害的改善的肽的例子 EVVEPGSGR 1200.00在P2位用V置換E5 95RASNGETLEK3.000HLA-B141 94RRASNGETL 20.0002 57SRLGGTGAF 5.000改善的肽的例子 SRLGGTGAL 100.000增強(qiáng)P93 100 ETLEKITNS 3.3754 105 ITNSRPPCV 2.0005 88DLIEAIRRA 1.350HLA-B14(10聚體肽)1 103 EKITNSRPPC6.750改善的肽的例子 ERITNSRPPL900.000增強(qiáng)P102 33CGFEATYLEL5.0003 93IRRASNGETL4.0004 18EPGSGVRIVV3.000
預(yù)測的人I類MHC結(jié)合肽的例子-續(xù)排位 起始位點(diǎn) 亞序列分值(估計(jì)的解離半衰期)5 88DLIEAIRRAS2.250HLA-B401 65FEIEINGQL 80.0002 3 GEPGQTSVA 40.0003 35FEATYLELA 40.0004 15EEVEPGSGV 24.000改善的肽的例子 EEVEPGSGL 120.000增強(qiáng)P95 67IEINGQLVF 16.000HLA-B40(10聚體肽)1 55IESRLGGTGA20.0002 53IEIESRLGGT16.000改善的肽的例子 IEIFSRLGGL80.000增強(qiáng)P103 65FEIEINGQLV16.0004 67IEINGQLVFS16.0005 99GETLEKITNS8.000HLA-B601 65FEIEFNGQL 387.2002 17VEPGSGVRI 17.600改善的肽的例子 VEPGSGVRL 352.000增強(qiáng)P93 15EEVEPGSGV 16.0004 47KEQYPGIEI 16.0005 85YEKDLIEAI 8.800
預(yù)測的人I類MHC結(jié)合肽的例子-續(xù)排位 起始位點(diǎn) 亞序列分值(估計(jì)的解離半衰期)HLA-B60(10聚體肽)1 65FEIEINGQLV16.000改善的肽的例子 FEIEINGQLL320.000增強(qiáng)P102 106 TNSRPPCVIL16.0003 53IEIESRLGGT8.0004 33CGFEATYLEL8.0005 17VEPGSGVRIV8.000HLA-B611 15EEVEPGSGV 80.0002 35FEATYLELA 40.000改善的肽的例子 FEATYLELV 160.000增強(qiáng)P93 3 GEPGQTSVA 22.0004 65FEIEINGQL 16.0005 85YEKDLIEAI 16.000HLA-B61(10聚體肽)1 65FEIEINGQLV80.0002 17VEPGSGVRIV40.0003 55IESRLGGTGA20.0004 87KDLIEAIRRA10.000改善的肽的例子 KELLEAIRRV160.000增強(qiáng)P2、P105 53IEIESRLGGT8.000
預(yù)測的人I類MHC結(jié)合肽的例子-續(xù)排位 起始位點(diǎn) 亞序列分值(估計(jì)的解離半衰期)HLA-B621 77KLENGGFPY 24.0002 21SGVRIVVEY 4.8003 75FSKLENGGF 3.0004 31EPCGFEATY 2.640在P2位是P是有害的改善的肽的例子 EQCGFEATY 105.6在P2位用Q置換P5 88DLIEAIRRA 2.200HLA-B62(10聚體肽)1 41ELASAVKEQY40.0002 58RLGGTGAFEI9.6003 66ELEINGQLVF7.9204 56ESRLGGTGAF6.000在P2位是S是有害的改善的肽的例子 EQRLGGTGAF480.000在P2位用Q置換S5 20GSGVRIVVEY4.800在P2位是S是有害的改善的肽的例子 GQGVRIVVEY384.000在P2位用Q置換SHLA-B71 107 NSRPPCVIL 60.000改善的肽的例子 NPRPPCVIL 1200.000增強(qiáng)P22 45AVKEQYPGI 6.0003 22GVRIVVEYC 5.0004 70NGQLVFSKL 4.0005 81GGFPYEKDL 4.000
預(yù)測的人I類MHC結(jié)合肽的例子-續(xù)排位 起始位點(diǎn) 亞序列 分值(估計(jì)的解離半衰期)HLA-B7(10聚體肽)1 50YPGIEIESRL 80.0002 31EPCGFEATYL 80.0003 18EPGSGVRIVV 6.000改善的肽的例子 EPGSGVRIVL 120.000增強(qiáng)P104 106 TNSRPPCVIL 6.0005 80NGGFPYEKDL 4.000HLA-B81 107 NSRPPCVIL4.0002 45AVKEQYPGI1.5003 105 ITNSRPPCV0.6004 56ESRLGGTGA0.4005 100 ETLEKITNS0.300在P9位是S是有害的改善的肽的例子 ETLEKITNL12.000在P9位用L置換SHLA-B8(8聚體肽)1 83FPYEKDLI 6.0002 107 NSRPPCVI 1.0003 91EAIRRASN 0.800 在P8位是N是有害的改善的肽的例子 EAIRRASL 32.000在P9位用L置換N4 20GSGVRIVV 0.6005 18EPGSGVRI 0.400
預(yù)測的人I類MHC結(jié)合肽的例子-續(xù)排位 起始位點(diǎn) 亞序列分值(估計(jì)的解離半衰期)HLA-B8(10聚體肽)1 50YPGIEIESRL0.8002 93IRRASNGETL0.400改善的肽的例子 IARASNGETL16.000在P2位用A置換R3 31EPCGFEATYL0.3204 104 KITNSRPPCV0.3005 18EPGSGVRIVV0.240HLA-B*27021 57SRLGGTGAF 200.0002 94RRASNGETL 180.000改善的肽的例子 RRASNGETF 600.000增強(qiáng)P93 93IRRASNGET 20.0004 27VEYCEPCGF 15.0005 77KLENGGFPY 9.000HLA-B*2702(10聚體肽)1 93IRRASNGETL60.0002 94RRASNGETLE6.0003 30CEPCGFEATY3.0004 58RLGGTGAFEI2.7005 23VRIVVEYCEP2.000在P10位是P是有害的改善的肽的例子 VRIVVEYCEY200.000在P10位用Y置換P
預(yù)測的人I類MHC結(jié)合肽的例子-續(xù)排位 起始位點(diǎn) 亞序列分值(估計(jì)的解離半衰期)HLA-B*27051 94RRASNGETL 6000.0002 57SRLGGTGAF 1000.0003 93IRRASNGET 200.000改善的肽的例子 IRRASNGEL 2000.000增強(qiáng)P94 27VEYCEPCGF 75.0005 77KLENGGFPY 45.000HLA-B*2705(10聚體肽)1 93IRRASNGETL2000.0002 94RRASNGETLE60.000在P2位是E是有害的改善的肽的例子 RRASNGETLL6000.000在P2位用L置換E3 78LENGGFPYEK30.0004 95RASNGETLEK30.0005 58RLGGTGAFEI27.000HLA-B*35011 31EPCGFFATY 40.0002 75FSKLENGGF 22.500改善的肽的例子 FPKLENGGM 120.000增強(qiáng)P2、P93 107 NSRPPCVIL 15.0004 42LASAVKEQY 6.0005 18EPGSGVRIV 4.000
預(yù)測的人I類MHC結(jié)合肽的例子-續(xù)排位 起始位點(diǎn) 亞序列分值(估計(jì)的解離半衰期)HLA-B*3501(10聚體肽)1 31EPCGFEATYL30.0002 50YPGIEIESRL20.0003 56ESRLGGTGAF15.0004 20GSGVRIVVEY10.0005 83FPYEKDLIEA6.000改善的肽的例子 FPYEKDLIEM120.000增強(qiáng)P10HLA-B*37011 65FEIEINGQL 15.000改善的肽的例子 FDIEINGQL 60.000增強(qiáng)P22 47KEQYPGIEI 10.0003 85YEKDLIEAI 10.0004 17VEPGSGVRI 10.0005 35FEATYLELA 5.000HLA-B*3701(10聚體肽)1 65FEIEINGQLV10.000改善的肽的例子 FDIEINGQLI200.000增強(qiáng)P2、P102 67IEINGQLVFS5.0003 81GGFPYEKDLI5.0004 87KDLIEAIRRA4.0005 30CEPCGFEATY2.000
預(yù)測的人I類MHC結(jié)合肽的例子-續(xù)排位 起始位點(diǎn) 亞序列 分值(估計(jì)的解離半衰期)HLA-B*38011 34GFEATYLEL6.000改善的肽的例子 GHEATYLEL90.000增強(qiáng)P22 70NGQLVFSKL1.5603 38TYLELASAV1.0404 81GGFPYEKDL1.0005 97SNGETLEKI0.720HLA-B*3801(10聚體肽)1 64AFEIEINGQL 7.800改善的肽的例子 AHEIEINGQL 117.000增強(qiáng)P22 31EPCGFEATYL 4.8003 66EIEINGQLVF 3.0004 26VVEYCEPCGF 3.0005 50YPGIEIESRL 2.600HLA-B*39011 94RRASNGETL15.000改善的肽的例子 RHASNGETL90.000增強(qiáng)P22 34GFEATYLEL9.0003 38TYLELASAV4.0004 66EIEINGQLV3.0005 2 SGEPGQTSV3.000
預(yù)測的人I類MHC結(jié)合肽的例子-續(xù)排位 起始位點(diǎn) 亞序列分值(估計(jì)的解離半衰期)HLA-B*3901(10聚體肽)1 33CGFEATYLEL12.000改善的肽的例子 CHFEATYLEL360.000增強(qiáng)P22 64AFEIEINGQL9.0003 93IRRASNGETL4.5004 46VKEQYPGIEI3.0005 16EVEPGSGVRI3.000HLA-B*39021 70NGQLVFSKL 2.400改善的肽的例子 NKQLVFSKL 24.000增強(qiáng)P22 81GGFPYEKDL 2.4003 94RRASNGETL 2.0004 34GFEATYLEL 2.0005 107 NSRPPCVIL 0.600HLA-B*3902(10聚體肽)1 69INGQLVFSKL2.4002 64AFEIEINGQL2.4003 50YPGIEIESRL2.4004 80NGGFPYEKDL2.4005 106 TNSRPPCVIL2.000
預(yù)測的人I類MHC結(jié)合肽的例子-續(xù)排位 起始位點(diǎn) 亞序列分值(估計(jì)的解離半衰期)HLA-B*44031 67IEINGQLVF 200.000改善的肽的例子 IEINGQLVY 900.000增強(qiáng)P92 27VEYCEPCGF 40.0003 21SGVRIVVEY 36.0004 65FEIEINGQL 20.0005 35FEATYLELA 12.000HLA-B*4403(10聚體肽)1 30CEPCGFEATY120.0002 53IEIESRLGGT30.000改善的肽的例子 IEIESRLGGY900.000增強(qiáng)P103 67IEINGQLVFS30.0004 65FEIEINGQLV20.0005 17VEPGSGVRIV18.000HLA-B*51011 18EPGSGVRIV 484.0002 59LGGTGAFEI 114.400改善的肽的例子 LPGTGAFEI 572.000增強(qiáng)P23 2 SGEPGQTSV 48.4004 81GGFPYEKDL 44.0005 70NGQLVFSKL 22.000
預(yù)測的人I類MHC結(jié)合肽的例子-續(xù)排位 起始位點(diǎn) 亞序列分值(估計(jì)的解離半衰期)HLA-B*5101(10聚體肽)1 18EPGSGVRIVV440.0002 44SAVKEQYPGI220.000改善的肽的例子 SPVKEQYPGI440.000增強(qiáng)P23 31EPCGFEATYL220.0004 81GGFPYEKDLI176.0005 50YPGIEIESRL157.300HLA-B*51021 18EPGSGVRIV 242.0002 81GGFPYEKDL 110.000改善的肽的例子 GPFPYEKDI 2200.000增強(qiáng)P2、P93 59LGGTGAFEI 96.8004 70NGQLVFSKL 48.4005 2 SGEPGQTSV 24.200HLA-B*5102(10聚體肽)1 44SAVKEQYPGI726.000改善的肽的例子 SPVKEQYPGI1452.000增強(qiáng)P22 50YPGIEIESRL400.0003 81GGFPYEKDLI400.0004 18EPGSGVRIVV220.0005 31EPCGFEATYL121000
預(yù)測的人I類MHC結(jié)合肽的例子-續(xù)排位 起始位點(diǎn) 亞序列 分值(估計(jì)的解離半衰期)HLA-B*51031 59LGGTGAFEI48.400改善的肽的例子 LAFTGAFEI145.200增強(qiáng)P22 2 SGEPGQTSV44.0003 18EPGSGVRIV44.0004 70NGQLVFSKL7.2605 81GGFPYEKDL7.200HLA-B*5103(10聚體肽)1 44SAVKEQYPGI 110.0002 81GGFPYEKDLI 52.8003 18EPGSGVRIVV 44.000改善的肽的例子 EAGSGVRIVV 110.000增強(qiáng)P24 60GGTGAFEIEI 44.0005 33CGFEATYLEL 7.920HLA-B*52011 18WPGSGVRIV75.0002 67LEINGQLVF22.500改善的肽的例子 LQINGQLVI450.000增強(qiáng)P2、P93 59LGGTGAFEI11.2504 98NGETLEKIT11.0005 19PGSGVRIVV10.000
預(yù)測的人I類MHC結(jié)合肽的例子-續(xù)排位 起始位點(diǎn) 亞序列 分值(估計(jì)的解離半衰期)HLA-B*5201(10聚體肽les)1 18EPGSGVRIVV 100.0002 17VEPGSGVRIV 45.000改善的肽的例子 VQPGSGVRIV 450.000增強(qiáng)P23 81GGFPYEKDLI 33.0004 105 ITNSRPPCVI 15.0005 37ATYLELASAV 12.000HLA-B*58011 75FSKLENGGF40.000改善的肽的例子 FSKLENGGW80.000增強(qiáng)P92 42LASAVKEQY4.5003 107 NSRPPCVIL4.0004 61GTGAFEIEI3.0005 105 ITNSRPPCV3.000HLA-B*5801(10聚體肽)1 56ESRLGGTGAF12.0002 20GSGVRIVVEY10.800改善的肽的例子 GSGVRIVVEW144.000增強(qiáng)P103 1 MSGEPGQTSV4.0004 105 ITNSRPPCVI3.0005 37ATYLELASAV3.000
預(yù)測的人I類MHC結(jié)合肽的例子-續(xù)排位 起始位點(diǎn) 亞序列 分值(估計(jì)的解離半衰期)HLA-Cw*03011 65FEIEINGQL30.0002 81GGFPYEKDL18.0003 70NGQLVFSKL12.0004 57SRLGGTGAF10.0005 34GFEATYLEL10.000HLA-Cw*0301(10聚體肽)1 44SAVKEQYPGI 50.000改善的肽的例子 SAVKEQYPGL 100.000增強(qiáng)P102 33CGFEATYLEL 45.0003 69INGQLVFSKL 12.0004 81GGFPYEKDLI 3.7505 106 TNSRPPCVIL 3.000HLA-Cw*04011 34GFEATYLEL240.0002 38TYLELASAV30.0003 82GFPYEKDLI25.0004 18EPGSGVRIV20.0005 31EPCGFEATY12.000改善的肽的例子 EFCGFEATL200.000增強(qiáng)P2、P9HLA-Cw*0401(10聚體肽)1 64AFEIEINGQL 200.0002 74VFSKLENGGF 100.000
預(yù)測的人I類MHC結(jié)合肽的例子-續(xù)排位 起始位點(diǎn) 亞序列分值(估計(jì)的解離半衰期)改善的肽的例子 VFSKLENGGL200.000增強(qiáng)P103 50YPGIEIESRL80.0004 31EPCGFEATYL80.0005 18EPGSGVRIVV10.000HLA-Cw*06021 85YEKDLIEAI 6.6002 65FEIEINGQL 6.6003 21SGVRIVVEY 6.0004 31EPCGFEATY 3.3005 61GTGAGEIEI 3.000HLA-Cw*07021 31EPCGFEATY 24.0002 21SGVRIVVEY 19.2003 42LASAVKEQY 8.8004 77KLENGGFPY 4.0005 49QYPGIEIES 2.880HLA-Cw*0702(10聚體肽)1 20GSGVRIVVEY38.4002 30CEPCGFEATY16.0003 41ELASAVKEQY16.0004 50YPGIEIESRL7.9205 76SKLENGGFPY4.000
表5預(yù)測的C35 HLA I類表位*HLA限制性元件包含的氨基酸序列A*0201 9-17SVAPPPEEVA*0201 10-17 VAPPPEEVA*0201 16-23 EVEPGSGVA*0201 16-25 EVEPGSGVRIA*0201 36-43 EATYLELAA*0201 37-45 ATYLELASAA*0201 37-46 ATYLELASAVA*0201 39 -46 YLELASAVA*0201 44-53 SAVKEQYPGIA*0201 45-53 AVKEQYPGIA*0201 52-59 GIEIESRLA*0201 54-62 EIESRLGGTA*0201 58-67 RLGGTGAFEIA*0201 61-69 GTGAFEIEIA*0201 66-73 EIEINGQLA*0201 66-74 EIEINGQLVA*0201 88-96 DLIEAIRRAA*0201 89-96 LIEAIRRAA*0201 92-101 AIRRASNGETA*0201 95-102 RASNGETLA*0201 104-113 KITNSRPPCVA*0201 105-113 ITNSRPPCVA*0201 105-114 ITNSRPPCVIA*3101 16-24 EVEPGSGVRB*3501 30-38 EPCGFEATYA*30101超基序 96-104 ASNGETLEK*利用在SYFPEITHI網(wǎng)站(wysiwyg//35/http//134.2.96.221/scriptslhlaserver.dll/EpPredict.htm)發(fā)現(xiàn)的規(guī)則，并根據(jù)Rammensee，H.G.，Bachmann，J.和Stevanovic，S.(Chapman & Hall，New York 1997)的著作″MHC Ligands and Peptide Motifs″進(jìn)行預(yù)測。
表6預(yù)測的C35 HLA II類表位*序列 包含的氨基酸 限制性元件SGVRIVVEYCEPCGF21-35DRB1*0101DRB1*0102DRB1*0301DRB1*0401DRB1*0404DRB1*0405DRB1*0410DRB1*0421DRB1*0701DRB1*0801DRB1*0804DRB1*0806DRB1*1101DRB1*1104DRB1*1106DRB1*1107DRB1*1305DRB1*1307DRB1*1321DRB1*1501DRB1*1502DRB5*0101SRLGGTGAFEIEINGQLVF 57-75 DRB1*0101DRB1*0102DRB1*0301DRB1*0401DRB1*0402DRB1*0421DRB1*0701DRB1*0804DRB1*0806DRB1*1101DRB1*1104DRB1*1106DRB1*1305DRB1*1321DRB1*1501
DRB1*1502DRB5*0101GAFEIEINGQLVFSKLENGGF 63-83DRB1*0101DRB1*0102DRB1*0301DRB1*0401DRB1*0402DRB1*0404DRB1*0405DRB1*0410DRB1*0421DRB1*0701DRB1*0804DRB1*0806DRB1*1101DRB1*1104DRB1*1106DRB1*1107DRB1*1305DRB1*1307DRB1*1311DRB1*1321DRB1*1501DRB1*1502DRB5*0101FPYEKDLIEAIRRASNGETLE 83-103 DRB1*0101DRB1*0102DRB1*0301DRB1*0401DRB1*0402DRB1*0404DRB1*0405DRB1*0410DRB1*0421DRB1*0701DRB1*0801DRB1*0802DRB1*0804DRB1*0806DRB1*1101DRB1*1104DRB1*1106
DRB1*1107DRB1*1305DRB1*1307DRB1*1311DRB1*1321DRB1*1501DRB1*1502DRB5*0101*利用TEPITOPE軟件預(yù)測II類MHC表位。Sturniolo，T.等人，1999。Generation of tissue-specific and promiscuous HLA liganddutabases using DNA microarrays and virtual HLA class IImatricws。Nature Biotechnology 17555-571。
本發(fā)明中″表位″是指在動物特別是人中具有抗原性或免疫原性、或者能夠激發(fā)動物、優(yōu)選人的T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的C35多肽片段。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案涉及包含表位的C35多肽片段，以及編碼該片段的多核苷酸。本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方案涉及包含表位的C35多肽片段，以及編碼該片段的多核苷酸。本發(fā)明特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，表位包含表1-6任一個(gè)中所列C35片段。本發(fā)明又一優(yōu)選實(shí)施方案中，表位由表1-6任一個(gè)中所列C35片段組成?？贵w能結(jié)合的蛋白質(zhì)分子區(qū)域定義為″抗原性表位″，相反，″免疫原性表位″定義為激發(fā)抗體應(yīng)答的蛋白質(zhì)的一部分。(例如參見Geysen等，Proc.Nail.Acad.Sci.USA 813998-4002(1983))。因而本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方案是免疫原性的C35肽片段，當(dāng)結(jié)合MHC分子的肽結(jié)合裂隙時(shí)，其能夠激發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答。本發(fā)明特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫原性的C35肽片段包含表1-6任一項(xiàng)中所列的表位。本發(fā)明又一優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫原性的C35肽片段由表1-6任一項(xiàng)中所列的表位組成。本發(fā)明另一實(shí)施方案涉及包含所述免疫原性C35肽片段或其編碼多核苷酸的藥物制劑和疫苗組合物。
可利用任何常規(guī)方法制備起表位作用的片段。(例如參見Houghten，R.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 825131-5135(1985)，美國專利No.4,631,211有進(jìn)一步描述。)按照能提高M(jìn)HC結(jié)合親和力的可預(yù)測方式，可以在已知的肽錨位改變已知與特定MHC分子結(jié)合的肽表位序列。該″表位增強(qiáng)″已用于改進(jìn)許多不同MHC I類或MHC II類結(jié)合肽表位的免疫原性(Berzofsky，J.A.等，Immunol.Rev.170151-72(1999)；Ahlers，J.D.等，Proc.Nat！.Acad.Sci U.S.A.9410856-61(1997)；Overwijk，等，J.Exp.Med.188277-86(1998)；Parkhurst，M.R.等，J.Immunol.1572539-48(1996))。因此，本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及該增強(qiáng)的C35表位，以及編碼該增強(qiáng)表位的多核苷酸。
本發(fā)明的抗原性表位優(yōu)選包含至少7個(gè)、更優(yōu)選包含至少9個(gè)以及最優(yōu)選包含約15-30個(gè)氨基酸的序列?？乖员砦豢捎糜谝l(fā)特異性結(jié)合該表位的抗體，包括單克隆抗體。(例如參見Wilson等人，Cell 37767-778(1984)；Sutcliffe，J.G.等人，Science 219660-666(1983).)類似地，根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法，免疫原性表位可用于誘導(dǎo)B細(xì)胞和T細(xì)胞。(參見Sutcliffe等人，上文；Wilson等人，上文；Chow，M.等人，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 82910-914；以及Bittle，F(xiàn).J.等人，J.Gen.Virol.662347-2354(1985).)優(yōu)選的免疫原性表位包括分泌的蛋白質(zhì)。免疫原性表位可與載體蛋白質(zhì)(例如白蛋白)一起呈遞給動物系統(tǒng)(例如兔或小鼠)，或者如果足夠長(至少約25個(gè)氨基酸)，則可不需要載體。然而已經(jīng)證明，僅含9個(gè)氨基酸的免疫原性表位，足以引發(fā)至少能夠結(jié)合變性多肽線性表位(例如在Western中印跡)的抗體。
此處所用術(shù)語″抗體″(Ab)或″單克隆抗體″(Mab)，是指包括能夠特異性結(jié)合蛋白質(zhì)的完整分子以及抗體片段(例如Fab和F(ab’)2片段)。缺少完整抗體Fc片段的Fab和F(ab’)2片段，在循環(huán)中清除更快，并且其可能具有的非特異性組織結(jié)合比完整抗體更少。(Wahl等，J.Nucl.Med.24316-325(1983).)因而，這些片段以及Fab或其它免疫球蛋白表達(dá)文庫的產(chǎn)物，更適于某些應(yīng)用。此外，本發(fā)明的抗體包括嵌合的、單鏈和人源化的抗體。
抗體的診斷和治療用途本發(fā)明進(jìn)一步涉及與人癌細(xì)胞，特別是人乳腺癌和膀胱癌細(xì)胞反應(yīng)的C35抗體、C35抗體片段和抗體綴合物以及單鏈免疫毒素。
表7所列為已經(jīng)分離并鑒定的適于不同應(yīng)用的C35特異性單克隆抗體。
表7C35特異性鼠單克隆抗體

ELISA分析細(xì)菌合成的C35空白＝未測定實(shí)施例所用的下列單詞或短語具有指定的含義。
實(shí)施例所用的″連接″是指通過任何方式，例如共價(jià)結(jié)合、非共價(jià)結(jié)合、離子結(jié)合或非離子結(jié)合，直接或間接地將一個(gè)分子與另一個(gè)分子偶聯(lián)。共價(jià)結(jié)合包括通過各種接頭(例如硫醚接頭或硫酯接頭)的結(jié)合。直接偶聯(lián)包括一個(gè)分子連接目的分子。間接偶聯(lián)包括一個(gè)分子連接于另一個(gè)非目的分子，其隨后直接或間接與目的分子偶聯(lián)。
實(shí)施例所用的″重組分子″是指通過基因工程方法制備的分子。
實(shí)施例所用″片段″定義為至少一部分可與目標(biāo)(即抗原結(jié)合區(qū)域)結(jié)合的免疫球蛋白分子可變區(qū)?？梢园庖咔虻鞍椎哪承┖愣▍^(qū)。
實(shí)施例所用″免疫綴合物″是指與細(xì)胞毒素、放射性試劑、抗腫瘤藥或治療劑化學(xué)或生物學(xué)連接的任何分子或配基，例如抗體或生長因子。只要能夠與目標(biāo)結(jié)合，該抗體或生長因子就可在分子的任何位置連接細(xì)胞毒素、放射性試劑、抗腫瘤藥或治療劑。免疫綴合物的例子包括免疫毒素和抗體綴合物。
實(shí)施例所用″選擇性殺傷″是指殺傷抗體結(jié)合的細(xì)胞。
實(shí)施例所用″癌″的例子包括膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌、卵巢癌和胰腺癌。
實(shí)施例所用″免疫毒素″是指化學(xué)或生物學(xué)連接細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性劑的抗體或生長因子。
實(shí)施例所用″有效量″是指殺傷細(xì)胞或抑制其增殖的抗體、免疫綴合物、重組分子的量。
實(shí)施例所用″競爭性抑制″是指能夠與另一分子的相同目標(biāo)相結(jié)合。對于抗體，競爭性抑制是指抗體能夠識別并結(jié)合另一抗體所針對的同一抗原結(jié)合區(qū)。
實(shí)施例所用″抗原結(jié)合區(qū)″是指本發(fā)明中能識別目標(biāo)或其部分的抗體、重組分子、融合蛋白質(zhì)或免疫偶聯(lián)物的一部分。
實(shí)施例所用″治療劑″是指可用于治療的任何試劑，包括抗腫瘤藥、細(xì)胞毒素、細(xì)胞毒性劑和放射性劑。
實(shí)施例所用″抗腫瘤藥″是指可用于治療癌癥的任何試劑，包括但不限于細(xì)胞毒素及藥劑，例如抗代謝物、烷化劑、蒽環(huán)霉素、抗生素、抗有絲分裂劑、甲基芐肼、羥基脲、天冬酰胺酶、皮質(zhì)類甾醇、mytotane(O，P’-(DDD))、干擾素和放射性試劑。
實(shí)施例所用″細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性劑″是指對細(xì)胞有害的任何試劑。例子包括紫杉醇、細(xì)胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根堿、絲裂霉素、足葉乙甙、tenoposide、長春新堿、長春花堿、秋水仙堿、阿霉素、柔紅霉素、二羥炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光輝霉素、放線菌素D、1-脫氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、潘妥卡因、昔羅卡因、心得安和嘌呤霉素及其類似物或同源物。
實(shí)施例所用″放射性同位素″包括有效破壞腫瘤的任何放射性同位素。例子包括而不限于鈷-60和X射線。另外，天然存在的放射性元素，例如鈾、鐳和釷(其一般為放射性同位素的混合物)，是放射性試劑的合適例子。
實(shí)施例所用″給藥″是指對受試者經(jīng)口服給藥、栓劑給藥、局部接觸、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下給藥，或者緩釋裝置植入(例如微型滲透泵)。
實(shí)施例所用″直接″是指利用偶聯(lián)標(biāo)記物的抗體。樣品與標(biāo)記的抗體溫育，洗滌除去未結(jié)合抗體，然后檢驗(yàn)樣品。
實(shí)施例所用″間接″是指樣品與非綴合抗體溫育、洗滌，然后與熒光素綴合的抗體溫育。由二抗或″夾心″抗體顯示一抗的存在。
實(shí)施例所用″作用″是指識別并結(jié)合目標(biāo)。結(jié)合可以是非特異性的。優(yōu)選特異性結(jié)合。
實(shí)施例所用″治療″是指基本上使腫瘤完全退化，以致一段時(shí)期，(即＞/＝10倍的腫瘤體積倍增時(shí)間(TVDD＝對照腫瘤大小倍增所需的時(shí)間天數(shù)))腫瘤仍不可觸知的。
實(shí)施例所用″腫瘤目標(biāo)抗體″是指識別腫瘤(即癌癥)細(xì)胞上的C35抗原的任何抗體。
實(shí)施例所用″抑制增殖″是指以任何方法干擾細(xì)胞生長。
實(shí)施例所用″哺乳動物腫瘤細(xì)胞″包括來自動物例如人、羊、豬、鼠、牛的細(xì)胞。
實(shí)施例所用″藥物可接受的載體″包括與抗體結(jié)合時(shí)保持抗體的免疫原性并不與受試者免疫系統(tǒng)反應(yīng)性的任何物質(zhì)。例子包括而不限于任何標(biāo)準(zhǔn)的藥物載體，例如磷酸緩沖鹽溶液、水、乳劑(例如油/水乳劑)，以及各種類型的濕潤劑。其它載體可能還包括無菌溶液、片劑(包括糖衣片)和膠囊。
上述載體一般包括賦形劑，例如淀粉、奶、糖、某種粘土、明膠、硬脂酸或其鹽、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、滑石粉、植物脂肪或油、樹膠、乙二醇或其它已知的賦形劑。上述載體可能還包括調(diào)味劑和色素添加劑或其它成分。利用熟知的常規(guī)方法配制包含上述載體的組合物。
本發(fā)明涉及針對癌細(xì)胞高度特異的C35抗體。更具體而言，該抗體與多種癌，例如乳腺癌、膀胱癌、肺癌、卵巢癌和結(jié)腸癌發(fā)生反應(yīng)，而與人正常組織或其它類型腫瘤例如肉瘤或淋巴瘤沒有反應(yīng)性或者反應(yīng)性有限。
此處所用術(shù)語″C35抗體″包括全部、完整的多克隆和單克隆抗體物質(zhì)以及嵌合的抗體分子。上述C35抗體包括利用本領(lǐng)域已非常成熟的技術(shù)獲得的、其中包含抗體的活性抗原結(jié)合區(qū)(例如Fab、F(ab’)2和Fv片段)的其任何片段[例如參見Rousseaux等人，″Optimal ConditionsFor The Preparation of Proteolytic Fragments From MonoclonalIgG of Different Rat IgG Subclasses″，MethodsEnzymol.，121663-69(Academic Press 1986)]。本發(fā)明的C35抗體還包括融合蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還包括本發(fā)明C35抗體的抗獨(dú)特型抗體?？衫肅35抗體和/或其片段作為免疫原制備這些抗獨(dú)特型抗體，并用于為診斷而進(jìn)行的檢測腫瘤的體液應(yīng)答和治療應(yīng)用，例如疫苗，以誘導(dǎo)病人的抗腫瘤反應(yīng)[例如參見Nepom等人，″Anti-Idiotypic Antibodies And TheInduction Of Specific Tumor Immunity″，Cancer And MetastasisReviews，6487-501(1987)]。
此外，本發(fā)明包括能夠結(jié)合與C35抗體相同的抗原決定簇、并在該位點(diǎn)與該抗體競爭結(jié)合的抗體。這包括具有與C35抗體相同的抗原特異性、但來源物種、同型、結(jié)合親和力或生物學(xué)功能(例如細(xì)胞毒性)不同的抗體。例如，可以利用本領(lǐng)域已知的重組類別-轉(zhuǎn)換(class-switching)和融合技術(shù)，構(gòu)建具有C35抗體抗原結(jié)合區(qū)的本發(fā)明抗體的類別、同型及其它變體[例如參見Thammana等人，″Immunoglobulin Heavy Chain Class Switch From IgM to IgG In AHybridoma″，Eur.J.Immunol.，13614(1983)；Spira等人，″TheIdentification Of Monoclonal Class Switch Variants BySubselection And ELISA Assay″，J.Immunol.Meth.74307-15(1984)；Neuberger等人，″Recombinant Antibodies PossessingNovel Effector Functions″，Nature 312614-608(1984)；以及Oi等人，″Chimeric Antibodies″，Biotechniques 4(3)214-21(1986)]。因此，具有與C35特異性抗體相同結(jié)合特異性的其它嵌合抗體或其它重組抗體(例如融合蛋白質(zhì)，其中抗體與另一蛋白質(zhì)例如淋巴因子或腫瘤抑制生長因子結(jié)合)，都屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)。
如此處所述可利用本領(lǐng)域已知的基因工程技術(shù)制備重組免疫毒素，方法是在DNA水平將C35抗體的抗原結(jié)合區(qū)與治療劑或細(xì)胞毒性劑融合，并制備嵌合蛋白質(zhì)形式的細(xì)胞毒性分子。治療劑的例子包括而不限于抗代謝物、烷化劑、蒽環(huán)霉素、抗生素和抗有絲分裂劑?？勾x物包括氨甲蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氮烯咪胺(decarbazine)。烷化劑包括氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、亞硝脲氮芥(BSNU)和環(huán)己亞硝脲(CCNU)、cyclothosphamide、二甲磺酸丁酯、二溴甘露醇、鏈脲菌素、絲裂霉素C和順-二氯雙胺鉑(cis-dichlorodiamine platinum)(II)(DDP)順鉑(cisplatin)。蒽環(huán)霉素包括柔紅霉素(原來的道諾霉素)和阿霉素(此處也指亞德里亞霉素)。其它例子包括米托蒽醌和比生群?？股匕ǚ啪€菌素(dactinomycin，原來的放線菌素actinomycin)、博萊霉素、光輝霉素和安曲霉素(AMC)。抗有絲分裂劑包括長春新堿和長春花堿(通常稱為長春花生物堿)。其它細(xì)胞毒劑包括甲基芐肼、羥基脲、天冬酰胺酶、皮質(zhì)類甾醇、mytotane(O，P’-(DDD))、干擾素。另外的細(xì)胞毒劑例子包括而不限于蓖麻素、阿霉素、紫杉醇、細(xì)胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、足葉乙甙、tenoposide、秋水仙堿、二羥基炭疽菌素二酮，1-脫氫睪酮和糖皮質(zhì)激素。
本發(fā)明顯然包括上述治療劑和細(xì)胞毒劑的類似物和同系物。例如化療藥物氨基蝶呤有一個(gè)相關(guān)的改進(jìn)類似物，即氨甲蝶呤。另外，阿霉素的改進(jìn)類似物是鐵-螯合物。還有，1-甲基亞硝脲的改進(jìn)類似物是環(huán)己亞硝脲。另外，長春花堿的改進(jìn)類似物是長春新堿。另外，氮芥的改進(jìn)類似物是環(huán)磷酰胺。
重組免疫毒素，特別是單鏈免疫毒素，與藥物/抗體綴合物相比，優(yōu)點(diǎn)在于比這些綴合物更易于制備，并得到均一的分子群體，即由相同氨基酸殘基組成的單一的肽?？寺『捅磉_(dá)編碼與C35單鏈免疫毒素相應(yīng)的氨基酸序列的DNA序列的技術(shù)，例如寡核苷酸合成、PCR、轉(zhuǎn)化細(xì)胞、構(gòu)建載體、表達(dá)系統(tǒng)等，在本領(lǐng)域已非常成熟，大多數(shù)專業(yè)人員熟悉用于特定條件和方法的標(biāo)準(zhǔn)原料[例如參見Sambrook等人，eds.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Edition，ColdSpring Harbor Laboratory Press (1989)]。
以下包括本發(fā)明免疫綴合物的優(yōu)選實(shí)施方案。本發(fā)明包括本領(lǐng)域已知的其它實(shí)施方案。本發(fā)明并不局限于這些特異性免疫綴合物，還包括含有本發(fā)明抗體和/或抗體片段的其它免疫綴合物。
綴合物包含至少一種藥物分子，其通過本發(fā)明的接頭連接與目的靶細(xì)胞群體反應(yīng)的靶向作用的配基分子。配基分子可以是免疫活性蛋白質(zhì)(例如抗體或其片段)、非免疫活性蛋白質(zhì)或肽配基(例如蛙皮素)、或識別細(xì)胞相關(guān)受體(如凝集素或類固醇分子)的結(jié)合配基。
另外，由于本發(fā)明的綴合物可用于修飾給定的生物反應(yīng)，不能認(rèn)為藥物部分局限于經(jīng)典化療藥物。例如，藥物部分可能是具有目的生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)或多肽。該蛋白質(zhì)可包括，例如毒素如相思豆毒素、篦麻毒素A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質(zhì)如腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經(jīng)生長因子、血小板源性生長因子、組織纖溶酶原激活物；或者生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物如淋巴因子、白細(xì)胞介素-1(″IL-1″)、白細(xì)胞介素-2(″IL-2″)、白細(xì)胞介素-6(″IL-6″)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(″GM-CSF″)，粒細(xì)胞集落刺激因子(″G-CSF″)或其它生長因子。
本發(fā)明所用的優(yōu)選的藥物是細(xì)胞毒藥物，特別是用于癌癥治療的細(xì)胞毒藥物。這些藥物通常包括烷化劑、抗增殖劑、微管蛋白結(jié)合劑等。優(yōu)選的細(xì)胞毒劑類別包括，例如蒽環(huán)霉素家族藥物、長春花屬藥物、絲裂霉素、博萊霉素、細(xì)胞毒核苷、蝶啶家族藥物、diynenes和鬼臼毒素。這些類別中特別有用的藥物包括，例如阿霉素、洋紅霉素、柔紅霉素、氨基蝶呤、氨甲蝶呤、甲喋呤、二氯氨甲喋呤、絲裂霉素C、甲基絲裂霉素、5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、阿糖胞苷、鬼臼毒素或者鬼臼毒素衍生物如足葉乙甙或磷酸足葉乙甙、苯丙氨酸氮芥、長春花堿、長春新堿、異長春堿、長春地辛、環(huán)氧長春堿等。如上所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對目的化合物進(jìn)行化學(xué)修飾，以便使化合物的反應(yīng)更為方便，以制備本發(fā)明的偶聯(lián)物。
如上所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明還包括識別抗原的免疫球蛋白片段的應(yīng)用。該免疫球蛋白片段可包括，例如Fab’、F(ab’)2、F[v]或Fab片段、或者可識別抗原的其它免疫球蛋白片段?？梢岳美绲鞍姿饷赶?例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化)、還原性烷基化作用或者重組技術(shù)制備該免疫球蛋白片段。制備該免疫球蛋白片段的材料和方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。一般參見Parham，J.Immunology，131，2895(1983)；Lamoyi等人，J.ImmunologicalMethods，56，235(1983)；Parham，id.，53，133(1982)；以及Matthew等人，id.，50，239(1982)。
免疫球蛋白可以是如本領(lǐng)域所知的術(shù)語″嵌合抗體″。免疫球蛋白還可能是″雙功能″或″雜合″抗體，即抗體的一個(gè)臂具有一個(gè)抗原性位點(diǎn)(例如腫瘤相關(guān)抗原)的特異性，而另一個(gè)臂識別不同的目標(biāo)，例如半抗原，本身即是或者結(jié)合有對攜帶抗原的腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用的藥物。另外，雙功能抗體可以是每個(gè)臂對將要治療或者生物學(xué)修飾的細(xì)胞的腫瘤相關(guān)抗原不同表位具有特異性的抗體。無論如何，雜合抗體具有雙重特異性，優(yōu)選地，具有針對所選半抗原的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，或者針對目標(biāo)抗原(例如與腫瘤、感染性生物體或其它疾病相關(guān)的抗原)的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。
例如歐洲專利文獻(xiàn)EPA 0 105 360描述了生物學(xué)雙功能抗體，供本領(lǐng)域技術(shù)人員參考。該雜合或雙功能抗體可如所述，通過生物學(xué)細(xì)胞融合技術(shù)或化學(xué)方法(特別是交聯(lián)劑或二硫鍵形成試劑)得到，并可包含其抗體和/或其片段。例如，1983年10月27日出版的PCT申請WO83/03679以及1987年4月8日的已公布的歐洲申請EPA 0 217 577，公開了獲得該雜合抗體的方法。特別優(yōu)選的雙功能抗體是從″多巢″或″細(xì)胞雜交瘤″生物學(xué)制備的，或者利用交聯(lián)劑諸如雙-(馬來酰亞胺)甲醚(″BMME″)或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的其它交聯(lián)劑合成制備。
另外免疫球蛋白可能是單鏈抗體(″SCA″)。其可包含單鏈Fv片段(″scFv″)，其中輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(″V[L]″)和重鏈可變結(jié)構(gòu)域(″V[H]″)通過肽橋或二硫鍵連接。免疫球蛋白還可包含具有抗原結(jié)合活性的單獨(dú)的V[H]結(jié)構(gòu)域(dAbs)。例如參見G.Winter和C.Milstein，Nature349295(1991)；R.Glockshuber等人，Biochemistry 291362(1990)；以及E.S.Ward等人，Nature 341544(1989)。
本發(fā)明特別優(yōu)選使用嵌合單克隆抗體，優(yōu)選對腫瘤相關(guān)抗原具有特異性的嵌合抗體。實(shí)施例所用術(shù)語″嵌合抗體″是指通常利用重組DNA技術(shù)制備的、包含來自一種來源或物種的可變區(qū)(即結(jié)合區(qū))以及至少一部分來自不同來源或物種的恒定區(qū)的單克隆抗體。本發(fā)明的某些應(yīng)用，特別是人的治療，優(yōu)選包含鼠可變區(qū)以及人恒定區(qū)的嵌合抗體，因?yàn)樵摽贵w易于制備，并可能比完全的鼠單克隆抗體免疫原性更低。該鼠/人嵌合抗體是包含編碼鼠免疫球蛋白可變區(qū)的DNA片段以及編碼人免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA片段的免疫球蛋白基因的表達(dá)產(chǎn)物。本發(fā)明包含的其它形式的嵌合抗體是原始抗體的類別或亞類已經(jīng)修飾或改變的抗體。該″嵌合″抗體也指″類別轉(zhuǎn)換的抗體″。制備嵌合抗體的方法包括本領(lǐng)域當(dāng)前熟知的常規(guī)重組DNA和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。例如參見Morrison，S.L.等人，Proc.Natl Acad.Sci.，81，6851(1984)。
術(shù)語″嵌合抗體″包含″人源化抗體″的概念，即構(gòu)架或″互補(bǔ)性″決定區(qū)(″CDR″)已被修飾，以包含與親代免疫球蛋白特異性不同的免疫蛋白的CDR的抗體。優(yōu)選實(shí)施方案中，將鼠CDR移植到人抗體的構(gòu)架區(qū)，以制備″人源化抗體″。例如參見L.Riechmann等人，Nature 332323(1988)；M.S.Neuberger等人，Nature 314268(1985)。特別優(yōu)選的CDR對應(yīng)于嵌合和雙功能抗體識別上述抗原的代表序列。讀者可參考EPA 0 239 400(出版于1987年9月30日)中有關(guān)CDR修飾的抗體的教導(dǎo)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)承認(rèn)，可以制備雙功能-嵌合抗體，其具有嵌合抗體或人源化抗體的較低免疫原性的優(yōu)點(diǎn)，以及上述雙功能抗體的靈活性，特別是對于治療的靈活性。例如利用交聯(lián)劑化學(xué)合成和/或上述的重組方法，可以合成該雙功能-嵌合抗體。無論如何，本發(fā)明不應(yīng)被理解為局限于通過任何特定的方法制備抗體的范圍內(nèi)，不論是雙功能的、嵌合的、雙功能-嵌合的、人源化的抗體或抗原識別片段或其衍生物。
此外，在本發(fā)明范圍內(nèi)包含免疫球蛋白(如上所述)或免疫球蛋白片段，其融合了活性蛋白質(zhì)，例如Neuberger等人1986年3月13日發(fā)表的PCT申請WO86/01533中公開的類型的酶。該公開內(nèi)容于此處引入作為參考。
如上所述，″雙功能的″、″融合的″、″嵌合的″(包括人源化的)以及″雙功能-嵌合的″(包括人源化的)抗體構(gòu)建體，也包括在其各自范圍內(nèi)包含抗原識別片段的構(gòu)建體。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)承認(rèn)，該片段可以利用傳統(tǒng)的酶解完整的雙功能的、嵌合的、人源化的或嵌合-雙功能抗體的方法制備。然而，如果完整的抗體由于所涉及構(gòu)建物的本性而對降解不敏感，可以利用免疫球蛋白片段為原始材料制備所述構(gòu)建物；或者，如果利用重組技術(shù)，可以使DNA序列本身適于編碼目的″片段″，其被表達(dá)以后，可以在體內(nèi)或體外通過化學(xué)或生物學(xué)方法組合，以制備最終所需的完整的免疫球蛋白″片段″。因此，在該背景下使用術(shù)語″片段″。
此外，如上所述，本發(fā)明所用的免疫球蛋白(抗體)或其片段本質(zhì)上可能是天然的多克隆或單克隆的。然而優(yōu)選的免疫球蛋白是單克隆抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員目前熟知多克隆或單克隆抗體的制備方法，他們當(dāng)然完全能夠制備可用于本發(fā)明的有用的免疫球蛋白。例如參見G.Kohler和C.Milstein，Nature 256495 (1975)。此外，雜交瘤和/或通過該雜交瘤制備的用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的單克隆抗體可公開獲得，例如以美國典型培養(yǎng)物保藏中心(″ATCC″)10801 University Blvd.，Manassas，VA.20110。
用于本發(fā)明的單克隆抗體特別優(yōu)選識別腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體。
診斷技術(shù)血清學(xué)診斷技術(shù)包括檢測和定量分泌到或“流”到據(jù)認(rèn)為是患癌病人的血清或其它生物學(xué)液體中的腫瘤相關(guān)抗原?？梢岳帽绢I(lǐng)域已知技術(shù)，例如放射免疫試驗(yàn)(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測體液中的該抗原，其中利用與″流出″抗原反應(yīng)的抗體檢測流體樣品中存在的抗原[例如參見Uotila等人，″Two-Site Sandwich ELISA WithMonoclonal Antibodies To Human AFP″，J.Immuynol.Methods，4211(1981)以及Allum等人，前文48-51頁]。因此，利用此處公開的C35抗體進(jìn)行的這些測定，可以用于檢測生物學(xué)流體中與C35抗體反應(yīng)的抗原，從而檢測病人中的癌。因此根據(jù)上文顯而易見，本發(fā)明的C35抗體可用于涉及抗原抗體反應(yīng)的大多數(shù)試驗(yàn)。這些試驗(yàn)包括而不限于標(biāo)準(zhǔn)的液相和固相RIA技術(shù)、ELISA試驗(yàn)、ELISPOT、免疫熒光技術(shù)及其它的免疫細(xì)胞化學(xué)試驗(yàn)[例如參見Sikora等人(eds.)，MonoclonalAntibodies，pp.32-52(Blackwell Scientific Publications1984)]。
本發(fā)明也包括進(jìn)行上述試驗(yàn)的診斷試劑盒。一個(gè)實(shí)施方案中，診斷試劑盒包含本發(fā)明的C35單克隆抗體、其片段、融合蛋白質(zhì)或嵌合抗體，以及包含C35抗體的特異性結(jié)合配偶體和能夠產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo)記物的綴合物。試劑還可包括輔助試劑，例如緩沖劑和蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑(例如多糖)。必要時(shí)診斷試劑盒可進(jìn)一步包含信號產(chǎn)生系統(tǒng)的其它組分，包括降低背景干擾的試劑、對照試劑或進(jìn)行測試的裝置或容器。
另一實(shí)施方案中，診斷試劑盒包含本發(fā)明C35抗體和能夠產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo)記物的綴合物。也可以包含上述的輔助試劑。
本發(fā)明C35抗體也可用于人癌檢測的體內(nèi)診斷應(yīng)用。該方法之一涉及通過腫瘤造影技術(shù)體內(nèi)檢測腫瘤。根據(jù)該方法，用能產(chǎn)生可檢測信號的合適造影劑標(biāo)記C35抗體?？梢允褂玫脑煊皠┑睦影ǘ幌抻冢派湫詷?biāo)記例如<131>I，<111>In，<123>I，<99m>Tc，<32>P，<125>I，<3>H，and<14>C，熒光標(biāo)記例如熒光素和羅丹明，以及化學(xué)發(fā)光劑例如蟲螢光素?？衫帽绢I(lǐng)域已知技術(shù)用該試劑標(biāo)記抗體。例如有關(guān)抗體放射標(biāo)記技術(shù)參見Wensel和Meares，Radioimmunoimaging And Radioimmunotherapy，Elsevier，New York(1983)[也參見Colcher等人，″Use Of Monoclonal Antibodies AsRadiopharmaceuticals For The Localization Of Human CarcinomaXenografts In Athymic Mice″，Meth.Enzyinol.121802-16(1986)]。
就放射性標(biāo)記抗體而言，給予病人抗體，定位到具有與該抗體反應(yīng)的抗原的腫瘤，并利用已知技術(shù)(諸如利用例如γ照相機(jī)或發(fā)射斷層術(shù)進(jìn)行放射性核的掃描)體內(nèi)檢測或″造影″[例如參見Bradwell等人，″Developments InAntibody Imaging″，MonoclonalAntibodies ForCancer Detection And Therapy，Baldwin等人(eds.)，pp.65-85(Academic Press 1985)]。給予病人在藥物可接受的載體(諸如水、鹽、Ringer’s液、Hank’s液或非水載體如不揮發(fā)油)中的抗體。載體也可包含增強(qiáng)抗體等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)，例如緩沖液或防腐劑?？贵w制劑是通過例如靜脈內(nèi)給藥，其劑量足以提供足夠的γ發(fā)射而使腫瘤目標(biāo)位點(diǎn)可見。在給予抗體和檢測之間應(yīng)有足夠時(shí)間，使之完成腫瘤目標(biāo)定位。腫瘤造影的一般討論參見Allum等人，前文51-55頁。
C35抗體的治療應(yīng)用C35抗體的特性適于許多體內(nèi)的治療應(yīng)用。
首先，C35抗體能夠單獨(dú)用于體內(nèi)靶向和殺傷腫瘤細(xì)胞。該抗體還可以與合適的治療劑聯(lián)用，治療人類癌癥。例如，該抗體可與標(biāo)準(zhǔn)或常規(guī)治療方法諸如化療、放療聯(lián)用，或者綴合或連接治療藥物或毒素，以及淋巴因子或腫瘤-抑制生長因子，將治療劑傳遞到癌位點(diǎn)。
將治療劑與抗體綴合的技術(shù)眾所周知[例如參見Amon等人，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy″，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等人(eds.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等人，″Antibodies For Drug Delivery″，Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson等人(eds.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In CancerTherapyA Review″，Monoclonal Antibodies’84Biological AndClinical Applications，Pinchera等人(eds.)，pp.475-506(1985)；以及Thorpe等人，″The Preparation And Cytotoxic PropertiesOfAntibody-Toxin Conjugates″，Immunol.Rev.，62119-58(1982)]。
另外，C35抗體可結(jié)合高能輻射，例如放射性同位素如<131>I，其定位于腫瘤位點(diǎn)時(shí)引起數(shù)個(gè)細(xì)胞直徑的殺傷[例如參見Order，″Analysis，Results，And Future Prospective Of The TherapeuticUse Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy″，MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等人(eds.)，pp.303-16(Academic Press 1985)]。根據(jù)另一實(shí)施方案，C35抗體可綴合另一抗體，形成治療腫瘤細(xì)胞的抗體雜綴合體(如Segal在美國專利編號4,676,980中所述)。
本發(fā)明C35抗體的其它治療應(yīng)用還包括，例如通過重組DNA技術(shù)綴合或連接能將前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒藥物的酶，以及該抗體-酶綴合物與前體藥物結(jié)合，在腫瘤位點(diǎn)將前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒藥物的用途[例如參見Senter等人，″Anti-Tumor Effects Of Antibody-alkalinePhosphatase″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，854842-46(1988)；″Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activitesof Phosphoiylated Mitocycin C and Etoposide Derivatives byMonoclonal Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates″，CancerResearch 495789-5792(1989)；以及Senter，″Activation ofProdrugs by Antibody-Enzyme ConjugatesANewApproachto CancerTherapy，″FASEB 14188-193(1990)]。
C35抗體的另一治療應(yīng)用還包括，在補(bǔ)體存在下或作為抗體-藥物或抗體-毒素偶聯(lián)物的一部分，從癌癥病人的骨髓中除去腫瘤細(xì)胞的應(yīng)用。依據(jù)這種方法，自體骨髓可通過該抗體處理而離體凈化，然后骨髓被回輸給病人[例如參見Ramsay等人，″Bone Marrow Purging UsingMonoclonal Antibodies″，J.Clin.Immunol.，8(2)81-88(1988)]。
此外，前述本發(fā)明嵌合C35、重組免疫毒素及其它重組構(gòu)建體，其包含C35單克隆抗體的抗原結(jié)合區(qū)特異性，如前所述，可用于治療。例如本發(fā)明的單鏈免疫毒素，可用來治療人體內(nèi)的癌。
類似地，至少包含C35抗體的抗原結(jié)合區(qū)(其至少與具有抗腫瘤活性的另一蛋白質(zhì)(例如淋巴因子或制瘤素)的功能活性部分連接)的融合蛋白質(zhì)，可用于治療人體內(nèi)的癌。此外，本領(lǐng)域已知的重組技術(shù)可用于構(gòu)建雙特異性抗體，其中該抗體的一種結(jié)合特異性是C35的結(jié)合特異性，而另一種結(jié)合特異性是除C35以外分子的結(jié)合特異性。
最后，C35抗體的抗獨(dú)特型抗體可用于主動腫瘤免疫和腫瘤治療[例如參見Hellstrom等人，″Immunological Approaches To TumorTherapyMonoclonal Antibodies，Tumor Vaccines，AndAnti-Idiotypes″，Covalently Modified Antigens And AntibodiesIn Diagnosis And Therapy，前文35-41頁]。
本發(fā)明提供了選擇性殺傷表達(dá)特異性結(jié)合C35單克隆抗體或功能等價(jià)物的抗原的腫瘤細(xì)胞的方法。該方法包含使所述腫瘤細(xì)胞與本發(fā)明的免疫綴合物(例如免疫毒素)反應(yīng)。這些腫瘤細(xì)胞可來自人類癌癥。
另外，本發(fā)明提供治療體內(nèi)癌癥(例如人類癌癥)的方法。該方法包含給予患者藥物有效量的包含至少一種本發(fā)明免疫綴合物(例如免疫毒素)的組合物。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)踐，患者可能是人、馬、豬、牛、鼠、犬、貓和鳥。其它溫血?jiǎng)游镆舶ㄔ诒景l(fā)明內(nèi)。
本發(fā)明也提供治療癌癥患者的方法。患者可以是人、狗、貓、小鼠、大鼠、兔、馬、山羊、綿羊、牛、雞。癌癥可為乳腺癌、膀胱癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、卵巢乳頭狀囊腺癌、Wilm’s腫瘤或小細(xì)胞肺癌，通常其特征為細(xì)胞表面具有腫瘤相關(guān)抗原的一群細(xì)胞。該方法包含給予患者癌癥殺傷劑量的與細(xì)胞毒劑連接的腫瘤靶向抗體。通常，在允許抗體與其細(xì)胞表面目標(biāo)結(jié)合的條件下，將腫瘤靶向抗體與細(xì)胞毒劑結(jié)合。通過與其目標(biāo)結(jié)合，腫瘤靶向抗體直接或間接導(dǎo)致或促進(jìn)殺傷所結(jié)合的細(xì)胞，從而治療患者。
本發(fā)明還提供了抑制哺乳動物腫瘤細(xì)胞增殖的方法，其包含將哺乳動物腫瘤細(xì)胞與足夠濃度的本發(fā)明的免疫綴合物接觸，以抑制哺乳動物腫瘤細(xì)胞的增殖。
本發(fā)明另外提供了抑制人腫瘤細(xì)胞生長、治療患者腫瘤以及治療患者增殖型疾病的方法。這些方法包含給予患者有效量的本發(fā)明組合物。
因此顯然本發(fā)明包含治療人類癌癥的藥物組合物、組合和方法。例如，本發(fā)明包括用于治療人類癌癥的藥物組合物，其中包含藥物有效劑量的C35抗體和藥物可接受的載體。
該組合物可包含未修飾的、與治療劑綴合的(例如藥物、毒素、酶或另一抗體)或者重組形式(例如嵌合的C35、嵌合C35的片段、雙特異性C35或單鏈免疫毒素C35)的C35抗體或抗體片段。該組合物另外可包括用于治療癌癥的其它抗體或綴合物(例如抗體混合物)。
本發(fā)明的抗體、抗體綴合物和免疫毒素組合物可利用常規(guī)給藥方式給藥，包括但不限于靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、口服、淋巴內(nèi)給藥或直接注射到腫瘤內(nèi)。優(yōu)選靜脈內(nèi)給藥。
本發(fā)明的組合物可以是各種劑型，包括而不限于液體溶液或懸浮液、片劑、丸劑、粉末、栓劑、聚合微膠囊或微囊、脂質(zhì)體以及可注射或輸注的溶液。優(yōu)選的形式取決于給藥方式和治療應(yīng)用。
本發(fā)明的組合物還優(yōu)選包括本領(lǐng)域已知的常規(guī)藥物可接受的載體和佐劑，諸如人血清白蛋白、離子交換劑、氧化鋁、卵磷脂、緩沖物質(zhì)如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀以及鹽或電解質(zhì)如硫酸魚精蛋白。
本發(fā)明組合物的最有效給藥方式和劑量方案取決于疾病的嚴(yán)重性和病程、病人的健康狀態(tài)和對治療的反應(yīng)，以及治療醫(yī)師的判斷。因此，組合物的劑量應(yīng)當(dāng)針對單個(gè)病人確定。然而，本發(fā)明組合物的有效劑量可在大約1-2000mg/kg范圍內(nèi)。
此處所述分子可以是各種劑型，包括而不限于液體溶液或懸浮液、片劑、丸劑、粉末、栓劑、聚合微膠囊或微囊、脂質(zhì)體以及可注射或輸注的溶液。優(yōu)選的形式取決于給藥方式和治療應(yīng)用。
本發(fā)明分子的最有效給藥方式和劑量方案取決于所治療腫瘤的部位、癌癥的嚴(yán)重性和病程、患者的健康狀態(tài)和對治療的反應(yīng)，以及治療醫(yī)師的判斷。因此，該分子的劑量應(yīng)當(dāng)針對單個(gè)患者確定。
Freireich，E.J.等人Cancer Chemother.，Rep.50(4)219-244(1966)描述了基于mg/kg體表面積各種大小和物種的動物與人的劑量相互關(guān)系。調(diào)整劑量方案可優(yōu)化腫瘤細(xì)胞生長抑制及殺傷反應(yīng)，例如可以分開劑量并按日給藥，或者根據(jù)情況按比例降低劑量(例如幾個(gè)分劑量按日給藥，或者根據(jù)特定的治療情況按比例降低)。
顯然，完成治療所需的本發(fā)明組合物的劑量可以按預(yù)定優(yōu)化進(jìn)一步降低。
依照本發(fā)明的實(shí)施，該藥物載體可以是脂類載體。該脂類載體可以是磷脂。另外，該脂類載體可以是脂肪酸。該脂類載體還可以是去污劑。此處所用去污劑是改變(一般是降低)液體表面張力的任何物質(zhì)。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，去污劑可以是非離子型去污劑。非離子型去污劑的例子包括而不限于多乙氧基醚(又名Tween 80或(聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯))、Brij和Triton(例如Triton WR-1339和TritonA-20)。
另外，該去污劑可以是離子型去污劑。離子型去污劑的例子包括而不限于烷基三甲基溴化銨。
另外，依照本發(fā)明，該脂類載體可以是脂質(zhì)體。本申請所用″脂質(zhì)體″是包含本發(fā)明任何分子或其組合的任何膜結(jié)合的囊。
疫苗制劑利用重組DNA方法可大量制備C35表位，并與促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的佐劑配劑。本發(fā)明包括在真核或原核重組表達(dá)載體中表達(dá)C35多肽或C35表位(包括細(xì)胞毒性或輔助T細(xì)胞誘導(dǎo)的表位)；以及與免疫原性和/或抗原性組合物相同的制劑。例如，美國專利申請?zhí)?8/935,377描述了該組合物，在此全文引入供參考。根據(jù)本發(fā)明，重組表達(dá)的C35表位可以作為亞單位疫苗進(jìn)行表達(dá)、純化和配制。優(yōu)選地，編碼C35表位的DNA也可構(gòu)建到病毒載體中，優(yōu)選痘病毒、腺病毒、皰疹病毒和甲病毒載體，用于疫苗。在這方面可以配制活的、滅活的或殺死的重組病毒疫苗。
(i)在原核和真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)C35本發(fā)明包括可用來表達(dá)C35表位的真核和原核表達(dá)載體的表達(dá)系統(tǒng)。C35表位可以表達(dá)為截短的或全長形式，特別是用于組成亞單位疫苗。
本發(fā)明包含表達(dá)編碼C35多肽及免疫學(xué)等價(jià)片段的核苷酸序列?？赏ㄟ^制備編碼鑒定表位(在該序列5’和/或3’端截短和/或具有一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部缺失)的核苷酸序列的類似物、表達(dá)該類似物核苷酸序列、以及確定所得片段是否受表位特異性T淋巴細(xì)胞免疫識別并誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答、或受表位特異性B淋巴細(xì)胞識別以誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，從而鑒定該免疫學(xué)等價(jià)片段。
本發(fā)明包括含有任何上述編碼序列(可操作性地連接有指導(dǎo)編碼序列表達(dá)的調(diào)節(jié)元件)的DNA表達(dá)載體以及包含任何上述編碼序列(可操作性地連接有在宿主細(xì)胞中指導(dǎo)編碼序列表達(dá)的調(diào)節(jié)元件)的基因工程宿主細(xì)胞。此處所用調(diào)節(jié)元件包括而不限于可驅(qū)動并調(diào)節(jié)表達(dá)的可誘導(dǎo)型和非誘導(dǎo)型啟動子、增強(qiáng)子、操作子及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它元件。
可以利用本領(lǐng)域公知的方法，通過重組DNA技術(shù)制備C35表位的基因產(chǎn)物或其肽片段。
因此，此處描述了通過表達(dá)包含表位基因序列的核酸，來制備本發(fā)明C35表位基因多肽和肽的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法可用于構(gòu)建包含表位基因產(chǎn)物編碼序列以及合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括，例如體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)以及體內(nèi)基因重組。例如參見Sambrook等人，在MolecularCloningALaboratory Manual，2ndEd.，(1989)，Cold SpringHarbor Laboratory Press，以及Ausubel等人，1989，前文中所述技術(shù)。另外，可以利用例如合成儀，化學(xué)合成能夠編碼糖蛋白表位基因產(chǎn)物序列的RNA。例如參見″Oligonucleotide Synthesis″，1984，Gait，M.J.ed.，IRL Press，Oxford所述技術(shù)，在此全文引入供參考。
本發(fā)明也包含編碼C35表位基因產(chǎn)物肽片段的核苷酸序列。例如，對應(yīng)于C35表位胞外結(jié)構(gòu)域的多肽或肽可用作促進(jìn)分泌的″可溶性″蛋白質(zhì)，特別是用于制備亞單位疫苗。C35表位基因產(chǎn)物或其肽片段(可以與識別商品化的抗體的異源表位相連接)也包括在本發(fā)明之內(nèi)。也可制備耐久的融合蛋白質(zhì)；即C35表位序列和異源蛋白質(zhì)序列之間具有裂解位點(diǎn)的融合蛋白質(zhì)，因此可以將所選的C35與異源部分分開。例如，可以在C35表位蛋白質(zhì)或肽與異源肽或蛋白質(zhì)之間制造膠原酶裂解識別的共有序列。通過膠原酶處理，可以從該融合蛋白質(zhì)中釋放表位結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，可以制備谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶與C35表位的融合蛋白質(zhì)。
本發(fā)明用于疫苗制劑，特別是亞單位疫苗制劑的C35表位蛋白質(zhì)，基本上是純的或同質(zhì)的。至少60-75％的樣品呈現(xiàn)單一多肽序列時(shí)，可認(rèn)為該蛋白質(zhì)基本上是純的或同質(zhì)的?；旧霞兊牡鞍踪|(zhì)優(yōu)選包含60-90％、更優(yōu)選大約95％、最優(yōu)選99％的蛋白質(zhì)樣品?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法確定蛋白質(zhì)純度或同質(zhì)性，諸如樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳、然后在染色凝膠上顯現(xiàn)單一的多肽條帶?？衫帽绢I(lǐng)域公知的HPLC或其它類似方法，確定更高的分辨率。
本發(fā)明包含的C35多肽，其一般從表達(dá)編碼這些蛋白質(zhì)的重組核苷酸序列的宿主細(xì)胞中純化。利用本領(lǐng)域公知的各種方法完成該蛋白質(zhì)的純化。優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的C35表位蛋白質(zhì)表達(dá)為與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合的融合蛋白質(zhì)。利用親和層析純化得到的重組融合蛋白質(zhì)，表位蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域與異源部分?jǐn)嗔眩玫交旧霞兊牡鞍踪|(zhì)樣品?？衫帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員所知的其它方法；例如參見″Methods InEnzymology″，1990，Academic Press，Inc.，San Diego，″ProteinPurificationPrinciples and Practice″，1982，SpringerVerlag，New York中所述技術(shù)，在此全文引入供參考。
(ii)真核和原核表達(dá)載體本發(fā)明包括可用來表達(dá)C35表位的真核和原核表達(dá)載體的表達(dá)系統(tǒng)。各種宿主-表達(dá)載體系統(tǒng)可用于表達(dá)本發(fā)明的C35表位基因。該宿主-表達(dá)系統(tǒng)代表載體，通過它可以制備C35編碼序列并進(jìn)行隨后純化，也代表用C35核苷酸編碼序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染后、可原位呈現(xiàn)本發(fā)明C35表位基因產(chǎn)物的細(xì)胞。其包括而不限于，用包含C35表位基因產(chǎn)物編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物如細(xì)菌(例如大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis))；用包含C35表位基因產(chǎn)物編碼序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母(例如糖酵母(Saccharomyces)、畢赤酵母(Pichia))；用包含C35表位基因產(chǎn)物編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用包含C35表位基因產(chǎn)物編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)感染或者重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或者哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)(例如COS、CHO、BHK、293、3T3)，其中帶有包含來自哺乳動物細(xì)胞基因組的啟動子(例如金屬硫蛋白啟動子)或來自哺乳動物病毒的啟動子(例如腺病毒晚期啟動子；痘苗病毒7.5K啟動子)的重組表達(dá)構(gòu)建體。
(iii)宿主細(xì)胞本發(fā)明包含在動物和昆蟲細(xì)胞系中表達(dá)C35表位。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，C35表位在昆蟲細(xì)胞系中桿狀病毒載體上表達(dá)，以制備非糖基化抗原。本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的哺乳動物宿主細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞系)中表達(dá)C35表位，以制備糖基化抗原。這些細(xì)胞系重組表達(dá)的C35表位可以配制成亞單位疫苗。本發(fā)明另外涉及過表達(dá)C35基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞。該細(xì)胞可以是利用任何合適載體瞬時(shí)或者穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，載體中包括編碼C35多肽或其片段的多核苷酸序列，以及指導(dǎo)C35基因產(chǎn)物過表達(dá)的合適啟動子和增強(qiáng)子序列。然而，過表達(dá)的細(xì)胞也可以是插入(例如通過同源重組)指導(dǎo)內(nèi)源性C35基因過表達(dá)的異源啟動子或增強(qiáng)子的產(chǎn)物。術(shù)語″過表達(dá)″是指其它條件都相同時(shí)，表達(dá)水平高于給定細(xì)胞特征性的基礎(chǔ)表達(dá)水平。
可以選擇調(diào)節(jié)插入序列表達(dá)、或以所需特定方式修飾和加工C35基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞株。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的修飾(例如糖基化)和加工(例如分裂)對該蛋白質(zhì)的功能可能很重要。不同的宿主細(xì)胞具有特征的和特定的蛋白質(zhì)及基因產(chǎn)物翻譯后加工和修飾的機(jī)制?？梢赃x擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系或宿主系統(tǒng)，以保證所表達(dá)的外源蛋白的正確修飾。為此，可以利用具有可適當(dāng)加工始轉(zhuǎn)錄、對C35基因產(chǎn)物糖基化、磷酸化和異戊二烯化的細(xì)胞器的真核宿主細(xì)胞。這種哺乳動物宿主細(xì)胞包括而不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3和W138細(xì)胞系。
為長期、高產(chǎn)量制備重組蛋白質(zhì)，優(yōu)選穩(wěn)定型表達(dá)。例如，可以制備穩(wěn)定表達(dá)C35目標(biāo)表位的細(xì)胞系。除了利用包含病毒復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體，可以利用合適的表達(dá)控制元件(例如啟動子、增強(qiáng)子序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多聚腺苷酸化位點(diǎn)等)控制的DNA以及選擇標(biāo)志轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。引入外源DNA后，可使改造的細(xì)胞在豐富培養(yǎng)基中生長1-2天，然后轉(zhuǎn)到選擇性培養(yǎng)基。重組質(zhì)粒的選擇標(biāo)志提供選擇抗性，使細(xì)胞將質(zhì)粒穩(wěn)定整合到染色體中，形成基因座，隨后被克隆并擴(kuò)增到細(xì)胞系中。此方法可方便地用于制備細(xì)胞系。此方法可方便地用于制備表達(dá)C35表位基因產(chǎn)物的細(xì)胞系。該細(xì)胞系可特別用于篩選和評價(jià)影響C35表位基因產(chǎn)物內(nèi)源活性的化合物。
可以利用多種選擇系統(tǒng)，包括而不限于單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，1977，Cell 11223)，次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Szybalska & Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA482026)，以及腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy等人，1980，Cell22817)基因，其可以分別用于tk-、hgprt-或aprt-細(xì)胞。還可以利用抗代謝物抗性為基礎(chǔ)選擇以下基因提供氨甲蝶呤抗性的dhfr(Wigler等人，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 773567；O’Hare等人，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 781527)；提供霉酚酸抗性的gpt(Mulligan & Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA782072)；提供氨基糖苷G-418抗性的neo(Colberre-Garapin等人，1981，J.Mol.Biol.1501)；以及提供潮霉素抗性的hygro(Santerre等人，1984，Gene 30147)。
另外，利用特異性針對所表達(dá)的融合蛋白質(zhì)的抗體，可以很容易純化任何融合蛋白質(zhì)。例如，Janknecht等人描述的系統(tǒng)允許迅速純化人細(xì)胞系中表達(dá)的未變性融合蛋白質(zhì)(Janknecht等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888972-8976)。該系統(tǒng)中，將目的基因亞克隆到牛痘重組質(zhì)粒，使該基因的開放閱讀框架可翻譯地與包含6個(gè)組氨酸殘基的氨基端標(biāo)記融合。將經(jīng)重組痘苗病毒感染的細(xì)胞的提取物，上樣到Ni2+·氮川乙酸-瓊脂糖柱上，用包含咪唑的緩沖液選擇性洗脫組氨酸-標(biāo)記的蛋白質(zhì)。
(iv)重組病毒疫苗中C35表位的表達(dá)本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，能夠制備表達(dá)C35表位的活重組病毒疫苗或滅活重組病毒疫苗。優(yōu)選活疫苗，因?yàn)槠湓谒拗髦袛U(kuò)增導(dǎo)致與自然感染種類和大小相似的刺激延長，因而提供大量、持久的免疫力?？梢岳迷诩?xì)胞培養(yǎng)或雞胚尿囊中繁殖病毒、并隨后純化的常規(guī)方法進(jìn)行重組活病毒疫苗制劑的制備。
在這方面，多種基因工程病毒可以表達(dá)C35表位。對于疫苗來說，其可能需要具有減毒特性的重組病毒。當(dāng)前供人使用的是耐冷、熱敏或減毒的活病毒疫苗。在用于轉(zhuǎn)染的模板中引入合適的突變(例如缺失)，可提供具有減毒特性的新病毒。例如，與溫度敏感性或寒冷適應(yīng)性有關(guān)的特定的多重錯(cuò)義突變，能夠制成缺失突變和/或多重突變，其可引入各個(gè)病毒基因中。這些突變體應(yīng)該比包含單一點(diǎn)突變的冷敏或溫度敏感突變體更穩(wěn)定，回復(fù)頻率應(yīng)該非常低。另外，可構(gòu)建具有″自殺″特性的重組病毒。此病毒在宿主中只經(jīng)歷一輪或幾輪復(fù)制。
為了本發(fā)明目的，具有以下特征的任何病毒可用于本發(fā)明(a)表現(xiàn)減毒表型或可改造為表現(xiàn)減毒表型特征；(b)表現(xiàn)對哺乳動物特別是對人的趨向性，或者可改造為表現(xiàn)這種趨向性；以及(c)可以改造為表達(dá)本發(fā)明的C35表位。
牛痘病毒載體可用于本發(fā)明，因?yàn)榇蟮腄NA片段很容易被克隆到其基因組中并且重組減毒牛痘變體已有描述(Meyer等人，1991，J.Gen.Virol.721031-1038)。正粘病毒，包括流感；副粘病毒，包括呼吸道合胞病毒和仙臺病毒；以及彈狀病毒可以改造為表達(dá)可產(chǎn)生減毒表型的突變(參見美國專利Serial No.5,578,473，1996年11月26日頒發(fā))。這些病毒基因組也可改造為表達(dá)外源核苷酸序列，例如本發(fā)明的C35表位(參見美國專利Serial No.5,166,057，1992年11月24日頒發(fā)，在此全文引入以供參考)?？梢詰?yīng)用反向遺傳學(xué)技術(shù)操作負(fù)鏈或正鏈RNA病毒基因組，以引入可產(chǎn)生減毒表型的突變，例如在流感病毒、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒和EB病毒、新培斯病毒以及脊髓灰質(zhì)炎病毒中所示(參見Palese等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9311354-11358)。這些技術(shù)也可用于引入外源DNA(即C35表位)，以制備用作本發(fā)明疫苗的重組病毒載體。例如參見美國專利申請?zhí)?8/935,377，在此全文引入以供參考。此外，可以改造減毒腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，以表達(dá)C35表位。因此，可以改造多種病毒，以設(shè)計(jì)本發(fā)明的疫苗，然而，通過而不受限于實(shí)施例，此處描述了表達(dá)C35表位、用作疫苗的重組減毒牛痘載體。
一個(gè)實(shí)施方案中，重組修飾的牛痘變體、修飾的安卡拉病毒(Modified Virus Ankara，MVA)用于疫苗制劑。此修飾的病毒已經(jīng)在鳥類細(xì)胞中傳代500次，不能在哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行完整的感染周期。(Meyer等人，1991，J.Gen.Virol.7210311038)。用作疫苗時(shí)，重組病毒經(jīng)歷單個(gè)復(fù)制周期，并誘導(dǎo)足夠水平的免疫應(yīng)答，而不在人類宿主中繼續(xù)生存并導(dǎo)致疾病。缺少一種或多種牛痘病毒必需基因的重組病毒不能進(jìn)行連續(xù)的復(fù)制循環(huán)。通過與缺少病毒復(fù)制所需特定基因的牛痘載體共轉(zhuǎn)染永久表達(dá)該基因的細(xì)胞系，可以制備該缺陷病毒。缺少必需基因的病毒將在這些細(xì)胞系中復(fù)制，但給與人類宿主時(shí)，將不能完成一輪復(fù)制。該制劑可在此無效循環(huán)中轉(zhuǎn)錄和翻譯足量的基因，以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
另外，可以將大量毒株給藥，因此這些制劑可作為滅活(死)病毒、疫苗。對于滅活疫苗，優(yōu)選表達(dá)異源C35基因產(chǎn)物作為病毒組分，因此C35基因產(chǎn)物與病毒顆粒有關(guān)。該制劑的優(yōu)點(diǎn)在于其包含天然蛋白質(zhì)，無需用福爾馬林或者其它用于制備死病毒疫苗的試劑處理，進(jìn)行滅活。
本發(fā)明另一實(shí)施方案中，利用常規(guī)方法″殺死″重組病毒，制備滅活疫苗制劑。滅活疫苗是″死的″是指其感染性已被破壞。理想地是破壞病毒的感染性，而不影響免疫原性。為了制備滅活疫苗，重組病毒可在細(xì)胞培養(yǎng)物或者雞胚尿囊中生長，區(qū)帶超速離心法純化，甲醛或者β-丙內(nèi)酯滅活，并混合。獲得的疫苗通常肌內(nèi)接種。
為了增強(qiáng)免疫應(yīng)答，滅活病毒可與合適的佐劑組合使用。佐劑可包括而不限于礦物凝膠，例如氫氧化鋁；表面活性物質(zhì)，例如溶血卵磷脂、多聚醇、聚陰離子；肽；寡核苷酸、油乳劑；以及具有潛在用途的人類佐劑，例如BCG和短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。
(v)治療和/或接種方法本發(fā)明的C35表位可以大量制備，因此制備和純化的抗原可用作疫苗制劑。C35表位可配制成亞單位疫苗制劑，或者可制備到病毒載體中并配制成疫苗制劑。另外，編碼C35表位的DNA可作為疫苗制劑直接給藥。一旦給予患者的″裸″質(zhì)粒DNA侵入細(xì)胞、表達(dá)、加工成肽片段，其中一些可與MHC分子聯(lián)合存在于所侵入細(xì)胞的表面，并誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，以致T淋巴細(xì)胞會攻擊展示C35表位的細(xì)胞。C35表位也可用于診斷，例如檢測或者測量患者體液樣品中表達(dá)C35的腫瘤的存在或者由表達(dá)C35的腫瘤誘導(dǎo)的抗體或T細(xì)胞的存在，并因而診斷癌癥和腫瘤和/或監(jiān)測患者在接種之后的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的重組病毒可用于治療帶有腫瘤的哺乳動物，包括人類，以產(chǎn)生針對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答。產(chǎn)生足夠并合適的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致體內(nèi)腫瘤退化。這種″疫苗″能夠單獨(dú)使用或者與其它用于腫瘤治療方法(包括而不限于化療、放療、手術(shù)、骨髓移植等)聯(lián)合使用。例如，可用手術(shù)或放射技術(shù)縮小腫塊，然后給予本發(fā)明的疫苗制劑，以確保退化并防止剩余腫瘤團(tuán)塊發(fā)展或在體內(nèi)微轉(zhuǎn)移。另外，″疫苗″給藥可先于手術(shù)、放療或化療。
另外，本發(fā)明的重組病毒可用于免疫或″接種″沒有腫瘤的個(gè)體，以防止腫瘤生成。隨著遺傳檢驗(yàn)的出現(xiàn)，現(xiàn)在有可能預(yù)測個(gè)體對某些癌癥的誘因。因此，這種個(gè)體可以利用表達(dá)C35抗原的重組牛痘病毒進(jìn)行免疫。
可以通過監(jiān)測試驗(yàn)動物免疫后的免疫應(yīng)答，或者利用本領(lǐng)域已知的任何免疫測定方法，確定C35表位疫苗制劑的致免疫力。產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)和/或體液免疫應(yīng)答可作為免疫應(yīng)答的指征。試驗(yàn)動物可包括小鼠、倉鼠、犬、貓、猴、兔、黑猩猩等，以及最后人類受試者。
合適的該疫苗制劑包括可注射的液體溶液或者懸浮液；也可制備成適合注射前溶解、懸浮于液體中的固體形式。制劑也可以乳化，或?qū)⒍嚯陌谥|(zhì)體中?；钚缘拿庖咴猿煞殖３Ｅc藥物可接受的、并與該活性成分相容的賦形劑混合。合適的賦形劑為，例如水、鹽、葡萄糖、甘油、乙醇等及其組合。此外，如果需要，疫苗制劑還可包括小量的輔助物質(zhì)，例如濕潤劑或乳化劑、pH緩沖劑和/或增強(qiáng)疫苗有效性的佐劑。
有效佐劑的例子包括而不限于氫氧化鋁、N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕櫚酰-錫-甘油-3-hydroxyphosphoryloxy)-乙胺、GM-CSF、QS-21(研究性物，Progenies Pharmaceuticals，Inc.)、DETOX(研究性藥物，Ribs Pharmaceuticals)、BCG以及CpG豐富的寡核苷酸。
通過測定誘導(dǎo)針對C35表位的細(xì)胞免疫應(yīng)答，可確定佐劑的有效性。
本發(fā)明的疫苗可以是多價(jià)或單價(jià)的。多價(jià)疫苗由指導(dǎo)一種以上的抗原表達(dá)的重組病毒制成。優(yōu)選的多價(jià)疫苗包含細(xì)胞毒T細(xì)胞以及輔助T細(xì)胞的多個(gè)表位。
如果需要，組合物還可以包含小量的濕潤劑或乳化劑、或pH緩沖劑。組合物可以是液體溶液、懸浮液、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、緩釋制劑、或粉末?？诜苿┛梢园?biāo)準(zhǔn)載體，例如藥用級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。
通常，這些成分分別或以混合成單元?jiǎng)┬吞峁?，例如裝在標(biāo)明活性劑數(shù)量的密閉容器(諸如安瓿或小袋(sachette))中的干燥的凍干粉末或無水濃縮物。組合物經(jīng)注射給藥時(shí)，可提供一安瓿無菌稀釋劑，以在給藥之前混合成分。
特定的實(shí)施方案中，一個(gè)容器中提供凍干的本發(fā)明C35表位；另一個(gè)容器包含稀釋劑，其由50％甘油、0.25％苯酚和防腐劑(例如0.005％亮綠)的水溶液組成。
可以利用標(biāo)準(zhǔn)方法使用純化的C35抗原作為疫苗制劑。例如，應(yīng)將純化的C35表位調(diào)整為合適濃度、與任何合適的疫苗佐劑組合、并包裝以供使用。合適的佐劑可包括而不限于礦物凝膠，例如氫氧化鋁；表面活性物質(zhì)，例如溶血卵磷脂、多聚醇；聚陰離子；肽；油乳劑；明礬和MDP。免疫原也可摻入到脂質(zhì)體、或與多醣和/或其它聚合物綴合，供疫苗制劑之用。重組抗原是半抗原(即具有抗原性，可以選擇性與相關(guān)的抗體反應(yīng)，但沒有免疫原性，不能引起免疫應(yīng)答的分子)的情況下，半抗原可與載體或免疫原性分子共價(jià)結(jié)合；例如，大蛋白質(zhì)諸如血清白蛋白，可以賦與之結(jié)合的半抗原免疫原性。半抗原-載體可配成疫苗。
很多方法可能用來將上述疫苗制劑引入病人。包括而不限于口腔的、皮內(nèi)的、肌內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、靜脈內(nèi)的、皮下的、鼻內(nèi)的、透皮的、硬膜外的、肺的、胃的、腸的、直腸的、陰道的或尿道的途徑。治療方法使用本發(fā)明的重組活牛痘疫苗時(shí)，可優(yōu)選的通過牛痘病毒的天然感染途徑引入該制劑，即通過粘膜或表面，例如口的、鼻的、胃的、腸的、直腸的、陰道的或尿道的途徑，或者通過皮膚。為了誘導(dǎo)CTL應(yīng)答，可通過口或鼻的粘膜給藥途徑。另外，可利用肌內(nèi)或腹腔內(nèi)給藥途徑。人類患者給藥優(yōu)選劑量106-107PFU(噬斑形成單位)的耐冷重組牛痘病毒。
制劑中所用疫苗制劑的準(zhǔn)確劑量還取決于給藥途徑和患者的性質(zhì)，并應(yīng)根據(jù)專業(yè)人員的判斷以及按標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)的每個(gè)患者狀況來決定。有效的免疫量是足以對給予疫苗制劑的宿主中抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答的量。
需要后續(xù)或加強(qiáng)劑量時(shí)，可以選擇修飾的牛痘病毒例如MVA作為親代病毒，用于產(chǎn)生重組體。另外，其它病毒例如腺病毒、金絲雀痘病毒或亞基制劑可用于加強(qiáng)免疫?？梢岳寐?lián)合免疫方案，例如利用本發(fā)明重組牛痘病毒疫苗進(jìn)行免疫并用重組腺病毒疫苗加強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)免疫和/或癌癥的免疫治療。在這樣的實(shí)施方案中，初次免疫并用表達(dá)相同表位的不同病毒加強(qiáng)免疫以后，誘導(dǎo)強(qiáng)的繼發(fā)的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答(有關(guān)該免疫和加強(qiáng)的方法參見，例如Murata等人，Cellular Immunol.17396107)。例如，患者首先用本發(fā)明的包含表達(dá)表位(例如選擇的腫瘤相關(guān)抗原或其片段)的重組牛痘病毒疫苗制劑初次免疫。然后，例如21天以后，利用包含表達(dá)相同表位的牛痘以外的重組病毒對患者加強(qiáng)免疫。這種初次免疫繼之加強(qiáng)免疫，誘導(dǎo)強(qiáng)的繼發(fā)的T細(xì)胞應(yīng)答。這種初級并加強(qiáng)免疫方案將優(yōu)選用于治療患有表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原(例如C35)的腫瘤、轉(zhuǎn)移瘤或成瘤性生長的患者。
另一實(shí)施方案中，重組牛痘病毒可用作經(jīng)滅活的腫瘤細(xì)胞、包含C35抗原或其表位的亞單位疫苗、或其它重組病毒疫苗(例如腺病毒、金絲雀痘病毒或MVA)初級免疫后的加強(qiáng)免疫。
另一實(shí)施方案中，編碼C35表位或其片段的重組牛痘病毒可用于過繼性免疫療法，以活化與患者具有組織相容性并對C35抗原特異的T淋巴細(xì)胞(有關(guān)過繼性免疫療法參見，例如Rosenberg，美國專利No.4,690,915，1987年9月1日頒發(fā)；Zarling等人，美國專利號5,081,029，1992年1月14日頒發(fā))?？梢詮幕颊呋蚪M織相容性供者中分離這種T淋巴細(xì)胞。通過接觸本發(fā)明的重組牛痘病毒體外活化該T淋巴細(xì)胞。活化的T淋巴細(xì)胞擴(kuò)增并接種給患者，以傳遞針對C35抗原表位的T細(xì)胞免疫。
本發(fā)明也提供包含一種或多種容器的藥物包裝或試劑盒，容器中裝有一種或多種本發(fā)明的疫苗制劑成分。該容器帶有按管理藥品或生物制品生產(chǎn)、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定形式的通知，其反映該機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于人的生產(chǎn)、使用或銷售。
癌癥診斷和預(yù)后有兩種類型基因影響腫瘤發(fā)展。一類基因是通過DNA水平改變(例如突變)直接作用而影響癌癥表型，例如BRCA1、BRCA2和p53。另一類基因通過調(diào)節(jié)表達(dá)水平而影響表型。乳腺癌的發(fā)展以及繼發(fā)的惡性發(fā)展與多種兩類基因的改變有關(guān)。鑒定惡性乳腺中基因表達(dá)的量變化，如果特征充分，可得到新的分子標(biāo)志，其可用于人類乳腺癌的診斷和治療。
本發(fā)明者已經(jīng)鑒定了一個(gè)新的乳癌標(biāo)志C35，其在原發(fā)性浸潤的乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞中差異表達(dá)。正常乳腺上皮細(xì)胞中C35的低水平表達(dá)提示C35過表達(dá)表明乳腺癌惡性發(fā)展。有可能在某些其它組織類型，包括膀胱和肺的腫瘤中，C35也可能過表達(dá)。
本發(fā)明者已經(jīng)證明，具有癌癥的哺乳動物中的某些組織，與相應(yīng)的″標(biāo)準(zhǔn)″哺乳動物(沒有癌癥的相同物種哺乳動物)相比，C35蛋白質(zhì)及其編碼mRNA的表達(dá)水平顯著增強(qiáng)。另外，認(rèn)為與沒有癌癥的相同物種哺乳動物的血清相比，可以在生有癌癥的哺乳動物的某些體液(例如血清、血漿、尿和脊髓液)中檢測到水平提高的C35蛋白質(zhì)、或特異性針對其的抗體或淋巴細(xì)胞。
因此，本發(fā)明提供可用于腫瘤診斷的診斷方法，其中包括測定哺乳動物細(xì)胞或體液中編碼C35蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)水平，并將該基因表達(dá)水平與標(biāo)準(zhǔn)C35基因表達(dá)水平相比較，基因表達(dá)水平超過標(biāo)準(zhǔn)則預(yù)示某些腫瘤。另外，可以確定血液或其它體液中C35蛋白質(zhì)或C35多肽特異性的抗體或淋巴細(xì)胞的表達(dá)水平，與C35特異性的抗體或淋巴細(xì)胞的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)相比較。
如果已經(jīng)按常規(guī)方法進(jìn)行腫瘤診斷，本發(fā)明可用于預(yù)后指示，相對于基因表達(dá)水平低的患者，顯示C35基因表達(dá)增強(qiáng)的患者臨床結(jié)果更差。
通過″測定編碼C35蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)水平″，意在直接(例如確定或評價(jià)絕對的蛋白質(zhì)或mRNA水平)或相對(例如與另一份生物樣品的C35蛋白質(zhì)或mRNA水平相比)、定性或定量測定或評價(jià)一份生物樣品中C35蛋白質(zhì)或其編碼C35蛋白質(zhì)的mRNA的水平。
優(yōu)選地，測定或者評價(jià)一份生物樣品的C35蛋白質(zhì)水平或mRNA水平，并與標(biāo)準(zhǔn)的C35蛋白質(zhì)水平或mRNA水平相比較，該標(biāo)準(zhǔn)取自從沒有癌癥的個(gè)體獲得的另一份生物樣品。本領(lǐng)域應(yīng)當(dāng)理解，一旦標(biāo)準(zhǔn)的C35蛋白質(zhì)或mRNA水平已知，其可以重復(fù)用作比較標(biāo)準(zhǔn)。
″生物樣品″是指從包含C35蛋白質(zhì)或mRNA的個(gè)體、細(xì)胞系、組織培養(yǎng)物或其它來源獲得的任何生物樣品。生物樣品包括含有分泌的成熟C35蛋白質(zhì)的哺乳動物體液(例如血清、血漿、尿、滑液和脊液)，以及可能含有前體或成熟形式C35的卵巢、前列腺、心臟、胎盤、胰腺、肝、脾、肺、乳腺、膀胱和臍帶組織。
本發(fā)明可用于檢測哺乳動物的癌癥。本發(fā)明特別用于診斷哺乳動物中下列類型的癌癥乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、骨癌、肝癌、肺癌、胰腺癌和脾癌。優(yōu)選哺乳動物包括猴、猿、貓、狗、牛、豬、馬、兔和人。特別優(yōu)選人。
利用Chomczynski和Sacchi，Anal.Biochein.162156-159(1987)所述的硫氰酸胍-酚-氯仿一步法可提取生物樣品的細(xì)胞總RNA。然后利用任何合適方法測定編碼C35蛋白質(zhì)mRNA的水平。其中包括Northern印跡分析(Harada等人，Cell 63303-312(1990))，S1核酸酶圖譜(Fujita等人，Cell 49357-367(1987))、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、反轉(zhuǎn)錄結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)(Makino等人，Technique2295-301(1990))，以及反轉(zhuǎn)錄結(jié)合連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-LCR)。
可利用基于抗體的技術(shù)測定生物樣品的C35蛋白質(zhì)水平。例如，可以利用經(jīng)典的免疫組化方法研究C35蛋白質(zhì)在組織中的表達(dá)(Jalkanen，M.，等人，J.Cell.Biol.101976-985(1985)；Jalkanen，M.等人，J.Cell.Biol.1053087-3096(1987))。
可用于檢測C35蛋白質(zhì)表達(dá)的基于抗體的其它方法包括免疫測定技術(shù)，例如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、ELISPOT和放射免疫測定(RIA)。
合適的標(biāo)記為本領(lǐng)域已知，并包括酶標(biāo)記，例如葡萄糖氧化酶，以及放射性同位素，例如碘(1251，121I)，碳(14C)，硫(35S)，氚(3H)，銦(112In)，和锝(99mTc)，熒光標(biāo)記例如熒光素和羅丹明，以及生物素。
根據(jù)本領(lǐng)域已知方法，在通過抗原呈遞細(xì)胞呈遞的C35活化以后，可以在多種增殖和淋巴因子分泌測定中檢測C35特異性的T細(xì)胞。結(jié)合可溶性MHC分子的C35肽表位的四聚體復(fù)合物，可以用于直接染色和計(jì)數(shù)細(xì)胞群體中的C35特異性T細(xì)胞(Lee，P.P.等人，Nature Medicine5677-85(1999)在此全文引入以供參考)。
除了測定生物樣品中的分泌蛋白質(zhì)水平，還可以利用造影體內(nèi)檢測蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)體內(nèi)造影的抗體標(biāo)記或標(biāo)志包括那些可通過X射線照相術(shù)、NMR或ESR檢測的標(biāo)記或標(biāo)志。X射線照相術(shù)的合適標(biāo)記包括放射性同位素(例如鋇或銫)，其發(fā)射可檢測的射線，而不明顯對患者有害。NMR和ESR的合適標(biāo)志包括具有可檢測的特征自旋的標(biāo)志，例如氘，其可通過標(biāo)記有關(guān)雜交瘤的營養(yǎng)物，而摻入到抗體。
將利用可檢測的合適造影成分(例如放射性同位素131I，112In，99mTc)、不透射線物質(zhì)或核磁共振可檢測物質(zhì)標(biāo)記蛋白質(zhì)特異性抗體或抗體片段，導(dǎo)入(例如非腸道、皮下或腹膜內(nèi))哺乳動物中。本領(lǐng)域應(yīng)當(dāng)理解，患者大小及使用的成像系統(tǒng)將決定產(chǎn)生診斷造影所需造影成分的量。就放射性同位素成分而言，人類患者注射的放射性量正常為大約5-20毫居99mTc。然后該標(biāo)記的抗體或抗體片段優(yōu)先積累在包含特定蛋白質(zhì)的細(xì)胞部位。體內(nèi)腫瘤造影描述見S.W.Burchiel等人，″Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and TheirFragments.″(Tumor imagingThe Radiochemical Detection ofCancer第13章，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes，eds.，MassonPublishing Inc.(1982).)融合蛋白質(zhì)任何C35多肽可用于產(chǎn)生融合蛋白質(zhì)。例如，融合另一種蛋白質(zhì)的C35多肽可用作抗原性標(biāo)記。針對C35多肽的抗體通過與C35結(jié)合，可用于間接檢測另一種蛋白質(zhì)。此外，由于分泌型蛋白質(zhì)以通行信號為基礎(chǔ)靶向細(xì)胞部位，C35多肽一旦與其它蛋白質(zhì)融合，可用作靶向分子。
可與C35多肽融合的結(jié)構(gòu)域，其例子不但包括異源信號序列，還包括其它異源功能區(qū)。不一定需要直接融合，可以通過接頭序列實(shí)現(xiàn)。
某些優(yōu)選實(shí)施方案中，可構(gòu)建包括另外的N端和/或C端氨基酸殘基的C35融合多肽。特別是此處公開的任何N-端或C-端缺失的C35多肽，可以通過N-端包含另外的氨基酸殘基而制備C35融合多肽。此外，C35融合多肽可包括將另外的N端和/或C端氨基酸殘基，與含有上述任何組合的N端和C端缺失的C35多肽融合。
此外，可以改造融合蛋白質(zhì)，以改善C35多肽的特性。例如，另外的氨基酸區(qū)域，特別是帶電荷的氨基酸，可以添加到C35多肽的N端，以改善在從宿主細(xì)胞中純化、或后續(xù)處理和保存期間的穩(wěn)定性和持久性。C35多肽也可添加肽成分以協(xié)助純化。在C35多肽目的制劑之前，除去這些區(qū)域。添加肽成分以便于多肽處理，是本領(lǐng)域熟悉的常規(guī)技術(shù)。
此外，C35多肽，包括片段和特定表位，能與免疫球蛋白(IgG)恒定結(jié)構(gòu)域的一部分結(jié)合，產(chǎn)生嵌合多肽。這些融合蛋白質(zhì)促進(jìn)純化，并且體內(nèi)半1衰期增加。一個(gè)報(bào)告的例子描述了由人CD4多肽的前兩個(gè)結(jié)構(gòu)域以及哺乳動物免疫球蛋白重鏈或輕鏈恒定區(qū)的各種結(jié)構(gòu)域組成的嵌合蛋白質(zhì)。(EP A 394,827；Traunecker等人，Nature 33184-86(1988).)具有二硫鍵連接的二聚體結(jié)構(gòu)(由于IgG)的融合蛋白質(zhì)，與單體的分泌型蛋白質(zhì)或單獨(dú)的蛋白質(zhì)片段相比，在結(jié)合并中和其它分子方面也更為有效。(Fountoulakis等人，J.Biochem.2703958-3964(1995).)類似地，EP-A-O 464 533(加拿大副本2045869)公開了包含免疫球蛋白分子恒定區(qū)各部分連同另一種人類蛋白質(zhì)或其部分的融合蛋白質(zhì)。多數(shù)情況下，融合蛋白質(zhì)的Fc部分有利于治療和診斷，因此可以導(dǎo)致，例如改善的藥物動力學(xué)特性。(EP-A 0232 262.)另外，在融合蛋白質(zhì)表達(dá)、檢測和純化后，可能希望缺失Fc部分。例如，如果融合蛋白質(zhì)用作免疫的抗原，F(xiàn)c部分可能妨礙治療和診斷。例如在藥物研究中，已將人蛋白質(zhì)如hIL-5，與Fc部分融合，目的是進(jìn)行高通量篩選分析，以鑒定hIL-5的拮抗劑。(參見D.Bennett等人，J.MolecularRecognition 852-58(1995)；K.Johanson等人，J.Biol.Chem.2709459-9471(1995).)此外，可將C35多肽融合標(biāo)志序列，例如協(xié)助C35純化的肽。優(yōu)選的實(shí)施方案中，標(biāo)志氨基酸序列是6個(gè)組氨酸的肽，例如pQE載體(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)提供的標(biāo)記，其中許多是商品化的。例如Gentz等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86821-824(1989)所述的便于純化融合蛋白質(zhì)的六聚組氨酸。用于純化的另一肽標(biāo)記，″HA″標(biāo)簽，對應(yīng)于來自流感血細(xì)胞凝集素蛋白質(zhì)的表位。(Wilson等人，Cell 37767 (1984).)因此，利用C35多核苷酸或C35多肽，能夠制備上述任何融合體。
載體、宿主細(xì)胞和蛋白質(zhì)制備本發(fā)明也涉及包含C35多核苷酸的載體、宿主細(xì)胞和通過重組技術(shù)制備C35多肽。載體可以是，例如噬菌體、質(zhì)粒、病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以是復(fù)制活性的或復(fù)制缺陷的。后者情況下，通常病毒繁殖只發(fā)生在互補(bǔ)的宿主細(xì)胞中。
C35多核苷酸可與包含選擇標(biāo)志的載體相連，以在宿主中繁殖。質(zhì)粒載體一般在沉淀(例如磷酸鈣沉淀)或具有帶電脂類的復(fù)合物中導(dǎo)入。如果載體是病毒，其可能利用合適的包裝細(xì)胞系體外包裝，然后轉(zhuǎn)導(dǎo)到宿主細(xì)胞。
C35多核苷酸插入片段應(yīng)該可操作地連接合適的啟動子，例如噬菌體λPL啟動子、E.coli lac、tip、phoA和tac啟動子、SV40早期和晚期啟動子以及逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR啟動子，僅舉幾個(gè)例子。
其它合適的啟動子為熟練技術(shù)人員所知。表達(dá)構(gòu)建體另外包含轉(zhuǎn)錄起始、終止位點(diǎn)，以及轉(zhuǎn)錄區(qū)中用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建體表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物編碼部分優(yōu)選包括開頭的翻譯起始密碼子，以及在所翻譯多肽末端適當(dāng)位置的終止密碼子(UAA、UGA或UAG)。
如上表明，表達(dá)載體優(yōu)選包括至少一個(gè)選擇標(biāo)志。這種標(biāo)志包括用于真核細(xì)胞培養(yǎng)的二氫葉酸還原酶、G418或新霉素抗性，以及用于E.coli和其它細(xì)菌培養(yǎng)的四環(huán)素、卡那霉素或氨芐青霉素抗性基因。合適宿主的典型例子包括而不限于細(xì)菌細(xì)胞，例如E.coli、鏈霉菌和鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞例如果蠅S2和夜蛾Sf9細(xì)胞；動物細(xì)胞例如CHO、COS、293和Bowes黑素瘤細(xì)胞；以及植物細(xì)胞。用于上述宿主細(xì)胞的合適培養(yǎng)基和條件為本領(lǐng)域已知。
載體之中優(yōu)選供細(xì)菌使用載體，包括pHE-4(及其變體)；來自QIAGEN，Inc.的pQE70，pQE60和pQE-9；來自Stratagene CloningSystems，Inc.的pBluescript載體、Phagescript載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A；以及來自Pharmacia Biotech，Inc.的ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRITS。其中優(yōu)選的真核載體是來自Stratagene的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTI和pSG；以及來自Pharmacia的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。其它合適的載體為熟練技術(shù)人員所易見。優(yōu)選載體為痘病毒載體，特別是例如美國專利申請No.08/935,377所述的痘苗病毒載體，在此全文引入以供參考。
可利用磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、陽離子脂類介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染或其它方法，將構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。許多標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)手冊描述了這些方法，例如Davis等人Basic Methods InMolecular Biology(1986)。
利用眾所周知的方法，包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸萃取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和凝集素層析，從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收并純化C35多肽。最優(yōu)選高效液相層析(″HPLC″)用于純化。
C35多肽還可以回收自天然來源的純化產(chǎn)物，包括體液、組織和細(xì)胞，不論是直接分離的還是培養(yǎng)的；化學(xué)合成方法的產(chǎn)物；以及利用重組技術(shù)從原核或真核宿主(包括例如細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)制備的產(chǎn)物。C35多肽根據(jù)重組制備方法所用的宿主，可以是糖基化或非糖基化。此外，C35多肽也可包括最初修飾的甲硫氨酸殘基，有時(shí)是宿主介導(dǎo)加工的結(jié)果。因此，本領(lǐng)域公知，所有真核細(xì)胞中，翻譯起始密碼子編碼的N端甲硫氨酸一般在翻譯后從任何蛋白質(zhì)中高效去除。而大多數(shù)原核生物也高效去除大部分蛋白質(zhì)的N端甲硫氨酸，有些蛋白質(zhì)原核去除過程的效率低，這取決于共價(jià)連接于N端甲硫氨酸的氨基酸的性質(zhì)。
除了包含具有此處所述載體構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，本發(fā)明還包含原發(fā)、繼發(fā)以及永生的脊椎動物特別是哺乳動物來源的宿主細(xì)胞，其已經(jīng)改造以缺失或置換內(nèi)源性遺傳物質(zhì)(例如C35編碼序列)，和/或包括與實(shí)施本發(fā)明的C35多核苷酸可操作性連接的遺傳物質(zhì)(例如異源多核苷酸序列)，以及活化、改變和/或擴(kuò)增內(nèi)源性C35多核苷酸的遺傳物質(zhì)。例如，可用本領(lǐng)域已知的技術(shù)通過同源重組可操作地連接異源控制區(qū)(例如啟動子和/或增強(qiáng)子)和內(nèi)源性C35多核苷酸序列(參見例如美國專利No.5,641,670，1997年6月24日頒發(fā)；國際公開No.WO 96/29411，1996年9月26日公布；國際公開No.WO 94/12650，1994年8月4日公布；Koller等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935(1989)；以及Zijlstra等人，Nature 342435438(1989)，每個(gè)公開內(nèi)容全文引入以供參考。)。
經(jīng)一般描述本發(fā)明，并通過參考下列提供的實(shí)施例，將更容易理解本發(fā)明，下列實(shí)施例是用來說明而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1人乳腺癌中C35的差異表達(dá)本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了代表C35基因的全長cDNA，其在人乳腺癌和膀胱癌中差異表達(dá)(圖1)。利用poly-A RNA消減雜交，最初從來自同一原發(fā)和浸潤的乳腺導(dǎo)管癌病人的腫瘤和正常乳腺上皮細(xì)胞系分離到348bp C35 DNA片段。(Band，V.等人，Cancer Res.507351-7357(1990)。利用根據(jù)該序列及重疊的EST序列(登錄號W57569)設(shè)計(jì)的引物，從SKBR3乳腺腫瘤細(xì)胞系(ATCC HTB-19)擴(kuò)增和克隆包括全長C35編碼序列的cDNA。除348bp編碼序列之外，該C35 cDNA包括167bp 3’非翻譯區(qū)。
圖2A比較了來源于正常乳腺上皮細(xì)胞、大約一年后從同一患者分離的兩株原發(fā)乳腺腫瘤結(jié)節(jié)以及兩株轉(zhuǎn)移性肺腫瘤結(jié)節(jié)細(xì)胞系中的poly-A RNA的C35克隆表達(dá)水平，證明了C35序列的差異表達(dá)(Band，V.等人，Cancer Res.507351-7357(1990))。定量分析表明，與正常乳腺上皮細(xì)胞相比，該序列在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)水平高10倍以上。圖2BNorthern雜交結(jié)果證明圖中其它正常組織中表達(dá)水平低。即使正常組織poly-A RNA上樣量三倍于腫瘤細(xì)胞系，并同等曝光15小時(shí)，仍幾乎沒有檢測到C35同源性RNA表達(dá)。只是在曝光延長96小時(shí)以后，在正常的脾和腎組織中檢測到低水平表達(dá)的某些同源序列。圖2C所示來自不同患者的三個(gè)原發(fā)浸潤的乳腺導(dǎo)管癌和正常乳腺上皮細(xì)胞樣品poly-ARNA的C35同源序列的表達(dá)分析。與正常乳腺上皮細(xì)胞相比，三個(gè)原發(fā)乳腺腫瘤中的兩個(gè)的C35同源性序列過表達(dá)45和25倍。
本發(fā)明人先前分析了在幾個(gè)獨(dú)立來源的鼠腫瘤中表達(dá)、而在正常小鼠組織中降低水平表達(dá)的免疫保護(hù)性腫瘤抗原。(參見2000年3月28日申請的美國專利，題為″Methods of Producing a Library andMethods of Directly Selecting Cells Expressing Inserts ofInterest″，此處全文引入以供參考)。在這種情況下，腫瘤和正常組織表達(dá)水平之間9倍的差異與誘導(dǎo)免疫保護(hù)性腫瘤特異應(yīng)答有關(guān)。如上所述，某些人類乳腺癌的C35表達(dá)水平相對于正常組織超過9倍，提示在這些個(gè)體中C35也可能對乳腺癌是免疫保護(hù)性的。
實(shí)施例2C35特異性CTL細(xì)胞溶解C35陽性的乳腺腫瘤細(xì)胞盡管如同C35一樣，某種基因產(chǎn)物可能在腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，但是只有在來源于該基因產(chǎn)物的肽能夠被加工并與腫瘤細(xì)胞MHC分子聯(lián)合被呈遞時(shí)，其才在免疫學(xué)上相關(guān)?？梢韵胂?，對于任何給定的基因產(chǎn)物，可能在細(xì)胞降解過程中沒有產(chǎn)生符合與腫瘤表達(dá)的MHC分子相結(jié)合的條件的肽，或者即使產(chǎn)生這種肽，轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷或其它腫瘤肽對MHC分子的競爭會阻止呈遞該特定基因產(chǎn)物的任何肽。即使相關(guān)腫瘤肽被加工并與腫瘤細(xì)胞的人類MHC聯(lián)合被呈遞，但是，在任何情況下，必須確定所有組成成分中是否充分展示與這些肽反應(yīng)的人類T細(xì)胞，或者是否也許由于其它非同源性正常組織表達(dá)相同或相關(guān)抗原而使T細(xì)胞耐受。因此對于這兩方面原因，有必要證實(shí)MHC限制性的人腫瘤抗原特異性T細(xì)胞能夠由C35誘導(dǎo)，而且其確實(shí)與人腫瘤細(xì)胞交叉反應(yīng)。利用重組C35或自身抗原呈遞細(xì)胞呈遞的重組C35肽體外刺激人T細(xì)胞應(yīng)答，能夠獲得這方面的相關(guān)信息。
評價(jià)對重組基因產(chǎn)物的T細(xì)胞應(yīng)答的主要技術(shù)問題在于，針對表達(dá)載體的強(qiáng)免疫應(yīng)答可能阻斷或隱藏重組體特異性的應(yīng)答。對于可能需要多輪體外刺激的初級應(yīng)答，這尤其是個(gè)問題。為使載體特異性應(yīng)答減到最低程度，有可能利用由同一基因產(chǎn)物不同病毒載體重組體感染的抗原呈遞細(xì)胞交替刺激。合適的載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和痘病毒。
利用Ficoll-Paque純化人PBMC，經(jīng)唾液酸苷酶處理的羊紅細(xì)胞玫瑰花結(jié)試驗(yàn)分離單核細(xì)胞(紅細(xì)胞玫瑰花結(jié)陰性，ER-)和T淋巴細(xì)胞(ER+)。ER-組分在含rhGM-CSF(1000U/ml)和rhIL-4(1000U/ml)的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天(每隔一天補(bǔ)加細(xì)胞因子)，產(chǎn)生樹突狀細(xì)胞。第7天，未成熟的樹突狀細(xì)胞用表達(dá)人C35的逆轉(zhuǎn)錄病毒于聚凝胺(1ug/ml)存在下轉(zhuǎn)導(dǎo)6小時(shí)。洗滌細(xì)胞，在12.5％單核細(xì)胞條件培養(yǎng)基、1000U/ml rhGM-CSF和1000rhU/ml IL-4以及1％自體血清存在下，于成熟條件下溫育4天。此時(shí)，樹突狀細(xì)胞與自體T淋巴細(xì)胞(冷凍保存的ER+組分)按1個(gè)DC50個(gè)T細(xì)胞比例溫育14天。存活T細(xì)胞用經(jīng)照射的自體EBV-B B細(xì)胞(在細(xì)胞因子IL-2(20U/ml)、IL-12(20U/ml)和IL-18(10ng/ml)存在下，用表達(dá)人C35的牛痘重組體按感染復(fù)數(shù)為1感染過夜(16小時(shí))再刺激。細(xì)胞在IL-2和IL-7(10ng/ml)存在下，用攜帶C35的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的自體EBV-B細(xì)胞，另外再刺激兩次。總共4次刺激后，利用5000個(gè)靶細(xì)胞/孔、測定4小時(shí)51Cr釋放分析測定細(xì)胞毒活性。下表8所示結(jié)果證明，C35刺激的T細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒活性針對C35表達(dá)水平相對提高的21NT乳腺腫瘤細(xì)胞，而不針對與未轉(zhuǎn)化正常上皮細(xì)胞一樣低水平表達(dá)C35的MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞。
表8C35特異性CTL細(xì)胞溶解C35陽性的乳腺腫瘤細(xì)胞靶細(xì)胞 E∶THLA單倍型 20∶110∶1(效應(yīng)子A2，A11；B8，B35) (特異性裂解％)自體A2，A11；B8，B35 21EBV-BMDA-MB-231C35低(lx)A2；B8 3121NTC35高(12x) A26，A31；B35，B38 22 10K562 20實(shí)施例3乳腺癌細(xì)胞膜上的C35表達(dá)為了確定C35多肽產(chǎn)物是否于腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)，制備了C35特異性的抗血清。用編碼人C35逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的同系Line 1小鼠腫瘤細(xì)胞免疫BALB/c小鼠。兩次或多次免疫小鼠后，取血。利用免疫血清，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測C35蛋白質(zhì)在三種乳腺腫瘤細(xì)胞系(代表Northern印跡中C35轉(zhuǎn)錄物的高(21NT)、中(SKBR3)和低(MDA-MB-231)表達(dá)水平)表面的表達(dá)(參見圖4)。1×105乳腺腫瘤細(xì)胞用3.5ul C35特異性抗血清或放血前BALB/c對照血清染色。溫育30分鐘后，細(xì)胞用染色緩沖液(PAB)洗滌兩次，與FITC-山羊抗小鼠IgG(1ug/樣品)溫育30分鐘。洗滌樣品，用EPICS Elite流式細(xì)胞儀分析。圖4所示結(jié)果表明，特異性免疫血清識別的細(xì)胞膜C35抗原表達(dá)水平，在腫瘤細(xì)胞系21NT中較高(圖A)，腫瘤細(xì)胞系SKBR3中中等(圖B)，腫瘤細(xì)胞系MDA-MB-231中檢測不到(圖C)?？贵w與C35轉(zhuǎn)錄物表達(dá)水平提高的腫瘤細(xì)胞膜的高反應(yīng)性提示，C35特異性抗體可作為該基因產(chǎn)物過表達(dá)的大量乳腺癌的有效免疫治療劑(參見圖2和3)。
實(shí)施例4失調(diào)的編碼共有鼠腫瘤排斥抗原的核糖體蛋白質(zhì)L3基因本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了抗原研究的新技術(shù)，其可以從構(gòu)建在痘病毒中的cDNA文庫中選擇編碼CTL表位的基因。本發(fā)明人已經(jīng)利用該技術(shù)確定了一個(gè)共有的鼠腫瘤抗原，其由核糖體蛋白質(zhì)L3基因的另一等位基因編碼。在正常組織(包括胸腺)中，該免疫原性L3基因表達(dá)水平顯著，雖然有所降低。用該免疫原性L3 cDNA的牛痘重組體免疫接種，誘導(dǎo)了抗腫瘤攻擊的保護(hù)性免疫。令人特別感興趣的是，看家基因的失調(diào)等位基因能作為免疫保護(hù)性抗原，并且胸腺表達(dá)不妨礙上調(diào)的腫瘤產(chǎn)物的免疫原性。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)，對自身蛋白質(zhì)的耐受不是絕對的，而必須根據(jù)表達(dá)水平來確定的。所述核糖體蛋白質(zhì)可代表一類腫瘤共有抗原，它們起源于自身蛋白質(zhì)的表達(dá)失調(diào)，但不影響正常組織的免疫耐受。這種抗原可能適于重要器官癌癥的免疫治療。
方法利用Perfect RNA Total RNA Isolation Kit(5 Prime 3 Prime，Inc.，Boulder，CO)分離BCA 39腫瘤細(xì)胞的總RNA。利用Dynabeads(Dynal，Lake Success，NY)從總RNA中分離Poly A+mRNA。利用Great Lengths cDNA Synthesis Kit(Clontech，Palo Alto，CA)將2ug poly A+mRNA轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈cDNA。然后將該雙鏈cDNA插入牛痘病毒載體v7.5/tk。
用照射過(6,500cGy)的2×106BCA 34細(xì)胞腹膜內(nèi)免疫Balb/cByJ(Jackson Labs)小鼠。兩周以后，小鼠皮下注射照射的2×106BCA 34細(xì)胞，加強(qiáng)免疫。第二次免疫一周以后，收集脾細(xì)胞，分成12份，在12孔板中與照射(10,000cGy)的、經(jīng)絲裂霉素C處理的BCA 34細(xì)胞(6×105/孔)培養(yǎng)。每周一次利用Lympholyte-M(AccurateChemical，Westbury，NY)純化存活的T細(xì)胞，在12孔板中培養(yǎng)(1.5×106T細(xì)胞/孔)。每孔還加入照射過(5000cGy)的4×106Balb/c脾細(xì)胞，連同照射過的、經(jīng)絲裂霉素C處理的6×105BCA 34細(xì)胞。
將編碼充分鑒定的、結(jié)合H-2Kb為免疫顯性的卵清蛋白257-264肽(SIINFEKL)的特定牛痘重組體，用非重組病毒稀釋，使其最初由0.2％、0.01％或0.001％的總病毒pfu組成。用該病毒混合物按m.o.i.＝1(大約5×105細(xì)胞/孔)感染貼壁的單層MC57G細(xì)胞(H-2b)。感染12小時(shí)以后，加入卵清蛋白肽特異性CTL(通過用免疫顯性的SIINFEKL肽體外重復(fù)刺激已接觸卵清蛋白抗原的脾T細(xì)胞得到)。溫育期間，特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞以被重組顆粒(表達(dá)卵清蛋白肽)感染的貼壁細(xì)胞為目標(biāo)，進(jìn)行細(xì)胞溶解事件，使其從單細(xì)胞層上釋放。與CTL溫育后，溫和洗滌單細(xì)胞層，分別收集漂浮細(xì)胞和剩余的貼壁細(xì)胞。測定從各個(gè)細(xì)胞群體提取的病毒的滴度，確定重組(BRdU抗性)病毒pfu的頻率。然后將從漂浮細(xì)胞提取的病毒用于與新鮮的貼壁MC57G細(xì)胞和卵清蛋白肽特異性CTL一起，注入另一富集周期?？梢杂^察到富集以后的VVova超過病毒總數(shù)的10％，如果后續(xù)周期的m.o.i.從1減少到0.1，可以加速重組病毒的進(jìn)一步富集。
利用牛痘BCA39 cDNA文庫按moi＝1.0感染12孔板中長滿的BCN單層細(xì)胞。感染12小時(shí)后，單細(xì)胞層用培養(yǎng)基洗滌3次，每孔加入250μl體積的2.5×106CTL。T細(xì)胞和靶細(xì)胞37℃溫育4小時(shí)。溫育后收集上清，用250μl培養(yǎng)基溫和洗滌單細(xì)胞層3次。通過冷凍/融化釋放病毒，利用BSC1細(xì)胞噬斑分析確定滴度。在12孔板的一個(gè)孔中，選擇的病毒群體(接受特異性T細(xì)胞的培養(yǎng)物中的漂浮細(xì)胞)用BSC1細(xì)胞擴(kuò)增2天。然后收集病毒，測定滴度。此病毒原液經(jīng)歷另外三個(gè)富集周期。在下一個(gè)周期之前，選擇的病毒群體不進(jìn)行擴(kuò)增。
將第四輪富集周期的病毒分成40份混合物，每份混合物5個(gè)pfu。在96孔板中用BSC1細(xì)胞擴(kuò)增每份混合物，每孔1份混合物。4天后收集病毒(P1)，用于在96孔板中按moi＝5感染BCN單細(xì)胞層，每孔1份混合物。用vNotI/tk按moi＝5感染BCN單細(xì)胞層，作為對照(Merschlinsky等人，Virology 190522(1992))。感染5小時(shí)后，每孔加入2×104洗過的CTL。每孔終體積225μl。細(xì)胞37℃溫育18小時(shí)。然后離心沉淀細(xì)胞，收集150μl上清液，ELISA檢測IFNg。40份5個(gè)pfu的混合物中，27份陽性，能夠刺激CTL。Poisson分析提示，特定重組體的富集超過20％。從5份陽性混合物中挑選各個(gè)克隆，如上所述進(jìn)行分析。
在6孔板中，用v7.5/tk、vF5.8或vH2.16按moi＝1.0感染B/C.N單細(xì)胞層。感染14小時(shí)后，收集細(xì)胞和對照靶細(xì)胞B/C.N、BCA 34和BCA 39。靶細(xì)胞用100uCi51Cr(Dupont，Boston，MA)37℃標(biāo)記1小時(shí)，在96孔圓底板中每孔加入104細(xì)胞，一式四份。腫瘤特異性CTL按指定比例加入靶細(xì)胞中。細(xì)胞37℃溫育4小時(shí)。收集上清液，測定51Cr釋放量。將靶細(xì)胞與培養(yǎng)基單獨(dú)溫育，得到自發(fā)釋放量。將靶細(xì)胞與5％Triton×100溫育，測定最大釋放量。特異性溶解百分比計(jì)算公式為特異性溶解％＝((實(shí)驗(yàn)釋放量-自發(fā)釋放量)/(最大釋放量-自發(fā)釋放量))×100。在每種情況下，上述公式使用四個(gè)孔的平均值。
利用dT引物和Superscript II Reverse Transcriptase(BRL，Gaithersburg，MD)，將2ug總RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA。以cDNA為模板，利用L3特異性引物L(fēng)3.F1.S(CGGCGAGATGTCTCACAGGA)和L3.F1.AS(ACCCCACCATCTGCACAAAG)、以及Klentaq DNA PolymeraseMix(Clontech)，在終體積20ul進(jìn)行PCR。反應(yīng)條件包括開始的變性步驟94℃3分鐘，然后94℃30秒、60℃30秒、68℃2分鐘，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物包含L3位點(diǎn)3-1252的區(qū)域。PCR產(chǎn)物利用Centricon 100柱(Amicon，Beverly，MA)純化，用Sau3AI消化，3％瓊脂糖/溴化乙錠凝膠分離。
成年雌性Balb/cByJ小鼠(每組兩只小鼠)皮下注射5×106pfu的vH2.16或v7.5/tk進(jìn)行免疫。免疫7天后，收集脾細(xì)胞，在12孔板中與1μM肽L348-56(I54)一同培養(yǎng)。7天后，利用Lympholyte-M純化存活的T細(xì)胞，在12孔板每孔中加入1×106T細(xì)胞、1μM肽以及4×106照射(5000cGy)的Balb/c脾細(xì)胞。
成年雌性Balb/cByJ小鼠皮下注射10×106pfu的vH2.16、vPKIa、v7.5/tk或磷酸鹽緩沖鹽溶液，進(jìn)行免疫。21天后進(jìn)行繼發(fā)免疫。免疫21天(只進(jìn)行初級免疫)或14天后，皮下注射2×105BCA 34細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤激發(fā)小鼠。
結(jié)果和討論幾種自身蛋白質(zhì)能夠被免疫T細(xì)胞識別為腫瘤抗原的事實(shí)推進(jìn)了開發(fā)廣泛有效的腫瘤疫苗的前景(Van den Eynde等人，J Exp.Med.1731373(1991)；M.B.Bloom等人，J Exp.Med.185453(1997)；Van Der Bruggen等人，Science 2541643(1991)；Gaugler等人，J.Exp.Med.179921(1994)；Boel等人，Immunity 2167(1995)；Van Den Eynde等人，J.Exp.Med.182689(1995)；Kawakami等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.913515(1994)；Kawakami等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.916458(1994)；Brichard等人，J.Exp.Med.178489(1993))。這種正常、未突變的基因產(chǎn)物可作為不同個(gè)體中某些類型腫瘤的共同靶抗原。目前，用這種共有腫瘤抗原免疫接種后，誘導(dǎo)保護(hù)性免疫的臨床證據(jù)很有限(Marchand等人，Int.J Cancer 80219(1999)；Rosenberg等人，Nat.Med.4321(1998)；Overwijk等人，Proc.Natl.Acad.Sci.962982(1999)；Brandle等人，Eur.J.Immunol.284010(1998))。此外，完全不清楚對這些自身蛋白質(zhì)的T細(xì)胞應(yīng)答是代表免疫耐受的意外故障，還是腫瘤細(xì)胞中自身蛋白質(zhì)表達(dá)的質(zhì)變或量變的結(jié)果。后一種情況下，能夠保持正常組織的耐受性，并且疫苗誘導(dǎo)的對自身蛋白質(zhì)(其在腫瘤中的表達(dá)被系統(tǒng)性改變)的免疫力，甚至可能適用于重要器官的癌癥。
本發(fā)明人已經(jīng)表明，在鼠多種腫瘤的轉(zhuǎn)化過程中系統(tǒng)性失調(diào)的核糖體蛋白質(zhì)等位基因是一種腫瘤排斥抗原，免疫原性的主要關(guān)聯(lián)是相對于正常組織和胸腺，腫瘤中表達(dá)量的變化顯著。
本發(fā)明人先前曾報(bào)道，在三個(gè)獨(dú)立衍生的鼠腫瘤細(xì)胞系間可誘導(dǎo)交叉保護(hù)性免疫(Sahasrabudhe等人，J.Immunology 1516302(1993))。通過體外誘變獨(dú)立傳代培養(yǎng)的B/C.N細(xì)胞系(來源于Balb/c胚胎的克隆的、永生化的、貼壁依賴性的、接觸抑制的、非致瘤性成纖維細(xì)胞系)得到上述腫瘤BCA 22、BCA 34和BCA 39(Collins等人，Nature 299169(1982)；Lin等人，JNCI741025(1985))。引人注目的是，用其中任何腫瘤細(xì)胞系(B/C.N除外)免疫接種，可提供針對同源腫瘤細(xì)胞攻擊以及針對異源腫瘤細(xì)胞系攻擊的保護(hù)。用三個(gè)腫瘤細(xì)胞系中的任何一個(gè)免疫以后，能夠產(chǎn)生CD8+細(xì)胞溶解性T淋巴細(xì)胞(CTL)系及克隆，它們在體外表現(xiàn)特異性針對這三個(gè)腫瘤的交叉反應(yīng)性，而不針對衍生它們的非致瘤性B/C.N細(xì)胞。
為了從該腫瘤共有抗原的免疫學(xué)定義轉(zhuǎn)到分子定義，本發(fā)明人開發(fā)了新的有效方法，用于鑒定編碼CTL靶表位的基因。此方法中，在修飾的痘苗病毒表達(dá)載體中構(gòu)建BCA 39腫瘤細(xì)胞系的cDNA文庫。(Merchlinsky等人，Virology 238444(1997)；E.Smith等人，撰寫中)。用該文庫的500,000個(gè)噬斑形成單位(pfu)來感染抗原陰性的B/C.N細(xì)胞的單細(xì)胞層，感染復(fù)數(shù)(moi)為1。感染12小時(shí)以后，按照標(biāo)準(zhǔn)51Cr釋放分析中引起大約50％溶解的效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例，將BCA34腫瘤特異性的CTL加入靶細(xì)胞單細(xì)胞層。使用異源BCA 34腫瘤細(xì)胞系特異性的CTL，以便于協(xié)助鑒定這兩株腫瘤細(xì)胞系的共有抗原。因?yàn)橘N壁是能量依賴性過程，可以預(yù)計(jì)，經(jīng)歷CTL介導(dǎo)的溶解事件的細(xì)胞將從單細(xì)胞層上脫落，并能夠從上清液中回收。通過從發(fā)生細(xì)胞介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞毒性(CML)的漂浮細(xì)胞中收獲病毒，有可能富集使宿主細(xì)胞對溶解敏感的病毒重組體。該方法的基本特征是適于重復(fù)。一個(gè)富集周期后收獲的病毒，能夠用于利用新鮮的單細(xì)胞層和新鮮的CTL而進(jìn)行另外的選擇周期，直至達(dá)到所要求的富集水平。在利用已知重組體的特異性CTL的模擬試驗(yàn)中，可證明在6個(gè)選擇周期中，特異性重組體能夠從最初的0.001％稀釋度富集到大約20％(表9)。在此水平上，挑選單個(gè)噬斑做進(jìn)一步性質(zhì)鑒定是簡單的事情。
表9多周期富集VVova
對由野生型vNotl/tk(tk+)摻加指定濃度的VVova(tk-)組成的牛痘混合物進(jìn)行CML選擇(12)富集 漂浮細(xì)胞中VVova％周期# 實(shí)驗(yàn)1 實(shí)驗(yàn)2 實(shí)驗(yàn)3moi＝1 0 0.20.010.0011 2.10.3 nd2 4.71.1 nd3 9.14.9 nd4 14.3 17.91.45 24.6 3.36 18.6moi＝0.1 5 48.8 39.3％VVova＝(有BudR的滴度/沒有BudR的滴度)×100nd＝?jīng)]有測定用腫瘤特異性CTL對痘病毒表達(dá)文庫進(jìn)行4輪選擇。選擇的病毒重組體的各個(gè)噬斑經(jīng)擴(kuò)增，用于感染分離培養(yǎng)的B/C.N細(xì)胞。分析這些細(xì)胞刺激特異性CTL以分泌干擾素γ(IFN-γ)的能力(圖5A)，或者分析對腫瘤特異性CTL溶解的致敏性(圖5B)。分離10個(gè)病毒克隆，都賦予B/C.N刺激腫瘤特異性CTL系分泌IFN-γ的能力。全部10個(gè)克隆包含相同大小(1,300bp)的插入片段(Smith等人，未發(fā)表資料)。序列分析證實(shí)，克隆F5.8和H2.16包含相同的全長cDNA。因此看來全部10個(gè)克隆都是相同cDNA的重組體。經(jīng)BCA 34免疫產(chǎn)生的總共6個(gè)CTL系中的6個(gè)表現(xiàn)了對該抗原的特異性。
檢索GenBank顯示，該cDNA與鼠核糖體蛋白質(zhì)L3基因高度同源。(Peckham等人，Genes and Development 32062(1989))。對完整的H2.16克隆測序顯示，與發(fā)表的L3基因序列相比，只有一個(gè)核苷酸置換，編碼的氨基酸改變。該C170T置換引起54位氨基酸由蘇氨酸置換為異亮氨酸。F5.8克隆也包含此核苷酸置換。
既然CTL識別由主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子呈遞的肽抗原，鑒定由這些I類MHC限制性腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞識別的肽表位是有意義的。認(rèn)為CTL識別的肽中可能包括該改變的氨基酸(Ile 54)。只有H2.16前199bp(63個(gè)氨基酸)的痘苗病毒克隆重組體(vH2199)能夠使B/C.N對腫瘤特異性CTL的溶解敏感的事實(shí)支持了該假說(Smith等人，未發(fā)表資料)。計(jì)算機(jī)篩選肽結(jié)合基序提示，此區(qū)域內(nèi)編碼的兩種表位可與I類MHC分子Kd以高親和力結(jié)合(圖12)(Parker等人，J.Immunology 152163(1994))。合成這兩種肽L345-54(I54)和L348-56(I54)，并檢測其使B/C.N細(xì)胞對腫瘤特異性CTL的溶解敏感的能力。如圖7A所示，肽L348-56(I54)使B/C.N對溶解敏感，而L345-54(I54)和野生型L348-56(T54)則不然。已經(jīng)確定10nM L348-56(I54)足以使靶細(xì)胞對CTL溶解敏感，而100mM L348-56(T54)則不然(圖7B)。這些結(jié)果表明，肽L348-56(I54)是腫瘤特異性CTL識別的靶表位。
為了分析不同L3基因產(chǎn)物的表達(dá)，以寡dT為引物，從腫瘤及衍生腫瘤的B/C.N細(xì)胞系的RNA合成cDNA。利用幾乎擴(kuò)增小鼠L3完整mRNA的一對引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增cDNA第一鏈。該P(yáng)CR產(chǎn)物的序列分析表明，B/C.N和BCB13的L3 cDNA在170位包含C(與發(fā)表序列相同)。BCB13是來源于B/C.N細(xì)胞系的腫瘤細(xì)胞系，但與BCA腫瘤細(xì)胞系不具有免疫學(xué)上的交叉保護(hù)性(Sahasrabudhe等人，J.Immunology 1516302(1993))。具有交叉反應(yīng)性的腫瘤BCA 39、BCA 34和BCA 22的PCR產(chǎn)物序列分析提示，這些細(xì)胞系表達(dá)兩種不同種類的L3 mRNA。一種在170位包含C，而另一種在170位包含T，與H2.16克隆相同。除了這一個(gè)堿基替換，所有L3 cDNA的序列相同。
有兩種可能的方式說明腫瘤細(xì)胞中新L3 RNA的起源。或者這些腫瘤中表達(dá)的L3(C170T)基因是野生型基因的體細(xì)胞突變體，或者有多種種系的L3等位基因，當(dāng)腫瘤轉(zhuǎn)化過程中失調(diào)時(shí)，其中至少一種產(chǎn)生免疫原性產(chǎn)物。我們認(rèn)為第一種假說不太可能，因?yàn)榫哂薪徊娣磻?yīng)性的腫瘤BCA 39、BCA 34和BCA 22是獨(dú)立得到的。如果在所有三個(gè)腫瘤中產(chǎn)生相同的突變表位，這太不尋常了。另一方面，BCA 39和B/C.N基因組DNA經(jīng)不同限制性消化的Southern印跡提示，小鼠基因組中存在多拷貝的L3基因(Smith等人，未發(fā)表資料)。也有報(bào)道大鼠和牛的L3基因是復(fù)等位基因(Kuwano等人，Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 18758(1992)；Simonic等人，Biochemica etBiophysica Acta 1219706(1994))。需要進(jìn)一步分析，以驗(yàn)證假說種系中不同的L3等位基因在腫瘤和正常細(xì)胞中受到不同的調(diào)節(jié)。
發(fā)表的L3 168-171位核苷酸序列是GACC。H2.16在同一區(qū)域的序列是GATC(圖8A)。這個(gè)新的回文序列是許多限制性內(nèi)切酶(包括Sau3AI)的識別序列。如圖8A的限制性圖譜所示，Sau3A I消化的L3預(yù)期產(chǎn)生200、355、348、289和84bp的片段，而Sau3A I消化的H2.16將產(chǎn)生168bp片段，而不是200bp片段。Sau 3AI消化產(chǎn)物的差異證實(shí)三個(gè)BCA細(xì)胞系表達(dá)至少兩種不同的L3等位基因。全部5個(gè)細(xì)胞系以及胸腺RNA的L3RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)Sau 3AI消化，用瓊脂糖凝膠進(jìn)行分析。如圖8B所示，所有3個(gè)BCA細(xì)胞系都表達(dá)兩種版本的L3。值得注意的是，當(dāng)利用大量原材料重復(fù)該分析時(shí)，從B/C.N、BCB13和正常胸腺cDNA的消化產(chǎn)物中也檢測到該168bp片段(Smith等人，未發(fā)表資料)。為了提高該分析的敏感性，利用P32末端標(biāo)記的5’L3特異性引物重復(fù)進(jìn)行PCR。放射性標(biāo)記的PCR產(chǎn)物用Sau3AI消化，瓊脂糖凝膠分離。如圖8C所示，B/C.N、BCB13和胸腺包含該168bp片段。定量分析表明，BCA腫瘤的200bp∶168bp片段比例為2∶1，而B/C.N、BCB13和胸腺中檢測的相同片段比例大約為20∶1。分析腎臟、心臟和骨骼肌的RNA，也觀察到該免疫原性L3等位基因的低水平表達(dá)(Smith等人，未發(fā)表資料)。這些結(jié)果提示，在交叉反應(yīng)性腫瘤中，與轉(zhuǎn)化過程有關(guān)的基因失調(diào)導(dǎo)致該種系L3(C170T)等位基因較高水平表達(dá)，該改變的L3基因并非通過L3基因(主要表達(dá)于正常組織)的體細(xì)胞突變產(chǎn)生。本發(fā)明人將該新的L3等位基因(C170T)命名為免疫原性L3等位基因(iL3)。
尤為引人注意的是，免疫原性L3等位基因也在正常胸腺中表達(dá)，盡管水平降低10倍。該表達(dá)水平顯然不足以耐受對某些腫瘤中表達(dá)的失調(diào)的iL3水平具有功能性親和力的全部T細(xì)胞。但是盡管B/C.N和BCB13都表達(dá)低水平的iL3，它們對腫瘤特異性CTL的溶解并不敏感，該結(jié)果提示較高親和力的T細(xì)胞已經(jīng)被耐受了。這似乎是胸腺中表達(dá)腫瘤抗原的首例報(bào)道。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)，對自我蛋白質(zhì)的耐受不是絕對的，而必須相對于表達(dá)水平的量來確定(Targoni等人，J.Exp.Med.1872055(1998)；C.J.Harrington等人，Immunity8571(1998))。
如果以腫瘤共有抗原的表達(dá)為基礎(chǔ)開發(fā)廣泛有效的疫苗，那么關(guān)鍵是證明該抗原是免疫保護(hù)性的。已經(jīng)鑒定了人類腫瘤的大量共有抗原，但迄今為止，利用這些抗原的臨床免疫治療試驗(yàn)都無確定結(jié)果，部分原因是最佳接種策略的不確定性(Pardoll，D.M.，Nat.Med.4525(1998))。在小鼠中能夠更徹底地研究免疫治療策略，幾乎沒有鑒定到腫瘤共有抗原。因此，確定用iL3重組痘苗病毒免疫是否誘導(dǎo)腫瘤特異性CTL并保護(hù)小鼠免于腫瘤的攻擊，具有重要意義。(Overwijk等人，Proc.Natl.Acad.Sci.962982(1999)；Moss，B.，Science2521662(1991)；.Irvine等人，J.Immunology 1544651(1995)；McCabe等人，Cancer Research 551741(1995)；Estin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.851052(1988)；J.Kantor等人，JNCI84.1084(1992)；V.Bronte等人，Proc.Natl.Acad.Sci.943183(1997))。用iL3基因(H2.16)的痘苗病毒重組體免疫Balb/c小鼠，產(chǎn)生的CTL能夠體外溶解BCA 34和BCA 39腫瘤細(xì)胞，而不溶解B/C.N(圖9A)。用iL3痘苗病毒重組體免疫兩次乃至一次的小鼠，能夠排斥BCA 34腫瘤細(xì)胞的攻擊(圖9B和9C)。用空的病毒載體或者cAMP-依賴性蛋白激酶抑制劑蛋白質(zhì)(PKIa)的對照牛痘重組體免疫的小鼠不能排斥腫瘤的攻擊(Olsen，S.R.和Uhler，M.D.，J.Biol.Chem.26611158(1991)；Mueller等人，撰寫中)。這些結(jié)果證明，iL3自身蛋白質(zhì)是免疫保護(hù)性腫瘤抗原。
本發(fā)明人基于CTL介導(dǎo)的篩選修飾的痘苗病毒載體的腫瘤cDNA文庫(Merchlinsky等人，Virology 23 8444(1997)；E.Smith等人，撰稿中)，已經(jīng)開發(fā)了鑒定編碼CTL表位的基因的新策略。我們已經(jīng)應(yīng)用該策略鑒定了失調(diào)的看家基因，其編碼由三個(gè)獨(dú)立衍生的鼠腫瘤共有的腫瘤排斥抗原。該核糖體蛋白質(zhì)可代表一大類免疫保護(hù)性腫瘤共有抗原，其由于自身蛋白質(zhì)的表達(dá)失調(diào)而變得具有免疫原性，但不影響對正常組織的免疫耐受。這種抗原將特別適合于重要器官癌癥的免疫治療。
實(shí)施例5C35腫瘤抗原的表達(dá)和免疫原性與人正常組織的表達(dá)相比，在所檢測的70％(12/17)人原發(fā)乳腺癌和50％(5/10)膀胱癌中，過表達(dá)新的C35腫瘤基因的RNA轉(zhuǎn)錄物。該全長基因編碼功能未知的115個(gè)氨基酸的新蛋白質(zhì)。選擇單克隆抗體2C3，利用流式細(xì)胞術(shù)分析，對表達(dá)C35的細(xì)胞表面膜染色。此外，體外產(chǎn)生特異性溶解C35+乳腺腫瘤和膀胱腫瘤的人細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。從正常人類供者體外產(chǎn)生C35特異性CTL的能力提示缺少對該過表達(dá)蛋白質(zhì)的耐受。C35在不同個(gè)體的腫瘤中過表達(dá)以及誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力，使其成為有希望的免疫治療候選者。
材料和方法細(xì)胞系人乳腺癌細(xì)胞系BT20、BT474、MCF7、MDA-MB231、SKBR3、T47D(ATCC提供)，在補(bǔ)加10％胎牛血清(Biofluids，Rockville，MD)的RPMI-1640(BioWhitaker，Walkersville，MD)中培養(yǎng)。衍生自正常乳腺上皮細(xì)胞的永生細(xì)胞系H16N2、兩株轉(zhuǎn)移瘤21-MT1和21-MT2、兩株原發(fā)瘤21-NT和21-PT，全部來源于同一患者，在DFCI培養(yǎng)基中培養(yǎng)(Band，V.和Sager，R.，″Tumor Progression in Breast Cancer″，Neoplastic Transformation in Human Cell Culture，IS.Rhim andA.Dritschilo eds.，The Human Press Inc.，Totowa，NJ..(1991)，pp.169-78)由Dr.Vimla Band，New England-Tufts Medical Center惠供。膀胱腫瘤細(xì)胞系ppTl1A3衍生自永生的非致瘤細(xì)胞系SV-HUC。這些膀胱細(xì)胞系由Dr.Catherine Reznikoff，University of WisconsinClinical Cancer Center惠供，在每500ml補(bǔ)加1％FBS、0.025U胰島素、1ug氫化可的松、5ug轉(zhuǎn)鐵蛋白、2.7g葡萄糖、0.1uM非必需氨基酸、2mML-谷氨酰胺、100U青霉素和100ug鏈霉素的F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。正常增殖的乳腺上皮細(xì)胞(MEC)購自Clonetics(BioWhittaker)，根據(jù)供應(yīng)商的說明書維持生長。
RNA提取和Northern印跡分析大約80％貼壁率時(shí)收獲細(xì)胞系，提取RNA。收獲細(xì)胞，在Qiagen RNAeasy kit的QG緩沖液中裂解。按制造商的操作規(guī)程提取總RNA，用GITC和酒精沉淀，-80℃保存。組織樣品由Cooperative Human Tissue Network以速凍樣品提供，在裂解緩沖液中勻漿，用于RNAeasy操作。為了Northern印跡，利用Dynal’s(LakeSuccess，NY)oligo-dT25磁珠從總RNA(30ug總RNA/孔)提取mRNA，用3％甲醛的0.8％SeaKemLE(FMC Bioproducts)電泳。利用毛細(xì)吸印方法于10 X SSC過夜，將mRNA印跡到Genescreen Plus(NEN)，然后80℃烘烤2小時(shí)。按照每個(gè)制造商的操作規(guī)程，在106cpm/ml Quickhyb液(Stratagene)中用隨機(jī)引發(fā)的32P標(biāo)記cDNA探針(Prime-It，Stratagene，LaJolla，CA)，68℃探測膜。印跡用X光膠片和/或磷光屏曝光過夜。所有印跡上的表達(dá)相對看家基因(例如GAPDH或β肌動蛋白)歸一化。
消減雜交根據(jù)每個(gè)制造商的操作規(guī)程，使用基于Lisitsyn等人(Lisitsyn，N.和Wigler，N.M.，Science 259946-51(1993))首次描述的代表性差異分析方法的PCR Select cDNA SubtractionKit(Clontech，Palo Alto，CA)，產(chǎn)生與正常乳腺細(xì)胞系比較在腫瘤中過表達(dá)的基因富集的cDNA。簡要地，以oligo-dT為引物，從腫瘤和正常細(xì)胞經(jīng)DNase處理的2ug高質(zhì)量mRNA合成雙鏈cDNA。在短的平端(Rsal消化的)腫瘤序列連接銜接頭，其與過量Rsal消化的正常片段雜交。雜交32小時(shí)后，以銜接頭序列為引物，利用抑制型PCR(Clontech)優(yōu)先擴(kuò)增過表達(dá)的腫瘤序列。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pT7Blue3(Novagen，Madison，WI)，產(chǎn)生消減文庫?？寺≡?6孔板中LB/氨芐青霉素(100ug/ml)中培養(yǎng)，從過夜培養(yǎng)物中PCR擴(kuò)增插入片段，PCR產(chǎn)物利用BioDot歧管(BioRad，Hercules，CA)在Genescreen Plus上點(diǎn)樣。然后復(fù)制的點(diǎn)印跡用隨機(jī)引物標(biāo)記的腫瘤或正常cDNA或正反向消減雜交的PCR產(chǎn)物進(jìn)行探測。在腫瘤cDNA和正向消減(腫瘤減正常)中似乎過表達(dá)的克隆經(jīng)Northern印跡(如上所述)分析，以確定差異基因表達(dá)。
cDNA文庫和全長基因以O(shè)ligo-dT為引物，利用SMART cDNASynthesis(Clontech Laboratories)從SKBR3細(xì)胞系產(chǎn)生雙鏈cDNA，然后用酚∶氯仿∶異戊醇抽提。具體地，根據(jù)從EST同源物(登錄號#W57569)推斷的開放閱讀框架，合成引物(C35正義5’-GCGATGACGGGGGAGCC，和C35反義5’CCACGGAATCTTCTATTCTTTCT；Fisher Oligos，The Woodlands，TX)，擴(kuò)增C35編碼區(qū)。PCR產(chǎn)物克隆到pT7Blue 3(Novagen)中。
牛痘和逆轉(zhuǎn)錄病毒C35重組體C35編碼序列從文庫中按指定方向亞克隆到牛痘轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pVTKO的BamHI/SalI位點(diǎn)。將pVTKO.C35連同Notl和Apal消化的V7.5/TK病毒DNA，轉(zhuǎn)染由禽痘病毒感染的BSC-1細(xì)胞，產(chǎn)生重組病毒。如別處所述(美國發(fā)明專利申請No.08/935,377；PCT/US98/24029；T Cells Specific for Target Antigens andVaccines Based Thereon)，這是構(gòu)建痘苗病毒重組體的有效方法。C35基因也克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN中，通過與假模標(biāo)本pVSVg共轉(zhuǎn)染293-GP細(xì)胞，產(chǎn)生病毒原液。48小時(shí)后收集包含感染性病毒的上清液。
C35特異性2C3單克隆抗體的產(chǎn)生和FACS分析用C35逆轉(zhuǎn)錄病毒感染Line1小鼠小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，將103-2×104細(xì)胞注射給3只BALB/cByJ小鼠。21天后，眼眶后取血，收集血清，檢測與已知C35 mRNA表達(dá)水平低(MDA-MB-231)或很高(21NT)的人腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)性。還收集脾，利用標(biāo)準(zhǔn)的小鼠雜交瘤技術(shù)，融合脾細(xì)胞和P3骨髓瘤細(xì)胞，制備雜交瘤。用ELISA篩選HAT抗性克隆中存在的Ig。高產(chǎn)者經(jīng)同型化、定量，用于通過流式細(xì)胞術(shù)篩選C35+和C35-細(xì)胞系。包含1ug IgG的雜交瘤克隆上清液在PAB中(PBS、1％BSA、0.1％疊氮化物)與106細(xì)胞冰浴30分鐘，然后用PAB洗3次，與FITC綴合的山羊抗小鼠IgG(SouthernBiotechnology，Birmingham，AL)冰浴30分鐘。選擇重復(fù)了免疫血清表面染色(圖14)的一個(gè)雜交瘤克隆2C3，擴(kuò)增并純化抗體(BioExpress，West Lebanon，NY)。
人C35特異性的T細(xì)胞系的產(chǎn)生將來源于健康雌性供者(HLA A2，11，B35，44)的外周血，分為紅細(xì)胞玫瑰花結(jié)陽性組分(全部T淋巴細(xì)胞源)和陰性組分(單核細(xì)胞源)。冷凍保存T淋巴細(xì)胞以供后用，而單核細(xì)胞于產(chǎn)生樹突狀細(xì)胞(DC)的條件下溫育。如Bhardwaj及同事所述(Bender，A.等人，J.Immunol.Meth.196121-35(1996)；Reddy，A.等人，Blood 903640-46(1997)；Engelmayer，J.等人，J.Immunology 1636762-68(1999))略加修改，誘導(dǎo)DC成熟。每隔一天添加hGM-CSF和hIL-4(1000U/ml)。第7天，未貼壁的未成熟DC在GM-CSF和IL-4存在下，與C35逆轉(zhuǎn)錄病毒重組體溫育6小時(shí)。此時(shí)，洗掉逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液，將未成熟的樹突狀細(xì)胞置于另外包含GM-CSF、IL-4和12.5％單核細(xì)胞條件培養(yǎng)基(MCM)的成熟條件下。4天以后，用這些成熟的、表達(dá)C35的DC按1 DC∶50 T細(xì)胞的比例，刺激自體T細(xì)胞14天。制備新鮮的自體DC混合物，再刺激T細(xì)胞，但這次DC在MCM中成熟48小時(shí)后，用C35痘苗病毒重組體感染。加入細(xì)胞因子IL-2(20U/ml)、IL-12(20U/ml)和IL-18(10ng/ml)，并保持DC∶T細(xì)胞比例為1∶50。培養(yǎng)12天后，在添加IL-2(20U/ml)和IL-7(10ng/ml)條件下，用C35重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的EBV-B細(xì)胞另外刺激T細(xì)胞7天。細(xì)胞因子全部購自R&D Systems(Minneapolis，MN)。此時(shí)，細(xì)胞90％以上是CD8+，利用標(biāo)準(zhǔn)51Cr釋放分析檢測其活性。簡要地，106靶細(xì)胞與100uCi51Cr溫育、洗滌，然后在補(bǔ)加10％人AB血清(BioWhittaker)的RPMI-1640中與CTL效應(yīng)細(xì)胞溫育4小時(shí)。CTL活性表示為特異性溶解的百分率，測量為(標(biāo)記的靶細(xì)胞經(jīng)CTL溶解而釋放到上清液的51Cr-自發(fā)的釋放量)/(最大釋放量-自發(fā)釋放量)。
結(jié)果C35的特性在人乳腺腫瘤細(xì)胞差異表達(dá)的C35克隆，其序列不與Genbank中已知的任何基因同源，但鑒定了其同源的EST序列(原型登錄號#W57569)。NCI CGAP(Cancer Genome Anatomy Project)文庫中存在同源的人EST片段，包括腦腫瘤、肺腫瘤和腎臟腫瘤(A#AA954696)、Soares卵巢腫瘤(A#AA285089)和甲狀旁腺腫瘤(A#W37432)、子宮內(nèi)膜腫瘤(A#AA337071)以及結(jié)腸癌(A#AA313422)。鑒定了編碼115個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)的開放閱讀框架(圖10A)。從乳腺腺癌細(xì)胞系SKBR3的cDNA文庫中分離全長基因。對細(xì)胞系SKBR3、21MT2-D和H16N2的全長轉(zhuǎn)錄物測序證實(shí)，在cDNA中沒有點(diǎn)突變；C35hi細(xì)胞系以及C35lo細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄物100％同源。C35基因定位于人類染色體l7q12(A#AC040933)，小鼠染色體11(A#AC064803)。根據(jù)與cDNA EST序列的同源性推斷外顯子，并進(jìn)行GRAIL預(yù)測。令人感興趣的是，C35基因位于Her2/neu癌基因的1000bp區(qū)域內(nèi)，以及生長因子受體結(jié)合蛋白質(zhì)7(GRB7)(參與細(xì)胞周期活化的酪氨酸激酶，在食道癌中過表達(dá))基因的2000bp區(qū)域內(nèi)(Tanaka，S.等人，J.Clin.Invest.102821-27(1998))(圖10B)。Her2/neu蛋白質(zhì)過表達(dá)與30％乳腺腫瘤的基因增殖有關(guān)，并與臨床預(yù)后不佳有關(guān)(Slamon，D.J.等人，Science 235177-82(1987))。
C35氨基酸序列中預(yù)測的蛋白質(zhì)基序包括位于氨基酸38-41(TYLE)、76-79(SKLE)和97-100(SNGE)處的酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)；位于氨基酸60-65(GGTGAF)處的N-豆蔻酰化位點(diǎn)；以及位于氨基酸94-97(RRAS)的cAMP-和cGMP-依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)。最后，C35蛋白質(zhì)在COOH端氨基酸112-115(CVIL)處包含異戊二烯化基序。異戊二烯化，即與疏水性類異戊二烯部分共價(jià)連接，是一種翻譯后修飾，其可促進(jìn)膜結(jié)合，也似乎介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Fu，H.-W.和Casey，P.J.，Recent Progress in Hormone Research 54315-43(1999))。已經(jīng)證明異戊二烯化為潛在的癌基因Ras家族蛋白質(zhì)定位以及轉(zhuǎn)化到細(xì)胞表面所必需(Jackson，J.H.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.873042-46(1990)；Hancock，J.F.等人，Cell571167-77(1989))。已經(jīng)證明異戊二烯化的抑制劑具有抗腫瘤活性，例如減緩腫瘤生長(Garcia，A.M.等人，J.Biol.Chem.26818415-18(1993))以及在動物模型中促進(jìn)排斥反應(yīng)(Kohl，N.E.等人，NatureMed.1792-97(1995))。利用NetOGlyc2.0預(yù)測了3個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，位于氨基端或氨基端附近-thr8、ser2和ser9。
C35轉(zhuǎn)錄物在乳腺和膀胱癌中過表達(dá)腫瘤免疫治療的理想靶抗原應(yīng)當(dāng)在許多獨(dú)立的癌中大量表達(dá)，而在正常增殖的重要組織中不表達(dá)或表達(dá)水平極低。通過Northern印跡分析確認(rèn)C35的差異表達(dá)。在7/10的人腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)的C35水平，比正常的永生乳腺上皮細(xì)胞系H16N2水平高10-25倍(圖11A)。重要的是，來源于單一患者的原發(fā)(21NT、21PT)和轉(zhuǎn)移(21MT1、21MT2)病變的細(xì)胞系都表達(dá)C35，提示其表達(dá)可能與腫瘤轉(zhuǎn)化過程中的早期事件有關(guān)。此外，在獨(dú)立起源的人類乳腺癌細(xì)胞系(包括SKBR3、T47D和BT474)中，都有C35的過表達(dá)。令人感興趣的是，在SKBR3、MDAMB231、H16N2以及來源于同一患者的腫瘤中，C35的表達(dá)模式與Her2/neu表達(dá)相關(guān)，這可能與這兩個(gè)基因的基因組緊密接近以及Her2/neu基因擴(kuò)增的發(fā)生率有關(guān)。
為研究來源于患者的腫瘤中的C35表達(dá)是否是臨床相關(guān)的，以開發(fā)癌癥疫苗，從速凍的人組織樣品(自Cooperative Human TissueNetwork(CHTN)獲得)提取mRNA。70％原發(fā)乳腺腫瘤樣品過表達(dá)C35轉(zhuǎn)錄物(圖11B)，35％(7/20)該乳腺腺癌過表達(dá)水平比正常乳腺高10-70倍。檢測的原發(fā)膀胱癌樣品中，50％也過表達(dá)C35(圖12)，而20％(3/14)原發(fā)膀胱癌比正常膀胱表達(dá)水平高10倍以上。卵巢(0/7)、前列腺(0/5)或結(jié)腸(0/15)癌樣品未檢測到9倍或更高的C35過表達(dá)水平(數(shù)據(jù)未顯示)。
2C3單克隆抗體與C35+細(xì)胞反應(yīng)為了確認(rèn)C35所編碼的基因產(chǎn)物的差異表達(dá)，選擇針對該腫瘤共有抗原的單克隆抗體。用經(jīng)人C35逆轉(zhuǎn)錄病毒重組體轉(zhuǎn)導(dǎo)的低免疫原性的BALB/cByJ腫瘤細(xì)胞系免疫小鼠，制備雜交瘤。根據(jù)對C35++的乳腺和膀胱腫瘤細(xì)胞系的染色能力，篩選雜交瘤克隆(圖13A和13B)。非致瘤性乳腺H16N2和膀胱SV-HUC上皮細(xì)胞系與同型對照相比，熒光強(qiáng)度的變化不顯著。相反，2C3單克隆抗體特異性染色C35+的乳腺腫瘤SKBR3和21-NT-D，以及膀胱腫瘤ppT11A3。對既不固定也不通透化的細(xì)胞進(jìn)行染色，表明2C3抗體識別細(xì)胞表面分子。
用C35抗體抑制腫瘤生長抗體是檢測癌癥診斷標(biāo)志的有用工具，但其也可能用于治療應(yīng)用。人源化的Her2/neu特異性抗體(Herceptin)已經(jīng)成功用于治療某些乳腺癌。Herceptin結(jié)合Her2/neu，并下調(diào)生長因子受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。用C35特異性的2C3抗體進(jìn)行生長抑制研究。21NT-D乳腺腫瘤和H16N2″正?！迦橄偌?xì)胞系在體外于不同抗體濃度下培養(yǎng)。在72小時(shí)進(jìn)行XTT分析，以評價(jià)細(xì)胞擴(kuò)增。結(jié)果如圖14所示，表明2C3在1ug/ml的低濃度下，抑制21NT腫瘤細(xì)胞生長約50％。
C35 I類表位為HLA-A2限制型自身耐受性的建立是基于自身蛋白質(zhì)開發(fā)疫苗的主要障礙。然而，必須根據(jù)定量的表達(dá)水平確定耐受性。有可能甚至高親和力的抗原特異性T細(xì)胞是耐受的，而具有低親和力受體(對低濃度抗原沒有功能性親和力)的T細(xì)胞逃避耐受誘導(dǎo)。然而，如果存在與靶抗原過表達(dá)有關(guān)的、顯著提高的親和力，這些同樣的T細(xì)胞能夠隨之變得功能上非常重要。即使它們數(shù)量很少，該T細(xì)胞能夠通過最基本的免疫學(xué)操作(疫苗接種)進(jìn)行擴(kuò)增。
C35是在人正常組織中低基礎(chǔ)水平表達(dá)的自身蛋白質(zhì)。因此，必須確定人T細(xì)胞是否耐受癌的特征性C35表達(dá)水平。排除耐受的唯一方法是證明免疫應(yīng)答，缺乏臨床試驗(yàn)而證明免疫應(yīng)答的唯一方法是體外刺激。人T細(xì)胞和自體樹突狀細(xì)胞來源于正常供者的PBL。利用C35 cDNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒或痘病毒重組體感染的自體樹突狀細(xì)胞交替刺激，致敏T細(xì)胞。幾個(gè)刺激周期后體外回收CTL，分析其裂解C35+腫瘤靶細(xì)胞(圖15)或者響應(yīng)抗原誘導(dǎo)的活化而分泌細(xì)胞因子(圖16)的能力。靶細(xì)胞或者內(nèi)源性表達(dá)C35和/或HLA-A2.1，或者經(jīng)改造(通過C35重組哺乳動物表達(dá)載體的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染，或通過C35重組痘苗病毒感染)表達(dá)這些蛋白質(zhì)。先前的研究已經(jīng)證明，利用痘苗病毒表達(dá)蛋白質(zhì)，是將肽靶向MHC-I加工途徑的有效方法(Moss，B.，Science 2521662-67(1991)。
幾輪刺激以后，選擇混合T細(xì)胞系和T細(xì)胞克隆，在51Cr釋放分析中，它們相對于C35loH16N2正常乳腺上皮細(xì)胞系，可差異溶解C35+腫瘤細(xì)胞(圖15A和B)。HLA-A2限制型C35特異性CTL克隆10G3，有效溶解HLA-A2轉(zhuǎn)染的致瘤細(xì)胞系21-NT.A2(21-NT.A2的C35抗原表達(dá)水平比H16N2高15倍，可用2C3單克隆抗體染色)。HLA-A2+膀胱腫瘤細(xì)胞系ppT11A3比衍生它的非致瘤性膀胱細(xì)胞系SV-HUC，也是特異性裂解的(圖15B)。該數(shù)據(jù)證明，CTL對表達(dá)高水平C35的腫瘤的敏感性，對C35lo非致瘤性永生細(xì)胞系的溶解最小。重要的是，同樣的CTL與原代培養(yǎng)的非永生、非轉(zhuǎn)化的HLA-A2+乳腺上皮細(xì)胞MEC(C35表達(dá)水平不顯著)不反應(yīng)。支持T細(xì)胞識別C35+腫瘤的進(jìn)一步證據(jù)如圖16A和B所示。T細(xì)胞響應(yīng)C35+、HLA-A2+刺激物而分泌IFN-γ和TNF-α。此外，非致瘤性C35lo細(xì)胞系H16N2.A2不誘導(dǎo)C35特異性T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。然而，用痘苗病毒C35重組體感染該細(xì)胞系，能使其能夠活化T細(xì)胞。既然T細(xì)胞不響應(yīng)無關(guān)蛋白質(zhì)L3轉(zhuǎn)導(dǎo)的H16N2.A2而分泌IFN-γ或TNF-α，表明該應(yīng)答特異性針對C35蛋白質(zhì)表達(dá)(圖16A和B)。
幾輪刺激以后，選擇混合T細(xì)胞系和T細(xì)胞克隆，在51Cr釋放分析中，它們差異溶C35+、HLA-A2+腫瘤細(xì)胞。C35特異性CTL不溶解HLA-A2轉(zhuǎn)染的非致瘤性乳腺上皮細(xì)胞系H16N2.A2(圖15A和B)，盡管根據(jù)如圖11A所示的Northern印跡數(shù)據(jù)，該細(xì)胞系確實(shí)低水平表達(dá)C35。然而，C35特異性CTL有效溶解HLA-A2轉(zhuǎn)染的致瘤細(xì)胞系21-NT.A2(21-NT.A2的C35抗原表達(dá)水平比H16N2高15倍，可用2C3單克隆抗體染色)。膀胱腫瘤細(xì)胞系ppT11A3與衍生它的非致瘤性膀胱細(xì)胞系SV-HUC相比，也顯示C35+腫瘤特異性的溶解。該數(shù)據(jù)證明，CTL對表達(dá)高水平C35的腫瘤的敏感性，對C35lo非致瘤性永生細(xì)胞系的裂解最小。重要的是，同樣的CTL與原代培養(yǎng)的非永生、非轉(zhuǎn)化的HLA-A2+乳腺上皮細(xì)胞MEC(C35表達(dá)水平不顯著)不反應(yīng)。支持T細(xì)胞識別C35+腫瘤的進(jìn)一步證據(jù)如圖16A和B所示。T細(xì)胞響應(yīng)C35+、HLA-A2+刺激物而分泌IFN-γ和TNF-α。此外，非致瘤性C35lo細(xì)胞系H16N2.A2不誘導(dǎo)C35特異性T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。然而，用痘苗病毒C35重組體感染該細(xì)胞系，能使其能夠活化T細(xì)胞。既然T細(xì)胞不響應(yīng)無關(guān)蛋白質(zhì)L3轉(zhuǎn)導(dǎo)的H16N2.A2而分泌IFN-γ或TNF-α，表明該應(yīng)答特異性針對C35蛋白質(zhì)表達(dá)。
C35特異性T細(xì)胞從HLA單倍型A2、A11、B8、B35的供者產(chǎn)生。膀胱細(xì)胞系SV-HUC和ppT11A3來源于單倍型HLA-A2、B18、B44的供者。然而，由于H16N2永生化乳腺上皮細(xì)胞系以及21-NT和21-MT乳腺腫瘤細(xì)胞系來源于同一個(gè)HLA-A2陰性供者，這些細(xì)胞系必需用HLA-A2.1轉(zhuǎn)染，以提供所需的MHC限制性元件，以供HLA-A2限制性10G3 T細(xì)胞克隆識別(圖16A和B)。T細(xì)胞經(jīng)表達(dá)C35和HLA-A2的乳腺細(xì)胞系強(qiáng)刺激而分泌淋巴因子(21-MT2與21-MT2.vvA2比較)。該數(shù)據(jù)表明，存在至少一個(gè)HLA-A2.1確定的C35表位。
構(gòu)建C35編碼區(qū)的缺失突變體，以鑒定編碼CTL識別的肽表位的cDNA片段。圖15A和B表明，用全長C35或只包含前50個(gè)氨基酸的截短的突變體刺激T細(xì)胞，分泌幾乎等量的IFN-γ和TNF-α。
討論C35是在乳腺癌和膀胱癌中過表達(dá)的新腫瘤抗原。該基因的特性使其成為有希望用于腫瘤免疫治療的候選者。它在來源于不同個(gè)體的大量腫瘤中表達(dá)。在正常的重要組織的表達(dá)相對較低，降低了自身免疫應(yīng)答的風(fēng)險(xiǎn)，并且同樣重要的是，這使免疫細(xì)胞不大可能已經(jīng)對該基因產(chǎn)物發(fā)生耐受。由于表達(dá)C35的樹突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)腫瘤特異性的人自體細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，將C35表征為″腫瘤抗原″。
C35是新的功能未知的基因產(chǎn)物。然而，我們用單克隆抗體的研究已經(jīng)使對蛋白質(zhì)定位有了一定理解。來源于C35免疫小鼠的血清和單克隆抗體都能對表達(dá)C35的未固定細(xì)胞進(jìn)行特異性染色。這提示該抗體識別腫瘤表面的膜蛋白質(zhì)。盡管根據(jù)疏水性，該蛋白質(zhì)序列不符合已知的跨膜基序，但在COOH末端存在的異戊二烯化位點(diǎn)提示該蛋白質(zhì)插入膜中。異戊二烯化是翻譯后的脂類修飾，其產(chǎn)生基本上更具疏水性、更高膜親和力的蛋白質(zhì)(Fu，H.-W.和Casey，P.J.，Recent Progressin Hormone Research 54315-43(1999))。包含異戊二烯化位點(diǎn)的其它蛋白質(zhì)包括Ras癌基因家族。Ras GTP酶在MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)中起作用，誘導(dǎo)細(xì)胞分裂和增殖。Ras蛋白質(zhì)通過異戊二烯化錨定到質(zhì)膜，但該蛋白質(zhì)保持在膜的細(xì)胞質(zhì)一側(cè)。因此，有可能C35也保持在膜的細(xì)胞質(zhì)一側(cè)，但可能有足夠數(shù)量轉(zhuǎn)運(yùn)到外表面，而被特異性抗體檢測到。
C35特異性抗體是研究C35蛋白質(zhì)表達(dá)的重要工具，以印證Northern印跡分析，并用于諸如Western印跡和免疫組織化學(xué)分析。此外，這些抗體可能具有治療上的益處，如最近已經(jīng)證明的Herceptin(Baselga，J.等人，J. Clin.Oncol.14737-44(1996)；Pegram，M.D.等人，J.Clin.Oncol.162659-71(1998))，它是腫瘤相關(guān)抗原HER2-neu(c-erbB-2)(Schechter，A.L.等，Nature312513-16(1984))的抗體。Herceptin的抗腫瘤效應(yīng)包括結(jié)合抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)育的表皮生長因子受體，并激發(fā)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(Dillman，R.O.，Cancer Biotherapy &Radiopharrnaceuticals 145-10(1999)。
實(shí)施例6誘導(dǎo)特異性針對腫瘤靶抗原的細(xì)胞毒性T細(xì)胞已經(jīng)通過用自體腫瘤或由腫瘤裂解物脈沖的自體抗原呈遞細(xì)胞刺激PBL，體外誘導(dǎo)人腫瘤特異性T細(xì)胞(van Der Bruggen，P.等人，Science 2541643-1647(1991)；Yasumura，S.等人，Cancer Res.531461-68(1993)；Yasumura，S.等人，Int.J.Cancer57297-305(1994)；Simons，J.W.等人，Cancer Res.571537-46(1997)；Jacob，L.等人，Int.J.Cancer 71325-332(1997)；Chaux，P.等人，J.Immunol.1632928-2936(1999))。PBL來源于有意用腫瘤、經(jīng)修飾以增強(qiáng)其免疫原性的腫瘤、或腫瘤提取物免疫的患者，或者只在自然病程中預(yù)先刺激的患者。通過用經(jīng)體外感染、或者自然病程中接觸傳染物而體內(nèi)感染的自體細(xì)胞對T細(xì)胞進(jìn)行體外刺激，能夠類似得到對傳染物具有反應(yīng)性的T細(xì)胞。在此條件或其它條件下選擇的、對腫瘤細(xì)胞或由病毒、真菌或分枝桿菌感染的細(xì)胞特異性的CD4+和CD8+T細(xì)胞或抗體，或者對自身免疫性疾病的靶抗原特異性的T細(xì)胞或抗體，能夠用于本發(fā)明的選擇和篩選方法，以檢測和分離編碼這些靶抗原并已摻入典型cDNA文庫的cDNA。
盡管證明了針對腫瘤和受感染細(xì)胞的多種抗原體外成功誘導(dǎo)了人T細(xì)胞應(yīng)答，但不能肯定這代表了體內(nèi)可被誘導(dǎo)的應(yīng)答全部組成成分。由于安全考慮限制了人免疫接種實(shí)驗(yàn)的可能性，因此需要另外的動物模型以研究對人疾病抗原的免疫應(yīng)答。開發(fā)這種模型的主要障礙是，人正常細(xì)胞表達(dá)的多數(shù)分子在其它物種中具有強(qiáng)烈的免疫原性。因此，必需設(shè)計(jì)一種方法，能夠在另一物種中誘導(dǎo)對人正?？乖哪褪苄?，以便揭示對任何人疾病特異性抗原的免疫應(yīng)答?，F(xiàn)在認(rèn)識到，活化抗原特異性T淋巴細(xì)胞需要兩種信號，其中一種涉及呈遞特異性抗原復(fù)合物到T細(xì)胞抗原受體，另一種是獨(dú)立的共刺激信號，一般通過抗原呈遞細(xì)胞表面的B7家族分子與T細(xì)胞膜上CD28分子的相互作用而介導(dǎo)。在缺少共刺激信號的情況下傳遞抗原特異性信號不僅未能誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫，而且導(dǎo)致T細(xì)胞對后續(xù)刺激沒有反應(yīng)性。(Lenschow，D.J.等人，Ann.Rev.Immunol.14233-258(1996))。其它研究揭示了在抗原呈遞細(xì)胞上的CD40分子和T細(xì)胞上的CD40配基之間的另一對相互作用的關(guān)鍵作用。該相互作用引起B(yǎng)7共刺激分子上調(diào)(Roy，M.等人，Eur.J.Immunol.25596-603(1995))。體內(nèi)或體外存在抗CD40配基抗體的情況下，與CD40的相互作用被阻斷，B7共刺激物不上調(diào)，特異性抗原復(fù)合物的刺激引起T細(xì)胞耐受，而非T細(xì)胞免疫(Bluestone，J.A.等人，Immunol.Rev.1655-12(1998))。使CD40/CD40配基相互作用以及B7/CD28相互作用之一或兩者都阻斷的各種方法，已經(jīng)顯示可有效誘導(dǎo)移植耐受(Larsen，C.等人，Nature 381434-438(1996)；Kirk等人，Nature Medicine 5686-693(1999))?？笴D40配基抗體(抗-CD154)阻斷鼠T細(xì)胞與特異性移植抗原反應(yīng)性的效果的實(shí)例如圖17所示。用107C57B1/6(H-2d)脾細(xì)胞腹膜內(nèi)免疫DBA/2(H-2b)小鼠，并在接種時(shí)以及兩天后另外注射鹽水或0.5mg單克隆抗CD40配基抗體(MR1，抗CD154，Pharmingen 09021D)。免疫后第10天，取出這些小鼠的脾細(xì)胞，用C57B1/6或經(jīng)照射(20Gy)的異源C3H(H-2k)對照脾細(xì)胞體外刺激。體外刺激5天后，利用特異性標(biāo)記靶細(xì)胞的51Cr釋放分析，按不同效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞比例，分析C57B1/6和C3H特異性的溶細(xì)胞反應(yīng)，在此情況下，用同源脾細(xì)胞裂解物脈沖C3H或C57B1/6樹突狀細(xì)胞。圖17中的結(jié)果表明，針對C3H同種抗原對照，在鹽水和抗CD154處理的小鼠中都誘導(dǎo)顯著的細(xì)胞毒性，而對于C57B1/6，只在鹽水處理小鼠中誘導(dǎo)細(xì)胞毒性反應(yīng)，而在抗CD154處理的小鼠中沒有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性反應(yīng)。這表明，當(dāng)CD40/CD40配基的相互作用被抗CD154阻斷時(shí)，誘導(dǎo)了針對免疫刺激所用抗原的耐受性。
類似于上述的、單獨(dú)使用抗CD154或者聯(lián)合使用抗CD154和抗B7或抗CD28的耐受化方法，能夠用于在用人腫瘤免疫之前，在小鼠中誘導(dǎo)對人正常異種抗原的耐受性。在一個(gè)實(shí)施方案中，在來源于相同個(gè)體和衍生腫瘤細(xì)胞系的組織的正常永生細(xì)胞上可表達(dá)正?？乖Ｔ诹硪粚?shí)施方案中，從同一個(gè)體正常和腫瘤組織的細(xì)胞裂解物得到正?？乖湍[瘤抗原，每一裂解物脈沖抗原呈遞細(xì)胞，以在體內(nèi)和體外呈遞給同源小鼠的T細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，經(jīng)體外誘變或者癌基因轉(zhuǎn)化從永生的、接觸抑制的、貼壁依賴性、非致瘤性細(xì)胞系產(chǎn)生腫瘤，因此可獲得很匹配的非致瘤性細(xì)胞，用于耐受性誘導(dǎo)。
另選的耐受化方法是，在用腫瘤免疫之前缺失由正常抗原活化的T細(xì)胞。活化的T細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)CD69和CD25，刺激后24-48小時(shí)表達(dá)最高。在經(jīng)正常細(xì)胞或正常細(xì)胞裂解物活化以后，能夠利用與基質(zhì)(例如磁珠)直接或間接偶聯(lián)的抗CD69和抗CD25抗體缺失表達(dá)這些標(biāo)志的T細(xì)胞。然后用腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞裂解物在繼承性轉(zhuǎn)移后體外或體內(nèi)免疫剩余的T細(xì)胞，將優(yōu)先引起腫瘤特異性應(yīng)答。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將要耐受人正常細(xì)胞或裂解物并繼之以腫瘤細(xì)胞或裂解物免疫的小鼠，是任何商品化的近交和遠(yuǎn)交品系。因?yàn)槭蟮腡細(xì)胞只限于識別與鼠MHC分子(而不是人細(xì)胞表達(dá)的MHC)結(jié)合的肽抗原，有效的耐受和刺激需要用鼠MHC分子轉(zhuǎn)染人細(xì)胞，或者通過鼠抗原呈遞細(xì)胞重新呈遞人的正常和腫瘤抗原。特別優(yōu)選樹突狀細(xì)胞作為抗原呈遞細(xì)胞，因?yàn)樗鼈冊贗類和II類MHC途徑中都能重新呈遞抗原肽(Huang等人，Science 264961-965(1994)；Inaba等人，J.Exp.Med.1761702(1992)；Inaba等人，J.Exp.Med.178479-488(1993))。在另一實(shí)施方案中，利用轉(zhuǎn)雙基因(人HLA和人CD8或CD4)的小鼠。HLA轉(zhuǎn)基因允許在小鼠胸腺中選擇高親和力、HLA限制性T細(xì)胞所有組成成分。此外需要人CD8或CD4轉(zhuǎn)基因，因?yàn)槭驝D8和CD4不與同源的人I類或II類MHC分子有效相互作用。利用非轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生人腫瘤特異性T細(xì)胞，將會鑒定到能夠與鼠MHC分子結(jié)合進(jìn)行加工的任何人類腫瘤抗原。因?yàn)榭色@得具有不同MHC分子的多個(gè)鼠品系，這樣可能包含各種各樣的抗原。然而，必須利用自身抗原呈遞細(xì)胞刺激人T細(xì)胞，來分別確定這些腫瘤特異性抗原是否也表達(dá)能夠與人HLA聯(lián)合加工和呈遞的肽。這種肽可能與或不與起初檢測到的鼠MHC分子結(jié)合的肽重疊，但可來源于同類蛋白質(zhì)。通過利用HLA轉(zhuǎn)基因小鼠，有可能更直接找到與人MHC相關(guān)的抗原肽。然而，不能肯定鼠和人的抗原呈遞細(xì)胞對肽的加工是相同的。因此，必須證實(shí)HLA限制性的人腫瘤抗原特異性T細(xì)胞確實(shí)也與人腫瘤細(xì)胞交叉反應(yīng)。最后，無論怎樣進(jìn)行聯(lián)合人HLA的加工和呈遞，在任何情況下，必須確定人類T細(xì)胞是否與鑒定的抗原反應(yīng)，或者也許由于其它非同源性正常組織表達(dá)相同或相關(guān)抗原而是否使T細(xì)胞耐受。利用鑒定的抗原或自身抗原呈遞細(xì)胞呈遞的抗原肽體外刺激人T細(xì)胞應(yīng)答，能夠獲得這方面的相關(guān)信息。理想地，抗原陽性腫瘤的患者，其與目的腫瘤特異性抗原反應(yīng)的T細(xì)胞的頻率提高。如Renner，C.等人，Science 264833-835(1994)所述，為證明誘導(dǎo)的人抗原特異性T細(xì)胞能夠有效消滅腫瘤，選擇的人T細(xì)胞可繼承性轉(zhuǎn)移到帶有人腫瘤異種移植物的SCID小鼠中。然而，臨床相關(guān)的確切證據(jù)將要等待人體臨床試驗(yàn)的結(jié)果。
實(shí)施例2描述了體外刺激原發(fā)性人T細(xì)胞應(yīng)答的條件，其對CD4+和CD8+應(yīng)答都適用。所述誘導(dǎo)人腫瘤特異性的人T細(xì)胞或抗體應(yīng)答的策略，同樣適用于針對病毒、真菌或分枝桿菌感染的人細(xì)胞的靶抗原的T細(xì)胞或抗體應(yīng)答的誘導(dǎo)。實(shí)際上，在此情況下，相同的未感染細(xì)胞群體可立即提供正常對照群體，用于誘導(dǎo)耐受并確認(rèn)感染的特異性。
轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建為本領(lǐng)域公知，例如Manipulating the MouseEnibroyA laboratory Manual，Hogan等人，Cold Spring HarborPress，second edition(1994)中的描述?？梢岳肔aFace等人，J.Exp.Med.1821315-25(1995)方法，構(gòu)建人CD8轉(zhuǎn)基因小鼠。將相應(yīng)的人cDNA插入基于人CD2小基因的載體中，可以構(gòu)建表達(dá)人CD8α和CD8β亞基的新品系轉(zhuǎn)基因小鼠，在轉(zhuǎn)基因小鼠中進(jìn)行T細(xì)胞特異性表達(dá)。(Zhumabekov等人，J.Immunol.Methods 185133-140(1995))?？衫肅hamberlain等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 857690-7694(1988)或Bernhard等人，J.Exp.Med.1681157-1162(1988)或Vitiello等人，J.Exp.Med.1731007-1015(1991)或Barra等人，J.Immunol.1503681-3689(1993)的方法，構(gòu)建HLA I類轉(zhuǎn)基因小鼠。
通過構(gòu)建包括2kb上游調(diào)節(jié)區(qū)以及前兩個(gè)內(nèi)含子(以前曾用于基因調(diào)節(jié))(Kralova等人，1992，EMBO J.114591-4600)的H-2Kb盒，進(jìn)行另外的HLA I類轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建。從該區(qū)去除內(nèi)源性翻譯起始位點(diǎn)，在第三個(gè)外顯子中引入供HLA cDNA插入的限制性位點(diǎn)，其后是polyA添加位點(diǎn)。通過在此構(gòu)建體3’端加入另外的3kb H-2Kb基因組序列，在胚胎干細(xì)胞中能夠以I類基因?yàn)槟繕?biāo)在H-2kb基因座進(jìn)行同源重組。好處在于，很可能在已知與鼠I類基因表達(dá)相容的指定位置進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)，并且通過在細(xì)胞膜表達(dá)H-2Kb，這些小鼠很可能欠缺潛在的競爭作用。據(jù)信這樣將得到在相同構(gòu)建體中引入的不同的人HLA I類cDNA的相對可重現(xiàn)性的表達(dá)。
實(shí)施例7構(gòu)建N端和/或C端缺失突變體下列一般方法可用來克隆N端或C端缺失的C35缺失突變體。通常，兩條大約15-25個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物來源于SEQ ID NO1多核苷酸的5’和3’目的位置。根據(jù)目的C35多核苷酸片段確定引物的5’和3’位置。如有必要，5’和3’引物分別添加起始和終止密碼子，以表達(dá)該多核苷酸片段編碼的C35多肽片段。優(yōu)選的C35多核苷酸片段編碼候選的MHC I類和MHC II類結(jié)合肽(在本說明書上述″多核苷酸和多肽片段″一節(jié)中公開的)。
5’和3’引物序列也可添加包含限制性位點(diǎn)的另外核苷酸，以便于將C35多核苷酸片段克隆到目的載體。利用合適的PCR寡核苷酸引物以及此處所述或本領(lǐng)域已知的條件，從基因組DNA或cDNA克隆擴(kuò)增C35多核苷酸片段。本發(fā)明的C35多核苷酸片段編碼的C35多肽片段，可以按與全長多肽相同的一般方式表達(dá)和純化，盡管由于特定片段和全長多肽之間存在化學(xué)及物理特性的差異而可能需要做常規(guī)的改變。
為例證而非限制本發(fā)明，編碼C35多肽片段的多核苷酸如下擴(kuò)增并克隆產(chǎn)生5’引物，包含限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，后接起始密碼子，其位于編碼MHC結(jié)合肽表位(表1-6所列)N端部分的多核苷酸序列的框架內(nèi)。產(chǎn)生互補(bǔ)3’引物，包含限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，后接終止密碼子，其位于編碼C35 MHC結(jié)合肽表位(表1-6所列)C端部分的多核苷酸序列的框架內(nèi)。
利用識別引物中位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶，消化擴(kuò)增的多核苷酸片段以及表達(dá)載體。然后將該消化的多核苷酸連接在一起。將C35多核苷酸片段插入到限制性酶切的表達(dá)載體中，優(yōu)選方式為將C35多肽片段編碼區(qū)置于啟動子下游。利用標(biāo)準(zhǔn)方法并如此處實(shí)施例所述，將連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞。從抗性克隆分離質(zhì)粒DNA，利用限制性分析、PCR和DNA測序確認(rèn)克隆的DNA的身份。
實(shí)施例8C35的蛋白質(zhì)融合優(yōu)選地，C35多肽與其它蛋白質(zhì)融合。這些融合蛋白質(zhì)可用于多種應(yīng)用。例如，C35多肽融合His-標(biāo)記、HA-標(biāo)記、蛋白質(zhì)A、IgG結(jié)構(gòu)域、以及麥芽糖結(jié)合蛋白可便于純化。(參見實(shí)施例5；也參見EP A 394,827；Traunecker等人，Nature 33184-86(1988).)類似地，融合IgG-1、IgG-3以及白蛋白可延長體內(nèi)半衰期。C35多肽融合核定位信號可靶向蛋白質(zhì)到特定的亞細(xì)胞定位，而共價(jià)異二聚體或同二聚體可提高或降低融合蛋白質(zhì)的活性。融合蛋白質(zhì)還可以產(chǎn)生具有一種以上功能的嵌合分子。最后，融合蛋白質(zhì)與非融合蛋白質(zhì)相比，可提高該融合蛋白質(zhì)的可溶性和/或穩(wěn)定性。通過修改以下概述的多肽與IgG分子融合的方法，可產(chǎn)生上述所有類型的融合蛋白質(zhì)。
簡要地，利用跨越下述序列的5’和3’端的引物，可PCR擴(kuò)增人IgG分子的Fc部分。這些引物也應(yīng)具有適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點(diǎn)，以便于克隆到表達(dá)載體，優(yōu)選哺乳動物表達(dá)載體。
例如，如果使用pC4(登錄號209646)，可將人Fc部分連接到BamHI克隆位點(diǎn)。注意，應(yīng)該破壞3’BamHI位點(diǎn)。然后，包含人Fc部分的載體再經(jīng)BamHI限制性酶切，線性化載體，并將按實(shí)施例1所述PCR方法分離的C35多核苷酸連接到該BamHI位點(diǎn)。注意，克隆的C35多核苷酸沒有終止密碼子，否則不能制備融合蛋白質(zhì)。
如果使用天然存在的信號序列制備分泌蛋白質(zhì)，pC4不需要另外的信號肽。另外，如果不使用天然存在的信號序列，載體可修改為包括異源信號序列。(例如參見WO 96/34891.)
人IgG Fc區(qū)GGGATCCGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAATTCGAGGGTGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACTCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTAAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAACCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCAAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTGCGACGGCCGCGACTCTAGAGGAT(SEQ ID NO[84])優(yōu)選的融合產(chǎn)物是，C35肽融合MHC分子的氨基端，其方式是肽自然地占據(jù)MHC肽結(jié)合槽。Kang，X.等人，Cancer Res.57202-5(1997)已經(jīng)報(bào)道，這種融合蛋白質(zhì)能夠用于對刺激特異性T細(xì)胞特別有效的疫苗組合物。
實(shí)施例9檢測生物樣品中C35水平異常的方法可以檢測生物樣品中的C35多肽，并且如果檢測到C35水平升高或降低，該多肽是特殊表型的標(biāo)志。檢測方法很多，因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以修改以下分析方法，以適合其特殊需要。
例如，抗體夾心ELISA用來檢測樣品中的C35，優(yōu)選檢測生物樣品中的C35。用終濃度為0.2-10ug/ml的C35特異性抗體包被微量滴定板的孔。抗體是單克隆或多克隆抗體。將孔封閉，以降低C35與孔的非特異性結(jié)合。
然后將包被的孔與包含C35的樣品室溫溫育2小時(shí)以上。優(yōu)選應(yīng)使用連續(xù)稀釋的樣品來驗(yàn)證結(jié)果。然后用鹽水洗板三次，除去未結(jié)合的C35。
然后，加入50ul濃度為25-400ng的可識別C35抗原決定簇(其不與結(jié)合板上的抗體識別的抗原決定簇重疊)的特異性抗體-堿性磷酸酶綴合物，室溫下溫育2小時(shí)。用去離子水或蒸餾水再洗板三次，除去未結(jié)合的綴合物。
每孔加入75ul 4-甲基傘形酮酰磷酸鹽(MUP)或?qū)ο趸交姿猁}(NPP)底物溶液，室溫下溫育1小時(shí)。利用微量滴定板讀數(shù)器測定反應(yīng)。利用連續(xù)稀釋的對照樣品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以C35多肽濃度為X軸(對數(shù)刻度)、以熒光或吸光度為Y軸(線性刻度)。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插計(jì)算樣品中的C35濃度。
實(shí)施例10配制多肽按照符合良好的醫(yī)療實(shí)踐的方式，并考慮患者個(gè)體的臨床狀況(特別是單獨(dú)用C35多肽治療的副作用)、輸送位置、給藥方法、給藥時(shí)間表及其它為專業(yè)人員所知的因素，配制C35組合物并確定劑量。因而根據(jù)這些考慮確定此處所用的″有效量″。
一般主張，每劑非腸道給藥C35的藥物總有效量介于大約1ug/kg/天-10mg/kg/天的患者體重，盡管如上所述，這也要經(jīng)過治療判斷。更優(yōu)選劑量至少0.01mg/kg/天，人用最優(yōu)選劑量大約0.01-1mg/kg/天。如果連續(xù)給藥，一般給予C35的劑量速率為大約1-50ug/kg/小時(shí)，每天注射1-4次或通過連續(xù)的皮下輸注，例如利用小泵。也可使用靜脈注射袋裝溶液。觀察到變化需要的治療時(shí)間長短以及治療后到發(fā)生反應(yīng)的間隔時(shí)間似乎取決于預(yù)期效果。
包含C35的藥物組合物經(jīng)口服、直腸、非腸道、腦池內(nèi)、陰道內(nèi)、腹腔內(nèi)、局部(通過粉末、軟膏、凝膠、滴劑或透皮片)、口腔，或者口噴或鼻噴給藥?！逅幬锟山邮艿妮d體″是指無毒的固體、半固體或液體填充物、稀釋劑、膠囊物質(zhì)或任何類型的輔助制劑。此處所用術(shù)語″非腸道″是指包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、皮下以及關(guān)節(jié)內(nèi)注射和輸注的給藥方式。
C35也適于通過緩釋系統(tǒng)給藥。合適的緩釋組合物例子包括有形物品形式的半滲透聚合物基質(zhì)，例如薄膜或微囊。緩釋基質(zhì)包括聚交酯(美國專利No.3,773,919，EP 58,481)，L-谷氨酸和L-谷氨酸-γ-乙酯的共聚物(Sidman，U.等人，Biopolymers 22547-556(1983))，聚(甲基丙烯酸-2-羥乙酯)(R.Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.15167-277(1981)以及R.Langer，Chem.Tech.1298-105(1982))，乙烯乙酸乙烯酯(R.Langer等人)或聚D-(-)-3-羥基丁酸(EP133,988)。緩釋組合物也包括脂質(zhì)體包載的C35多肽。包含C35的脂質(zhì)體按本來已知的方法制備DE 3,218,121；Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 823688-3692(1985)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本專利申請83-118008；美國專利Nos.4,485,045和4,544,545；以及EP 102,324。脂質(zhì)體通常是小(大約200-800埃)的單層類型，其中脂類內(nèi)容物是大于約30摩爾百分比的膽固醇，調(diào)整選擇的比例以優(yōu)化分泌型多肽的治療。
至于非腸道給藥，在一個(gè)實(shí)施方案中，一般以單位劑量的注射形式(溶液、懸浮液或乳液)，按所要求純度，與藥物可接受的載體(即，在使用的劑量和濃度下對受者無毒，并與該制劑的其它成分相容)混合，配制C35。例如，優(yōu)選制劑不包括氧化劑及其它已知對多肽有害的化合物。
通常，通過將C35與液體載體或精細(xì)粉碎的固體載體或兩者都均一并緊密地接觸而制備制劑。如有必要，該產(chǎn)物然后做成所要求制劑的形狀。優(yōu)選載體是非腸道載體，更優(yōu)選與受者血液等滲的溶液。該載體的例子包括水、鹽水、Ringer’s液和葡萄糖溶液。此處也用非水載體諸如不揮發(fā)油和油酸乙酯，以及脂質(zhì)體。
載體適當(dāng)?shù)匕×刻砑觿?，例如增?qiáng)等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)。該物質(zhì)在使用的劑量和濃度下對受者無毒，并包括緩沖液例如磷酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、乙酸，及其它有機(jī)酸或其鹽；抗氧化劑，例如抗壞血酸；低分子量(小于大約10個(gè)殘基)的多肽，例如多聚精氨酸或三肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；單糖、二糖及其它碳水化合物，包括纖維素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖醇，例如甘露糖醇或山梨糖醇；平衡離子，例如鈉；和/或非離子型表面活性劑，例如聚山梨酸酯、聚羥體或PEG。
一般在這種載體中配制C35，濃度大約0.1-100mg/ml，優(yōu)選1-10mg/ml，pH大約3-8。應(yīng)當(dāng)理解，利用上述的某些賦形劑、載體或穩(wěn)定劑，將導(dǎo)致形成多肽鹽。
用來治療性給藥的C35可無菌。利用通過無菌過濾膜(例如0.2微米膜)，可輕易實(shí)現(xiàn)無菌。治療性多肽組合物通常放入具有無菌入口的容器中，例如靜脈注射液袋子或帶有可由皮下注射針刺穿的塞子的小瓶。
C35多肽通常以水溶液或用于重建的凍干制劑，保存在單位劑量或多劑量的容器中，例如密封的安瓿或小瓶。凍干制劑例如，10ml小瓶中充滿5ml無菌過濾的1％(w/v)C35多肽水溶液，將獲得的混合物凍干。利用注射用抑菌水重建凍干的C35多肽，制備輸注液。
本發(fā)明還提供包含一種或多種容器的藥物包裝或試劑盒，其中裝有一種或多種本發(fā)明的藥物組合物成分。該容器帶有按管理藥品或生物制品生產(chǎn)、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定形式的通知，其反映該機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)生產(chǎn)、使用或銷售，供人類藥用。此外，C35可與其它的治療化合物聯(lián)合使用。
顯然，可以不同于上述說明書和實(shí)施例中的特別描述而實(shí)施本發(fā)明。根據(jù)上述教導(dǎo)，能夠?qū)Ρ景l(fā)明進(jìn)行大量修改和變動，因此，在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)，可以不同于其特別描述而實(shí)施本發(fā)明。
在本發(fā)明的背景、詳述、實(shí)施例和序列表中引用的每個(gè)文件(包括專利、專利申請、期刊文章、摘要、實(shí)驗(yàn)手冊、著作或其它公開物)的所有公開物，在此引入作為參考。
顯然，可以不同于上述說明書和實(shí)施例中的特別描述而實(shí)施本發(fā)明。根據(jù)上述教導(dǎo)，能夠?qū)Ρ景l(fā)明進(jìn)行大量修改和變動，因此，在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)，可以不同于其特別描述而實(shí)施本發(fā)明。
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序列表<110>羅切斯特大學(xué)<120>在乳腺癌和膀胱癌中差異表達(dá)的基因及編碼的多肽<130>1821.004PC01<140>
<141>
<150>US 60/194,463<151>2000-04-04<160>84<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>354<212>DNA<213>人類(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(7)..(354)<400>1gccgcg atg agc ggg gag ccg ggg cag acg tcc gta gcg ccc cct ccc48Met Ser Gly Glu Pro Gly Gln Thr Ser Val Ala Pro Pro Pro1 5 10gag gag gtc gag ccg ggc agt ggg gtc cgc atc gtg gtg gag tac tgt 96Glu Glu Val Glu Pro Gly Ser Gly Val Arg Ile Val Val Glu Tyr Cys15 20 25 30gaa ccc tgc ggc ttc gag gcg acc tac ctg gag ctg gcc agt gct gtg 144Glu Pro Cys Gly Phe Glu Ala Thr Tyr Leu Glu Leu Ala Ser Ala Val35 40 45aag gag cag tat ccg ggc atc gag atc gag tcg cgc ctc ggg ggc aca 192Lys Glu Gln Tyr Pro Gly Ile Glu Ile Glu Ser Arg Leu Gly Gly Thr50 55 60ggt gcc ttt gag ata gag ata aat gga cag ctg gtg ttc tcc aag ctg 240Gly Ala Phe Glu Ile Glu Ile Asn Gly Gln Leu Val Phe Ser Lys Leu65 70 75gag aat ggg ggc ttt ccc tat gag aaa gat ctc att gag gcc atc cga 288Glu Asn Gly Gly Phe Pro Tyr Glu Lys Asp Leu Ile Glu Ala Ile Arg80 85 90aga gcc agt aat gga gaa acc cta gaa aag atc acc aac agc cgt cct 336Arg Ala Ser Asn Gly Glu Thr Leu Glu Lys Ile Thr Asn Ser Arg Pro95 100 105 110ccc tgc gtc atc ctg tga 354Pro Cys Val Ile Leu115
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1.分離的核酸分子，其包含具有與選自下列的序列至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸(a)SEQ ID NO1的多核苷酸片段；(b)編碼SEQ ID NO2的多肽片段的多核苷酸；(c)編碼SEQ ID NO2的多肽結(jié)構(gòu)域的多核苷酸；(d)編碼SEQ ID NO2的多肽表位的多核苷酸；(e)編碼具有生物學(xué)活性的SEQ ID NO2的多肽的多核苷酸；(f)作為SEQ ID NO1的變體的多核苷酸(g)作為SEQ ID NO1的等位基因變體的多核苷酸；(h)編碼SEQ ID NO2的物種同系物的多核苷酸；(i)能夠在嚴(yán)格條件下與(a)-(h)中指定的任何一種多核苷酸雜交的多核苷酸，其中所述多核苷酸在嚴(yán)格條件下不與具有僅僅A殘基或僅僅T殘基的核苷酸序列的核酸分子雜交。
2.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中多核苷酸片段包含編碼成熟形式或分泌蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
3.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中多核苷酸片段包含編碼SEQID NO2所確定序列的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中多核苷酸片段包含全部的SEQ ID NO1核苷酸序列。
5.權(quán)利要求2的分離的核酸分子，其中核苷酸序列包含從C-端或N-端或兩端連續(xù)的核苷酸缺失。
6.權(quán)利要求3的分離的核酸分子，其中核苷酸序列包含從C-端或N-端或兩端連續(xù)的核苷酸缺失。
7.包含權(quán)利要求1的分離的核酸分子的重組載體。
8.重組宿主細(xì)胞的制備方法，該細(xì)胞包含權(quán)利要求1的分離的核酸分子。
9.利用權(quán)利要求8的方法制備的重組宿主細(xì)胞。
10.包含載體序列的權(quán)利要求9的重組宿主細(xì)胞。
11.分離的多肽，其包含與選自以下的序列至少95％相同的氨基酸序列(a)SEQ ID NO2的多肽片段；(b)具有生物學(xué)活性的SEQ ID NO2的多肽片段；(c)SEQ ID NO2的多肽結(jié)構(gòu)域；(d)SEQ ID NO2的多肽表位；(e)分泌蛋白質(zhì)的成熟形式；(f)全長的分泌蛋白質(zhì)；(g)SEQ ID NO2的變體；(h)SEQ ID NO2的等位基因變體；或(i)SEQ ID NO2的物種同系物。
12.權(quán)利要求11的分離的多肽，其中成熟形式或全長分泌蛋白質(zhì)包含從C-端或N-端或兩端連續(xù)的氨基酸缺失。
13.分離的抗體，其可特異性結(jié)合權(quán)利要求11的分離的多肽。
14.表達(dá)權(quán)利要求11的分離的多肽的重組宿主細(xì)胞。
15.分離的多肽的制備方法，包含(a)在使所述多肽表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求14的重組宿主細(xì)胞；以及(b)回收所述多肽。
16.通過權(quán)利要求15制備的多肽。
17.一種用于預(yù)防、治療或改善醫(yī)療狀況的方法，其包含給予哺乳動物個(gè)體治療有效量的權(quán)利要求11的多肽、或者權(quán)利要求1的多核苷酸、或者權(quán)利要求13的抗體。
18.診斷個(gè)體中與分泌蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性有關(guān)的病理狀況或?qū)ζ湟赘行缘姆椒?，包?a)確定權(quán)利要求1的多核苷酸中是否存在突變；(b)根據(jù)是否存在所述突變，診斷病理狀況或?qū)Σ±頎顩r的易感性。
19.診斷個(gè)體中與分泌蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性有關(guān)的病理狀況或?qū)ζ湟赘行缘姆椒?，包?a)確定生物樣品中權(quán)利要求11的多肽的存在或其表達(dá)量；(b)根據(jù)該多肽的存在或表達(dá)量，診斷病理狀況或?qū)Σ±頎顩r的易感性。
20.一種用于鑒定權(quán)利要求11的多肽的結(jié)合配偶體的方法，包含(a)將權(quán)利要求11的多肽與結(jié)合配偶體接觸；以及(b)確定結(jié)合配偶體是否影響該多肽的活性。
21.SEQ ID NO1的cDNA序列的相應(yīng)基因。
22.在生物學(xué)分析中鑒定活性的方法，其中該方法包含(a)在細(xì)胞中表達(dá)SEQ ID NO1；(b)分離上清液；(c)在生物學(xué)分析中檢測活性；以及(d)鑒定上清液中具有該活性的蛋白質(zhì)。
23.利用權(quán)利要求22的方法制備的產(chǎn)物。
24.分離的核酸分子，其包含具有與選自下列的序列至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸(a)SEQ ID NO1的多核苷酸片段；(b)編碼SEQ ID NO2的多肽片段的多核苷酸；(c)編碼SEQ ID NO2的多肽結(jié)構(gòu)域的多核苷酸；(d)編碼SEQ ID NO2的多肽表位的多核苷酸；(e)編碼具有生物學(xué)活性的SEQ ID NO2的多肽的多核苷酸；(f)作為SEQ ID NO2XXXXX]的變體的多核苷酸；(g)作為SEQ ID NO1的等位基因變體的多核苷酸；(h)編碼SEQ ID NO2的物種同系物的多核苷酸；(i)能夠在嚴(yán)格條件下與(a)-(h)中指定的任何一種的多核苷酸雜交的多核苷酸，其中所述多核苷酸在嚴(yán)格條件下不與具有僅僅A殘基或僅僅T殘基的核苷酸序列的核酸分子雜交。
25.分離的多肽，其包含與選自以下的序列至少95％相同的氨基酸序列(a)SEQ ID NO2的多肽片段；(b)具有生物學(xué)活性的SEQ ID NO2的多肽片段；(c)SEQ ID NO2的多肽結(jié)構(gòu)域；(d)SEQ ID NO2的多肽表位；(e)SEQ ID No2的分泌型的成熟形式；(f)SEQ ID No2的全長分泌型；(g)SEQ ID NO2的變體；(h)SEQ ID NO2的等位基因變體；或(i)SEQ ID NO2的物種同系物。
26.用于個(gè)體腫瘤診斷的方法，其包括測定該個(gè)體的細(xì)胞或體液中編碼C35蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)水平，并與標(biāo)準(zhǔn)C35基因表達(dá)水平相比較，基因表達(dá)水平超過標(biāo)準(zhǔn)則預(yù)示惡性腫瘤。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述腫瘤是人乳腺癌。
28.藥物組合物，其包含權(quán)利要求11的分離的多肽及藥物可接受的載體。
29.權(quán)利要求28的藥物組合物，其另外包含佐劑。
30.在宿主中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，其包含給予所述宿主權(quán)利要求28或29的藥物組合物。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述宿主是人。
32.在宿主中產(chǎn)生特異性抗體和/或T細(xì)胞的方法，其包含在所述宿主中引入足夠量的病毒載體，以刺激產(chǎn)生特異性抗體和/或T細(xì)胞，其中所述病毒載體包含可操作性連接啟動子的、能夠在所述宿主中表達(dá)的編碼C35抗原的多核苷酸。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述宿主是人。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述抗體和/或T細(xì)胞特異性針對人的癌癥。
35.權(quán)利要求32的方法，其中所述病毒載體是痘苗病毒。
36.權(quán)利要求32的方法，其中所述病毒載體是活的。
37.權(quán)利要求32的方法，其中所述病毒載體是減毒的。
全文摘要
本發(fā)明涉及在人類癌癥中差異表達(dá)的新的人基因。更具體而言，本發(fā)明涉及編碼在人乳腺癌和膀胱癌中過表達(dá)的、稱為C35的新的人多肽的多核苷酸。本發(fā)明還涉及C35多肽及其載體、宿主細(xì)胞、C35多肽的抗體，及其重組制備方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及檢測癌的診斷方法，包括人乳腺癌。本發(fā)明另外涉及C35基因及多肽在免疫原性組合物或疫苗中的組成和應(yīng)用，以誘導(dǎo)針對表達(dá)C35基因的靶細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)抗體或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。本發(fā)明還涉及鑒定C35活性的激動劑和拮抗劑的篩選方法。
文檔編號A61K48/00GK1610743SQ01817804
公開日2005年4月27日 申請日期2001年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月4日
發(fā)明者M·佐德爾, E·E·埃文斯, M·A·博雷羅 申請人:羅切斯特大學(xué)