專利名稱：具有一個或多個d－氨基酸取代的酶變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及相對于其相應(yīng)的野生型酶具有降低的免疫原性的酶變體，以及含有該變體的組合物、編碼該變體的DNA序列和使用該變體的方法。
背景技術(shù)：
酶構(gòu)成最大類的天然存在的蛋白質(zhì)并負(fù)責(zé)多種反應(yīng)的催化。例如，一類酶包含催化其它蛋白質(zhì)水解的蛋白質(zhì)酶。通過將天然存在的和蛋白質(zhì)工程的蛋白酶摻入到清潔組合物、特別是與洗衣應(yīng)用有關(guān)的那些組合物中，人們已經(jīng)在利用水解蛋白質(zhì)的這種能力。其它酶例如淀粉酶和脂酶也因多種目的(包括淀粉和脂質(zhì)的水解)結(jié)合入各種清潔組合物中。
在清潔領(lǐng)域，這些蛋白酶中最廣泛使用的是絲氨酸蛋白酶。這些絲氨酸蛋白酶中的大多數(shù)是由細(xì)菌生物體生產(chǎn)的，而另一些是由其它生物體例如真菌生產(chǎn)的。參見，Siezen，Ro1and J.等，“Subti1ases的同源性模擬和蛋白質(zhì)工程戰(zhàn)略，枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶家族”，蛋白質(zhì)工程，第4卷，No.7,719-737頁(1991)。
所有這些酶的相似的性質(zhì)涉及野生型酶在其相對于人造清潔組合物環(huán)境的自然環(huán)境中的效力。一般地，在自然環(huán)境中的效力不能轉(zhuǎn)變?yōu)槿嗽飙h(huán)境中的效力，致使酶的用途受限。例如，蛋白酶特征，例如熱穩(wěn)定性，pH穩(wěn)定性，氧化穩(wěn)定性和底物特異性，對于在該酶的天然環(huán)境之外的應(yīng)用未必是最佳的。
為了提高該酶在非天然洗滌環(huán)境中的效力，曾應(yīng)用過幾種方法來改變酶的野生型氨基酸序列。這些方法包含酶的基因重設(shè)計來增強例如熱穩(wěn)定性和在完全不同的條件下改善氧化穩(wěn)定性。
但是由于這樣的基因工程酶對于哺乳動物是外源的，它們是潛在的抗原。作為抗原，這些酶在哺乳動物中可以引起免疫性反應(yīng)和/或變應(yīng)反應(yīng)(這里簡單地統(tǒng)稱為變應(yīng)原性或變應(yīng)性反應(yīng))。實際上，在人經(jīng)常暴露于酶中的環(huán)境中已發(fā)現(xiàn)了對酶的敏感。這些環(huán)境包括生產(chǎn)設(shè)備，在該環(huán)境中職員通過如無控灰塵或氣溶膠化的媒介暴露于酶中。酶吸入肺中可導(dǎo)致氣溶膠化，這是可引起最危險的反應(yīng)的酶暴露的途徑。在消費者重復(fù)使用含可引起變應(yīng)性反應(yīng)的酶的產(chǎn)品的市場中也會產(chǎn)生酶致敏。
此外，盡管在對在洗衣應(yīng)用中使用的更高效蛋白酶的不懈探索中基因工程已經(jīng)是重要的了，但是目前在個人護理組合物和輕垢洗滌劑中最小程度地應(yīng)用基因工程酶。象例如化妝品，手用/體用水劑和膏霜，肥皂，凝膠，浴液和香波這樣的產(chǎn)品中沒有基因工程酶的主要原因是由于導(dǎo)致不期望的變應(yīng)反應(yīng)的人類致敏的上述問題。因此，提供一種提供具有最小變應(yīng)反應(yīng)激發(fā)的基因工程酶的清潔性能的個人護理組合物是非常有利的。
減弱酶的變應(yīng)活性的一個方法是通過該酶的一個或多個抗原決定部位的重設(shè)計?？乖瓫Q定部位是通過抗體結(jié)合或者通過主要的組織相容性復(fù)合體蛋白(MHC)將處理過的抗原呈遞給T細(xì)胞而誘發(fā)免疫反應(yīng)的抗原的那些氨基酸區(qū)?？乖瓫Q定部位的變化能夠影響它們作為抗原的效力。參見Walsh，B.J.和M.E.H.Howden，“以抗原決定部位圖譜的修飾為基礎(chǔ)測定變應(yīng)原的IgE結(jié)合序列的方法”，免疫學(xué)方法雜志(Journal of Immunological Methods)，121卷，275-280頁(1989)。
已發(fā)現(xiàn)用一個或多個右旋氨基酸(下文簡稱為“D-氨基酸”)取代野生型酶中的一個或多個氨基酸殘基、特別是在抗原決定部位取代時，可提供具有驚人的降低的變應(yīng)性和/或免疫反應(yīng)、同時仍保持酶效力的酶變體。作為參考氨基酸可以左旋(“L-氨基酸”)和右旋(“D-氨基酸”)構(gòu)象存在。L-氨基酸為天然存在于自然界和大多數(shù)生物系統(tǒng)中的。此外，天然存在的多肽由L-氨基酸構(gòu)成，因而可稱為L-多肽。D-氨基酸為其L-氨基酸對應(yīng)物的“鏡像”。盡管D-多肽(完全由D-氨基酸構(gòu)成的多肽)不是天然存在的，可人工合成這些多肽以形成三維的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)優(yōu)選地在酶的抗原決定部位區(qū)引入至少一個D-氨基酸，可使酶相對于野生型酶更少引起變應(yīng)癥。不受理論的限制，通常認(rèn)為生物系統(tǒng)不會把含有D-氨基酸的抗原決定部位區(qū)識別為真抗原決定部位區(qū)。因此，不會發(fā)生通常會發(fā)生的變應(yīng)性反應(yīng)。但是，令人興奮地，可保持生物功能和酶效力。因此，此處可提供降低的引起的變應(yīng)性反應(yīng)并保持酶效力的酶。
因而，本發(fā)明涉及具有野生型氨基酸序列的改性氨基酸序列的酶變體，該變體具有在一個或多個氨基酸位由取代D-氨基酸產(chǎn)生的取代。
因此，本發(fā)明酶適合在幾種類型的組合物中使用，包含但不限于洗衣、洗碟、硬表面、皮膚護理、頭發(fā)護理、美容護理，口腔和隱形眼鏡組合物。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及相對于它們的相應(yīng)的野生型酶來說具有降低的免疫原性的酶變體。更具體地說，本發(fā)明涉及具有野生型氨基酸序列的改性的氨基酸序列的酶變體，其中所述酶變體包含在一個或多個氨基酸位由取代D-氨基酸產(chǎn)生的取代。該酶變體的至少一個氨基酸是L-氨基酸。本發(fā)明進一步涉及編碼這樣的變體的突變基因和含有這樣的變體的清潔和個人護理組合物。
本發(fā)明的詳細(xì)描述下面描述本發(fā)明的基本成分。也包含本發(fā)明實施方案中使用的各種任選的和優(yōu)選的成分的非限制性描述。
本發(fā)明能包含任何必需的或任選的成分和/或這里描述的限定，由任何必需的或任選的成分和/或這里描述的限定構(gòu)成，或者基本上由任何必需的或任選的成分和/或這里描述的限定構(gòu)成。
除非另有說明，所有的百分比和比例以重量計算。除非另有說明，所有的百分比以總的組合物為基礎(chǔ)計算。
所有的成分或組成含量都與那個成分或組成的活性含量有關(guān)，并且不包含在商業(yè)可獲得的來源中可能存在的雜質(zhì)，例如殘留溶劑或副產(chǎn)物。
這里提到的所有的文獻，包括所有的專利，專利申請和出版物，都全文引作參考。
此處提及的為包括、但不限于蛋白質(zhì)、更特別地酶的原料的商品名。此處發(fā)明者不想受限于某種商品名的原料?？蓪⑴c由商品名注明的原料相當(dāng)?shù)脑?如來自不同名稱或編目(參考)號下的不同來源的原料)代替并將其用在此處的組合物中。
如這里使用的，將用縮寫來描述氨基酸，包括L-氨基酸和D-氨基酸。表I提供了這里使用的縮寫表表I
如此處所用的，可通過參考表征變體的取代氨基酸位為變體命名。此處通過提供野生型氨基酸殘基、隨后是位號、隨后是待取代的取代氨基酸殘基表示取代。在取代氨基酸殘基可為在該特定位處的允許的任何D-氨基酸時，提供以符號“D-*”表示。構(gòu)成變體的多取代以符號“+”分隔。舉例說明，甘氨酸在70位處的D-纈氨酸取代可表示為Gly70D-Val或G70D-V。在70位和72位都有D-氨基酸取代的變體的例子可表示為Gly70D-Val+Val72D-Ala或G70D-V+V72D-A。76位處任何D-氨基酸的取代的變體的例子表示為N76D-*。
定義如這里使用的，術(shù)語“突變”指在基因序列和這些基因序列產(chǎn)生的氨基酸序列中的改變。突變可以是使野生型蛋白質(zhì)序列缺失、取代或添加氨基酸殘基。
如這里使用的，術(shù)語“野生型”指沒有突變的生物體生產(chǎn)的酶。
如這里使用的，術(shù)語“變體”指具有不同于相應(yīng)的野生型酶的氨基酸序列的酶。
本發(fā)明的酶變體本發(fā)明者已鑒別出相對于相應(yīng)的野生型酶具有降低的變應(yīng)性反應(yīng)的某些酶變體。已發(fā)現(xiàn)用一個或多個右旋氨基酸(下文簡稱為“D-氨基酸”)取代野生型酶中的一個或多個氨基酸殘基可提供在特別是人造清潔和個人清潔環(huán)境中驚人地具有降低的變應(yīng)性反應(yīng)同時又保持了酶效力的酶變體。因而，此處提供的為具有至少一個D-氨基酸的酶變體、包含該變體的組合物、該變體的DNA序列編碼以及特別是在清潔和個人護理領(lǐng)域使用該變體的方法。
作為參考氨基酸可以左旋(“L-氨基酸”)和右旋(“D-氨基酸”)構(gòu)象存在。L-氨基酸為天然存在于自然界和大多數(shù)生物系統(tǒng)中的。此外，天然存在的多肽由L-氨基酸構(gòu)成，因而可稱為L-多肽。D-氨基酸為其L-氨基酸對應(yīng)物的“鏡像”，盡管D-多肽(完全由D-氨基酸構(gòu)成的多肽)不是天然存在的，可人工合成這些多肽以形成三維的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)優(yōu)選地在酶的抗原決定部位區(qū)引入至少一個D-氨基酸，可使酶相對于相應(yīng)的野生型酶更少引起變應(yīng)癥。不受理論的限制，通常認(rèn)為生物系統(tǒng)不會把含有D-氨基酸的抗原決定部位區(qū)識別為真抗原決定部位區(qū)。因此，不會發(fā)生通常會發(fā)生的變應(yīng)性反應(yīng)。但是，令人興奮地，可保持生物功能和酶效力。因此，此處可提供降低的引起的變應(yīng)性反應(yīng)并保持酶效力的酶。本發(fā)明的酶適用于包括、但不限于洗衣、洗碟、硬表面清潔、護膚、護發(fā)、美容、口腔和隱形眼鏡組合物的幾種組合物。
因而，本發(fā)明涉及具有野生型氨基酸序列的改性氨基酸序列的酶變體，該變體具有在一個或多個氨基酸位由取代D-氨基酸產(chǎn)生的取代。因為應(yīng)避免完全由D-氨基酸組成的酶，變體的至少一個氨基酸為L-氨基酸。優(yōu)選地，至少有一個取代是發(fā)生在野生型氨基酸序列的抗原決定部位區(qū)。抗原決定部位區(qū)包括B-細(xì)胞抗原決定部位區(qū)和T-細(xì)胞抗原決定部位區(qū)，但是，優(yōu)選地在至少一個T-細(xì)胞抗原決定部位區(qū)引入D-氨基酸取代。
優(yōu)選地，此處的酶變體為選自于蛋白酶、纖維素酶、脂酶、淀粉酶、過氧化物酶、微過氧化物酶、半纖維素酶、木聚糖酶、磷脂酶、酯酶、角質(zhì)酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪氧化酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、丹寧酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶(malanases)、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、漆酶、轉(zhuǎn)移酶、異構(gòu)酶、裂解酶、合成酶和果基酶的改性野生型酶。更優(yōu)選地，此處的酶變體為選自于蛋白酶、纖維素酶、脂酶、淀粉酶、過氧化物酶、微過氧化物酶、磷脂酶、酯酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、β-葡聚糖酶、轉(zhuǎn)移酶、裂解酶、合成酶和果基酶的改性野生型酶。甚至更優(yōu)選地，此處的酶變體為選自于蛋白酶、纖維素酶、脂酶、淀粉酶、過氧化物酶、磷脂酶、酯酶、果膠酶、還原酶、氧化酶、β-葡聚糖酶、轉(zhuǎn)移酶和果基酶的改性野生型酶。最優(yōu)選地，此處的酶變體為是蛋白酶的改性野生型酶。
作為非限制性例子，含有134個氨基酸的磷脂酶A2含有幾個T-細(xì)胞抗原決定部位區(qū)。這些抗原決定部位區(qū)存在于氨基酸位號71-92、101-118、104-121和108-125內(nèi)。參見如Specht等人的“蜂毒磷脂酶A2的鼠(H-2K)T-細(xì)胞抗原決定部位位于酶的活性位以外”，Int.Arch.Allergy Immunol.，第112卷，226-230頁(1997年)，以及Blaser的“隨變應(yīng)原劑量而定的細(xì)胞因子的生產(chǎn)控制特異性的IgE和IgG抗體的生產(chǎn)”，《變應(yīng)癥免疫療法新視野》，第295頁(1996年)。依照本發(fā)明，可在任何這些抗原決定部位區(qū)內(nèi)引入一個或多個D-氨基酸，以減少變應(yīng)性反應(yīng)?？墒褂萌魏蜠-氨基酸，優(yōu)選地使用此處的表1中列出的天然存在的L-氨基酸的“鏡像”的D-氨基酸。
優(yōu)選地，酶為蛋白酶時，本發(fā)明的變體為絲氨酸蛋白酶的變體。此處所用的術(shù)語“絲氨酸蛋白酶”是指其中至少50％、優(yōu)選地80％的氨基酸序列與一種或多種類枯草桿菌蛋白酶絲氨酸蛋白酶相同的蛋白酶。可在Siezen等人的“Subtilases-類枯草桿菌蛋白酶絲氨酸蛋白酶族的同族模擬和蛋白質(zhì)工程戰(zhàn)略”，《蛋白質(zhì)工程》第4卷，第7期，719-737頁(1991年)中找到有關(guān)類枯草桿菌蛋白酶絲氨酸蛋白酶及其同族的討論。用于以一個或多個D-氨基酸取代的優(yōu)選的絲氨酸蛋白酶包括枯草桿菌蛋白酶BPN’、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶DY、枯草桿菌蛋白酶309、蛋白酶K和致熱酶(thermitase)。用于以一個或多個D-氨基酸取代的更優(yōu)選的絲氨酸蛋白酶包括枯草桿菌蛋白酶BPN’和枯草桿菌蛋白酶309。用于以一個或多個D-氨基酸取代的最優(yōu)選的絲氨酸蛋白酶為枯草桿菌蛋白酶BPN’。
已發(fā)現(xiàn)抗原決定部位區(qū)存在于絲氨酸蛋白酶中的相應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的70-84、103-126和217-252位。本發(fā)明者已進一步發(fā)現(xiàn)在一個或多個這些抗原決定部位區(qū)內(nèi)的以取代D-氨基酸的一個或多個氨基酸取代可提供相對于相應(yīng)的野生型絲氨酸蛋白酶引起降低的變應(yīng)性反應(yīng)的變體。就絲氨酸蛋白酶的位號而言，雖然本發(fā)明的變體不限于枯草桿菌蛋白酶BPN’的變體，所有氨基酸的編號是參照以SEQ IDNO1表示的枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列的。Well，J.A.、E.Ferrari、D.J.Henner、D.A.Estell和E.Y.Chen在《核酸研究》第2卷，7911-7925頁(1983年)中進一步介紹了枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列。已在絲氨酸蛋白酶中鑒別出了其它抗原決定部位區(qū)，包括在1998年6月16日授權(quán)的轉(zhuǎn)讓給Novo Nordisk A/S的Loevborg的美國專利5,766,898號中介紹的。
因而，本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方案涉及在三個抗原決定部位區(qū)的一個或多個具有由一個或多個取代D-氨基酸的取代的酶變體，其中酶變體為絲氨酸蛋白酶變體?？墒褂萌魏蜠-氨基酸，優(yōu)選地使用此處的表1中列出的天然存在的L-氨基酸的“鏡像”的D-氨基酸。優(yōu)選的變體具有野生型氨基酸序列的改性氨基酸序列，其中野生型氨基酸序列含有第一抗原決定部位區(qū)、第二抗原決定部位區(qū)和第三抗原決定部位區(qū)，其中改性氨基酸序列含有在一個或多個抗原決定部位區(qū)的一個或多個位處由取代D-氨基酸產(chǎn)生的取代，其中(i)當(dāng)取代發(fā)生在第一抗原決定部位區(qū)時，取代發(fā)生在相應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的70-84位的一個或多個位點；(ii)當(dāng)取代發(fā)生在第二抗原決定部位區(qū)時，取代發(fā)生在相應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的103-126位的一個或多個位點；(iii)當(dāng)取代發(fā)生在第三抗原決定部位區(qū)時，取代發(fā)生在相應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的217-252位的一個或多個位點。
因而，本發(fā)明的變體可為具有由取代D-氨基酸取代的野生型氨基酸序列的改性氨基酸序列的絲氨酸蛋白酶的變體，其中取代是在相應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83和84(70-84)、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125和126(103-126)和217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251和252(217-252)的一個或多個位點處。更優(yōu)選地，改性氨基酸序列具有由兩個或多個D-氨基酸在兩個或多個這些位點處的取代，甚至更優(yōu)選地具有由三個或多個D-氨基酸在三個或多個這些位點處的取代。在這些位點處的取代是通過以D-氨基酸取代野生型氨基酸殘基實現(xiàn)的。優(yōu)選地，用于取代的氨基酸為天然存在的氨基酸的D-構(gòu)象，因而是通過以如表1中列出的D-氨基酸殘基取代野生型氨基酸殘基而實現(xiàn)的。
更明確地說，變體具有包含由取代D-氨基酸在相應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的70-84位的一個或多個位點處的取代的野生型氨基酸序列的改性氨基酸序列，其中(a)取代發(fā)生在70位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala、D-Arg、D-Asn、D-Asp、D-Cys、D-Gln、D-Glu、D-His、D-Ile、D-Leu、D-Lys、D-Met、D-Phe、D-Pro、D-Ser、D-Thr、D-Trp、D-Tyr和D-Val；(b)取代發(fā)生在71位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；更優(yōu)選D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Cys，D-Gly，D-Phe，D-His，D-Ile，D-Lys，D-Leu，D-Met，D-Pro，D-Gln，D-Ser，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(c)取代發(fā)生在72位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，和D-Tyr；(d)取代發(fā)生在73位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；更優(yōu)選D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Glu，D-Gly，D-Phe，D-His，D-Ile，D-Lys，D-Met，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(e)取代發(fā)生在74位點處時，取代氨基酸選自于D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；更優(yōu)選D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Glu，D-Gly，D-Phe，D-His，D-Ile，D-Lys，D-Leu，D-Met，D-Gln，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(f)取代發(fā)生在75位點處時，取代氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；更優(yōu)選D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Glu，D-Gly，D-Phe，D-His，D-Ile，D-Lys，D-Met，D-Gln，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(g)取代發(fā)生在76位點處時，取代氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；更優(yōu)選D-Ala，D-Arg，D-Cys，D-Ile，D-Leu，D-Met，D-Gln，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(h)取代發(fā)生在77位點處時，取代氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；更優(yōu)選D-Ala，D-Arg，D-Cys，D-Glu，D-Gly，D-Phe，D-His，D-Ile，D-Lys，D-Leu，D-Met，D-Pro，D-Gln，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(i)取代發(fā)生在78位點處時，取代氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；更優(yōu)選D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Cys，D-Glu，D-Gly，D-Phe，D-His，D-Ile，D-Lys，D-Leu，D-Met，D-Pro，D-Gln，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(j)取代發(fā)生在79位點處時，取代氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；更優(yōu)選D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Cys，D-Gly，D-Phe，D-His，D-Lys，D-Leu，D-Met，D-Pro，D-Gln，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(k)取代發(fā)生在80位點處時，取代氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(l)取代發(fā)生在81位點處時，取代氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，和D-Tyr；(m)取代發(fā)生在82位點處時，取代氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(n)取代發(fā)生在83位點處時，取代氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；和(o)取代發(fā)生在84位點處時，取代氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，和D-Tyr。
再優(yōu)選，本發(fā)明的變體包括取代，其中取代是在相應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、和83(73-83)的一個或多個位點處D-氨基酸的取代，更優(yōu)選地，相應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的75、76、77、78、79、80、81、82(75-82)的一個或多個位點處。
變體可以具有包含由取代D-氨基酸在相應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的103-126位的一個或多個位點處取代的野生型氨基酸序列的改性氨基酸序列，其中(a)取代發(fā)生在103位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(b)取代發(fā)生在104位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，和D-Val；(c)取代發(fā)生在105位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(d)取代發(fā)生在106位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Tyr，和D-Val；(e)取代發(fā)生在107位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(f)取代發(fā)生在108位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(g)取代發(fā)生在109位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(h)取代發(fā)生在110位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(i)取代發(fā)生在111位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(j)取代發(fā)生在112位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(k)取代發(fā)生在113位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Tyr，和D-Val；(l)取代發(fā)生在114位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(m)取代發(fā)生在115位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(n)取代發(fā)生在116位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(o)取代發(fā)生在117位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(p)取代發(fā)生在118位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(q)取代發(fā)生在119位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(r)取代發(fā)生在120位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(s)取代發(fā)生在121位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，和D-Tyr；(t)取代發(fā)生在122位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(u)取代發(fā)生在123位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(v)取代發(fā)生在124位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(w)取代發(fā)生在125位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；和(x)取代發(fā)生在126位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val.
變體可以具有包含由取代D-氨基酸在相應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的217-252位的一個或多個位點處的取代的野生型氨基酸序列的改性氨基酸序列，其中(a)取代發(fā)生在217位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，和D-Val；(b)取代發(fā)生在218位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(c)取代發(fā)生在219位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(d)取代發(fā)生在220位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(e)取代發(fā)生在221位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(f)取代發(fā)生在222位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(g)取代發(fā)生在223位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(h)取代發(fā)生在224位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(i)取代發(fā)生在225位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(j)取代發(fā)生在226位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(k)取代發(fā)生在227位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，和D-Tyr；(l)取代發(fā)生在228位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(m)取代發(fā)生在229位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(n)取代發(fā)生在230位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(o)取代發(fā)生在231位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(p)取代發(fā)生在232位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(q)取代發(fā)生在233位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(r)取代發(fā)生在234位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；
(s)取代發(fā)生在235位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(t)取代發(fā)生在236位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(u)取代發(fā)生在237位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(v)取代發(fā)生在238位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(w)取代發(fā)生在239位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(x)取代發(fā)生在240位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(y)取代發(fā)生在241位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Tyr，和D-Val；(z)取代發(fā)生在242位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(aa)取代發(fā)生在243位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(bb)取代發(fā)生在244位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(cc)取代發(fā)生在245位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(dd)取代發(fā)生在246位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，和D-Tyr；(ee)取代發(fā)生在247位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(ff)取代發(fā)生在248位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(gg)取代發(fā)生在249位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(hh)取代發(fā)生在250位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；(ii)取代發(fā)生在251位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asn，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val；和(jj)取代發(fā)生在252位點處時，取代D-氨基酸選自于D-Ala，D-Arg，D-Asp，D-Cys，D-Gln，D-Glu，D-Gly，D-His，D-Ile，D-Leu，D-Lys，D-Met，D-Phe，D-Pro，D-Ser，D-Thr，D-Trp，D-Tyr，和D-Val。
在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案中，D-氨基酸在相應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的70-84位點、更優(yōu)選地在相應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的73-83位點、甚至更優(yōu)選地在相應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的70和75-82位點、最優(yōu)選地在相應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的75-82位點的一個或多個位點處取代野生型氨基酸。在本發(fā)明的另外的特別優(yōu)選的實施方案中，D-氨基酸在相應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的70-84位點(第一抗原決定部位區(qū))的一個或多個位點和相應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的103-126位點(第二抗原決定部位區(qū))的一個或多個位點處取代野生型氨基酸。在本發(fā)明的另一特別優(yōu)選的實施方案中，D-氨基酸在相應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的70-84位點(第一抗原決定部位區(qū))的一個或多個位點和相應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的217-252位點(第三抗原決定部位區(qū))的一個或多個位點處取代野生型氨基酸。在本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案中，D-氨基酸在相應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的70-84位點(第一抗原決定部位區(qū))的一個或多個位點、相應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的103-126位點(第二抗原決定部位區(qū))的一個或多個位點和相應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的217-252位點(第三抗原決定部位區(qū))的一個或多個位點處取代野生型氨基酸。
下面的表2-3舉例說明了本發(fā)明的非限制性優(yōu)選的變體，其中在此舉例說明中使用了絲氨酸蛋白酶。雖然沒有明確地說明，可進行三、四、五、六、七、八、九和甚至更高的取代以形成變體。就這些表而言，在介紹特定的取代時，首先給出的是野生型氨基酸殘基，其次給出的是位號(相應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’)，第三個給出的是取代D-氨基酸。表2-3介紹了具有兩個或三個取代的優(yōu)選的變體。為了說明，表3的第一個例子為“VAL 81 D-THR LEU 82 D-PHE”。這一例子意指說明的是變體Val81D-Thr+Leu82D-Phe。
表2單一取代變體GLY 83 D-VALLEU 82 D-PHELEU 82 D-HISLEU 82 D-TYRLEU 82 D-ALAVAL 81 D-THRVAL 81 D-ALA
GLY 80 D-VALILE 79 D-LEUILE 79 D-METILE 79 D-THRILE 79 D-VALILE 79 D-ALASER 78 D-AsNSER 78 D-THRSER 78 D-ARGSER 78 D-GLNSER 78 D-HISSER 78 D-LYSSER 78 D-TYRSER 78 D-ALAASN 77 D-ALAASN 76 D-ALALEU 75 D-ILELEU 75 D-METLEU 75 D-VALLEU 75 D-ALAALA 74 D-VALALA 73 D-VALVAL 72 D-ALATHR 71 D-ALAGLY 70 D-VAL表3雙取代變體VAL 81 D-THR LEU 82 D-PHEVAL 81 D-THR LEU 82 D-HISVAL 81 D-THR LEU 82 D-TYRILE 79 D-LEU LEU 82 D-PHEILE 79 D-LEU LEU 82 D-HISILR 79 D-LEU LEU 82 D-TYRILE 79 D-MET LEU 82 D-PHEILE 79 D-MET LEU 82 D-HISILE 79 D-MET LEU 82 D-TYRILE 79 D-THR LEU 82 D-PHEILE 79 D-THR LEU 82 D-HISILE 79 D-THR LEU 82 D-TYRILE 79 D-VAL LEU 82 D-PHEILE 79 D-VAL LEU 82 D-HISILE 79 D-VAL LEU 82 D-TYRILE 79 D-LEU VAL 81 D-THRILE 79 D-MET VAL 81 D-THRILE 79 D-THR VAL 81 D-THRILE 79 D-VAL VAL 81 D-THRSER 78 D-ASN LEU 82 D-PHESER 78 D-ASN LEU 82 D-HISSER 78 D-ASN LEU 82 D-TYRSER 78 D-THR LEU 82 D-PHESER 78 D-THR LEU 82 D-HISSER 78 D-THR LEU 82 D-TYRSER 78 D-ARG LEU 82 D-PHESER 78 D-ARG LEU 82 D-HISSER 78 D-ARG LEU 82 D-TYRSER 78 D-ASP LEU 82 D-PHESER 78 D-ASP LEU 82 D-HISSER 78 D-ASP LEU 82 D-TYRSER 78 D-GLN LEU 82 D-PHRSER 78 D-GLN LEU 82 D-HISSER 78 D-GLN LEU 82 D-TYRSER 78 D-HIS LEU 82 D-PHESER 78 D-HIS LEU 82 D-HISSER 78 D-HIS LEU 82 D-TYRSER 78 D-LYS LEU 82 D-PHESER 78 D-LYS LEU 82 D-HISSER 78 D-LYS LEU 82 D-TYRSER 78 D-TYR LEU 82 D-PHESER 78 D-TYR LEU 82 D-HISSER 78 D-TYR LEU 82 D-TYRSER 78 D-ASN VAL 81 D-THRSER 78 D-THR VAL 81 D-THRSER 78 D-ARG VAL 81 D-THRSER 78 D-ASP VAL 81 D-THRSER 78 D-GLN VAL 81 D-THRSER 78 D-HIS VAL 81 D-THRSER 78 D-LYS VAL 81 D-THRSER 78 D-TYR VAL 81 D-THRSER 78 D-ASN ILE 79 D-LEUSER 78 D-ASN ILE 79 D-METSER 78 D-ASN ILE 79 D-THRSER 78 D-ASN ILE 79 D-VALSER 78 D-THR ILE 79 D-LEUSER 78 D-THR ILE 79 D-METSER 78 D-THR ILE 79 D-THRSER 78 D-THR ILE 79 D-VALSER 78 D-ARG ILE 79 D-LEUSER 78 D-ARG ILE 79 D-METSER 78 D-ARG ILE 79 D-THRSER 78 D-ARG ILE 79 D-VALSER 78 D-ASP ILE 79 D-LEUSER 78 D-ASP ILE 79 D-METSER 78 D-ASP ILE 79 D-THRSER 78 D-ASP ILE 79 D-VALSER 78 D-GLN ILE 79 D-LEUSER 78 D-GLN ILE 79 D-METSER 78 D-GLN ILE 79 D-THRSER 78 D-GLN ILE 79 D-VALSER 78 D-HIS ILE 79 D-LEUSER 78 D-HIS ILE 79 D-METSER 78 D-HIS ILE 79 D-THRSER 78 D-HIS ILE 79 D-VALSER 78 D-LYS ILE 79 D-LEUSER 78 D-LYS ILE 79 D-METSER 78 D-LYS ILE 79 D-THRSER 78 D-LYS ILE 79 D-VALSER 78 D-TYR ILE 79 D-LEUSER 78 D-TYR ILE 79 D-METSER 78 D-TYR ILE 79 D-THRSER 78 D-TYR ILE 79 D-VALASN 76 D-HIS LEU 82 D-PHEASN 76 D-HIS LEU 82 D-HISASN 76 D-HIS LEU 82 D-TYRASN 76 D-HIS VAL 81 D-THRASN 76 D-HIS ILE 79 D-LEUASN 76 D-HIS ILE 79 D-METASN 76 D-HIS ILE 79 D-THRASN 76 D-HIS ILE 79 D-VALASN 76 D-HIS SER 78 D-ASNASN 76 D-HIS SER 78 D-THRASN 76 D-HIS SER 78 D-ARGASN 76 D-HIS SER 78 D-ASPASN 76 D-HIS SER 78 D-GLNASN 76 D-HIS SER 78 D-HISASN 76 D-HIS SER 78 D-LYSASN 76 D-HIS SER 78 D-TYRLEU 75 D-ILE LEU 82 D-PHELEU 75 D-ILE LEU 82 D-HISLEU 75 D-ILE LEU 82 D-TYRLEU 75 D-MET LEU 82 D-PHELEU 75 D-MET LEU 82 D-HISLEU 75 D-MET LEU 82 D-TYRLEU 75 D-VAL LEU 82 D-PHELEU 75 D-VAL LEU 82 D-HISLEU 75 D-VAL LEU 82 D-TYRLEU 75 D-ILE VAL 81 D-THRLEU 75 D-MET VAL 81 D-THRLEU 75 D-VAL VAL 81 D-THRLEU 75 D-ILE ILE 79 D-LEULEU 75 D-ILE ILE 79 D-METLEU 75 D-ILE ILE 79 D-THRLEU 75 D-ILE ILE 79 D-VALLEU 75 D-MET ILE 79 D-LEULEU 75 D-MET ILE 79 D-METLEU 75 D-MET ILE 79 D-THRLEU 75 D-MET ILE 79 D-VALLEU 75 D-VAL ILE 79 D-LEULEU 75 D-VAL ILE 79 D-MET
LEU 75 D-VAL ILE 79 D-THRLEU 75 D-VAL ILE 79 D-VALLEU 75 D-ILE SER 78 D-ASNLEU 75 D-ILE SER 78 D-THRLEU 75 D-ILE SER 78 D-ARGLEU 75 D-ILE SER 78 D-ASPLEU 75 D-ILE SER 78 D-GLNLEU 75 D-ILE SER 78 D-HISLEU 75 D-ILE SER 78 D-LYSLEU 75 D-ILE SER 78 D-TYRLEU 75 D-MET SER 78 D-ASNLEU 75 D-MET SER 78 D-THRLEU 75 D-MET SER 78 D-ARGLEU 75 D-MET SER 78 D-ASPLEU 75 D-MET SER 78 D-GLNLEU 75 D-MET SER 78 D-HISLEU 75 D-MET SER 78 D-LYSLEU 75 D-MET SER 78 D-TYRLEU 75 D-AL SER 78 D-ASNLEU 75 D-VAL SER 78 D-THRLEU 75 D-VAL SER 78 D-ARGLEU 75 D-VAL SER 78 D-ASPLEU 75 D-VAL SER 78 D-GLNLEU 75 D-VAL SER 78 D-HISLEU 75 D-VAL SER 78 D-LYSLEU 75 D-VAL SER 78 D-TYRLEU 75 D-ILE ASN 76 D-HISLEU 75 D-MET ASN 76 D-HISLEU 75 D-VAL ASN 76 D-HIS此外可以一個或多個L-氨基酸或D-氨基酸、優(yōu)選地L-氨基酸進行一個或多個另外的取代(“穩(wěn)定化取代”)，其中在酶的抗原決定部位區(qū)的內(nèi)部或外部進行該取代。該穩(wěn)定化取代通過以D-氨基酸在抗原決定部位區(qū)取代使酶再穩(wěn)定或提高變體的酶活性。很多這樣的穩(wěn)定化取代是本領(lǐng)域公知的。這樣的穩(wěn)定化突變的非限定性例子(例如絲氨酸蛋白酶)描述于，例如，1995年4月20日公開的WO95/10591，Baeck等；1990年4月3日授權(quán)的美國專利No.4,914,031，Zukowski等；1995年11月28日授權(quán)的美國專利No.5,470,733，Bryan等；1996年10月22日授權(quán)的美國專利No.5,567,601，Bryan等；1998年1月13日授權(quán)的WO89/07642，美國專利No.5,707,848，Bryan等；1989年8月24日公開的，Van Eekelen等；1987年7月30日公開的WO92/11348，Branner等；1991年1月2日公開的EP0,405,901，Casteleijn等；1991年1月10日公開的WO91/00345，Branner等；和1995年3月23日公開的WO94/10020，Brode等。
優(yōu)選的絲氨酸蛋白酶穩(wěn)定化取代包含下面所列中的一個或多個I107V；K213R；Y217L；Y217K；N218S；G169A；M50F；Q19E；P5A；S9A；I31L；E156S；G169A；N212G；S188P；T254A；S3C+Q206C；和Q271E，其中整個)該位置編號是相對于枯草桿菌蛋白酶BPN’。其中更優(yōu)選的穩(wěn)定化突變包含下面所列中的一個或多個P5A；S9A；I31L；E156S；G169A；N212G；S188P；T254A；S3C+Q206C；Q271E；Y217L；和Y217K。最優(yōu)選的絲氨酸蛋白酶的穩(wěn)定化突變包含Y217L和Y217K。
制備方法可通過含有一個或多個特定位點的D-氨基酸取代的酶的合成制備本發(fā)明的變體。這些方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，下面說明了用枯草桿菌作為非限制性例子的一個方法。制備本發(fā)明的變體的其它方法為普通技術(shù)人員所熟知，可在此處使用。
用標(biāo)準(zhǔn)固相方法制備長度約為50個氨基酸的枯草桿菌蛋白酶BPN’的片段。該片段應(yīng)包括前肽前導(dǎo)序列的氨基酸序列以及蛋白酶的最終加工形式的序列。通過用D-氨基酸前體取代相應(yīng)的L-氨基酸，在適當(dāng)?shù)碾钠我氚被帷＿@些肽在C-末端(除了蛋白質(zhì)的C-末端片段)應(yīng)具有反應(yīng)性的離去基團，在氨基酸末端(除了蛋白質(zhì)的N-末端片段)應(yīng)有可除去的保護基團。合成方法與轉(zhuǎn)讓給Genentach公司的Abrahmsen等人的WO94/18329中介紹的方法相似。將改性的枯草桿菌蛋白酶用于按適當(dāng)?shù)捻樞蝽樞虻剡B接合成肽片段，以生成包括前導(dǎo)肽的完整的蛋白質(zhì)。將蛋白質(zhì)折疊并且經(jīng)自身催化過程以脫除前肽并得到活性蛋白酶(參見如Strausberg等人的蛋白質(zhì)折疊反應(yīng)的催化作用枯草桿菌蛋白酶BPN’與其前肽片段的相互作用的熱力學(xué)和動力學(xué)分析”，《生物化學(xué)》，第33卷，8112-8119頁(1993年))。
分析方法利用下面的方法可以對本發(fā)明變體測定酶活性和變應(yīng)原性反應(yīng)，這兩種方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的?；蛘撸梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的其它方法。
酶變體的活性可通過本領(lǐng)域眾所周知的方法測定本發(fā)明變體的酶活性。下文介紹了兩種這樣的方法，特別地其中的酶為蛋白酶皮膚薄片活性方法該方法尤其適用于測定個人護理組合物中采用的酶變體的效力。使用Scotch#3750G膠帶，反復(fù)從受試者的腿上剝離人皮膚薄片，直到帶有皮膚薄片的膠帶薄片基本上不透光。然后將該膠帶切為一英寸乘一英寸的方塊放置一邊。在10毫米×35毫米培養(yǎng)皿中，在0.01M KH2PO4pH5.5緩沖液中加入2毫升的0.75毫克/毫升對照酶(例如枯草桿菌蛋白酶BPN’)或者待測定的變體。向該溶液中加入1毫升2.5％pH8.6的月桂酸鈉溶液。該溶液在平臺振蕩器上溫和混合。繼續(xù)溫和混合下將先前制備的膠帶塊浸泡在該溶液中10分鐘(薄片一面向上)。然后將膠帶塊在自來水中溫和漂洗15秒鐘。將Stevenel藍染料(3毫升，從Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO購得)移入干凈的培養(yǎng)皿中。溫和混合下，將漂洗過的膠帶方塊置于染料中三分鐘(薄片一面向上)。從染料中取出膠帶塊，并且依次在兩個300毫升蒸餾水的燒杯中漂洗，每次漂洗15秒鐘。使膠帶塊風(fēng)干。目測或者通過色度計(chromameter)比較從對照酶獲得的膠布塊與從變體獲得的膠布塊之間的色強度。相對于對照酶膠布塊，顯示較小色強度的變體膠布塊是具有較高活性變體的指示。
染色的膠原活性方法該方法尤其適用于測定清潔組合物中采用的酶變體的效力。將50毫升含有0.01M CaCl2的0.1M tris緩沖液(三羥甲基-氨基甲烷)(pH8.6)和0.5克azocoll(浸過膠原的偶氮染料，從SigmaChemical Co.，St.Louis，MO購得)混合。該混合物用平臺振蕩器溫和混合下在25℃下溫育。通過0.2微米針筒式濾器過濾2毫升該混合物，并且將該混合物在分光光度計520nm處的吸收度讀為零。向剩下的48毫升tris/azocoll混合物中加入1ppm對照酶(例如枯草桿菌蛋白酶BPN’)或者待測定的變體。每2分鐘通過0.2微米針筒式濾器過濾2毫升含有對照物/變體的溶液，共10分鐘。對每個濾過樣品，立即讀取520nm處的吸收度，用該值對時間作圖。對照物和受試綴合物的斜率是樣品相對活性的指征。較高斜率的指示較高的活性。受試變體活性(斜率)可以表示為對照活性(斜率)的百分比。
用于免疫原性的小鼠鼻內(nèi)試驗利用本領(lǐng)域公知的方法或者通過下面給出的用于免疫原性的小鼠鼻內(nèi)試驗可以測定本發(fā)明酶的變應(yīng)原性的潛力。該實驗類似于下面文獻中描述的測定Robinson等，“小鼠中對枯草桿菌蛋白酶Carlsberg(Alcalase)的特異性抗體反應(yīng)鼻內(nèi)暴露模型的進展”，基礎(chǔ)和應(yīng)用毒理學(xué)(Fundamental and Applied Toxicology)，34卷，15-24頁(1996)和Robinson等，“小鼠鼻內(nèi)試驗(MINT)測定洗滌劑酶的變應(yīng)原效力的用途與豚鼠氣管內(nèi)試驗(GPIT)之比較”，毒理科學(xué)(ToxicologicalScience)，43卷，39-46頁(1998)，這兩篇文獻中的測定都可以代替下面給出的試驗而使用。
在該實驗中使用體重大約18至大約20克的雌性BDF1小鼠(Charles River Laboratories，Portage，MI)。在給藥之前一周對小鼠檢疫。小鼠關(guān)養(yǎng)在鋪有碎木屑的籠中，控制其中的濕度(30-70％)和溫度(67-77華氏度)，并且有12小時光亮和黑暗周期。小鼠喂食Purina小鼠飼料(Purina Mills，Richmond，IN)并自由進水。
對一組五只小鼠施用待測試的酶。在施用之前，通過腹膜內(nèi)(i.p.)注射鹽酸氯胺酮(Ketaset)(88.8毫克/千克)和甲苯噻嗪(6.67毫克/千克)的混合物，將每一只小鼠麻醉。將麻醉的動物放在手掌心中，反轉(zhuǎn)向下，并且用5毫升蛋白酶緩沖液(0.01M KH2PO4，pH5.5)經(jīng)鼻內(nèi)給藥。各組接受相同劑量的同時，可以測試不同劑量。將藥溶液小心放在各鼻孔外面讓小鼠吸入。在第3，10，17和24天重復(fù)給藥。
在第29天采集血清樣品。采用ELISA方法如下所述測定總的和特異性抗原抗體?？侷gE的測定用抗小鼠IgE抗體(Pharmingen)涂覆96坑的微滴定盤。用PBS中的BSA保護后，在小坑中培養(yǎng)小鼠血清的稀釋物。沖洗后，用帶有與辣根過氧化物酶結(jié)合的鏈霉抗生物素的生物素化抗小鼠IgE獲得血清IgE。把酶生成物與用硫酸抑制的四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫一起使用。在450nm處讀取盤的數(shù)據(jù)。將適當(dāng)?shù)南♂屛锏腛D450值與由小鼠IgE標(biāo)準(zhǔn)值生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，以確定IgE的濃度?？乖禺愋訲gE的測定用抗小鼠IgE抗體(Pharmingen)涂覆96坑的微滴定盤。用PBS中的BSA保護后，在小室中培養(yǎng)鼠血清的稀釋物。沖洗后，用帶有與辣根過氧化物酶結(jié)合的鏈菌霉抗生物素的單生物素化抗原獲得酶特異性血清IgE。把酶生成物與用硫酸抑制的四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫一起使用。在450nm處讀取盤的數(shù)據(jù)。將適當(dāng)?shù)南♂屛锏腛D450值相互比較，以確定抗原特異性IgE的相對量。
T-細(xì)胞增殖測定可通過如下文所述的測定法的T-細(xì)胞增殖測定法測定本發(fā)明的變體的變應(yīng)性可能。此測定法為在Bungy Poor Fard等人的“用活體外和活體內(nèi)重疊肽定義的黑麥草Lolium perenne(Lol p I)主要部分的T細(xì)胞抗原決定部位”《臨床實驗免疫學(xué)》，第94卷，111-116頁(1993年)中介紹的測定法的變更，將枯草桿菌蛋白酶BPN’用作例證的目的。
在此測定法中使用對枯草桿菌蛋白酶BPN’變應(yīng)的主體(刺破試驗陽性)和對照主體(刺破試驗陰性)的血液。收集每個主體的血液(約60mL)并用ficoll-hypaque(可從Pharmacia，Piscataway，NewJersey獲得)收獲單核細(xì)胞。將細(xì)胞在RPMI 1640(可從Gibco，GrandIsland，New York獲得)中洗兩次然后再懸浮在添加了10％的人的AB血清、2mM的L-谷氨酰胺和25mg/mL的慶大霉素(可從Gibco獲得)的完整介質(zhì)RPMI中。在盛有0.2mL濃度為2×105細(xì)胞/坑的完整介質(zhì)的U形底的96坑微滴定盤中培養(yǎng)細(xì)胞。加入待測潛在抗原(作為陽性對照的失活BPN’或本發(fā)明的變體)直到最終濃度最大至約40mg/mL。在37℃、5％的CO2中進行培養(yǎng)。五天后，加入1mCi/坑的甲基-3H-胸腺嘧啶核苷，18小時后收獲細(xì)胞。通過液體閃爍計數(shù)估計作為T-細(xì)胞增殖量度的通過細(xì)胞引入的3H-胸腺嘧啶核苷。
本發(fā)明組合物在適合各自野生型蛋白酶的任何應(yīng)用中都能夠使用本發(fā)明變體。一個這樣的例子包含清潔組合物。由于本發(fā)明變體期望的降低的變應(yīng)原性和/或免疫原性性質(zhì)，本發(fā)明變體可以進一步應(yīng)用于從使用酶得到最小利益的那些應(yīng)用中。這樣的應(yīng)用的例子包括其中變體必須接觸人皮膚的那些應(yīng)用，例如使用個人護理組合物。
清潔組合物本發(fā)明變體可以用在清潔組合物中，包括但不限于洗衣組合物，硬表面清潔組合物，輕垢清潔組合物，包括洗碟組合物和自動洗碟機清潔組合物。
這里的清潔組合物含有有效量的一種或多種本發(fā)明變體和清潔組合物載體。
如這里所使用的，“有效量的變體”或類似的表達方式是指在具體的清潔組合物中實現(xiàn)需要的蛋白水解活性所必需的變體的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易確定這樣的有效量，并且其基于很多因素，例如所使用的特定變體，清潔應(yīng)用，清潔組合物的具體組成以及期望的是液體組合物還是干燥的組合物(例如顆粒，條塊)等等。優(yōu)選地，清潔組合物含有大約0.0001％至大約10％，更優(yōu)選大約0.001％至大約1％，最優(yōu)選大約0.01％至大約0.1％的一種或多種本發(fā)明的變體。下面進一步詳細(xì)討論其中可以使用本發(fā)明變體的各種清潔組合物的幾個例子。
除了本發(fā)明變體之外，本發(fā)明清潔組合物進一步含有包含與所述變體相容的一或多種清潔組合物材料的清潔組合物載體。如這里使用的術(shù)語“清潔組合物材料”指為了需要的特殊類型的清潔組合物和產(chǎn)物形式(例如液體，顆粒，條塊，噴霧劑，棒劑，糊劑，凝膠)而選擇的任何材料，該材料也與組合物中使用的變體相容。通過考慮要清潔的材料、使用中的清潔條件需要的組合物形式，可以容易地進行清潔組合物材料的具體選擇。這里使用的術(shù)語“相容”指清潔組合物材料不使所述變體的蛋白水解活性在正常使用情況下降低到不象該變體期望的那樣有效的程度。下文舉例詳細(xì)描述具體的清潔組合物材料。
本發(fā)明的變體可以用于各種需要高起泡和好的清潔活性的清潔組合物中。因此，所述變體可以和各種常規(guī)成分一起使用以提供完全配制的硬表面清潔品、洗碟組合物、織物清潔組合物等等。這樣的組合物可以是液體、顆粒、條塊等等形式。這樣的組合物可以配制成含有大約30％至大約60％(按重量計)表面活性劑的“濃縮”洗滌劑。
這里的清潔組合物可以任選地、并且優(yōu)選地含有各種表面活性劑(例如陰離子，非離子或兩性離子表面活性劑)。這種表面活性劑典型地以大約5％至大約35％的水平存在于組合物中。
這里使用的表面活性劑的非限制性例子包括常規(guī)的C11-C18烷基苯磺酸鹽和伯烷基硫酸鹽和任意烷基硫酸鹽，式CH3(CH2)x(CHOSO3)-M+)CH3和CH3(CH2)y(CHOSO3-M+)CH2CH3的C10-C18仲(2，3)烷基硫酸鹽，其中x和(y+1)是至少大約7優(yōu)選大約9的整數(shù)，M是水溶性陽離子，特別是鈉，C10-C18烷基烷氧基硫酸鹽(特別是EO 1-5乙氧基硫酸鹽)，C10-C18烷基烷氧基羧酸鹽類(特別是EO 1-5乙氧基羧酸鹽)，C10-C18烷基多聚葡糖苷類和它們相應(yīng)的硫酸化多聚葡糖苷類，C12-C18a-磺酸化脂肪酸酯類，C12-C18烷基和烷基苯酚烷氧基化物類(特別是乙氧基化物和混合乙氧基/丙氧基)，C12-C18甜菜堿類和磺基三甲銨乙內(nèi)酯類(“磺基甜菜堿類”)，C10-C18氧化胺類等等。烷基烷氧基硫酸鹽(AES)和烷基烷氧基羧酸鹽(AEC)是優(yōu)選的。根據(jù)配方者的需要，這樣的表面活性劑與氧化胺和/或甜菜堿或磺基甜菜堿表面活性劑結(jié)合使用也是優(yōu)選的。在標(biāo)準(zhǔn)教科書中列出了其它常規(guī)的有用表面活性劑。特別有用的表面活性劑包括在1993年3月16日授權(quán)的Connor等人的美國專利No.5,194,639中公開的C10-C18N-甲基葡糖酰胺。
組合物中可以含有用于去污清潔組合物的各種其它成分，其包括，例如，其它活性成分、載體、水溶助長劑、操作助劑、染料或顏料以及用于液體配方的溶劑。如果需要額外的增加起泡，則典型地以大約1％至大約10％的水平向組合物中摻入增泡劑，例如C10-C16烷醇酰胺。C10-C14一乙醇酰胺和二乙醇酰胺能舉例說明這樣的一類增泡劑。這類增泡劑與高起泡輔助表面活性劑如上述氧化胺、甜菜堿和磺基甜菜堿一起使用也是有利的。如果需要，典型地可以以大約0.1％至大約2％的水平加入可溶性鎂鹽，例如MgCl2、MgSO4等等，以提供額外的起泡。
這里的液體清潔組合物可以含有水和其它溶劑作為載體。例如甲醇、乙醇、丙醇和異丙醇這類低分子量的伯醇或仲醇是合適的。一元醇對于溶解表面活性劑是優(yōu)選的，但是也可以使用例如含有大約2至大約6個碳原子和大約2至大約6個羥基的那些多元醇(例如1，3-丙二醇，乙二醇，甘油和1，2-丙二醇)。組合物可以含有大約5％至大約90％、典型地大約10％至大約50％這樣的載體。
優(yōu)選配制這里所述的清潔組合物使得在含水清潔操作中，洗用水具有的pH在大約6.8和大約11之間。典型地在該范圍內(nèi)配制最終產(chǎn)品。將pH控制在推薦的使用水平的技術(shù)包括使用例如緩沖劑、堿和酸。這樣的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
當(dāng)配制本發(fā)明硬表面清潔組合物和織物清潔組合物時，配方者可以期望以大約5％至大約50％(按重量計)的水平應(yīng)用各種助洗劑。典型的助洗劑包括1-10微米沸石、聚羧酸鹽類，例如檸檬酸鹽和氧代二琥珀酸鹽，層狀硅酸鹽，磷酸鹽等等。在標(biāo)準(zhǔn)配方手冊中列出了其它常規(guī)助洗劑。
同樣，配方者可以期望在這樣的組合物中使用各種各樣其它的酶，例如纖維素酶、脂酶、淀粉酶和蛋白酶，典型地大約為0.001％至大約1％(按重量計)的水平。各種清潔酶和織物護理酶是洗衣清潔劑領(lǐng)域公知的。
這樣的組合物中可以使用各種各樣的漂白化合物，例如過碳酸鹽，過硼酸鹽等等，典型地為大約1％至大約15％(按重量計)的水平。如果需要，這樣的組合物還可以含有漂白活性劑，例如四乙?；叶?、壬酰氧基苯磺酸鹽等等，這也是本領(lǐng)域公知的。使用水平典型的是大約1％至大約10％(按重量計)。
污垢釋放劑、特別是陰離子低聚酯型，螯合劑、特別是氨基膦酸鹽(酯)和乙二胺二琥珀酸鹽(酯)，粘土污垢去除劑、特別是乙氧基化的四亞乙基五胺，分散劑、特別是聚丙烯酸鹽類和聚天冬氨酸鹽類，增白劑、特別是陰離子增白劑，抑泡劑、特別是硅氧烷類和仲醇類，織物柔軟劑、特別是綠土粘土等等都可以以大約1％至大約35％(按重量計)的水平用于這樣的組合物中。標(biāo)準(zhǔn)配方手冊和公開的專利對這樣的常規(guī)材料有很多詳細(xì)描述。
在清潔組合物中也可以使用酶穩(wěn)定劑。這樣的酶穩(wěn)定劑包括丙二醇(優(yōu)選大約1％至大約10％)，甲酸鈉(優(yōu)選大約0.1％至大約1％)和甲酸鈣(優(yōu)選大約0.1％至大約1％)。
本發(fā)明變體在硬表面清潔組合物中是有用的。這里使用的“硬表面清潔組合物”指用于清潔硬表面例如底板、墻面、浴室瓷磚等等的液體和顆粒清潔組合物。本發(fā)明硬表面清潔組合物含有有效量的一或多種本發(fā)明的變體，優(yōu)選占組合物的大約0.001％至大約10％，更優(yōu)選大約0.01％至大約5％，更優(yōu)選大約0.05％至大約1％(按重量計)。除了含有一種或多種所述變體之外，這樣的硬表面清潔組合物典型地含有表面活性劑和水溶性螯合助洗劑。但是在一些特殊化產(chǎn)品例如噴霧式窗戶清潔劑中有時不使用表面活性劑，因為它們可能在玻璃表面上產(chǎn)生薄膜和/或條痕殘余物。
當(dāng)存在時，組合物中可以含有僅僅0.1％的表面活性劑成分，但是典型地組合物含有大約0.25％至大約10％、更優(yōu)選大約1％至大約5％的表面活性劑。
典型地組合物含有大約0.5％至大約50％的清潔助洗劑，優(yōu)選大約1％至大約10％。
優(yōu)選地，pH應(yīng)該在大約7至大約12的范圍內(nèi)。如果需要調(diào)節(jié)，可以使用常規(guī)的pH調(diào)節(jié)劑，例如氫氧化鈉、碳酸鈉或鹽酸。
組合物中可以含有溶劑。有用的溶劑包括但不限于二醇醚，例如二乙二醇一己醚，二乙二醇一丁醚， 乙二醇一丁醚，乙二醇一己醚，丙二醇一丁醚，二丙二醇一丁醚和二元醇，例如2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇和2-乙基-1，3-己二醇。當(dāng)使用時，這樣的溶劑典型地以大約0.5％至大約15％、更優(yōu)選大約3％至大約11％的水平存在。
另外，本發(fā)明組合物中可以使用高揮發(fā)性溶劑，例如異丙醇或乙醇以有利于當(dāng)對表面“全強度”施用組合物之后不淋洗表面時組合物從表面的快速蒸發(fā)。當(dāng)使用時，揮發(fā)性溶劑典型地以占組合物大約2％至大約12％的水平存在。
通過下面的實施例詳細(xì)說明本發(fā)明的硬表面清潔組合物。
實施例1-6液體硬表面清潔組合物
所有的配方都調(diào)節(jié)到pH7。
在實施例1-6中，表2-3中所列舉的變體和此處所列舉的在其它變體中優(yōu)選的變體取代G70D-*+S78D-*+I79D-*，結(jié)果大體上相似。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，洗碟組合物包含一種或多種本發(fā)明變體。這里使用的“洗碟組合物”指用于清潔碟子的組合物的所有形式，包括但不限于顆粒和液體形式。通過下面的實施例詳細(xì)說明本發(fā)明的洗碟組合物。
實施例7-10液體碟子洗滌劑
所有的配方都調(diào)節(jié)到pH7。
在實施例7-10中，表2-3中所列舉的變體和此處所列舉的在其它變體中優(yōu)選的變體取代G70D-*+L75D-*+N76D-*+N77D-*+S78D-*+I79D-*+G80D-*+V81D-*+L82D-*，結(jié)果大體上相似。
通過下面的實施例詳細(xì)說明本發(fā)明的液體織物清潔組合物。
實施例11-13液體織物清潔組合物
在實施例11-13中，表2-3中所列舉的變體和此處所列舉的在其它變體中優(yōu)選的變體取代G70D-*，結(jié)果大體上相似。
個人護理組合物本發(fā)明變體特別適合用于個人護理組合物，例如存留型和漂洗型頭發(fā)調(diào)理劑、香波、存留型和漂洗型粉刺組合物、洗面奶和調(diào)理劑、沐浴凝膠、肥皂、起泡和非起泡潔面劑、化妝品、手和面部以及身體露劑以及增濕劑、存留型面部增濕劑、化妝用和清潔用擦巾、口腔護理組合物以及隱形眼鏡護理組合物。本發(fā)明個人護理組合物包含一或多種本發(fā)明變體和個人護理載體。
為了詳細(xì)說明，下面參考文獻中描述的組合物適合含有本發(fā)明變體1997年6月24日授權(quán)的Linares等人的美國專利No.5,641,479(潔膚劑)；1997年2月4日授權(quán)的Wivell等人的美國專利No.5,599,549(潔膚劑)；1996年12月17日授權(quán)的Ha等人的美國專利No.5,585,104(潔膚劑)；1996年7月30日授權(quán)的Kefauver等人的美國專利No.5,540,852(潔膚劑)；1996年4月23日授權(quán)的Dunbar等人的美國專利No.5,510,050(潔膚劑)；1997年3月18日授權(quán)的Guang Lin等人的美國專利No.5,612,324(抗粉刺制劑)；1996年12月24日授權(quán)的Warren等人的美國專利No.5,587,176(抗粉刺制劑)；1996年8月27日授權(quán)的Venkateswaran等人的美國專利No.5,549,888(抗粉刺制劑)；1995年11月28日授權(quán)的Corless等人的美國專利No.5,470,884(抗粉刺制劑)；1997年7月22日授權(quán)的Gordon等人的美國專利No.5,650,384(沐浴凝膠)；1997年3月4日授權(quán)的Moore等人的美國專利No.5,607,678(沐浴凝膠)；1997年4月29日授權(quán)的Coffindaffer等人的美國專利No.5,624,666(頭發(fā)調(diào)理劑和/或香波)；1997年4月8日授權(quán)的Bolich等人的美國專利No.5,618,524(頭發(fā)調(diào)理劑和/或香波)；1997年3月18日授權(quán)的Inman等人的美國專利No.5,612,301(頭發(fā)調(diào)理劑和/或香波)；1996年11月12日授權(quán)的Wells等人的美國專利No.5,573,709(頭發(fā)調(diào)理劑和/或香波)；1996年1月9日授權(quán)的Pings等人的美國專利No.5,482,703(頭發(fā)調(diào)理劑和/或香波)；1994年4月12日再次授權(quán)的Grote等人的美國專利No.Re.34,584(頭發(fā)調(diào)理劑和/或香波)；1997年6月24日授權(quán)的Date等人的美國專利No.5,641,493(化妝品)；1997年2月25日授權(quán)的Blank等人的美國專利No.5,605,894(化妝品)；1996年12月17日授權(quán)的Yoshioka等人的美國專利No.5,585,090(化妝品)；1990年7月3日授權(quán)的Cheney等人的美國專利No.4,939,179(洗手液，洗面液和/或沐浴露)；1997年3月4日授權(quán)的McAtee等人的美國專利No.5,607,980(洗手液，洗面液和/或沐浴露)；1977年8月30授權(quán)的Richter等人的美國專利No.4,045,364(化妝擦巾和清潔擦巾)；1994年10月12日公開的Touchet等人的歐洲專利申請EP 0 619 074(化妝擦巾和清潔擦巾)；1990年12月4日授權(quán)的Brown-Skrobot等人的美國專利No.4,975,217(化妝擦巾和清潔擦巾)；1992年3月17日授權(quán)的Seibel的美國專利No.5,096,700(口腔清潔組合物)；1991年7月2日授權(quán)的Sampathkumar等人的美國專利No.5,028,414(口腔清潔組合物)；1991年7月2授權(quán)的Benedict等人的美國專利No.5,028,415(口腔清潔組合物)；1989年9月5日授權(quán)的Davies等人的美國專利No.4,863,627(隱形眼鏡清潔液)；1988年5月24日再次授權(quán)的Huth等人的美國專利No.Re.32,672(隱形眼鏡清潔液)；以及1986年9月2日授權(quán)的Schafer的美國專利No.4,609,493(隱形眼鏡清潔液)。
為了進一步說明本發(fā)明的口腔清潔組合物，組合物中可以含有藥學(xué)可接受量的一或多種本發(fā)明變體用于從牙齒或假牙上去除蛋白質(zhì)污垢。這里使用的“口腔清潔組合物”指潔齒劑，牙膏，牙用凝膠，牙粉，漱口液，口腔噴霧劑，口腔用凝膠，口香糖，糖錠，香囊，片劑，生物凝膠，預(yù)防膏劑，牙科治療液等等。優(yōu)選地，所述口腔清潔組合物含有占組合物重量大約0.0001％至大約20％、更優(yōu)選大約0.001％至大約10％、更優(yōu)選大約0.01％至大約5％的一或多種本發(fā)明變體以及藥物學(xué)可接受的載體。這里使用的“藥物學(xué)可接受”指術(shù)語描述的藥劑、藥物或惰性成分適合用于與人和低級動物組織接觸而沒有不適當(dāng)?shù)亩拘浴⒉幌嗳菪?、不穩(wěn)定性、刺激性、變應(yīng)反應(yīng)等等，并具有合理的利益/風(fēng)險比。
典型地，所述口腔清潔組合物的口腔清潔成分的藥物學(xué)可接受口腔清潔載體占所述組合物重量的大約50％至大約99.99％，優(yōu)選大約65％至大約99.99％，更優(yōu)選大約65％至大約99％。
包含在本發(fā)明口腔清潔組合物中的藥物學(xué)可接受載體成分和任選成分是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。上文引述的參考文獻中公開了用于口腔清潔組合物的各種組合物類型、載體成分和任選成分。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，用于口腔外清潔假牙的假牙清潔組合物包含一或多種本發(fā)明變體。這樣的假牙清潔組合物包含有效量的一或多種所述變體，優(yōu)選占所述組合物重量大約0.0001％至大約50％、更優(yōu)選大約0.001％至大約35％、更優(yōu)選大約0.01％至大約20％的一或多種所述變體以及假牙清潔載體。各種假牙清潔組合物形式例如泡騰片等是本領(lǐng)域公知的(參見，例如Young的美國專利No.5,055,305)，并且通常適合摻入一或多種所述變體以去除假牙上的蛋白質(zhì)污垢。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，隱形眼鏡清潔組合物包含一或多種本發(fā)明變體。這樣的隱形眼鏡清潔組合物包含有效量的一或多種所述變體，優(yōu)選占所述組合物重量大約0.01％至大約50％、更優(yōu)選大約0.01％至大約20％、更優(yōu)選大約1％至大約5％的一或多種所述變體以及隱形眼鏡清潔載體。各種隱形眼鏡清潔組合物形式例如片劑、液體等是本領(lǐng)域公知的，并且通常適合摻入一或多種本發(fā)明變體以從隱形眼鏡上去除蛋白質(zhì)污物。
通過實施例14-17詳細(xì)說明本發(fā)明的隱形眼鏡清潔組合物實施方案。
實施例14-17隱形眼鏡清潔溶液
在實施例14-17中，表2-3中所列舉的變體和此處所列舉的在其它變體中優(yōu)選的變體取代N76D-*，結(jié)果大體上相似。
實施例18-21詳細(xì)說明本發(fā)明變體在潔身產(chǎn)品中的應(yīng)用。
實施例18-21潔身產(chǎn)品
在實施例18-21中，表2-3中所列舉的變體和此處所列舉的在其它變體中優(yōu)選的變體取代L75D-*+N76D-*+N77D-*+S78D-*+I79D-*+G80D-*+V81D-*+L82D-*，結(jié)果大體上相似。
實例22-25詳細(xì)說明本發(fā)明變體在洗面產(chǎn)品中的應(yīng)用
實施例22-25洗面產(chǎn)品
在實施例22-25中，表2-3中所列舉的變體和此處所列舉的在其它變體中優(yōu)選的變體取代L75D-*，結(jié)果大體上相似。
實施例26-27詳細(xì)說明本發(fā)明變體在存留型皮膚增濕劑組合物中的應(yīng)用。
實施例26-27存留型皮膚增濕劑組合物
在實施例26-27中，表2-3中所列舉的變體和此處所列舉的在其它變體中優(yōu)選的變體取代L82D-*，結(jié)果大體上相似。
實施例28詳細(xì)說明本發(fā)明變體在清潔擦巾組合物中的應(yīng)用。
實施例28清潔擦巾組合物
將上述組合物以吸收層重量大約250％的量浸潤到由纖維素和/或聚酯組成的紡織吸收層中。
在實施例28中，表2-3中所列舉的變體和此處所列舉的在其它變體中優(yōu)選的變體取代S78D-*，結(jié)果大體上相似。
權(quán)利要求
1.酶變體，特征為該變體具有包含由取代D-氨基酸在一個或多個氨基酸位產(chǎn)生的取代的野生型氨基酸序列的改性氨基酸序列，其中酶變體的至少一個氨基酸為L-氨基酸。
2.權(quán)利要求1的酶變體，其中至少一個取代發(fā)生在野生型氨基酸序列的抗原決定部位區(qū)。
3.權(quán)利要求1的酶變體，其為選自于蛋白酶、纖維素酶、脂酶、淀粉酶、過氧化物酶、微過氧化物酶、半纖維素酶、木聚糖酶、磷脂酶、酯酶、角質(zhì)酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂肪氧化酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、丹寧酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、漆酶、轉(zhuǎn)移酶、異構(gòu)酶、裂解酶、連接酶、合成酶和果基酶的酶的變體。
4.權(quán)利要求3的酶變體，其中酶為蛋白酶。
5.權(quán)利要求4的酶變體，其中野生型氨基酸序列含有第一抗原決定部位區(qū)、第二抗原決定部位區(qū)和第三抗原決定部位區(qū)，其中改性氨基酸序列含有在一個或多個抗原決定部位區(qū)的一個或多個位處由取代D-氨基酸產(chǎn)生的取代，其中(i)當(dāng)取代發(fā)生在第一抗原決定部位區(qū)時，取代發(fā)生在相應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的70-84位的一個或多個位點；(ii)當(dāng)取代發(fā)生在第二抗原決定部位區(qū)時，取代發(fā)生在相應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的103-126位的一個或多個位點；(iii)當(dāng)取代發(fā)生在第三抗原決定部位區(qū)時，取代發(fā)生在相應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的217-252位的一個或多個位點。
6.權(quán)利要求5的酶變體，為選自于枯草桿菌蛋白酶BPN’、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶DY、枯草桿菌蛋白酶309、蛋白酶K和致熱酶的絲氨酸蛋白酶。
7.權(quán)利要求6的酶變體，其中至少一個取代發(fā)生在第一抗原決定部位區(qū)。
8.權(quán)利要求7的酶變體，其中至少一個取代是在相應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’的70和75-82位的一個或多個位處。
9.權(quán)利要求7的酶變體，其中至少一個取代發(fā)生在第二抗原決定部位區(qū)。
10.權(quán)利要求7的蛋白質(zhì)變體，其中至少一個取代發(fā)生在第三抗原決定部位區(qū)。
11.組合物，特征為該組合物選自于清潔組合物和個人護理組合物，其中該組合物含有權(quán)利要求1的酶變體和載體。
12.突變基因，特征為該基因編碼權(quán)利要求1的酶變體。
全文摘要
本發(fā)明涉及與它們相應(yīng)的野生型酶相比具有降低的免疫原性的酶變體。更具體地說，本發(fā)明涉及具有野生型氨基酸序列的改性的氨基酸序列的變體，其中改性的氨基酸序列包含用D－氨基酸的一個或多個氨基酸位的取代。本發(fā)明進一步涉及編碼這種酶變體的突變基因以及含有這種的變體的清潔和個人護理組合物。
文檔編號A61K8/00GK1426469SQ01808500
公開日2003年6月25日 申請日期2001年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月24日
發(fā)明者D·J·維斯戈比爾 申請人:寶潔公司