專利名稱：：通過操作信使rna前體加工而提供的針對(duì)環(huán)境毒性的保護(hù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及參與信使RNA前體加工的核酸和蛋白質(zhì)用于在真核細(xì)胞和生物體中增強(qiáng)針對(duì)環(huán)境壓力(諸如無機(jī)鹽毒性)的耐受性的用途。
背景技術(shù)：
：對(duì)鋰和鈉毒性敏感的細(xì)胞靶的本質(zhì)為我們呈現(xiàn)了關(guān)于真核細(xì)胞中離子穩(wěn)態(tài)生理學(xué)的重要圖譜。這些靶的表征對(duì)于理解臨床問題諸如鋰對(duì)偶極紊亂治療的影響(Schou，1997，Arch.Gen.Psychiatry，549)或與高血壓有關(guān)的高鈉水平(Lifton，1996，Science，272676)是至關(guān)重要的。完全不同但也與離子穩(wěn)態(tài)有關(guān)的另一個(gè)問題是耕地在大量灌溉后的漸進(jìn)鹽化，為了在干旱地區(qū)發(fā)展足夠的農(nóng)業(yè)，這使得培育耐鹽農(nóng)作物成為迫切需要(Serrano，1996，Int.Rev.Cytol.，1651；Yeo，1998，J.Exp.Bot.，49915；Holmberg和Bülow，1998，TrendsPlantSci.，361)。除了離子運(yùn)輸(Haro等人，1991，F(xiàn)EBSLett.，291189；Gaxiola等人，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，961480；Apse等人，1999，Science，2851256)和滲壓劑合成(Tarczynski等人，1998，PlantJ.，16155)，操作對(duì)高離子濃度和水壓力最敏感的細(xì)胞系統(tǒng)提供了改進(jìn)農(nóng)作物鹽耐受性的候選途徑(Serrano，1996，Int.Rev.Cytol.，1651；Tezara等人，1999，Nature，401914)。遺傳和生化分析已經(jīng)將酵母基因HAL2的產(chǎn)物鑒定為鹽毒性的重要生理靶(Glser等人，1993，EMBOJ.，123105；Dichtl等人，1997，EMBOJ.，167184)。HAL2編碼3’，5’-二磷酸核苷酸酶，它對(duì)鋰和鈉的抑制非常敏感(Murguá等人，1995，Science，267232)。Hal2p的鹽抑制導(dǎo)致有毒化合物3’-磷酸腺苷5’-磷酸(pAp)的胞內(nèi)積累(Murguá等人，1996，J.Biol.Chem.，27129029)，繼而抑制硫酸基團(tuán)的還原和轉(zhuǎn)移反應(yīng)，并抑制有些外切核糖核酸酶(Dichtl等人，1997，EMBOJ.，167184；Gil-Mascarell等人，1999，PlantJ.，17373)。植物(Gil-Mascarell等人，1999，PlantJ.，17373)和哺乳動(dòng)物(López-Coronado等人，1999，J.Biol.Chem.，27416043)中存在與HAL2同源的基因，盡管后者中所編碼的酶受到鋰但非鈉的抑制。Hal2p的野生型蛋白質(zhì)和耐受鋰與鈉的突變形式的過度表達(dá)所賦予的鹽耐受性較為適中(Albert等人，2000，J.Mol.Biol.，295927)。這說明還存在鹽毒性的其它靶，而且一旦克服了HAL2瓶頸，它們將成為限制性因素，但是尚不知道這些重要的鹽敏感過程。下面的兩項(xiàng)專利申請(qǐng)涉及滲透壓，但描述的保護(hù)機(jī)制與本發(fā)明描述的普遍機(jī)制不同ES2110918A(1998-02-16)涉及通過操作碳水化合物代謝而生成耐受性滲透壓的植物；ES2134155A1(1998-10-07)涉及通過在淡土植物中使用編碼具有過氧化物酶活性的蛋白質(zhì)的基因而賦予對(duì)滲透、水、和鹽壓力的耐受性的方法。發(fā)明概述本發(fā)明隱含的技術(shù)問題是提供可用于為遭受由鹽、干旱、或寒冷和凍結(jié)壓力引起的壓力條件(像滲透壓)的細(xì)胞和生物體增強(qiáng)壓力耐受性的方法。本發(fā)明通過操作信使RNA加工而在細(xì)胞和生物體中提供了針對(duì)滲透壓的保護(hù)，從而解決了這個(gè)技術(shù)問題。本發(fā)明提供了能夠賦予異源宿主細(xì)胞或宿主生物體以針對(duì)壓力條件的耐受性的一套分離基因。這些基因都參與mRNA前體的加工(諸如合成、剪接、5’和3’末端修飾、運(yùn)動(dòng)、運(yùn)輸至細(xì)胞質(zhì)、代謝、等)，而且它們?cè)诜珠_轉(zhuǎn)化對(duì)鹽敏感的酵母突變體后都顯示抗鹽表型。由此，每種基因都能擔(dān)當(dāng)壓力耐受性的有效增強(qiáng)劑，而無需其它因素的輔助。這套基因包括SR樣蛋白質(zhì)、(核)RNA結(jié)合因子、核糖核蛋白復(fù)合物成分、轉(zhuǎn)錄因子和核移動(dòng)蛋白，它們使得本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能夠在遺傳學(xué)上改變目的生物體，使之耐受性壓力處境，諸如滲透壓處境，更具體的說是無機(jī)鹽或Na+或Li+毒性。公開的每種基因都使得本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能夠通過將至少一種上述基因?qū)爰?xì)胞來更改細(xì)胞命運(yùn)和/或植物發(fā)育和/或生化和/或生理。對(duì)于例如農(nóng)作物的栽培，它們中的許多對(duì)壓力條件像鹽、干旱、或寒冷敏感，本發(fā)明公開的基因提供了解決產(chǎn)量降低和經(jīng)濟(jì)利益降低問題的可能性。本發(fā)明提供了通過操作信使RNA前體加工來解決由環(huán)境壓力引起的細(xì)胞毒性的方法，而且本發(fā)明的實(shí)施方案包括方法、核酸、多肽、載體、宿主細(xì)胞、和轉(zhuǎn)基因生物體像轉(zhuǎn)基因植物。發(fā)明詳述土壤鹽度是對(duì)植物農(nóng)業(yè)而言最重要的非生物或環(huán)境壓力之一。除了普遍改進(jìn)農(nóng)作物鹽耐受性的實(shí)踐目的，鹽耐受性研究還是基礎(chǔ)植物生物學(xué)的一個(gè)重要部分。同樣，關(guān)于其它兩項(xiàng)主要的非生物壓力即干旱和寒冷的研究與鹽壓力工作有密切聯(lián)系。例如，受到鹽壓力調(diào)控的許多基因也響應(yīng)干旱或寒冷壓力(ZhuJ.K.，1997，Molecularaspectsofosmoticstressinplants即植物中滲透壓的分子方面，CRCCrit.Rev.PlantSci.，16253-277)。因而，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能夠推定的，當(dāng)分離基因在轉(zhuǎn)染宿主生物體后賦予其以鹽耐受性時(shí)，它還能夠賦予針對(duì)寒冷和/或干旱壓力的耐受性。鹽、干旱、和寒冷被認(rèn)為是滲透壓的三種最重要形式。為了在真核細(xì)胞中鑒定環(huán)境毒性的新靶，發(fā)明人表征了在酵母細(xì)胞中表達(dá)時(shí)賦予對(duì)無機(jī)鹽的耐受性增加的基因。因此，搜索了能夠通過在酵母細(xì)胞中過度表達(dá)而賦予鹽壓力耐受性的擬南芥(Arabidopsisthaliana)(Minet等人，1992，Plant.J.，2417)和甜菜(Betavulgaris)cDNA文庫(kù)，其中通過向培養(yǎng)基中添加甲硫氨酸來避免pAp的積累及其毒性作用(Glser等人，1993，EMBOJ.，123105；Dichtl等人，1997，EMBOJ.，167184；Murguá等人，1995，Science，267232；Murguá等人，1996，J.Biol.Chem.，27129029)。這種策略的結(jié)果就是產(chǎn)生了本發(fā)明。這是用于鑒定參與植物應(yīng)答鹽壓力的基因和蛋白質(zhì)的功能性方法。為此目的，如實(shí)施例1和實(shí)施例3所述構(gòu)建了cDNA表達(dá)庫(kù)，并將感受態(tài)酵母菌株(見實(shí)施例2)用于篩選在過度表達(dá)時(shí)提高酵母鹽耐受性的cDNA。這些酵母菌株的生長(zhǎng)通常在與削弱大多數(shù)農(nóng)作物生長(zhǎng)的NaCl或LiCl濃度相似的高濃度(150mM)下受到抑制。在用cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞后，合并菌落，并對(duì)它們選擇存在150mMNaCl時(shí)的生長(zhǎng)能力。實(shí)施例4進(jìn)一步描述了這種篩選流程。增強(qiáng)鹽耐受性的擬南芥基因的分離篩選了大約7.5×105個(gè)轉(zhuǎn)化體的擬南芥cDNA文庫(kù)，并分離得到能夠在酵母中賦予針對(duì)高鹽濃度的耐受性的3個(gè)獨(dú)立克隆(圖1)。令人驚訝的是，這3種cDNA編碼的蛋白質(zhì)都參與信使RNA前體的加工。將這3種蛋白質(zhì)稱為Ct-SRL1、RCY1、和U1A。這些蛋白質(zhì)中的兩種屬于所謂的“SR樣”或“富含交替精氨酸的”因子家族，其特征是包含具有高含量的Arg殘基與Ser、Asp、和/或Glu交替的結(jié)構(gòu)域(RS結(jié)構(gòu)域)(圖2)。該家族的成員參與組成性和/或旁路剪接，并且參與信使RNA的加工和代謝過程中不同步驟(轉(zhuǎn)錄、5’和3’末端修飾、和前mRNA剪接、將成熟RNA運(yùn)輸至細(xì)胞質(zhì)、等)的偶聯(lián)。具有SEQIDNO.3所列氨基酸序列的Ct-SRL1蛋白質(zhì)是由本文鑒定為SEQIDNO.1的cDNA編碼的，它還發(fā)現(xiàn)于來自P1克隆MNJ8(Genbank編號(hào)AB017069)的擬南芥5號(hào)染色體的基因組區(qū)域。同樣，SEQIDNO.3的蛋白質(zhì)序列也呈現(xiàn)于公開的數(shù)據(jù)庫(kù)，編號(hào)BAB09109，但是尚未指出該序列有任何功能。Ct-SRL1的cDNA不是全長(zhǎng)的，它編碼推測(cè)的SR樣蛋白質(zhì)(包含RS結(jié)構(gòu)域)的羧基末端。它在酵母中的表達(dá)賦予針對(duì)鋰和鈉的耐受性(圖1)。第二個(gè)克隆編碼的推定的蛋白質(zhì)具有與K型和T型細(xì)胞周期蛋白有關(guān)的N端細(xì)胞周期蛋白結(jié)構(gòu)域和富含精氨酸的C端結(jié)構(gòu)域(圖2A)。將這種SR樣蛋白質(zhì)命名為RCY1，作為富含精氨酸的細(xì)胞周期蛋白1的變更。它在酵母中的表達(dá)賦予針對(duì)鋰和鈉的耐受性(圖1)。為了測(cè)定這種SR樣蛋白質(zhì)中RS結(jié)構(gòu)域在酵母中增強(qiáng)鹽耐受性的作用，分開克隆RCY1的細(xì)胞周期蛋白結(jié)構(gòu)域和RS結(jié)構(gòu)域，并轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞中。在圖2A中通過標(biāo)有下劃線的甲硫氨酸殘基標(biāo)記了兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的分割，并將包含RS結(jié)構(gòu)域的C端部分稱為SEQIDNO.21(圖5)。單獨(dú)的RS結(jié)構(gòu)域的表達(dá)即賦予與全長(zhǎng)蛋白質(zhì)表達(dá)相同的表型(圖3)。這些結(jié)果證明，在“SR樣”因子的情況中，是RS結(jié)構(gòu)域本身而非特定蛋白質(zhì)的表達(dá)賦予針對(duì)鹽壓力的耐受性。本文將RCY1蛋白質(zhì)的氨基酸組成呈現(xiàn)于SEQIDNO.4。本文將RCY1的cDNA鑒定為SEQIDNO.2，該序列還發(fā)現(xiàn)于來自克隆T9J22的擬南芥2號(hào)染色體序列的基因組區(qū)域。該基因組擬南芥克隆的核苷酸序列對(duì)應(yīng)于RCY1基因的部分核苷酸序列，將它注解為推定的細(xì)胞周期蛋白(編號(hào)AAC14513.1)。來自公開數(shù)據(jù)庫(kù)的這一蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)缺乏RCY1蛋白質(zhì)的前55個(gè)氨基酸。因此，將對(duì)應(yīng)于氨基末端區(qū)域的RCY1蛋白質(zhì)片段呈現(xiàn)于SEQIDNO.22。第三個(gè)擬南芥克隆編碼擬南芥的U1A蛋白質(zhì)，它是U1-snRNP的成分，后者是在前信使RNA內(nèi)含子加工最初步驟之一中識(shí)別5’-剪接位點(diǎn)的核糖核蛋白復(fù)合物。擬南芥的U1A蛋白質(zhì)先前被(Simpson等人，1995，EMBOJ.，144540-4550)描述為剪接體U1-snRNP的特異成分。U1A在酵母中的表達(dá)賦予較弱的LiCl耐受性，且不賦予NaCl耐受性(圖1)。具有SEQIDNO.6所列氨基酸組成的U1A蛋白質(zhì)是由本文鑒定為SEQIDNO.5的cDNA編碼的?？梢栽诠_的數(shù)據(jù)庫(kù)中找到該蛋白質(zhì)序列和核酸序列，編號(hào)分別是CAA90283.1和Z49991，而且具有充分的注解。上文所述序列呈現(xiàn)于圖5。在存在和缺乏甲硫氨酸時(shí)且在不同的遺傳背景中觀察上文所述表型。酵母中通過表達(dá)擬南芥克隆而得到的鹽耐受的性改進(jìn)并非由于離子運(yùn)輸?shù)拇碳?，因?yàn)樗c胞內(nèi)鋰濃度的變化無關(guān)。這是如實(shí)施例5中所述測(cè)定的。同樣，該表型在液泡運(yùn)輸缺陷的酵母菌株中得到維持。上述結(jié)果說明，可能是對(duì)另一細(xì)胞過程的作用引起了所觀察到的壓力耐受性。本發(fā)明人相信，信使RNA前體的加工可能是真核細(xì)胞中離子毒性的作用靶。這一觀點(diǎn)先前從未被描述過。與本文一致的是，發(fā)明人已經(jīng)確認(rèn)了前mRNA內(nèi)含子加工在酵母中受到例如LiCl的存在的抑制。前mRNA體內(nèi)剪接的兩項(xiàng)獨(dú)立測(cè)試支持本發(fā)明。首先，發(fā)明人測(cè)量了酵母細(xì)胞中由質(zhì)粒合成的β-半乳糖苷酶的比活，該質(zhì)粒包含由內(nèi)含子人為中斷的大腸桿菌(Escherichiacoli)LacZ基因(實(shí)施例6)。在向培養(yǎng)基中添加LiCl時(shí)，他們檢測(cè)到這種酶的積累相對(duì)于由不含內(nèi)含子的對(duì)照構(gòu)建物生成的酶有降低。擬南芥SRL1RS結(jié)構(gòu)域在這些酵母細(xì)胞中的同時(shí)表達(dá)部分阻斷所觀察到的抑制(未顯示數(shù)據(jù))。這些結(jié)果已經(jīng)得到了第二種測(cè)定法的確認(rèn)，其中發(fā)明人如實(shí)施例7中所述通過RT-PCR技術(shù)直接測(cè)定了存在鋰時(shí)對(duì)剪接的抑制。證明了存在LiCl時(shí)內(nèi)源酵母信使RNA前體例如對(duì)應(yīng)于SAR1基因的前mRNA的積累。因?yàn)槠毡榈募艚右种茖⑹紫扔绊懲ǔＲ暂^低效率得到加工的那些內(nèi)含子的消除，所以發(fā)明人為這些實(shí)驗(yàn)選擇了包含這種內(nèi)含子的SAR1前mRNA(Kao和Siliciano，1996，Mol.Cell.Biol.，16960-967)。此外，通過將酵母細(xì)胞在鹽壓力條件下保溫，發(fā)明人觀察到SAR1前mRNA的積累，和它是如何通過Ct-SRL1的同時(shí)共表達(dá)而得到部分逆轉(zhuǎn)的。發(fā)明人通過這種方法證明了存在鹽時(shí)前mRNA的加工抑制由上述擬南芥克隆之一(如Ct-SRL1)的表達(dá)而得到部分逆轉(zhuǎn)。本發(fā)明的普遍意義由過度表達(dá)Ct-SRL1cDNA的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的表型而得到確認(rèn)。與該機(jī)制普遍特征一致的是，相同Ct-SRL1cDNA在CaMV35S啟動(dòng)子控制下在擬南芥轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)以與酵母中相似的方式增加它們對(duì)NaCl和LiCl的耐受性。例如，通過在含有對(duì)野生型對(duì)照種子有毒的LiCl濃度的瓊脂平板中使轉(zhuǎn)基因種子發(fā)芽，可以觀察到這種現(xiàn)象(圖4)。3個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因系能夠生長(zhǎng)，顯示了本發(fā)明方法的效率。根據(jù)這些結(jié)果和根據(jù)分離擬南芥克隆的真正本質(zhì)，可以推斷，不管具體機(jī)制如何，對(duì)信使RNA前體加工的任何刺激都能夠抵消鹽的毒性作用，而且針對(duì)鹽壓力的這種保護(hù)作用在所有真核細(xì)胞和生物體中是普遍的。本發(fā)明的普遍特征(即針對(duì)鹽壓力的保護(hù)作用不依賴物種)通過同樣賦予鹽耐受性且同樣涉及信使RNA前體加工的甜菜基因和真核基因的分離而得到了確認(rèn)。增強(qiáng)鹽耐受性的甜菜基因的分離本發(fā)明的另一方面是篩選經(jīng)NaCl誘導(dǎo)的甜菜葉片的cDNA文庫(kù)并隨后分離得到賦予酵母細(xì)胞以壓力耐受性的七種甜菜基因的流程。下面是用于鑒定參與植物應(yīng)答鹽壓力的的甜菜基因和蛋白質(zhì)的功能性方法。為此目的，如實(shí)施例1和實(shí)施例3中所述由甜菜葉片構(gòu)建經(jīng)NaCl誘導(dǎo)的cDNA表達(dá)文庫(kù)，并將對(duì)Na+敏感的酵母突變株JM26(見實(shí)施例2)用于篩選在過度表達(dá)后增加酵母鹽耐受性的甜菜cDNA。這種酵母突變體的生長(zhǎng)通常在與削弱大多數(shù)農(nóng)作物物種生長(zhǎng)的NaCl濃度相似的濃度(150mM)下受到抑制。在用cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞后，合并菌落，并對(duì)它們選擇存在150mMNaCl時(shí)的生長(zhǎng)能力。實(shí)施例4進(jìn)一步描述了這種篩選流程。進(jìn)一步表征在高鹽濃度存活的六個(gè)陽性克隆，它們包含具有SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13、SEQIDNO.15、或SEQIDNO.17所示序列的基因。由這些基因編碼的相應(yīng)蛋白質(zhì)序列分別具有SEQIDNO.8、SEQIDNO.10、SEQIDNO.12、SEQIDNO.14、SEQIDNO.16、或SEQIDNO.18所列氨基酸組成。所有這些序列都呈現(xiàn)于圖5。令人驚訝的是，六個(gè)選定酵母克隆的每一個(gè)都受到所編碼蛋白質(zhì)參與mRNA加工的基因的轉(zhuǎn)化一種蛋白質(zhì)是推定的精氨酸-天冬氨酸RNA結(jié)合蛋白；兩種是推定的RNA結(jié)合蛋白；兩種是推定的轉(zhuǎn)錄因子；一種顯示與核運(yùn)動(dòng)蛋白有相似性。因此，正如關(guān)于本發(fā)明擬南芥基因所述且如上所述，這些蛋白質(zhì)(及其編碼基因)適合作為通過操作前mRNA加工而發(fā)揮作用的壓力耐受性增強(qiáng)劑。因此，本發(fā)明涉及SEQIDNO.7所列新的分離甜菜核酸，它編碼推定的精氨酸-天冬氨酸RNA結(jié)合蛋白，且能夠在酵母細(xì)胞中增強(qiáng)鹽耐受性。自第51位核苷酸起始、至第1079位核苷酸終止的開放讀碼框編碼SEQIDNO.8所列氨基酸序列。該多肽與擬南芥推定的精氨酸-天冬氨酸RNA結(jié)合蛋白(瑞士PROT編號(hào)AAB68037)具有76％同一性和86％相似性。氨基酸比較是使用程序GAP進(jìn)行的(符號(hào)比較表blosum62.cmp，CompCheck6430，BLOSUM62氨基酸替代矩陣，參考文獻(xiàn)HenikoffS.和HenikoffJ.G.，1992，Aminoacidsubstitutionmatricesfromproteinblocks即來自蛋白質(zhì)模塊的氨基酸替代矩陣，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8910915-10919)。該程序還用于比較下列紅甜菜多肽的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及SEQIDNO.9所列新的分離紅甜菜核酸，它編碼推定的RNA結(jié)合蛋白，且能夠在酵母細(xì)胞中增強(qiáng)鹽耐受性。自第14位核苷酸起始、至第625位核苷酸終止的開放讀碼框編碼SEQIDNO.10所列氨基酸序列。該多肽與擬南芥推定的RNA結(jié)合蛋白(瑞士PROT編號(hào)AAG52616.1)具有68％同一性和78％相似性。本發(fā)明還涉及SEQIDNO.11(也稱為克隆或序列編號(hào)11)所列新的分離紅甜菜核酸，它編碼推定的轉(zhuǎn)錄因子，且能夠在酵母細(xì)胞中增強(qiáng)鹽耐受性。自第51位核苷酸起始、至第1119位核苷酸終止的開放讀碼框編碼SEQIDNO.12所列氨基酸序列。該多肽與菠菜(Spinaciaoleracea)核RNA結(jié)合蛋白(瑞士PROT編號(hào)AAF14145.1)具有81％同一性和86％相似性。SEQIDNO.11的第1-475位核苷酸發(fā)表于EST數(shù)據(jù)庫(kù)，編號(hào)BF011019，描述為甜菜發(fā)芽cDNA文庫(kù)的DNA片段，而且與推定的轉(zhuǎn)錄因子相似。本發(fā)明還涉及SEQIDNO.13所列新的分離紅甜菜核酸，它編碼推定的轉(zhuǎn)錄因子，且能夠在酵母細(xì)胞中增強(qiáng)鹽耐受性。自第51位核苷酸起始、至第1121位核苷酸終止的開放讀碼框編碼SEQIDNO.14所列氨基酸序列。該多肽與菠菜核RNA結(jié)合蛋白(瑞士PROT編號(hào)AAF14144.1)具有81％同一性和87％相似性。本發(fā)明還涉及SEQIDNO.15所列新的分離紅甜菜核酸，它編碼推定的RNA結(jié)合蛋白，且能夠在酵母細(xì)胞中增強(qiáng)鹽耐受性。自第2位核苷酸起始、至第970位核苷酸終止的開放讀碼框編碼SEQIDNO.16所列氨基酸序列。該多肽與稻(Oryzasativa)推定的RNA結(jié)合蛋白(瑞士PROT編號(hào)AAG59664.1)具有68％同一性和74％相似性。本發(fā)明還涉及SEQIDNO.17所列新的分離紅甜菜核酸，它編碼未知類型的蛋白質(zhì)，且能夠在酵母細(xì)胞中增強(qiáng)鹽耐受性。自第35位核苷酸起始、至第922位核苷酸終止的開放讀碼框編碼SEQIDNO.18所列氨基酸序列。該多肽與與核運(yùn)動(dòng)蛋白相似的擬南芥蛋白質(zhì)(瑞士PROT編號(hào)BAA97317.1)具有61％同一性和69％相似性。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及用于對(duì)生物體誘導(dǎo)壓力耐受性的方法，包括表達(dá)參與信使RNA前體加工的一種或多種甜菜基因。上文所述的篩選和選擇流程同樣可用于由植物以外的其它生物體選擇基因。作為范例，選擇了在酵母細(xì)胞中增強(qiáng)鹽耐受性的家鼠(Musmusculus)序列。如SEQIDNO.19所列的該序列編碼U2snRNP輔助因子蛋白質(zhì)的推定的小亞基，且能夠在酵母細(xì)胞中增強(qiáng)鹽耐受性。自第37位核苷酸起始、至第969位核苷酸終止的開放讀碼框編碼SEQIDNO.20所列氨基酸序列。該多肽與擬南芥U2snRNP輔助因子小亞基(瑞士PROT編號(hào)BAB10638.1)具有78％同一性和84％相似性。該序列呈現(xiàn)于圖5。該結(jié)果例示了哺乳動(dòng)物基因也可用于本發(fā)明的方法。本發(fā)明的方法因而可普通應(yīng)用于通過操作信使RNA前體而賦予宿主細(xì)胞或生物體以壓力耐受性。如上所述選擇的有些酵母克隆的令人驚訝的強(qiáng)烈表型及在分離位置中和在異源背景中這些基因擔(dān)當(dāng)壓力耐受性增強(qiáng)劑的事實(shí)使得這些基因成為非常有吸引力的工具，可用于在任何目的生物體中誘導(dǎo)壓力耐受性而無需輔助化合物。這些基因在如本文所述分離和轉(zhuǎn)染的酵母細(xì)胞中增強(qiáng)滲透壓(特別是無機(jī)鹽壓力，諸如Na+和Li+)耐受性的能力清楚證明了它們將它們自身的滲透壓耐受性賦予任何異源宿主生物體的潛力。或者，本發(fā)明的每一種壓力耐受性基因都可彼此聯(lián)合，以改變細(xì)胞命運(yùn)或植物形態(tài)、植物發(fā)育、植物生化、或植物生理。依照第一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及在細(xì)胞和生物體中增強(qiáng)壓力耐受性的方法，包括操作信使RNA前體的加工過程。依照一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所述壓力可以是環(huán)境壓力，諸如但不限于滲透壓、鹽壓力、干旱壓力、寒冷壓力、或凍結(jié)壓力。依照一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的方法涉及增強(qiáng)細(xì)胞和生物體的鹽耐受性。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及保護(hù)細(xì)胞和生物體免于鹽毒性的損害的方法，包括操作信使RNA(mRNA)前體的加工過程。依照一個(gè)實(shí)施方案，操作信使RNA前體加工過程的一種方式是對(duì)參與或干預(yù)信使RNA前體加工過程或mRNA前體加工途徑之一的至少一種分子進(jìn)行遺傳或生化操作。術(shù)語“細(xì)胞”指任何原核或真核細(xì)胞。術(shù)語“生物體”指任何原核或真核起源的單細(xì)胞或多細(xì)胞生物體。本發(fā)明清楚描述的幾種基因和蛋白質(zhì)屬于可用于增強(qiáng)壓力耐受性的不同基因和蛋白質(zhì)類型。本發(fā)明的這些基因和蛋白質(zhì)已經(jīng)顯示了對(duì)mRNA加工過程有一定影響。因此，依照還有一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明涉及任何上述方法，其中包括對(duì)具有Arg-Ser、Arg-Glu、和Arg-Asp二肽高含量結(jié)構(gòu)域(RS結(jié)構(gòu)域)的蛋白質(zhì)、RNA結(jié)合蛋白、U1-snRNP或U2-snRNP復(fù)合物成分、轉(zhuǎn)錄因子、或核運(yùn)動(dòng)蛋白進(jìn)行遺傳或生化操作。本發(fā)明還涉及包含SEQIDNO.1所示核酸序列即編碼SEQIDNO.3所列氨基酸序列的分離核酸、或包含如SEQIDNO.2所示即編碼SEQIDNO.4所列氨基酸序列的核酸、或編碼包含SEQIDNO.22所示氨基酸序列的多肽的核酸用于至少一種上述方法的用途。SEQIDNO.1和2與編碼SR樣蛋白質(zhì)的基因共享實(shí)質(zhì)性同源性。本發(fā)明還涉及用于任何上述方法的包含SEQIDNO.5所示核酸序列即編碼SEQIDNO.6所列氨基酸序列的分離核酸。SEQIDNO.5與編碼I1-snRNP或U2-snRP復(fù)合物的成分的基因共享實(shí)質(zhì)性同源性。本發(fā)明還涉及用于任何上述方法的包含SEQIDNO.7、9、11、13、15、17、或19任一項(xiàng)所示核酸序列即編碼SEQIDNO.8、10、12、14、16、18、或20任一項(xiàng)所列氨基酸序列的分離核酸。SEQIDNO.7、9、13、和15與編碼RNA結(jié)合蛋白的基因共享實(shí)質(zhì)性同源性。SEQIDNO.19與編碼I1-snRNP或U2-snRP復(fù)合物的成分的基因共享實(shí)質(zhì)性同源性。SEQIDNO.11和17與編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因共享實(shí)質(zhì)性同源性。本發(fā)明還涉及選自下組且編碼蛋白質(zhì)或其免疫學(xué)活性和/或功能性片段的分離核酸(a)包含SEQIDNO.1、2、5、7、9、11、13、15、17、或19任一項(xiàng)所示DNA序列或其互補(bǔ)序列的核酸；(b)包含對(duì)應(yīng)于(a)中SEQIDNO.1、2、5、7、9、11、13、15、17、或19任一項(xiàng)的RNA序列或其互補(bǔ)序列的核酸；(c)與(a)或(b)中定義的核苷酸序列特異雜交的核酸；(d)所編碼的多肽或蛋白質(zhì)具有與SEQIDNO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、或21所示多肽至少50％、優(yōu)選至少60％、70％、或80％、更優(yōu)選至少85％或90％、最優(yōu)選95％同一的氨基酸序列的核酸；(e)所編碼的多肽或蛋白質(zhì)具有SEQIDNO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、21、或22所示氨基酸序列的核酸；(f)由于SEQIDNO.1、2、5、7、9、11、13、15、17、或19任一項(xiàng)所示或(a)-(e)中定義的核酸的核苷酸序列遺傳密碼而具有簡(jiǎn)并性的核酸；(g)由于生物體之間編碼SEQIDNO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、或21任一項(xiàng)所示多肽或蛋白質(zhì)或(a)-(e)中定義的核苷酸序列的密碼子使用率差異而具有分歧的核酸；(h)由于編碼SEQIDNO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、或21任一項(xiàng)所示多肽或蛋白質(zhì)或(a)-(e)中定義的等位基因的差異而具有分歧的核酸；(i)編碼由SEQIDNO.1、2、5、7、9、11、13、15、17、或19任一項(xiàng)所示或(a)-(e)中定義的DNA序列編碼的多肽或蛋白質(zhì)的免疫學(xué)活性和/或功能性片段的核酸；(j)編碼SEQIDNO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、或21中定義的蛋白質(zhì)或多肽或(a)-(i)中定義的核酸，且特征為所述序列是DNA、cDNA、基因組DNA、或合成DNA。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明還涉及用于任何上述方法的(a)-(j)中定義的任何核酸。本發(fā)明還涉及特異擴(kuò)增本發(fā)明核酸之一(優(yōu)選(a)-(j)中定義的那些核酸)或與之特異雜交的長(zhǎng)度為至少15個(gè)核苷酸的核酸分子。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸的載體，其中所述載體優(yōu)選表達(dá)載體，其中核酸可操作連接能夠在原核和/或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)所述序列的一種或多種控制序列。因此，本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸或載體的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可以選自細(xì)菌、昆蟲、真菌、酵母、植物、或動(dòng)物細(xì)胞。依照還有一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及編碼包含上文所述“RS結(jié)構(gòu)域”的蛋白質(zhì)的天然或合成核酸用于本文所述任何方法的用途。本發(fā)明還涉及編碼在真核細(xì)胞中參與信使RNA前體加工過程的蛋白質(zhì)的天然或合成核酸在本發(fā)明任何方法中的用途。本發(fā)明還涉及與本文所述至少一種序列具有至少50％同一性的核酸在用于增強(qiáng)壓力耐受性的方法中的用途，所述方法包括操作mRNA前體加工的過程或途徑。優(yōu)選的是，所述核酸源自真核細(xì)胞或生物體。本發(fā)明還包括對(duì)應(yīng)于至少一種本發(fā)明核酸的反義分子及其在本發(fā)明任何方法中的用途。依照還有一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及可以由至少一種本發(fā)明核酸編碼的多肽、或其同系物或衍生物、或其免疫學(xué)活性和/或功能性片段，所述多肽可以是天然的、合成的、富集的、分離的、不含細(xì)胞的、和/或重組的。這些多肽的每一種都可用于本發(fā)明的任何方法。優(yōu)選多肽是那些包含SEQIDNO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、21、或22任一項(xiàng)所示氨基酸序列的多肽、或其同系物或衍生物、或其免疫學(xué)活性和/或功能性片段。本發(fā)明還涉及生成本發(fā)明多肽的方法，包括在允許表達(dá)多肽的條件下培養(yǎng)上文所述宿主細(xì)胞并由培養(yǎng)物回收生成的多肽。本發(fā)明還涉及用于生成轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞、或植物組織的方法，包括將可表達(dá)形式或本發(fā)明載體中的本發(fā)明核酸導(dǎo)入所述植物、植物細(xì)胞、或植物組織。本發(fā)明還涉及用于生成改變的植物、植物細(xì)胞、或植物組織的方法，包括將本發(fā)明多肽直接導(dǎo)入所述植物的細(xì)胞、組織、或器官。本發(fā)明還涉及用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明多肽的表達(dá)的方法，包括將可操作連接一種或多種控制序列的本發(fā)明核酸或本發(fā)明載體穩(wěn)定導(dǎo)入植物細(xì)胞的基因組。本發(fā)明還涉及用于生成轉(zhuǎn)基因植物的方法，還包括由所述植物細(xì)胞再生植株。本發(fā)明還涉及可以通過上述方法之一獲得的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述核酸穩(wěn)定整合到所述植物細(xì)胞的基因組中。依照本發(fā)明，由于表達(dá)權(quán)利要求13的至少一種核酸或權(quán)利要求25或26的至少一種多肽或權(quán)利要求23的反義分子，可以生成耐受鹽壓力的轉(zhuǎn)基因植物。所述轉(zhuǎn)基因植物也是本發(fā)明的一部分，由于表達(dá)至少一種本發(fā)明核酸或反義分子或至少一種本發(fā)明多肽而顯示表型變化的轉(zhuǎn)基因植物也屬于本發(fā)明一部分。本發(fā)明還涉及本發(fā)明植物的任何可收獲部分，優(yōu)選選自下組種子、葉、果實(shí)、莖干培養(yǎng)物、根狀莖、根、塊莖、和鱗莖。由本發(fā)明任何植物或植物部分衍生的后代同樣是本發(fā)明的一部分。依照另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及用于在植物中增強(qiáng)壓力耐受性的方法，包括在所述植物的細(xì)胞、組織、或部分中表達(dá)本發(fā)明的至少一種核酸或至少一種多肽或反義分子。依照另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及用于在植物中改變壓力耐受性的方法，包括在所述植物的細(xì)胞、組織、或部分中表達(dá)本發(fā)明的至少一種核酸或至少一種多肽或反義分子。應(yīng)當(dāng)清楚，上述方法中的壓力耐受性可以指由環(huán)境引起的任何壓力，諸如但不限于滲透壓、鹽壓力、干旱壓力、凍結(jié)壓力、或寒冷壓力。另外，本發(fā)明的任何方法、核酸、反義分子、或多肽都可用于提高產(chǎn)量、刺激植物生長(zhǎng)(可以是該植物的任何部分，諸如根、葉、種子)(的方法)。本發(fā)明還涉及可以通過任何上述方法獲得的植物，用于在高鹽濃度的土壤上栽培，優(yōu)選鹽含量超過1mM鹽離子的土壤。由于表達(dá)本發(fā)明的任何核酸和/或蛋白質(zhì)而更加耐受鹽壓力的新的酵母菌株或其它單細(xì)胞真核生物同樣構(gòu)成本發(fā)明的一部分。本發(fā)明還涉及體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，它包括耐受鹽的、因表達(dá)至少一種核酸、載體、多肽、或權(quán)利要求23的反義分子而獲得的上文定義的動(dòng)物、植物、或宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及由本文所述方法衍生的對(duì)人的至少一種治療性應(yīng)用。本發(fā)明還涉及特異識(shí)別本發(fā)明多肽或其特定表位的抗體。本發(fā)明還涉及診斷組合物，它包含本發(fā)明的至少一種核酸、載體、反義分子、多肽、或抗體。定義和實(shí)施方案的詳述專業(yè)定義“對(duì)某一過程的操作”在本文中指干預(yù)或調(diào)控該過程，優(yōu)選增強(qiáng)、催化、改變、或變更該過程。這種干預(yù)可能對(duì)該過程的每一個(gè)步驟或每一種成分或每一種產(chǎn)物或每一種結(jié)果產(chǎn)生影響。這種干預(yù)還可能對(duì)該過程的效率、速率、或產(chǎn)量產(chǎn)生影響?！皩?duì)某一過程的遺傳操作”在本文中指通過對(duì)該過程所涉及的遺傳序列(如核苷酸序列、RNA、DNA)的任何類型干預(yù)來操作某一過程。除了細(xì)胞的天然遺傳活性諸如不同核酸的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、和加工，術(shù)語“對(duì)某一過程的遺傳操作”還包括分子生物學(xué)技術(shù)和遺傳工程技術(shù)。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員知道這些人工遺傳技術(shù)，例如克隆、轉(zhuǎn)化、重組、表達(dá)、過度表達(dá)、沉默、等。作為“對(duì)某一過程的遺傳操作”的范例，可以干預(yù)編碼參與信使RNA前體加工過程的蛋白質(zhì)的遺傳序列?；蛘撸梢愿深A(yù)直接參與信使RNA前體加工過程的RNA分子(諸如小核RNA)。在所述遺傳序列編碼蛋白質(zhì)且該編碼序列的表達(dá)、構(gòu)造、結(jié)構(gòu)、或定位遭到改變的情況中，使用術(shù)語“對(duì)某一蛋白質(zhì)的遺傳操作”。更具體的說，可以改變所述編碼序列的組成或表達(dá)，或者可以在進(jìn)行該過程的宿主細(xì)胞中導(dǎo)入或刪除所述編碼序列。更具體的說，所述蛋白質(zhì)可以是參與前mRNA加工的任何成分，諸如但不限于U1-snRNP或U2-snRNP復(fù)合物成分、轉(zhuǎn)錄因子、RNA結(jié)合蛋白、或核運(yùn)動(dòng)蛋白?！皩?duì)某一過程的生化操作”在本文中指通過使用干預(yù)所述過程的生化方法來操作所述過程。生化方法指使用對(duì)生物學(xué)過程有影響的任何物質(zhì)(化學(xué)藥品、肽、和分子)。例如，可以在進(jìn)行該過程的細(xì)胞中導(dǎo)入肽、蛋白質(zhì)、或生化或化學(xué)物質(zhì)以干預(yù)該過程。更具體的說，可以在細(xì)胞中直接導(dǎo)入由本發(fā)明基因衍生的蛋白質(zhì)或肽以增強(qiáng)信使RNA前體的加工過程。在所述生化方法涉及使用蛋白質(zhì)或肽的情況中或者在所述生化方法導(dǎo)致蛋白質(zhì)修飾的情況中，使用術(shù)語“對(duì)某一蛋白質(zhì)的生化加工”?！凹?xì)胞”在本文中理解為它的廣義，包括每一種存活細(xì)胞，諸如原核和真核細(xì)胞?！靶攀筊NA前體”在本文中指尚未成為成熟信使RNA(由其翻譯成多肽)的任何RNA分子，因?yàn)樗慕M成、結(jié)構(gòu)、或定位還有待改變?！靶攀筊NA前體的加工”在本文中指改變信使RNA前體的組成、結(jié)構(gòu)、或定位的任何過程。這種加工在真核細(xì)胞中的范例是轉(zhuǎn)錄過程中信使RNA前體的合成、前體5’和/或3’端的修飾像聚腺苷酸化、前體中內(nèi)含子的剪接像組成性或旁路剪接、前體的代謝或前體轉(zhuǎn)移至核膜、和成熟RNA運(yùn)輸至細(xì)胞質(zhì)等。前體DNA的這種加工或代謝的不同步驟的偶聯(lián)也是本說明書中所用術(shù)語“信使RNA前體的加工”的一部分。前體RNA的轉(zhuǎn)錄后加工包括核內(nèi)分解切割、核外分解消化、和共價(jià)修飾的復(fù)雜途徑。各個(gè)加工步驟的一般次序在真核細(xì)胞中是相當(dāng)保守的，但是根本的機(jī)制在很大程度上還不知道。前mRNA加工是重要的細(xì)胞活性，而且已經(jīng)在酵母細(xì)胞釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中進(jìn)行了研究(Venema和Tollervey，1995，Yeast，11(16)1629-1650)。加工步驟包括多種蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用及蛋白質(zhì)-RNA和RNA-RNA相互作用。不同轉(zhuǎn)錄因子、RNA結(jié)合蛋白、其它核蛋白諸如核運(yùn)動(dòng)蛋白、和核RNA在前mRNA加工中的精確作用在很大程度上仍然還不知道。因此，干預(yù)信使RNA前體加工過程的蛋白質(zhì)可能是許多不同類型的蛋白質(zhì)。前mRNA的核運(yùn)輸所涉及的幾種因子可用于本發(fā)明的方法，因?yàn)樗鼈儏⑴c前mRNA的加工。前mRNA主要是由位于染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域與染色質(zhì)間區(qū)域之間介面的基因轉(zhuǎn)錄得到的。部分或完全加工并與核蛋白復(fù)合后，轉(zhuǎn)錄本離開它們的合成位點(diǎn)，并經(jīng)由染色質(zhì)間區(qū)運(yùn)動(dòng)至核孔，在那里，它們被輸出機(jī)器捕獲并輸出至細(xì)胞質(zhì)。能夠運(yùn)輸?shù)膍RNA復(fù)合了正確的核蛋白補(bǔ)體(回顧見Plitz和Pderson，2000，J.Struct.Biol.，129(2-3)252-257)。U1-snRNP和U2-snRNP的作用主要在于前mRNA的剪接。U1小核核糖核蛋白顆?；驈?fù)合物U1-snRNP70K(U1-70K)基因的產(chǎn)物(一種U1-snRNP特異蛋白質(zhì))，涉及動(dòng)物及植物中前mRNA的基本及旁路剪接(Golovkin和Reddy，1996，PlantCell，81421-1435)。在其它報(bào)告中描述了U1-70K蛋白質(zhì)的不同相互作用蛋白質(zhì)，諸如SC35樣蛋白質(zhì)和富含絲氨酸/精氨酸的蛋白質(zhì)(Golovkin和Reddy，1999，J.Biol.Chem.，245(51)36428-36438)。已經(jīng)描述了U2小核核糖核蛋白輔助因子諸如U2A(Domon等人，1998，J.Biol.Chem.，273(51)34603-34610)。本發(fā)明的范圍涵蓋參與信使RNA前體剪接的任何蛋白質(zhì)。已經(jīng)描述了小核RNA在植物的前mRNA加工中的作用(Brown和Shaw，PlantCell，1998，10649-657)。因此，還可以通過干預(yù)RNA分子來建立對(duì)前mRNA加工過程的操作。Jarrous等人，1999，J.CellBiol.，146(3)559-572顯示在細(xì)胞核中可找到Rpp29和Rpp38(人RNA酶P的蛋白質(zhì)亞基)，而且它們位于卷曲體中，卷曲體是參與前體mRNA加工所需要的其它幾種小核核糖核蛋白的生物發(fā)生的細(xì)胞器。這些類型的蛋白質(zhì)是參與前mRNA加工的核糖核蛋白核糖核酸酶復(fù)合物的一部分，因而也可用于本發(fā)明的方法。本領(lǐng)域尚未精確確定核運(yùn)動(dòng)蛋白的作用。仍有許多參與信使RNA前體加工的分子有待闡明。Blencowe等人，1999，77(4)277-291TheprocessingofmessengerRNAprecursors(pre-mRNA)tomRNArequiresalargenumberofproteinsthatcontainsdomainsrichinalternatingarginineandserineresidues(RSdomains)(信使RNA前體(前mRNA)變成mRNA的加工需要包含富含交替精氨酸和絲氨酸殘基的結(jié)構(gòu)域(RS結(jié)構(gòu)域)的大量蛋白質(zhì))描述了本文所用的“SR樣蛋白質(zhì)”。它們包括剪接因子SR家族的成員和在結(jié)構(gòu)上和在功能上與SR家族截然不同的蛋白質(zhì)，下文共同稱為SR相關(guān)蛋白質(zhì)。兩組RS結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)都在組成性和受控前mRNA剪接中發(fā)揮功能。最近，鑒定了幾種SR相關(guān)蛋白質(zhì)與mRNA3’端形成有關(guān)且參與輸出。Blencowe等人，1999，77(4)277-291進(jìn)一步回顧了包含RS結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可能在前mRNA合成和加工的不同步驟的協(xié)調(diào)中發(fā)揮基礎(chǔ)作用的證據(jù)。通用定義術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“肽”、“寡肽”、或“多肽”在用于本文時(shí)指任何長(zhǎng)度的聚合形式的氨基酸。所述術(shù)語還包括已知的氨基酸修飾，諸如形成二硫鍵、半胱氨酸化、氧化、谷胱甘肽化、甲基化、乙?；⒎峄?、生物素化、硬脂?；?、甲?；⑻砑恿蛐了?、磷酸化、硫酸化、遍在蛋白化、豆蔻?；?、棕櫚酰化、香葉基香葉基化、環(huán)化(如形成焦谷氨酸)、氧化、脫酰胺作用、脫水、糖基化(如戊糖、己糖胺、N-乙酰己糖胺、脫氧己糖、己糖、唾液酸、等)、?；⒑头派湫詷?biāo)記(如125I、131I、35S、14C、32P、33P、3H)及非天然存在的氨基酸殘基、L-氨基酸殘基和D-氨基酸殘基。本發(fā)明蛋白質(zhì)的“同系物”指那些相對(duì)于所述蛋白質(zhì)而言包含氨基酸替代、刪除、和/或添加的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、和酶，即相對(duì)于所述蛋白質(zhì)而言，它們是未曾改變它的一項(xiàng)或多項(xiàng)功能特性、特別是未曾降低所生成活性的同系物。例如，所述蛋白質(zhì)的同系物將包括所述蛋白質(zhì)的生物活性氨基酸序列變體。為了生成這種同系物，可以用具有相似特性(例如疏水性、親水性、疏水矩、抗原性、形成或打斷α-螺旋結(jié)構(gòu)或β-折疊結(jié)構(gòu)的傾向、等等)的其它氨基酸替代所述蛋白質(zhì)中存在的氨基酸。本發(fā)明蛋白質(zhì)的替代性變體指那些其中消除了所述蛋白質(zhì)氨基酸序列中的至少一個(gè)殘基并在該位置插入了不同殘基的變體。氨基酸替代通常指單個(gè)殘基，但是根據(jù)對(duì)多肽的功能性約束可以成簇；插入通常是1-10個(gè)氨基酸殘基的數(shù)量級(jí)，刪除的范圍是大約1-20個(gè)殘基。優(yōu)選的是，氨基酸替代將包括保守氨基酸替代，諸如上文所述。本發(fā)明蛋白質(zhì)的插入性變體指那些其中在所述蛋白質(zhì)的預(yù)定位點(diǎn)導(dǎo)入了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的變體。插入可以包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基末端和/或羧基末端融合及序列內(nèi)插入。一般而言，氨基酸序列內(nèi)插入將小于氨基或羧基末端融合，數(shù)量級(jí)是大約1-10個(gè)殘基。氨基或羧基末端融合蛋白質(zhì)或肽的范例包括用于酵母雙雜交系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄激活劑的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或激活結(jié)構(gòu)域、噬菌體外殼蛋白、His6標(biāo)簽、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、蛋白A、麥芽糖結(jié)合蛋白、二氫葉酸還原酶、Tag·100表位(EETARFQPGYRS)、c-myc表位(EQKLISEEDL)、FLAG表位(DYKDDDK)、lacZ、CMP(鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽)、HA表位(YPYDVPDYA)、蛋白C表位(EDQVDPRLIDGK)、和VSV表位(YTDIEMNRLGK)。本發(fā)明蛋白質(zhì)的刪除性變體的特征是由所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列消除了一個(gè)或多個(gè)氨基酸。使用本領(lǐng)域眾所周知的肽合成技術(shù)(諸如固相肽合成法等)或重組DNA操作，可以容易的生成本發(fā)明蛋白質(zhì)的氨基酸變體。用于生成蛋白質(zhì)變體(表示為替代性、插入性、或刪除性變體)的DNA序列操作在本領(lǐng)域是眾所周知的。例如，用于在具有已知序列的DNA中預(yù)定位點(diǎn)生成替代性突變的技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員而言是眾所周知的，諸如M13誘變、T7-Gen體外誘變?cè)噭┖?USB，Cleveland，OH)、QuickChangeSiteDirectedmutagenesiskit即快速改變定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene，SanDiego，CA)、由PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變、或其它定點(diǎn)誘變方案。用于生成蛋白質(zhì)變體(表示為替代性、插入性、或刪除性變體)的DNA序列操作的另一種候選方案包括靶向體內(nèi)基因修飾，這可以如先前所述(Palmgren，1997；Yoon等人，1996)通過嵌合RNA/DNA寡核苷酸來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明蛋白質(zhì)的“衍生物”指那些包含所述多肽的至少大約五個(gè)連續(xù)氨基酸殘基但保留所述蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、和酶。相對(duì)于所述多肽的天然存在形式的氨基酸序列而言，“衍生物”還可以額外包含天然存在的、不同糖基化的、?；?、或非天然存在的氨基酸殘基?；蛘?另外，相對(duì)于所述多肽的天然存在形式的氨基酸序列而言，衍生物還可以包含一個(gè)或多個(gè)非氨基酸替代基，例如共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合在氨基酸序列上的報(bào)告分子或其它配體，諸如結(jié)合在氨基酸序列上以便于其檢測(cè)的報(bào)告分子?！懊庖邔W(xué)活性”指受到抗體的識(shí)別即與之結(jié)合的分子或其特定片段諸如表位或半抗原。本發(fā)明的內(nèi)容還包括任何本發(fā)明多肽的同系物、衍生物、和/或免疫學(xué)活性片段?！翱贵w”包括單克隆、多克隆、合成、或重鏈抗體，以及抗體片段諸如Fab、Fv、或scFv片段。可以通過先前所述(Liddle和Cryer，1991)技術(shù)來制備單克隆抗體，包括融合小鼠骨髓瘤細(xì)胞與衍生自免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞。術(shù)語“抗體”還包括它們的衍生物，諸如標(biāo)記抗體?？贵w標(biāo)記包括堿性磷酸酶、PKH2、PKH26、PKH67、熒光素(FITC)、Hoechst33258、R-藻紅蛋白(PE)、羅丹明(TRITC)、QuantumRed、德克薩斯紅、Cy3、生物素、瓊脂糖、過氧化物酶、金球、和放射性標(biāo)記(如125I、131I、35S、14C、32P、33P、3H)。依賴針對(duì)蛋白質(zhì)的抗體的分子生物學(xué)工具包括蛋白質(zhì)凝膠印跡分析、能夠鑒定基因的表達(dá)文庫(kù)篩選、蛋白質(zhì)定量法包括ELISA和RIA、蛋白質(zhì)的免疫親和純化、蛋白質(zhì)的免疫沉淀(Magyar等人，1997)、和免疫定位?？贵w(尤其是肽抗體)的其它用途包括研究蛋白水解加工(Loffler等人，1994；Woulfe等人，1994)、測(cè)定蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)(Lerner，1982)、研究前體和翻譯后加工(Baron和Baltimore，1982；Lerner等人，1981；Semler等人，1982)、鑒定蛋白質(zhì)參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)域(Murakami等人，1992)、和研究基因表達(dá)中的外顯子使用(Tamura等人，1991)。本發(fā)明的范圍還包括識(shí)別上文定義的本發(fā)明蛋白質(zhì)或其同系物、衍生物、或片段的抗體。術(shù)語“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“DNA序列”、或“核酸分子”在用于本文時(shí)指任何長(zhǎng)度的聚合形式的核苷酸(核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或二者組合)。所述術(shù)語還包括雙鏈和單鏈DNA和RNA。所述術(shù)語還包括已知的核苷酸修飾，諸如甲基化、環(huán)化和“加帽”、和用類似物諸如次黃苷替代一個(gè)或多個(gè)天然存在的核苷酸。所述術(shù)語還涵蓋肽核酸(PNA)，這是一種DNA類似物，其中主鏈?zhǔn)怯蒒-(2-氨乙基)-甘氨酸單位而非糖構(gòu)成的假肽。PNA模擬DNA的性質(zhì)，且結(jié)合互補(bǔ)核酸鏈。PNA的中性主鏈導(dǎo)致比通常更強(qiáng)的結(jié)合和更強(qiáng)的特異性。另外，已經(jīng)將PNA的獨(dú)特的化學(xué)、物理、和生物學(xué)特性用于生成有力的生物分子工具、反義和反基因試劑、分子探針、和生物傳感器?！爸亟MDNA分子”或“嵌合基因”指通過連接來自不同來源的DNA片段而生成的雜種DNA?！爱愒春怂嵝蛄小敝概c啟動(dòng)子序列并非天然相關(guān)的序列。盡管該核苷酸序列對(duì)于啟動(dòng)子序列而言是異源的，然而它對(duì)于植物宿主而言可能是同源的、天然的、異源的、或外源的?！坝辛x鏈”指雙鏈DNA分子中與其mRNA轉(zhuǎn)錄本同源的那條鏈。“反義鏈”包含與有義鏈”序列互補(bǔ)的倒置序列?！熬幋a序列”或“開放讀碼框”或“ORF”定義為在置于適當(dāng)調(diào)控序列的控制下時(shí)即當(dāng)所述編碼序列或ORF以可表達(dá)形式存在時(shí)能夠轉(zhuǎn)錄成mRNA和/或翻譯成多肽的核苷酸序列。所述編碼序列或ORF以5’翻譯起始密碼子和3’翻譯終止密碼子為界。編碼序列或ORF可以包括但不限于RNA、mRNA、cDNA、重組核苷酸序列、合成制造的核苷酸序列、或基因組DNA。所述編碼序列或ORF可以用干預(yù)性核酸序列中斷?；旧暇幋a相同蛋白質(zhì)但由不同來源分離的基因和編碼序列可以由充分不同的核酸序列構(gòu)成。相反，充分不同的核酸序列可以設(shè)計(jì)用于實(shí)現(xiàn)本質(zhì)上相同蛋白質(zhì)的表達(dá)。所述核酸序列是例如指定基因存在的不同等位基因或遺傳密碼的簡(jiǎn)并性或密碼子使用率的差異的結(jié)果。因而，氨基酸諸如甲硫氨酸和色氨酸是一種密碼子編碼，而其它氨基酸諸如精氨酸、亮氨酸、和絲氨酸每一種都能夠由多達(dá)六種不同密碼子翻譯而成。下文為根癌農(nóng)桿菌(Agrobateriumtumefaciens)(細(xì)菌)、擬南芥、紫苜蓿(Medicagosativa)(兩種雙子葉植物)、和稻(單子葉植物)例示了優(yōu)選密碼子使用率的差異。這些范例摘錄自http//www.kazusa.or.jp/codon。作為一個(gè)范例，密碼子GGC(甘氨酸)是根癌農(nóng)桿菌中最頻繁使用的密碼子(36.2‰)，是稻中第二個(gè)最頻繁使用的密碼子，但是在擬南芥和紫苜蓿的使用率則低得多(分別是9‰和8.4‰)。在編碼甘氨酸的四種可能密碼子中(見表2)，所述GGC密碼子在根癌農(nóng)桿菌和稻中是最優(yōu)選使用的。然而，在擬南芥中是GGA(和GGU)密碼子，在紫苜蓿中是GGU(和GGA)密碼子。等位基因變體還定義為包含單核苷酸多態(tài)性(SNP)及小插入/刪除多態(tài)性(INDEL；INDEL的大小通常小于100bp)。SNP和INDEL在大多數(shù)生物體的天然發(fā)生多態(tài)性菌株中形成最大一套序列變體。它們有助于基因作圖和基因及基因功能的發(fā)現(xiàn)。它們還有助于鑒定參與決定性過程諸如生長(zhǎng)速率、植株大小和植株產(chǎn)量、植株活力、疾病抵抗力、壓力耐受性、等的遺傳基因座(如植物基因)?，F(xiàn)在有許多技術(shù)可用于鑒定SNP和/或INDEL，包括(1)PCR及隨后的變性高效液相層析(DHPLC；如Cho等人，1999)；(2)恒定變性劑毛細(xì)管電泳(CDCE)聯(lián)合高保真PCR(如Li-Sucholeiki等人，1999)；(3)變性梯度凝膠電泳(如Fischer和Lerman，1983)；(4)矩陣輔助激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS；如Ross等人，2000)；(5)實(shí)時(shí)熒光監(jiān)控PCR測(cè)定法(如Tapp等人，2000)；(6)AcryditeTM凝膠技術(shù)(如Kenney等人，1998)；(7)循環(huán)雙脫氧指紋(CddF；如Langemeier等人，1994)；(8)單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析(如Vidal-Puig和Moller，1994)；和(9)小型測(cè)序引物延伸反應(yīng)(如Syvanen，1999)。上文(1)的變體“基因組中靶向誘導(dǎo)局部損傷”(TILLING；McCallum等人，2000a；McCallum等人，2000b)技術(shù)也可用于在例如經(jīng)化學(xué)誘變后顯示有趣表型的植株個(gè)體中快速鑒定改變后的基因?！半s交”指充分同源的互補(bǔ)核苷酸序列彼此退火的過程。雜交過程可以完全發(fā)生于溶液中，即兩種互補(bǔ)核酸都處于溶液中。依賴這種過程的分子生物學(xué)工具包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR以及以此為基礎(chǔ)的所有方法)、扣除雜交、隨機(jī)引物延伸、核酸酶S1作圖、引物延伸、逆轉(zhuǎn)錄、cDNA合成、RNA差異顯示、和DNA序列測(cè)定。雜交過程還可以發(fā)生于互補(bǔ)核酸之一固定在基質(zhì)諸如磁珠、Sepharose即瓊脂糖珠、或任何其它樹脂上的情況。依賴這種過程的分子生物學(xué)工具包括poly(A+)mRNA的分離。雜交過程還可以發(fā)生于互補(bǔ)核酸之一固定在固相支持物諸如硝酸纖維素或尼龍膜上或者通過例如光刻法固定在例如硅質(zhì)玻璃支持物上的情況(后者稱為核酸陣列或微陣或者稱為核酸芯片)。依賴這種過程的分子生物學(xué)工具包括RNA和DNA凝膠印跡分析、菌落雜交、噬斑雜交、原位雜交、和微陣雜交。為了能夠進(jìn)行雜交，通常通過熱或化學(xué)方法使核酸分子變性，從而使雙鏈熔解成兩條單鏈和/或由單鏈核酸消除發(fā)夾或其它二級(jí)結(jié)構(gòu)。雜交嚴(yán)謹(jǐn)度受到諸如溫度、鹽濃度、和雜交緩沖液組成等條件的影響。高嚴(yán)謹(jǐn)度的雜交條件包括高溫和/或低鹽濃度(鹽包括NaCl和Na3-檸檬酸)和/或在雜交緩沖液中包含甲酰胺和/或降低雜交緩沖液中諸如SDS(去污劑)等化合物的濃度和/或由雜交緩沖液中排除諸如硫酸葡聚糖或聚乙二醇(促進(jìn)分子擁擠)等化合物。例如Sambrook等人，1989描述了常規(guī)雜交條件，但是熟練技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)可以根據(jù)已知或預(yù)期同源性和/或核酸序列的長(zhǎng)度設(shè)計(jì)許多不同的雜交條件。特異雜交指嚴(yán)謹(jǐn)條件下的雜交。足夠低的嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件對(duì)于分離上文定義的DNA序列的異源核酸是特別優(yōu)選的。產(chǎn)生所述異源性的要素包括上文討論的等位性、遺傳密碼簡(jiǎn)并性、和優(yōu)選密碼子使用率的差異。因此，本發(fā)明的范圍還涉及編碼上文定義的本發(fā)明多肽及其同系物、衍生物、和/或免疫學(xué)片段的本發(fā)明DNA序列在任何雜交方法中的用途。本發(fā)明還涉及與所述本發(fā)明DNA序列發(fā)生雜交的DNA序列?！疤禺悢U(kuò)增”在本文中指選擇性且只擴(kuò)增具有特定堿基對(duì)組成的核酸序列的擴(kuò)增方法(如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))。本發(fā)明定義的DNA序列可以由間插序列中斷?！伴g插序列”指中斷包含所述本發(fā)明DNA序列的編碼序列或中斷包含所述本發(fā)明DNA序列的DNA序列可表達(dá)形式的任何核酸序列。消除間插序列能夠恢復(fù)所述編碼序列或所述可表達(dá)形式。間插序列的范例包括內(nèi)含子、可轉(zhuǎn)移DNA序列諸如轉(zhuǎn)座子、和DNA標(biāo)簽諸如T-DNA?！翱赊D(zhuǎn)移DNA序列”指可以因重組事件而轉(zhuǎn)移的任何DNA序列。為了實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)在細(xì)胞、組織、或器官(優(yōu)選植物起源)中的表達(dá)，可以將蛋白質(zhì)直接導(dǎo)入所述細(xì)胞，諸如通過顯微注射或彈果手段，或者可以可表達(dá)形式將編碼所述蛋白質(zhì)的分離核酸分子導(dǎo)入所述細(xì)胞、組織、或器官。優(yōu)選的是，本發(fā)明的DNA序列包含編碼上文定義的本發(fā)明蛋白質(zhì)或其同系物或衍生物或其免疫學(xué)活性片段的編碼序列或開放讀碼框(ORF)。本發(fā)明的優(yōu)選蛋白質(zhì)包含SEQIDNO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、和21所示氨基酸序列?！拜d體”或“載體序列”指可以通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入生物體且可以在所述生物體中穩(wěn)定維持的DNA序列。在例如大腸桿菌、根癌農(nóng)桿菌、釀酒酵母、或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的培養(yǎng)物中維持載體是可能的?？梢栽诩?xì)菌和/或病毒中維持和擴(kuò)增其它載體諸如噬菌粒和粘粒載體。載體序列通常包含由限制酶識(shí)別的一套獨(dú)特位點(diǎn)即多克隆位點(diǎn)(MCS)，其中可以插入一種或多種非載體序列?！胺禽d體序列”因此指整合到載體所含MCS的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)中的DNA序列?！氨磉_(dá)載體”是一小群載體，其由于包含能夠使插入的非載體序列成為可表達(dá)形式的適當(dāng)調(diào)控序列，因而能夠表達(dá)由所述非載體序列編碼的蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域知道表達(dá)載體能夠在生物體包括細(xì)菌(如大腸桿菌)、真菌(如釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris))、昆蟲細(xì)胞(如桿狀病毒表達(dá)載體)、動(dòng)物細(xì)胞(如COS或CHO細(xì)胞)、和植物細(xì)胞(如基于馬鈴薯病毒X的表達(dá)載體，參閱例如Vance等人，1998，WO9844097)中表達(dá)蛋白質(zhì)。有關(guān)典型的植物表達(dá)載體也可參閱本說明書。本發(fā)明清楚包括包含非載體DNA序列的任何載體或表達(dá)載體，所述非載體DNA序列包含依照本發(fā)明的核苷酸序列或編碼上文定義的本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其同系物、衍生物、和/或免疫學(xué)活性片段。作為在生物學(xué)系統(tǒng)中由表達(dá)載體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)生成的候選方案，可以應(yīng)用蛋白質(zhì)化學(xué)合成?？梢砸合嗷蚬滔嗪铣呻摹Ｈ欢?，固相肽合成法(Merrifield，1963)是最常用的方法，它涉及連續(xù)添加氨基酸而形成線性肽鏈?！翱杀磉_(dá)形式”或“在表達(dá)控制序列的控制之下”指分離核酸分子處于適合于轉(zhuǎn)錄成mRNA和/或翻譯成蛋白質(zhì)的形式，其或是組成性的或是在受到胞內(nèi)或胞外信號(hào)(諸如環(huán)境刺激或壓力(促分裂原、缺氧、低氧、溫度、鹽、光、脫水、等)或化學(xué)化合物諸如IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)或諸如抗生素(四環(huán)素、氨芐青霉素、利福平、卡那霉素)、激素(如赤霉素、生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、糖皮質(zhì)激素、油菜素類固醇、乙烯、脫落酸、等)、激素類似物(碘乙酸(IAA)、2，4-D、等)、金屬(鋅、銅、鐵、等)、或地塞米松、等)的誘導(dǎo)之后發(fā)生轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道的，功能性蛋白質(zhì)的表達(dá)可能還需要一種或多種翻譯后修飾，諸如糖基化、磷酸化、去磷酸化、或一種或多種蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、等。術(shù)語“可表達(dá)形式”的范圍包括所有這些過程。優(yōu)選的是，通過在所述細(xì)胞、組織、或器官中導(dǎo)入并表達(dá)編碼所述蛋白質(zhì)的分離核酸分子(諸如cDNA分子、基因組基因、合成寡核苷酸分子、mRNA分子、或開放讀碼框)來實(shí)現(xiàn)所述蛋白質(zhì)在特定細(xì)胞、組織、或器官(優(yōu)選植物起源)中的表達(dá)，其中所述核酸分子可操作連接合適的調(diào)控序列，包括啟動(dòng)子(優(yōu)選植物可表達(dá)啟動(dòng)子)和終止子序列?！罢{(diào)控序列”指實(shí)現(xiàn)其所連接編碼序列的表達(dá)所必需的控制DNA序列。這種控制序列的本質(zhì)隨宿主生物體而不同。在原核生物中，控制序列通常包含啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、和終止子。在真核生物中，控制細(xì)胞通常包含啟動(dòng)子、終止子、和增強(qiáng)子或沉默子。本發(fā)明的范圍還包括本發(fā)明中定義的與任何調(diào)控序列融合的核苷酸序列。術(shù)語“控制序列”意欲在最低限度上包含表達(dá)所必需的所有成分，而且還可以包含額外的有利成分和決定何時(shí)、如何、和何處表達(dá)特定基因的成分?！皢?dòng)子”在本文中采用它的廣義，包括由經(jīng)典真核基因組基因衍生的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，它包含精確轉(zhuǎn)錄起始所需要的TATA盒，連同或不含CCAAT盒序列和應(yīng)答發(fā)育和/或外部刺激或以組織特異方式改變基因表達(dá)的額外調(diào)控元件(即上游激活序列、增強(qiáng)子、和沉默子)。術(shù)語“啟動(dòng)子”還包括經(jīng)典原核基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，在這種情況中，它可以包含-35盒序列和/或-10盒轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。術(shù)語“啟動(dòng)子”還用于描述在細(xì)胞、組織、或器官中賦予、激活、或增強(qiáng)核酸分子表達(dá)的合成或融合分子或衍生物。啟動(dòng)子可以包含一種或多種特定調(diào)控元件的額外拷貝，以進(jìn)一步增強(qiáng)它可操作連接的核酸分子的表達(dá)和/或改變其空間表達(dá)和/或時(shí)間表達(dá)?？梢詫⑦@種調(diào)控元件鄰接異源啟動(dòng)子序列，以應(yīng)答例如銅、糖皮質(zhì)激素、地塞米松、四環(huán)素、赤霉素、cAMP、脫落酸、生長(zhǎng)素、損傷、乙烯、茉莉酮酸酯、或唾液酸而驅(qū)動(dòng)核酸分子的表達(dá)，或者將核酸分子的表達(dá)賦予特定細(xì)胞、組織、或器官諸如分生組織、葉、根、胚、花、種子、或果實(shí)。在本發(fā)明的內(nèi)容中，啟動(dòng)子優(yōu)選植物可表達(dá)啟動(dòng)子序列。然而，本發(fā)明也不排除在非植物細(xì)胞(諸如細(xì)菌、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、和動(dòng)物細(xì)胞)中也發(fā)揮功能或只在非植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子。“植物可表達(dá)的”指啟動(dòng)子序列(包括添加或包含的任何額外調(diào)控元件)至少能夠在植物細(xì)胞、組織、或器官(優(yōu)選單子葉或雙子葉植物細(xì)胞、組織、或器官)中誘導(dǎo)、賦予、激活、或增強(qiáng)表達(dá)。術(shù)語“植物可操作的”或“在植物中可操作的”在本文中用于啟動(dòng)子序列時(shí)應(yīng)當(dāng)理解為與植物可表達(dá)啟動(dòng)子序列等同。在本文中，“受控啟動(dòng)子”或“可調(diào)控啟動(dòng)子序列”指任選在特定條件下，能夠在植物的特定細(xì)胞、組織、或器官或一組細(xì)胞、組織、或器官中賦予結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，然而并不是在所有條件下在整個(gè)植株中通常都賦予表達(dá)的啟動(dòng)子。因此，可調(diào)控啟動(dòng)子序列可以是在一套特定條件下(諸如在通過化學(xué)化合物或其它引發(fā)劑誘導(dǎo)基因表達(dá)后)在植株內(nèi)特定部位或者在整個(gè)植株中賦予其可操作連接的基因以表達(dá)的啟動(dòng)子序列。優(yōu)選的是，用于進(jìn)行本發(fā)明的可調(diào)控啟動(dòng)子在植株內(nèi)特定部位賦予表達(dá)(或是組成性的或是在誘導(dǎo)后)，但不是在任何環(huán)境中在整個(gè)植株中都賦予表達(dá)。這種啟動(dòng)子的范圍包括細(xì)胞特異啟動(dòng)子序列、組織特異啟動(dòng)子序列、器官特異啟動(dòng)子序列、細(xì)胞周期特異基因啟動(dòng)子序列、可誘導(dǎo)啟動(dòng)子序列、和經(jīng)修飾后在特定植物部分中在任一時(shí)間賦予表達(dá)的組成性啟動(dòng)子序列，諸如通過可轉(zhuǎn)座遺傳因子(Ac、Ds、Spm、En、或其它轉(zhuǎn)座子)內(nèi)所述組成性啟動(dòng)子的整合。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將知道，“可誘導(dǎo)啟動(dòng)子”指其轉(zhuǎn)錄活性應(yīng)答發(fā)育、化學(xué)、環(huán)境、或物理刺激而得到提高或誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。本發(fā)明的范圍包括與壓力可誘導(dǎo)啟動(dòng)子融合的、權(quán)利要求書中定義的核苷酸序列。相似的，熟練技術(shù)人員將理解，“組成性啟動(dòng)子”指在生物體(優(yōu)選植物)的大多數(shù)但不必所有部分中、在大多數(shù)但不必所有生長(zhǎng)和發(fā)育階段有轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。相反，術(shù)語“遍在啟動(dòng)子”指在生物體(優(yōu)選植物)的大多數(shù)但不必所有部分中有轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將能夠容易的由可公開獲得或可容易獲得的來源選擇適當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列用于調(diào)控上文所述本發(fā)明蛋白質(zhì)的適當(dāng)表達(dá)，而無需過度的實(shí)驗(yàn)。將核酸分子置于啟動(dòng)子序列的調(diào)控控制之下或可操作連接啟動(dòng)子序列指將放置所述核酸分子使得表達(dá)受到啟動(dòng)子序列的控制。啟動(dòng)子通常但不必位于其所調(diào)控核酸分子的上游或位于5’端、且距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)2kb以內(nèi)。在構(gòu)建異源啟動(dòng)子/結(jié)構(gòu)基因組合時(shí)，通常優(yōu)選啟動(dòng)子與基因轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)的距離與啟動(dòng)子同它在天然環(huán)境下控制的基因(即衍生該啟動(dòng)子的基因)的距離大致相同?！氨磉_(dá)”指在細(xì)胞自身或無細(xì)胞系統(tǒng)中生成蛋白質(zhì)或核苷酸序列。它包括由編碼所述產(chǎn)物的DNA轉(zhuǎn)錄成RNA產(chǎn)物、轉(zhuǎn)錄后修飾、和/或翻譯成蛋白質(zhì)產(chǎn)物或多肽，以及可能的翻譯后修飾。“可操作連接”指并列，其中所述成分的相互關(guān)系使它們能夠以預(yù)定方式發(fā)揮功能。與編碼序列“可操作連接”的控制序列的連接方式能夠在與控制序列相容的條件下實(shí)現(xiàn)編碼序列的表達(dá)。在控制序列是啟動(dòng)子的情況中，熟練技術(shù)人員清楚優(yōu)選使用雙鏈核酸。術(shù)語“終止子”指位于轉(zhuǎn)錄單位末端、發(fā)出轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的DNA序列。終止子是包含有助于向初級(jí)轉(zhuǎn)錄本3’端添加聚腺苷酸序列的聚腺苷酸化信號(hào)的3’非翻譯DNA序列。本領(lǐng)域知道且描述了在衍生自病毒、酵母、霉菌、細(xì)菌、昆蟲、鳥、哺乳動(dòng)物、和植物衍生的細(xì)胞中有活性的終止子?？梢杂杉?xì)菌、真菌、病毒、動(dòng)物、和/或植物分離這些終止子。特別適用于本發(fā)明基因構(gòu)建物的終止子的范例包括根癌農(nóng)桿菌胭脂堿合酶(NOS)基因終止子、根癌農(nóng)桿菌章魚堿合酶(OCS)基因終止子序列、花椰菜花葉病毒(CaMY)35S基因終止子序列、稻ADP-葡萄糖焦磷酸化酶終止子序列(t3’Bt2)、玉蜀黍玉米醇溶蛋白基因終止子序列、rbcs-1A基因終止子、和rbcs-3A基因終止子序列、等。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將知道可能適用于進(jìn)行本發(fā)明的合適啟動(dòng)子序列和終止子序列。可以容易的使用這些序列而無需任何過多實(shí)驗(yàn)。改變基因表達(dá)可以是下調(diào)表達(dá)。本發(fā)明的內(nèi)容關(guān)注參與信使RNA前體加工過程的一些蛋白質(zhì)的表達(dá)下調(diào)。當(dāng)所述蛋白質(zhì)是信使RNA加工的負(fù)調(diào)控劑時(shí)，這能夠?qū)е吕鐚?duì)信使RNA加工和壓力耐受性的有益影響?！氨磉_(dá)下調(diào)”在用于本文時(shí)指降低基因表達(dá)的水平和/或活性基因產(chǎn)物的水平和/或基因產(chǎn)物活性的水平?？梢酝ㄟ^例如以相對(duì)于啟動(dòng)子序列的有義取向(若導(dǎo)致共遏制)或反義取向添加編碼序列或其部分，而且可通過例如插入誘變(如T-DNA插入或轉(zhuǎn)座子插入)或通過基因沉默策略(Angell和Baulcombe，1988，WO9836083；Lowe等人，1989，WO9853083；Lederer等人，1999，WO9915682；或Wang等人，1999，WO9953050)來實(shí)現(xiàn)表達(dá)下降。以沉默基因表達(dá)為目標(biāo)的遺傳構(gòu)建物可以相對(duì)于啟動(dòng)子序列的有義和/或反義取向包含所述基因(或其一個(gè)或多個(gè)部分)的核苷酸序列。用于下調(diào)基因表達(dá)的另一種方法包括使用核酶(Atikins等人，1999，WO9400012；Lenee等人，1995，WO9503404；Lutziger等人，2000，WO0000619；Prinsen等人，1997，WO9713865；和Scott等人，1997，WO9738116)?？梢酝ㄟ^將細(xì)胞、組織、器官、或生物體施用或暴露于所述基因產(chǎn)物或其同系物、類似物、衍生物、和/或免疫學(xué)活性片段來實(shí)現(xiàn)調(diào)控(包括降低)活性基因產(chǎn)物或基因產(chǎn)物活性的水平。免疫調(diào)控是能夠下調(diào)活性基因產(chǎn)物和/或基因產(chǎn)物活性水平的技術(shù)的另一個(gè)范例，包括在其中所述基因產(chǎn)物和/或基因產(chǎn)物活性水平有待調(diào)控的細(xì)胞、組織、器官、或生物體中施用、暴露、或表達(dá)針對(duì)所述基因產(chǎn)物的抗體。這些抗體包括“plantibodies”、單鏈抗體、IgG抗體、和重鏈camelantibodies及其片段。本發(fā)明的范圍還包括識(shí)別本發(fā)明蛋白質(zhì)且可用于所述免疫調(diào)控的抗體。還可以通過將細(xì)胞、組織、器官、或生物體施用或暴露于所述基因產(chǎn)物或其活性的抑制劑或激活劑來實(shí)現(xiàn)調(diào)控(包括降低)活性基因產(chǎn)物或基因產(chǎn)物活性的水平。這種抑制劑或激活劑包括依照本發(fā)明鑒定的蛋白質(zhì)(包括例如蛋白酶和激酶)和化學(xué)化合物?！凹?xì)胞命運(yùn)和/或植物發(fā)育和/或植物形態(tài)和/或生化和/或生理”指植物的一項(xiàng)或多項(xiàng)發(fā)育和/或形態(tài)和/或生化和/或生理特征因?qū)儆诒疚乃霭l(fā)明的一個(gè)或多個(gè)步驟的執(zhí)行而受到改變?！凹?xì)胞命運(yùn)”指在植物發(fā)育或其細(xì)胞過程中，特別是在細(xì)胞周期過程中或作為細(xì)胞周期過程的后果而生成的特定細(xì)胞的細(xì)胞類型或細(xì)胞特征?！爸参锇l(fā)育”或術(shù)語“植物發(fā)育特征”或相似術(shù)語在用于本文時(shí)應(yīng)當(dāng)理解為指植物中參與確定植物細(xì)胞(特別是祖細(xì)胞將發(fā)育而成的特定組織或器官類型)的發(fā)育命運(yùn)的任何細(xì)胞過程。與植物發(fā)育有關(guān)的細(xì)胞過程對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員而言是知道的。這些過程包括例如形態(tài)發(fā)生、光形態(tài)發(fā)生、苗發(fā)育、根發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)發(fā)育、生殖發(fā)育、莖干延長(zhǎng)、開花，及參與確定細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)控機(jī)制，特別是參與細(xì)胞周期的過程或調(diào)控過程?！爸参镄螒B(tài)”或術(shù)語“植物形態(tài)特征”或相似術(shù)語在用于本文時(shí)將由本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員理解為指植物的外觀，包括任何一項(xiàng)或多項(xiàng)結(jié)構(gòu)特征或其組合。這種結(jié)構(gòu)特征包括植物的任何細(xì)胞、組織、或器官、或成組細(xì)胞、組織、或器官(包括根、莖干、葉、苗、葉柄、毛狀體、花、花瓣、柱頭、花柱、雄蕊、花粉、胚珠、種子、胚、胚乳、種皮、糊粉、纖維、果實(shí)、形成層、木材、心材、薄壁組織、通氣組織、篩分子、韌皮和維管組織、等)的形狀、大小、數(shù)目、位置、顏色、質(zhì)地、排列、和圖案?！爸参锷被蛐g(shù)語“植物生化特征”或相似術(shù)語在用于本文時(shí)將由本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員理解為指植物的代謝和催化過程，包括初級(jí)和次級(jí)代謝及其產(chǎn)物，包括由植物生成的任何小分子、大分子、或化學(xué)化合物，諸如但不限于淀粉、糖、蛋白質(zhì)、肽、酶、激素、生長(zhǎng)因子、核酸分子、纖維素、半纖維素、胼胝質(zhì)、凝集素、纖維、色素(諸如花青素)、維生素、礦質(zhì)、微量營(yíng)養(yǎng)物、或大量營(yíng)養(yǎng)物?！爸参锷韺W(xué)”或術(shù)語“植物生理學(xué)特征”或相似術(shù)語在用于本文時(shí)將理解為指植物的功能性過程，包括發(fā)育過程(諸如生長(zhǎng)、擴(kuò)大、和分化)、性發(fā)育、有性生殖、結(jié)子、種子發(fā)育、灌漿、無性生殖、細(xì)胞分裂、休眠、發(fā)芽、光適應(yīng)、光合作用、葉片擴(kuò)大、纖維生成、次級(jí)生長(zhǎng)、或木材生成、等；植物對(duì)外部應(yīng)用因子(諸如金屬、化學(xué)藥品、激素、生長(zhǎng)因子、環(huán)境、和環(huán)境壓力因素(如缺氧、低氧、高溫、低溫、脫水、光、白晝長(zhǎng)度、水淹、鹽、重金屬、等))的應(yīng)答，包括植物對(duì)所述外部應(yīng)用因子的適應(yīng)性應(yīng)答。術(shù)語“環(huán)境壓力”在本領(lǐng)域已經(jīng)以不同方式進(jìn)行了定義，而且與術(shù)語“滲透壓”大大交疊。例如Holmberg和Bülow，1998，TrendsPlantSci.，361-66定義了導(dǎo)致非生物壓力的不同環(huán)境壓力因素。術(shù)語滲透壓在用于本文時(shí)指由鹽度、干旱、熱、寒冷、和凍結(jié)等條件誘導(dǎo)的壓力處境。術(shù)語“環(huán)境壓力”在用于本發(fā)明時(shí)指由非存活或非生物環(huán)境壓力生成的、作用于細(xì)胞、組織、種子、器官、或完整植株的代謝、生長(zhǎng)、或生存力的任何不利影響。更具體的說，它還涵蓋諸如水壓力(水淹、水浸、干旱、脫水)、缺氧(低水平的氧、CO2、等)、氧壓力、滲透壓、鹽壓力、溫度壓力(熱、冷、凍結(jié)、霜凍)、營(yíng)養(yǎng)物貧乏、污染物壓力(重金屬、有毒化學(xué)藥品)、臭氧、高光(highlight)、病原體(包括病毒、細(xì)菌、真菌、昆蟲、和線蟲)等環(huán)境因素及其組合。術(shù)語“缺氧壓力”指足以生成上文定義的壓力的任何氧水平下降，包括低氧和缺氧。術(shù)語“水淹壓力”指與將植物、植物部分、組織、或分離細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間或短時(shí)間的淹沒在液體培養(yǎng)基中(諸如季風(fēng)、多雨季節(jié)、山洪暴發(fā)、或過度灌溉等期間)有關(guān)或由其誘導(dǎo)的任何壓力?！昂鋲毫Α焙汀盁釅毫Α狈謩e指由低于或高于特定植物物種的最佳生長(zhǎng)溫度范圍的溫度誘導(dǎo)的壓力。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能夠容易的測(cè)定或知道這種最佳生長(zhǎng)溫度范圍?！懊撍畨毫Α敝概c細(xì)胞、組織、器官、或完整植株失水、膨脹度降低、或水含量降低有關(guān)或由其誘導(dǎo)的任何壓力?！案珊祲毫Α敝赣杉?xì)胞、組織、器官、或生物體缺水或水供應(yīng)降低誘導(dǎo)或與其有關(guān)的任何壓力?！把趸瘔毫Α敝干叻磻?yīng)性氧種類的胞內(nèi)水平的任何壓力。術(shù)語“由鹽度誘導(dǎo)的壓力”、“鹽壓力”、或“鹽離子毒性”或無機(jī)鹽毒性或相似術(shù)語指與鹽濃度升高有關(guān)或由其誘導(dǎo)且導(dǎo)致細(xì)胞胞內(nèi)或胞外環(huán)境的滲透勢(shì)微擾的任何壓力。在誘導(dǎo)所述鹽壓力的無機(jī)鹽中知道的最清楚的范例就是Na+和Li+。依照本發(fā)明的方法將多核苷酸和/或調(diào)控序列導(dǎo)入所述植物后獲得的轉(zhuǎn)基因植物獲得了針對(duì)相應(yīng)野生型植株易感的環(huán)境壓力的抗性、耐受性、或增強(qiáng)的耐受性或抗性。術(shù)語“耐受性”和“抗性”覆蓋自遲滯至完全抑制由上文定義的環(huán)境壓力條件引起的細(xì)胞代謝改變、細(xì)胞生長(zhǎng)降低、和/或細(xì)胞死亡的保護(hù)范圍。優(yōu)選的是，依照本發(fā)明的方法獲得的轉(zhuǎn)基因植物耐受性或抵抗環(huán)境壓力條件，即所述植物能夠在相應(yīng)野生型植株顯示生長(zhǎng)、代謝、生存力、生產(chǎn)力降低、和/或雄性或雌性不育的環(huán)境條件下充分的正常生長(zhǎng)。在用于本文時(shí)，“壓力耐受性”指在壓力下生長(zhǎng)和生成生物量的能力、在壓力后再次起始生長(zhǎng)和生成生物量的能力、和在壓力下存活的能力。術(shù)語“壓力耐受性”還覆蓋植物在壓力下完成與在非壓力條件下相似的發(fā)育程序的能力，如與在非壓力條件下相似，在壓力下由休眠轉(zhuǎn)向發(fā)芽和由營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)向生殖階段。用于測(cè)定植物生長(zhǎng)或壓力應(yīng)答的方法學(xué)包括但不限于高度測(cè)量、葉片面積、植物水關(guān)系、開花能力、生成后代的能力、和產(chǎn)量，或本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員知道的任何其它方法學(xué)?！吧L(zhǎng)”指植物或其部分生長(zhǎng)并增加生物量的能力，而“產(chǎn)量”指植物或其部分(特別是那些有商業(yè)價(jià)值的部分)的可收獲生物量?！霸趬毫头菈毫l件下的生長(zhǎng)和/或產(chǎn)量”指田間生長(zhǎng)的植物幾乎總是將經(jīng)歷一些形式的壓力(盡管輕微)的事實(shí)。因此，優(yōu)選不區(qū)分非壓力與輕微壓力條件。由于預(yù)計(jì)本發(fā)明對(duì)生長(zhǎng)和產(chǎn)量的某些有利影響在嚴(yán)重和輕微壓力條件下均會(huì)發(fā)生，因此將它們描述成在壓力和非壓力條件下增加生長(zhǎng)和/或產(chǎn)量。用于將重組DNA導(dǎo)入植物組織或細(xì)胞的手段包括但不限于使用CaCl2的轉(zhuǎn)化及其變化形式，特別是先前所述方法(Hanahan，1983)、直接將DNA攝取到原生質(zhì)體中(Krens等人，1982；Paszkowski等人，1984)、由PEG介導(dǎo)的攝取到原生質(zhì)體中(Armstrong等人，1990)、微粒轟擊、電穿孔(Fromm等人，1985)、DNA顯微注射(Crossway等人，1986；Fromm等人，1985)、組織外植體或細(xì)胞的微粒轟擊(Christou等人，1988)、用核酸真空滲透組織、或(在植物的情況中)由T-DNA介導(dǎo)的由農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至植物組織(An等人，1985；Herrera-Estrella等人，1983a；Herrera-Estrella等人，1983b)。用于轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，包括由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Cheng等人，1997，WO9748814；Hansen，1998，WO9854961；Hiei等人，1994，WO9400977；Hiei等人，1998，WO9817813；Rikiishi等人，1999，WO9904618；Saito等人，1995，WO9506722)、微粒轟擊(Adams等人，1999，US5969213；Bowen等人，1998，US5736369；Chang等人，1994，WO9413822；Lundquist等人，1999，US5874265/US5990390；Vasil和Vasil，1995，US5405765；Walker等人，1999，US5955362)、DNA攝取(Eyal等人，1993，WO9318168)、農(nóng)桿菌細(xì)胞的顯微注射(vonHolt，1994，DE4309203)、和超聲處理(Finer等人，1997，US5693512)。依照本領(lǐng)域眾所周知的流程，可以由經(jīng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞再生完整植株?？梢杂帽景l(fā)明的基因構(gòu)建物轉(zhuǎn)化能夠隨后通過器官發(fā)生或胚胎發(fā)生而克隆繁殖的植物組織，并由此再生完整植株。選擇的特定組織將隨可用于或最適用于待轉(zhuǎn)化的特定物種的克隆繁殖系統(tǒng)而變化。例示性組織靶包括葉片、花粉、胚、子葉下、胚軸、雌配子體、愈傷組織、已有分生組織(如頂端分生組織、腋芽和根部分生組織)以及誘導(dǎo)的分生組織(如子葉分生組織和下胚軸分生組織)。優(yōu)選的是，通過本領(lǐng)域公認(rèn)的任何手段，諸如微粒轟擊、顯微注射、由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(包括“浸花”轉(zhuǎn)化法；Bechtold和Pelletier，1998；Trieu等人，2000)、原生質(zhì)體融合、或電穿孔等，用負(fù)責(zé)生成蛋白質(zhì)的遺傳序列轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化依照本發(fā)明方法生成的植物。最優(yōu)選的是，所述植物是通過由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化生成的。“二元轉(zhuǎn)化載體”指包含下列各項(xiàng)的T-DNA轉(zhuǎn)化載體包含在待轉(zhuǎn)化的真核細(xì)胞中有活性的至少一種目的基因和/或至少一種選擇標(biāo)記的T-DNA區(qū)；和包含在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中有活性的至少一種復(fù)制起點(diǎn)和用于在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中進(jìn)行選擇的標(biāo)記基因的載體主鏈區(qū)?；蛘?，二元轉(zhuǎn)化載體在農(nóng)桿菌中的復(fù)制依賴分開的輔助質(zhì)粒的存在。二元載體pGreen和輔助質(zhì)粒pSoup構(gòu)成諸如Hellens等人，2000中所述或因特網(wǎng)站點(diǎn)http//www.pgreen.ac.uk上可獲得的系統(tǒng)的范例。二元轉(zhuǎn)化載體的T-DNA邊界可以衍生自章魚堿型或胭脂堿型Ti質(zhì)粒或二者兼之。二元載體的T-DNA只有在聯(lián)合輔助質(zhì)粒時(shí)才轉(zhuǎn)移到真核細(xì)胞中。本領(lǐng)域還知道用于有效植物共轉(zhuǎn)化的多種二元載體農(nóng)桿菌菌株(Bidney和Scelonge，2000，WO0018939)?！八拗鳌被颉八拗骷?xì)胞”或“宿主生物體”在本文中指能夠作為本發(fā)明序列的受體的任何原核或真核細(xì)胞或生物體。術(shù)語“宿主”在用于本文時(shí)包括可以進(jìn)行遺傳工程改造的原核或真核生物體。這種宿主的范例參閱Maniatis等人，MolecularCloningALaboratoryManual即分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約，1982?！爸参锛?xì)胞”包括衍生自任何植物且在培養(yǎng)過程以單細(xì)胞、細(xì)胞組、或愈傷組織存在的任何細(xì)胞。植物細(xì)胞還可以是培養(yǎng)中或天然生長(zhǎng)中的發(fā)育中或成熟植物的任何細(xì)胞。“植物”包括屬于綠色植物(Viridiplantae)超家族的任何植物物種。本發(fā)明可應(yīng)用于任何植物，特別是單子葉植物和雙子葉植物，包括選自下組的飼料豆科植物、觀賞植物、糧食作物、喬木、或灌木Acacisspp.(金合歡)、Acerspp.(槭)、Actinidiaspp.(獼猴桃)、Aesculusspp.(七葉樹)、Agathisaustralis(新西蘭貝殼杉)、Albiziaamara、Alsophilatricolor、Andropogonspp.(須芒草)、Arachisspp.(落花生)、Arecacatechu(檳榔)、Asteliafragrans、Astragaluscicer、Baikiaeaplurijuga、Betulaspp.(樺木)、Brassicaspp.(蕓苔)、Bruguieragymnorrhiza(木欖)、Burkeaafricana、Buteafrondosa(紫鉚)、Cadabafarinose、Calliandraspp.(牛纓花)、Camelliasinensis(茶)、Cannaindica(美人蕉)、Capsicumspp.(辣椒)、Cassiaspp.(決明)、Centrosemapubescens(距瓣豆)、Chaenomelesspp.(木瓜)、Cinnamomumcassia(肉桂)、Coffeaarabica(小果咖啡)、Colophospermummopane、Coronilliavaria、Cotoneasterserotina、Crataegusspp.(山楂)、Cucumisspp.(甜瓜)、Cupressusspp.(柏木)、Cyatheadealbata、Cydoniaoblonga(榅桲)、Cryptomeriajaponica(日本柳杉)、Cymbopogonspp.(香茅)、Cyntheadealbata、Cydoniaoblonga、Dalbergiamonetaria、Davalliadivaricata、Desmodiumspp.(山螞蟥)、Dicksoniasquarosa、Diheteropogonamplectens、Diocleaspp.、Dolichosspp.(扁豆)、Dorycniumrectum、Echinochloapyramidalis(稗)、Ehrartiaspp.(厚殼樹)、Eleusinecoracana(子)、Eragrestisspp.(畫眉草)、Erythrinaspp.(刺桐)、Eucalyptusspp.(桉)、Eucleaschimperi、Eulaliavillosa(金茅)、Fagopyrumspp.(蕎麥)、Feijoasellowiana(南美稔)、Fragariaspp.(草莓)、Flemingiaspp.(千斤拔)、Freycinetiabanksii(藤露兜樹)、Geraniumthunbergii(老鸛草)、Ginkgobiloba(銀杏)、Glycinejavanica、Gliricidiaspp.(墨西哥丁香)、Gossypiumhirsutum(陸地棉)、Grevilleaspp.(銀樺)、Guibourtiacoleosperma、Hedysarumspp.(巖黃蓍)、Hemarthriaaltissima(牛鞭草)、Heteropogoncontortus(黃茅)、Hordeumvulgare(大麥)、Hyparrheniarufa、Hypericumerectum(小連翹)、Hypertheliadissolute、Indigoincarnata(庭藤)、Irisspp.(鳶尾)、Leptarrhenapyrolifolia、Lespedezaspp.(胡枝子)、Lettucaspp.、Leucaenaleucocephala(銀合歡)、Loudetiasimplex、Lotonusbainesii、Lotusspp.(百脈根)、Macrotylomaaxillare、Malusspp.(蘋果)、Manihotesculenta(木薯)、Medicagosativa(紫苜蓿)、Metasequoiaglyptostroboides(水杉)、Musasapientum(大蕉)、Nicotianumspp.(煙草)、Onobrychisspp.(驢豆)、Ornithopusspp.、Oryzaspp.(稻)、Peltophorumafricanum、Pennisetumspp.(狼尾草)、Perseagratissima(鱷梨)、Petuniaspp.(碧冬茄)、Phaseolusspp.(菜豆)、Phoenixcanariensis、Phormiumcookianum、Photiniaspp.(石楠)、Piceaglauca(白云杉)、Pinusspp.(松)、Pisumsativum(豌豆)、Podocarpustotara(新西蘭羅漢松)、Pogonarthriafleckii、Pogonarthriasquarrosa、Populusspp.(楊)、Prosopiscineraria(牧豆樹)、Pseudotsugamenziesii(花旗松)、Pterolobiumstellatum、Pyruscommunis(西洋梨)、Quercusspp.(櫟)、Rhaphiolepsisumbellate(厚葉石斑木)、Rhopalostylissapida、Rhusnatalensis、Ribesgrossularia、Ribesspp.(茶藨子)、Robiniapseudoacacia(洋槐)、Rosaspp.(薔薇)、Rubusspp.(懸鉤子)、Salixspp.(柳)、Schyzachyriumsanguineum、Sciadopitysverticillata(金松)、Sequoiasempervirens(北美紅杉)、Sequoiadendrongiganteum(巨杉)、Sorghumbicolor、Spinaciaspp.(菠菜)、Sporobolusfimbriatus、Stiburusalopecuroides、Stylosanthoshumilis、Tadehagispp.(葫蘆茶)、Taxodiumdistichum(落羽松)、Themedatriandra(黃背草)、Trifoliumspp.(車軸草)、Triticumspp.(小麥)、Tsugaheterophylla(異葉鐵杉)、Vacciniumspp.(烏飯樹)、Viciaspp.(蠶豆)、Vitisvinifera(葡萄)、Watsoniapyramdata、Zantedeschiaaethiopica(馬蹄蓮)、Zeamays(玉蜀黍)、莧菜、朝鮮薊、蘆筍、嫩莖花椰菜、抱子甘藍(lán)、甘藍(lán)、canola、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘藍(lán)、亞麻、散葉甘藍(lán)、小扁豆、油籽、油菜、秋葵、洋蔥、馬鈴薯、稻、大豆、稻草、甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜、和茶等，或上文具體提及的任何植物的種子，或任何上述物種的組織、細(xì)胞、或器官培養(yǎng)物。本發(fā)明可應(yīng)用于任何植物，特別是單子葉植物和雙子葉植物，包括選自下組的飼料豆科植物、觀賞植物、糧食作物、喬木、或灌木Acacisspp.(金合歡)、Acerspp.(槭)、Actinidiaspp.(獼猴桃)、Aesculusspp.(七葉樹)、Agathisaustralis(新西蘭貝殼杉)、Albiziaamara、Alsophilatricolor、Andropogonspp.(須芒草)、Arachisspp.(落花生)、Arecacatechu(檳榔)、Asteliafragrans、Astragaluscicer、Baikiaeaplurijuga、Betulaspp.(樺木)、Brassicaspp.(蕓苔)、Bruguieragymnorrhiza(木欖)、Burkeaafricana、Buteafrondosa(紫鉚)、Cadabafarinose、Calliandraspp.(牛纓花)、Camelliasinensis(茶)、Cannaindica(美人蕉)、Capsicumspp.(辣椒)、Cassiaspp.(決明)、Centrosemapubescens(距瓣豆)、Chaenomelesspp.(木瓜)、Cinnamomumcassia(肉桂)、Coffeaarabica(小果咖啡)、Colophospermummopane、Coronilliavaria、Cotoneasterserotina、Crataegusspp.(山楂)、Cucumisspp.(甜瓜)、Cupressusspp.(柏木)、Cyatheadealbata、Cydoniaoblonga(榅桲)、Cryptomeriajaponica(日本柳杉)、Cymbopogonspp.(香茅)、Cyntheadealbata、Cydoniaoblonga、Dalbergiamonetaria、Davalliadivaricata、Desmodiumspp.(山螞蟥)、Dicksoniasquarosa、Diheteropogonamplectens、Diocleaspp.、Dolichosspp.(扁豆)、Dorycniumrectum、Echinochloapyramidalis(稗)、Ehrartiaspp.(厚殼樹)、Eleusinecoracana(子)、Eragrestisspp.(畫眉草)、Erythrinaspp.(刺桐)、Eucalyptusspp.(桉)、Eucleaschimperi、Eulaliavillosa(金茅)、Fagopyrumspp.(蕎麥)、Feijoasellowiana(南美稔)、Fragariaspp.(草莓)、Flemingiaspp.(千斤拔)、Freycinetiabanksii(藤露兜樹)、Geraniumthunbergii(老鸛草)、Ginkgobiloba(銀杏)、Glycinejavanica、Gliricidiaspp.(墨西哥丁香)、Gossypiumhirsutum(陸地棉)、Grevilleaspp.(銀樺)、Guibourtiacoleosperma、Hedysarumspp.(巖黃蓍)、Hemarthriaaltissima(牛鞭草)、Heteropogoncontortus(黃茅)、Hordeumvulgare(大麥)、Hyparrheniarufa、Hypericumerectum(小連翹)、Hypertheliadissolute、Indigoincarnata(庭藤)、Irisspp.(鳶尾)、Leptarrhenapyrolifolia、Lespedezaspp.(胡枝子)、Lettucaspp.、Leucaenaleucocephala(銀合歡)、Loudetiasimplex、Lotonusbainesii、Lotusspp.(百脈根)、Macrotylomaaxillare、Malusspp.(蘋果)、Manihotesculenta(木薯)、Medicagosativa(紫苜蓿)、Metasequoiaglyptostroboides(水杉)、Musasapientum(大蕉)、Nicotianumspp.(煙草)、Onobrychisspp.(驢豆)、Ornithopusspp.、Oryzaspp.(稻)、Peltophorumafricanum、Pennisetumspp.(狼尾草)、Perseagratissima(鱷梨)、Petuniaspp.(碧冬茄)、Phaseolusspp.(菜豆)、Phoenixcanariensis、Phormiumcookianum、Photiniaspp.(石楠)、Piceaglauca(白云杉)、Pinusspp.(松)、Pisumsativum(豌豆)、Podocarpustotara(新西蘭羅漢松)、Pogonarthriafleckii、Pogonarthriasquarrosa、Populusspp.(楊)、Prosopiscineraria(牧豆樹)、Pseudotsugamenziesii(花旗松)、Pterolobiumstellatum、Pyruscommunis(西洋梨)、Quercusspp.(櫟)、Rhaphiolepsisumbellate(厚葉石斑木)、Rhopalostylissapida、Rhusnatalensis、Ribesgrossularia、Ribesspp.(茶藨子)、Robiniapseudoacacia(洋槐)、Rosaspp.(薔薇)、Rubusspp.(懸鉤子)、Salixspp.(柳)、Schyzachyriumsanguineum、Sciadopitysverticillata(金松)、Sequoiasempervirens(北美紅杉)、Sequoiadendrongiganteum(巨杉)、Sorghumbicolor、Spinaciaspp.(菠菜)、Sporobolusfimbriatus、Stiburusalopecuroides、Stylosanthoshumilis、Tadehagispp.(葫蘆茶)、Taxodiumdistichum(落羽松)、Themedatriandra(黃背草)、Trifoliumspp.(車軸草)、Triticumspp.(小麥)、Tsugaheterophylla(異葉鐵杉)、Vacciniumspp.(烏飯樹)、Viciaspp.(蠶豆)、Vitisvinifera(葡萄)、Watsoniapyramidata、Zantedeschiaaethiopica(馬蹄蓮)、Zeamays(玉蜀黍)、莧菜、朝鮮薊、蘆筍、嫩莖花椰菜、抱子甘藍(lán)、甘藍(lán)、canola、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘藍(lán)、亞麻、散葉甘藍(lán)、小扁豆、油籽、油菜、秋葵、洋蔥、馬鈴薯、稻、大豆、稻草、甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜、和茶等，或上文具體提及的任何植物的種子，或任何上述物種的組織、細(xì)胞、或器官培養(yǎng)物?！肮阮悺卑ň哂锌墒秤霉攘５淖魑铮鐚儆诤瘫究?、為了獲得其營(yíng)養(yǎng)谷粒而栽培的植物，諸如燕麥、大麥、黑麥、小麥、稻、和玉米等。本發(fā)明的范圍還包括雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用，其中將本發(fā)明的任何序列用于研究與其它因素諸如蛋白質(zhì)的相互作用?！敖湍鸽p雜交實(shí)驗(yàn)”指以如下觀察結(jié)果為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)許多真核轉(zhuǎn)錄因子包含兩種結(jié)構(gòu)域，即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DB)和激活結(jié)構(gòu)域(AB)，當(dāng)它們?cè)谖锢砩戏珠_時(shí)(即破壞共價(jià)連接)，它們不實(shí)行靶基因的表達(dá)。對(duì)于能夠相互作用的兩種蛋白質(zhì)而言，將一種所述蛋白質(zhì)融合DB，將另一種所述蛋白質(zhì)融合AD，則它們能夠重新聯(lián)合轉(zhuǎn)錄因子的DB和AD結(jié)構(gòu)域，從而導(dǎo)致靶基因的表達(dá)。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中的靶基因通常是報(bào)告基因，諸如β-半乳糖苷酶基因。因而可以通過測(cè)量報(bào)告基因產(chǎn)物的活性來量化酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)配偶體之間的相互作用(Bartel和Fields，1997)?；蛘?，可以使用哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)，包括例如編碼報(bào)告基因的嵌合綠色熒光蛋白(Shioda等人，2000)。還有一種候選方案是使用例如HIS作為報(bào)告基因的細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)(Joung等人，2000)。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員還將認(rèn)識(shí)到，在雙雜交系統(tǒng)的適合形式及其它技術(shù)(如凝膠阻滯、免疫沉淀、競(jìng)爭(zhēng)抑制)中，有可能研究蛋白質(zhì)-寡核苷酸相互作用，因而使用本發(fā)明任何序列的這些技術(shù)也屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。術(shù)語“序列片段”或“部分序列”指所指原始序列的截短序列。截短序列(核酸或蛋白質(zhì)序列)的長(zhǎng)度可以廣泛變化；最小長(zhǎng)度是足以提供具有所指原始序列的至少一種可比功能和/或活性的序列，而最大長(zhǎng)度并不重要。在有些應(yīng)用中，最大長(zhǎng)度通常并不顯著大于提供原始序列期望活性和/或功能所需要的長(zhǎng)度。通常，截短氨基酸或核苷酸序列的長(zhǎng)度范圍將是大約5-大約60個(gè)氨基酸。然而，更通常的是，序列的最大長(zhǎng)度將是大約50個(gè)氨基酸，優(yōu)選大約60個(gè)氨基酸。通常期望選擇至少大約10、12、或15個(gè)氨基酸或核苷酸的序列，最大值可達(dá)大約20或25個(gè)氨基酸或核苷酸。本發(fā)明還包括用于高通量化合物篩選的方法。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能夠容易的設(shè)計(jì)使用一種或幾種本發(fā)明元件的這種方法。仍然有待獲得或鑒定的化合物可以是能夠結(jié)合參與前體信使RNA加工過程因而可用于本發(fā)明方法的任何核酸、肽、或蛋白質(zhì)的化合物。例如樣品(如來自植物、動(dòng)物、或微生物的細(xì)胞提取物)中可能包含所述化合物或其組合。此外，所述化合物在本領(lǐng)域可能是已知的但迄今不知道能夠遏制或激活參與前體信使RNA加工的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的范圍還包括向植物細(xì)胞中導(dǎo)入一種或多種重組核酸分子，諸如在所述植物細(xì)胞中以有效量表達(dá)后所編碼蛋白質(zhì)能提高或誘導(dǎo)依照本發(fā)明的或權(quán)利要求書中定義的內(nèi)源多核苷酸表達(dá)或者誘導(dǎo)權(quán)利要求的多肽的活性的DNA分子。通過參考下文非限制性圖和實(shí)施例進(jìn)一步描述了本發(fā)明。圖的簡(jiǎn)述圖1表達(dá)擬南芥cDNA分離克隆U1A、Ct-SRL1、或RCY1的酵母菌株的耐鹽表型，通過“懸滴測(cè)試(droptest)”測(cè)定；其中在不含鹽或含指定LiCl或NaCl濃度的平板上測(cè)試不同菌株和包含空表達(dá)載體的對(duì)照菌株的飽和培養(yǎng)物的系列稀釋物。圖2由克隆RYC1(ASEQIDNO.4)和Ct-SRL1(BSEQIDNO.3)的核苷酸序列衍生的氨基酸序列。定義RS結(jié)構(gòu)域的二肽Arg-Ser、Arg-Glu、和Arg-Asp以粗體字母書寫。(A)中標(biāo)有下劃線的M指示在酵母中表達(dá)RCY1的RS結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO.21)時(shí)用作起始子的甲硫氨酸殘基。圖3表達(dá)RCY1的氨基末端(細(xì)胞周期蛋白)結(jié)構(gòu)域、羧基末端RS結(jié)構(gòu)域、或全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的酵母菌株的耐鹽表型。如圖1的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行懸滴測(cè)試。圖4轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的耐鹽表型。將來自經(jīng)CaMV35S啟動(dòng)子控制下的Ct-RSL1cDNA轉(zhuǎn)化的3個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因系(L1、L3、和L5，作為獲得的12個(gè)系的范例)的T2種子在不含(A)或含有(B)20mMLiCl的瓊脂平板上發(fā)芽。將來自野生型植株(Wt)的種子用作對(duì)照。所有轉(zhuǎn)基因系都顯示相似表型。圖5本發(fā)明的基因和蛋白質(zhì)的序列。實(shí)施例實(shí)施例1植物材料將紅甜菜(甜菜變種DITA，本文也稱為“甜菜”)種子播種在裝有沙子和蛭石混合物(1∶1w/w)的陶罐中。在溫室條件(20℃8小時(shí)和25℃16小時(shí)，補(bǔ)充光照以刺激最少12小時(shí)的光周期)下栽培植物。用含2.4g/LCa(NO3)2·4H2O、1g/LKNO3、1g/LMgSO4·7H2O、0.3g/LKH2PO4、5.6mg/LFe-quelate(Kelantren，Bayer)、1.1mg/LZnSO4·7H2O、3.3mg/LMnO4·H2O、0.3mg/LCuSO4·5H2O、3.8mg/LH3BO3、0.18mg/L(NH4)6Mo7·4H2O的營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行定期灌溉。為了構(gòu)建cDNA文庫(kù)，在收獲前用200mMNaCl灌溉3周齡的植株達(dá)24小時(shí)。實(shí)施例2酵母菌株和培養(yǎng)條件用擬南芥cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞W303-1A(MATaura3，leu2，his3，trp1，ade2，ena1-4HIS3)。將由J.M.Mulet(UniversidadPolitécnicadeValencia，InstitutodeBiologiaMolecularyCellulardePlantas)提供的釀酒酵母菌株JM26(MAtaleu2-3，112ura3-1trp1-1，ade2-1his3-11，15can1-100，ena1-4HIS3，nha1TRP1)用于篩選紅甜菜cDNA文庫(kù)。菌株JM26是W303.1A(Wallis等人，1989，Cell，58409-419)的衍生物，它具有基因ENA1-4和NHA1的無效突變，二者分別編碼在酵母中負(fù)責(zé)排出大部分鈉的Na+泵APT酶和Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Garciadeblas等人，1993，Mol.Gen.Genet.，236363-368；Bauelos等人，1998，Microbiology，1442749-2758)。在基本合成葡萄糖培養(yǎng)基(SD)或豐富培養(yǎng)基(YPD)中培養(yǎng)酵母細(xì)胞。SD培養(yǎng)基含有2％葡萄糖、0.7％不含氨基酸的酵母氮堿、和50mM琥珀酸，用Tris調(diào)至pH5，依照指示添加需要的氨基酸[100μg/ml亮氨酸、30μg/ml腺嘌呤、100μg/ml甲硫氨酸]。YPD培養(yǎng)基含有1％酵母提取物、2％細(xì)菌用蛋白胨、和2％葡萄糖。依照?qǐng)D和實(shí)施例所示向培養(yǎng)基中添加NaCl和LiCl。固體培養(yǎng)基含有2％細(xì)菌學(xué)級(jí)瓊脂。實(shí)施例3cDNA文庫(kù)的構(gòu)建Minet等人，1992，PlantJ.，2(3)417-422描述了在載體pFL61中構(gòu)建擬南芥cDNA文庫(kù)。為了構(gòu)建經(jīng)過鹽壓力誘導(dǎo)的甜菜cDNA文庫(kù)，使用實(shí)施例1中描述的植物材料。使用由經(jīng)鹽處理的甜菜植株的葉片制備的poly(A)+RNA合成定向cDNA(cDNA合成試劑盒，Stratagene)。將cDNA連接到噬菌體λPG15載體中，并進(jìn)行包裝(GigapackIIgold包裝提取物，Stratagene)。該噬菌體插入了可切除的表達(dá)質(zhì)粒pYPGE15(以URA3作為選擇標(biāo)記)，后者可直接用于大腸桿菌和酵母互補(bǔ)(Brunelli和Pall，1993，Yeast，91309-1318)。通過cre-lox重組酶系統(tǒng)(Brunelli和Pall，1993，Yeast，91309-1318)由λPG15回收質(zhì)粒cDNA文庫(kù)。實(shí)施例4賦予酵母以鹽耐受性的cDNA克隆的篩選和分離為了篩選在酵母中增加鹽耐受性的擬南芥cDNA，通過LiCl法(Gietz等人，1992，NucleicAcidsRes.，201425)將在pFL61中構(gòu)建的cDNA文庫(kù)用于轉(zhuǎn)化酵母菌株W303-1A。在基本培養(yǎng)基添加25mM和50mMLiCl、或如圖所示、且含有400μM甲硫氨酸的平板中對(duì)轉(zhuǎn)化體篩選鹽耐受性。對(duì)抗性克隆進(jìn)行由氟乳清酸誘導(dǎo)的質(zhì)粒喪失(Boeke等人，1984，Mol.Gen.Genet.，197354-346)，從而只選擇那些顯示依賴質(zhì)粒的LiCl耐受性的克隆。結(jié)果在野生型菌株和液泡運(yùn)輸缺陷的雙重突變體ena1-4HIS3tfp1LEU2中得到了確認(rèn)。為了篩選在酵母中增加鹽耐受性的甜菜cDNA，將在pYPGE15中構(gòu)建的cDNA文庫(kù)用于轉(zhuǎn)化酵母突變株JM26。合并在含有亮氨酸和腺嘌呤的SD平板上通過尿嘧啶原養(yǎng)型選擇的轉(zhuǎn)化體，并以2×105細(xì)胞/板(12×12cm)的密度再次涂布在篩選培養(yǎng)基(含有亮氨酸、腺嘌呤、和甲硫氨酸且添加0.15MNaCl的SD)上。向選擇培養(yǎng)基中添加甲硫氨酸以避免選擇早已在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的HAL2樣同系物(Quintero等人，1996，PlantCell，859-537；Gel-Mascarell等人，1999，PlantJ.，17(4)373-383)?；蛘?，為了選擇Li+抗性酵母細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化體再次涂布在篩選培養(yǎng)基(含有亮氨酸和腺嘌呤且添加20mMLiCl的SD)上。在相同的NaCl或LiCl培養(yǎng)基上再次篩選推定的陽性克隆。實(shí)施例5胞內(nèi)鋰含量的測(cè)定將表達(dá)本發(fā)明cDNA克隆的酵母細(xì)胞或用空載體轉(zhuǎn)化的對(duì)照菌株培養(yǎng)至指數(shù)期，然后向培養(yǎng)基中添加LiCl至終濃度30mM。在不同時(shí)間采集10ml樣品，并如先前所述(Murgùia等人，1996，J.Biol.Chem.，27129029-29033)測(cè)定胞內(nèi)鋰含量。實(shí)施例6β-半乳糖苷酶測(cè)定用酵母表達(dá)載體中的Ct-SRL1cDNA轉(zhuǎn)化包含半乳糖誘導(dǎo)性啟動(dòng)子控制下的大腸桿菌LacZ基因(被或未被內(nèi)含子中斷)(Legrain和Rosbash，1989，Cell，75573-583)的酵母細(xì)胞，或者用空質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化作為對(duì)照。將培養(yǎng)物在含有或不含35mMLiCl的葡萄糖基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)至指數(shù)期，然后換成半乳糖培養(yǎng)基并維持在相同鹽條件，以誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶表達(dá)。在誘導(dǎo)后0(背景值)和4小時(shí)采集樣品，并如先前所述(Serrano等人，1973，Eur.J.Biochem.，34479-482)在滲透后細(xì)胞中測(cè)量β-半乳糖苷酶活性。實(shí)施例7RT-PCR測(cè)定將過度表達(dá)Ct-SRL1cDNA或用空載體轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞培養(yǎng)至指數(shù)期，然后向培養(yǎng)基中添加LiCl至終濃度150mM，并在不同時(shí)間純化總RNA。用不含RNA酶的DNA酶1消化等量的總RNA，并使用M-MuLVRT酶(RocheMolecularBiochemicals)和與3’剪接位點(diǎn)下游277個(gè)核苷酸的第二個(gè)SAR1外顯子發(fā)生雜交的引物preSAR1rp(5’-CATCAAATCTTTCAGGG-3’，SEQIDNO.23)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。隨后使用Netzyme(MolecularNetlineBioproducts)DNA聚合酶和與SAR1內(nèi)含子3’端發(fā)生雜交的引物preSAR1fp(5’-CTTTATTTTACTGTACAG-3’，SEQIDNO.24)進(jìn)行15個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增。第5個(gè)循環(huán)后加入[α-32P]dCTP(740kBq，110TBq/mmol，Amersham)，并在6％PA-尿素凝膠中分離產(chǎn)物，進(jìn)行放射自顯影。使用FUJI(FujifilmBAS-1500)磷光成像儀測(cè)定擴(kuò)增條帶的相對(duì)強(qiáng)度。將缺乏逆轉(zhuǎn)錄酶的樣品用作對(duì)照。實(shí)施例8植物轉(zhuǎn)化將本發(fā)明的克隆(例如擬南芥Ct-SRL1cDNA)亞克隆到pBI121(Clontech)中取代GUS基因，并通過電穿孔將生成的二元載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌菌株C58C1中。如http//www.arabidopsis.org/protocols_Mundy2.htm1#trans.inf所述通過體內(nèi)滲透獲得轉(zhuǎn)基因植株(像擬南芥植株)。或者，可以用本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)化其它雙子葉或單子葉植物。因此，將它們克隆到合適的植物轉(zhuǎn)化載體(諸如二元載體)中，處于植物可操作性調(diào)控序列(諸如植物可操作啟動(dòng)子和植物可操作終止子)的控制之下?？梢允褂帽绢I(lǐng)域熟練技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(諸如由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移)將包含本發(fā)明基因的這些載體轉(zhuǎn)化到植物(諸如農(nóng)作物植物)中。表達(dá)本發(fā)明基因的轉(zhuǎn)基因植株預(yù)計(jì)顯示對(duì)環(huán)境壓力的耐受性增加，諸如對(duì)無機(jī)鹽毒性的耐受性增加?？梢酝ㄟ^例如轉(zhuǎn)基因植株在含鹽培養(yǎng)基中發(fā)芽的能力而觀察到這種增加的耐受性。實(shí)施例9用本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)化稻在酵母中參與鹽耐受性的甜菜或擬南芥基因在單子葉植物(諸如稻)中的表達(dá)能夠賦予該單子葉植物以壓力耐受性。為了將本發(fā)明基因的壓力耐受性活性轉(zhuǎn)移至單子葉植物，通過本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員眾所周知且下一段概述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用可操作連接啟動(dòng)子的每一種上述基因(SEQIDNO.1、2、5、7、9、11、13、15、17、和19)轉(zhuǎn)化稻。在范圍為1天-1或多周的幾個(gè)時(shí)間周期后，如下所述對(duì)幼苗檢查轉(zhuǎn)化基因的表達(dá)。這里通過在器官發(fā)生培養(yǎng)基中栽培幼苗，并通過PCR或反向PCR檢查DNA或RNA的存在而進(jìn)行的。在確認(rèn)了基因表達(dá)后，如下所述對(duì)經(jīng)轉(zhuǎn)化稻植株檢查對(duì)壓力環(huán)境(包括鹽、干旱、和寒冷)的耐受性的增強(qiáng)(參閱WO97/13843)。這是通過在含有數(shù)量漸增的NaCl或LiCl的培養(yǎng)基中栽培經(jīng)轉(zhuǎn)化稻植株而進(jìn)行的。同樣，通過分別在亞最佳栽培溫度和亞最佳濕度水平下栽培經(jīng)轉(zhuǎn)化植株來測(cè)試對(duì)寒冷或干旱的抵抗力的增加(參閱WO97/13843)。由擬南芥介導(dǎo)的稻轉(zhuǎn)化將本發(fā)明的基因可操作連接啟動(dòng)子，并克隆到載體中。通過電穿孔用這些載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404或C58，隨后在含有適當(dāng)抗生素的固體瓊脂培養(yǎng)基上選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞。為了證明本發(fā)明基因在稻中的表達(dá)，將稻日本栽培種Nipponbare或Taipei的309枚成熟的、干燥的種子脫殼，滅菌，并在含有2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的培養(yǎng)基上發(fā)芽。在黑暗中保溫4周后，切下由盾片衍生的胚性愈傷組織，并在相同培養(yǎng)基中增殖。然后將選擇的胚性愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)。將共培養(yǎng)后的愈傷組織在含有2，4-D的培養(yǎng)基上在黑暗中在存在合適濃度的適當(dāng)選擇劑時(shí)培養(yǎng)4-5周。在此期間，形成了快速生長(zhǎng)的抗性愈傷組織島。將此材料轉(zhuǎn)移至含有濃度降低的2，4-D的培養(yǎng)基并在光照下保溫后，成胚潛力得到釋放，并在隨后的4-5周內(nèi)形成苗。由愈傷組織切下苗，并在含有生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中保溫1周，然后可以由此轉(zhuǎn)移至土壤。在濕度高、白晝短的人工氣候室中栽培變硬的苗。可以在移植后3-5個(gè)月收獲種子。該方法以超過50％的比率產(chǎn)生單基因座轉(zhuǎn)化體(Chan等人，1993，PlantMol.Biol.，22491-506；Hidi等人，1994，PlantJ.，6271-282)。參考文獻(xiàn)AnG.，WatsonB.D.，StachelS.，GordonM.P.，&NesterE.W.(1985)Newcloningvehiclesfortransformationofhigherplants(用于轉(zhuǎn)化高等植物的新克隆載體).EMBOJ.4，277-284.ArmstrongC.L.，PetersenW.P.，BuchholzW.G.，BowenB.A.，&SulcS.L.(1990)FactorsaffectingPEG-mediatedstabletransformationofmaizeprotoplasts(影響由PEG介導(dǎo)的玉米原生質(zhì)體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的因素).PlantCellReports9，335-339.BaronM.H.&BaltimoreD.(1982)Antibodiesagainstthechemicallysynthesizedgenome-linkedproteinofpoliovirusreactwithnativevirus-specificproteins(針對(duì)化學(xué)合成的脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組連接蛋白的抗體與天然病毒特異蛋白發(fā)生反應(yīng)).Cell28，395-404.BartelP.L.&FieldsS.(1997)TheYeastTow-HybridSystem(酵母雙雜交系統(tǒng)).OxfordUniversityPress.BechtoldN.&PelletierG.(1998)InplantaAgrobacterium-mediatedtransformationofadultArabidopsisthalianaplantsbyvaccuminfiltration(通過真空滲透在植物中進(jìn)行的由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的成熟擬南芥植株的轉(zhuǎn)化).MethodsMol.Biol.82，259-266.ChoR.J.，MindrinosM.，RichardsD.R.，SapolskyR.J.，AndersonM.，DrenkardE.，DewdneyJ.，ReuberT.L.，StammersM.，F(xiàn)ederspielN.，TheologisA.，YangW.H.，HubbellE.，AuM.，ChungE.Y.，LashkariD.，LemieuxB.，DeanC.，LipshutzR.J.，AusubelF.M.，DavisR.W.，&OefnerP.J.(1999)Genome-widemappingwithbiallelicmarkersinArabidopsisthaliana(使用biallelic標(biāo)記在擬南芥中進(jìn)行基因組范圍的作圖).Nat.Genet.23，203-207.ChristouP.，McCabeD.E.，&SwainW.F.(1988)StabletransformationofsoybeancallusbyDNA-coatedgoldparticles(使用由DNA包被的金微粒進(jìn)行的大豆愈傷組織的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化).PlantPhysiol.87，671-674.CrosswayA，OakesJ.V.，IrvineJ.M.，WardB.，KnaufV.C.，&ShewmakerC.K.(1986)IntegrationofforeignDNAfollowingmicroinjectionoftobaccomesophyllprotoplasts(外源DNA在顯微注射到煙草葉肉原生質(zhì)體中后的整合).Mol.Gen.Genet.202，179-185.DoddsJ.H.(1985)Plantgeneticengineering(植物遺傳工程).CambridgeUniversityPress.FrommM.，TaylorL.P.，&WalbotV.(1985)Expressionofgenestransferredintomonocotanddicotplantcellsbyelectroporation(通過電穿孔轉(zhuǎn)移到單子葉和雙子葉植物細(xì)胞中的基因的表達(dá)).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A82，5824-5828.HanahanD.(1983)StudiesontransformationofEscherichiacoliwithplasmids(關(guān)于用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌的研究).J.Mol.Biol.166，557-580.HellensR.P.，EdwardsE.A.，LeylandN.R.，BeanS.，&MullineauxP.M.(2000)pGreenaversatileandflexiblebinaryTivectorforAgrobacterium-mediatedplanttransformation(pGreen用于由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化的通用且穩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rgGluArgAspLysLeuLysAspArgSerHisHis65707580ArgSerArgAspArgLeuLysAspSerGlyGlyHisSerAspLysSer859095ArgHisHisSerSerArgAspArgAspTyrArgAspSerSerLysAsp100105110ArgArgArgHisHis115<210>22<211>55<212>PRT<213>擬南芥(Arabidopsisthaliana)<400>22MetIleTyrThrAlaIleAspAsnPheTyrLeuThrAspGluGlnLeu151015LysAlaSerProSerArgLysAspGlyIleAspGluThrThrGluIle202530SerLeuArgIleTyrGlyCysAspLeuIleGlnGluGlyGlyIleLeu354045LeuLysLeuProGlnAlaVal5055<210>23<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述探針或引物<400>23catcaaatctttcaggg17<210>24<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述探針或引物<400>24ctttattttactgtacag18權(quán)利要求1.增強(qiáng)細(xì)胞和生物體中的壓力耐受性的方法，包括操作信使RNA前體的加工過程。2.增強(qiáng)細(xì)胞和生物體中的鹽毒性的方法，包括操作信使RNA前體的加工過程。3.依照權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)的方法，其中所述操作包括對(duì)參與或干預(yù)信使RNA前體加工過程的分子進(jìn)行的遺傳或生化操作。4.依照權(quán)利要求1或3的方法，其中所述壓力耐受性包括對(duì)滲透、干旱、寒冷、或凍結(jié)壓力的耐受性。5.依照權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，包括對(duì)具有Arg-Ser、Arg-G1u、和Arg-Asp二肽高含量的結(jié)構(gòu)域(RS結(jié)構(gòu)域)的蛋白質(zhì)進(jìn)行的遺傳或生化操作。6.依照權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，包括對(duì)屬于RNA結(jié)合蛋白的蛋白質(zhì)進(jìn)行的遺傳或生化操作。7.依照權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，包括對(duì)U1-snRNP或U2-snRNP復(fù)合物的成分進(jìn)行的遺傳或生化操作。8.依照權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，包括對(duì)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行的遺傳或生化操作。9.依照權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，包括對(duì)核運(yùn)動(dòng)蛋白進(jìn)行的遺傳或生化操作。10.包含SEQIDNO.1所示核酸序列即編碼SEQIDNO.3所列氨基酸序列的分離核酸、或包含如SEQIDNO.2所示即編碼SEQIDNO.4或SEQIDNO.21所列氨基酸序列或包含SEQIDNO.22的氨基酸序列的核酸用于依照權(quán)利要求1-5的任何方法的用途。11.包含SEQIDNO.5所示核酸序列即編碼SEQIDNO6所列氨基酸序列的分離核酸用于權(quán)利要求1-4或7的任何方法的用途。12.包含SEQIDNO.7、9、11、13、15、17、或19任一核酸序列即編碼SEQIDNO.8、10、12、14、16、18、或20任一所列氨基酸序列的分離核酸用于權(quán)利要求1-4的任何方法的用途。13.選自下組且編碼蛋白質(zhì)或其免疫學(xué)活性和/或功能性片段的分離核酸a)包含SEQIDNO.1、2、5、7、9、11、13、15、17、或19任一所示DNA序列或其互補(bǔ)序列的核酸；b)包含對(duì)應(yīng)于(a)中SEQIDNO.1、2、5、7、9、11、13、15、17、或19任一項(xiàng)的RNA序列或其互補(bǔ)序列的核酸；c)與(a)或(b)中定義的核苷酸序列特異雜交的核酸；d)所編碼的蛋白質(zhì)具有與SEQIDNO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、或21任一項(xiàng)所示多肽至少95％同一的氨基酸序列的核酸；e)所編碼的蛋白質(zhì)包含SEQIDNO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、21、或22任一項(xiàng)所示氨基酸序列的核酸；f)由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性而是SEQIDNO.1、2、5、7、9、11、13、15、17、或19任一項(xiàng)所示或(a)-(e)中定義的核酸的簡(jiǎn)并性的核酸；g)由于生物體之間密碼子使用率的差異而與編碼SEQIDNO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、或21任一項(xiàng)所示蛋白質(zhì)或(a)-(e)中定義的核苷酸序列具有分歧的核酸；h)由于編碼SEQIDNO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、或21任一項(xiàng)所示蛋白質(zhì)或(a)-(e)中定義的等位基因的差異而具有分歧的核酸；i)編碼由SEQIDNO.1、2、5、7、9、11、13、15、17、或19任一項(xiàng)所示或(a)-(e)中定義的DNA序列編碼的蛋白質(zhì)的免疫學(xué)活性和/或功能性片段的核酸；j)編碼SEQIDNO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、或21中定義的蛋白質(zhì)或(a)-(i)中定義的核酸，其特征為所述序列是DNA、cDNA、基因組DNA、或合成DNA。14.與權(quán)利要求13的核酸特異雜交的長(zhǎng)度為至少15個(gè)核苷酸的核酸分子。15.特異擴(kuò)增權(quán)利要求13的核酸的長(zhǎng)度為至少15個(gè)核苷酸的核酸分子。16.包含依照權(quán)利要求13的核酸的載體。17.依照權(quán)利要求16的載體，它是表達(dá)載體，其中所述核酸可操作連接能夠在原核和/或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)所述序列的一種或多種控制序列。18.包含依照權(quán)利要求13的核酸或權(quán)利要求16或17的載體的宿主細(xì)胞。19.依照權(quán)利要求18的宿主細(xì)胞，其選自細(xì)菌、昆蟲、真菌、酵母、植物、或動(dòng)物細(xì)胞。20.編碼包含權(quán)利要求5中定義的“RS結(jié)構(gòu)域”的蛋白質(zhì)的天然或合成核酸用于權(quán)利要求1-4的任何方法的用途。21.編碼在真核細(xì)胞中參與信使RNA前體加工過程的蛋白質(zhì)的天然或合成核酸在權(quán)利要求1-9的任何方法中的用途。22.與權(quán)利要求10-13任一項(xiàng)中鑒定的至少一種序列具有至少50％同一性的核酸在權(quán)利要求1的方法中的用途，其中所述核酸源自真核細(xì)胞。23.對(duì)應(yīng)于權(quán)利要求12中定義的至少一種核酸的反義分子。24.權(quán)利要求23的反義分子在權(quán)利要求1-4的任何方法中的用途。25.可以由權(quán)利要求13定義的至少一種核酸編碼的多肽、或其同系物或衍生物、或其免疫學(xué)活性和/或功能性片段。26.包含SEQIDNO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、21、或22任一項(xiàng)所示氨基酸序列的權(quán)利要求25的多肽、或其同系物或衍生物、或其免疫學(xué)活性和/或功能性片段。27.生成依照權(quán)利要求25或26的多肽的方法，包括在允許表達(dá)多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求18或19的宿主細(xì)胞并由培養(yǎng)物回收生成的多肽。28.用于生成轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞、或植物組織的方法，包括將可表達(dá)形式的依照權(quán)利要求13的核酸分子或依照權(quán)利要求16或17的載體導(dǎo)入所述植物、植物細(xì)胞、或植物組織。29.用于生成改變后的植物、植物細(xì)胞、或植物組織的方法，包括將權(quán)利要求25或26的多肽直接導(dǎo)入所述植物的細(xì)胞、組織、或器官。30.用于實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求25或26的多肽的表達(dá)的方法，包括將可操作連接一種或多種控制序列的權(quán)利要求13的核酸或依照權(quán)利要求16或17的載體穩(wěn)定導(dǎo)入植物細(xì)胞的基因組。31.權(quán)利要求28或30的方法，還包括由所述植物細(xì)胞再生植株。32.可以通過權(quán)利要求31的方法獲得的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述核酸穩(wěn)定整合到所述植物細(xì)胞的基因組中。33.因表達(dá)權(quán)利要求13的至少一種核酸或權(quán)利要求25或26的至少一種多肽或權(quán)利要求23的反義分子而耐受鹽壓力的轉(zhuǎn)基因植物。34.因表達(dá)權(quán)利要求13的至少一種核酸或權(quán)利要求25或26的至少一種多肽或權(quán)利要求23的反義分子而顯示表型變化的轉(zhuǎn)基因植物。35.權(quán)利要求33和34的植物的可收獲部分。36.權(quán)利要求35的植物的可收獲部分，其選自下組種子、葉、果實(shí)、莖干培養(yǎng)物、根狀莖、根、塊莖、和鱗莖。37.由權(quán)利要求33-36任一項(xiàng)任何植物或植物部分衍生的后代。38.用于在植物中增強(qiáng)壓力耐受性的方法，包括在所述植物的細(xì)胞、組織、或部分中表達(dá)權(quán)利要求13的至少一種核酸或權(quán)利要求25或26的至少一種多肽或權(quán)利要求23的反義分子。39.用于在植物中改變壓力耐受性的方法，包括在所述植物的細(xì)胞、組織、或部分中表達(dá)權(quán)利要求13的至少一種核酸或權(quán)利要求25或26的至少一種多肽或權(quán)利要求23的反義分子。40.權(quán)利要求38或39的方法，其中所述壓力是滲透壓。41.權(quán)利要求38或39的方法，其中所述壓力是鹽壓力。42.權(quán)利要求38或39的方法，其中所述壓力是干旱壓力。43.權(quán)利要求38或39的方法，其中所述壓力是凍結(jié)壓力。44.權(quán)利要求38或39的方法，其中所述壓力是寒冷壓力。45.權(quán)利要求1-9、27-31、或38-44任一項(xiàng)的方法用于提高產(chǎn)量。46.權(quán)利要求13的核酸、權(quán)利要求16或17的載體、權(quán)利要求25或26的多肽用于提高產(chǎn)量的用途。47.權(quán)利要求13的核酸、權(quán)利要求16或17的載體、權(quán)利要求25或26的多肽用于刺激植物生長(zhǎng)的用途，可以是在該植物的任何部分，諸如根、葉、種子中。48.可以通過權(quán)利要求1-9、28-31、或38-42的任何方法獲得的植物或者權(quán)利要求33或34的植物用于在鹽含量超過1mM鹽離子的土壤上栽培的用途。49.因表達(dá)權(quán)利要求13的任何核酸和/或權(quán)利要求25或26的蛋白質(zhì)而更加耐受鹽壓力的新的酵母菌株或其它單細(xì)胞真核生物。50.體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，它包括因表達(dá)權(quán)利要求13的至少一種核酸、權(quán)利要求16或17的載體、權(quán)利要求25或26的多肽、或者權(quán)利要求23的反義分子而獲得的權(quán)利要求18或19中定義的耐受鹽的動(dòng)物、植物、或宿主細(xì)胞。51.由權(quán)利要求1中描述的方法衍生的對(duì)人的治療性應(yīng)用。52.特異識(shí)別權(quán)利要求25或26的多肽或其特定表位的抗體。53.診斷組合物，它包含權(quán)利要求13-15的至少一種核酸、權(quán)利要求16或17的載體、權(quán)利要求25或26的多肽、或權(quán)利要求52的抗體。全文摘要本發(fā)明描述了前信使RNA加工作為由例如鋰和鈉毒性引起的環(huán)境壓力的新靶的鑒定。由不同生物體過度表達(dá)參與前mRNA加工的不同類型的蛋白質(zhì)(或蛋白質(zhì)片段)可保護(hù)酵母免于鹽壓力的損害，這說明，不依賴其機(jī)制，對(duì)這種過程的任何刺激都可能抵消無機(jī)鹽的毒性作用。已經(jīng)通過在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中過度表達(dá)這些類型的蛋白質(zhì)而觀察到耐受性NaCl和LiCl的相似表型，證明了這種保護(hù)作用在真核細(xì)胞和生物體中的普遍性。文檔編號(hào)A61K48/00GK1429273SQ01809382公開日2003年7月9日申請(qǐng)日期2001年4月19日優(yōu)先權(quán)日2000年4月19日發(fā)明者O·溫森特邁納,M·羅丹莫迪納,R·塞拉諾薩拉姆,J·J·弗門特米萊特,M·A·納蘭多奧利弗,R·羅斯帕羅,R·A·卡諾努申請(qǐng)人:巴倫西亞多學(xué)科技術(shù)大學(xué)