專利名稱：洛神花萃取物用于制備抑制腦心血管病變藥物的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明是關于洛神花萃取物的一種新用途，更詳而言之，是一種洛神花萃取物用于制備抑制腦心血管疾病及動脈粥樣硬化藥物的用途。
背景技術：
過去民間多用洛神花茶于解熱、抗高血壓及治療肝病。但是，仍未有人真確了解洛神花萃取物具有抑制腦心血管疾病及動脈粥樣硬化的用途，本發(fā)明即在于此新用途的發(fā)現(xiàn)。
據(jù)考查，近年來腦血管疾病與心臟疾病均高居死因的前幾名，雖無論腦血管疾病或心臟疾病都是由多項因子交互作用而導致，但根據(jù)許多研究資料顯示動脈粥樣硬化是導致這些血管疾病的最主要原因。
血清脂質主要包括甘油三酸酯(Triacylglycerols)、膽固醇、磷脂及游離脂肪酸等。甘油三酸酯及膽固醇無法溶解于水性的血漿中，故須藉由蛋白質及磷脂等兩性乳化劑包圍在外側而形成可親水性的脂蛋白顆粒，才能溶解于血漿中，而隨著血液循環(huán)運送至身體的各器官組織中。血漿中的脂蛋白依其顆粒大小或密度，可分為乳糜粒、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)。
低密度脂蛋白含大量的膽固醇，具有趨動脈粥樣硬化特質，較容易滲入血管壁內(nèi)。當其中脂質被氧化形成oxLDL，而被滲入血管壁下方的巨噬細胞所吞食，形成泡沫細胞(Foam cells)，再經(jīng)一連串的變化而形成動脈粥樣硬化，因此目前認為LDL的氧化是引發(fā)初期動脈粥樣硬化病變的最主要導因。相反的，高密度脂蛋白含大量的磷脂與少量的膽固醇，從肝臟釋出進入血液循環(huán)后，從周邊組織移走多余的膽固醇，因此具有可減少膽固醇在血管壁沉積的作用。目前已普遍接受血漿總膽固醇(TC)或低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)過高是導致動脈粥樣硬化疾病的正相關危險因子；而升高血漿高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)或HDL-C/LDL-C的比例，則是導致動脈粥樣硬化疾病的負相關危險因子。但是血漿LDL中含太少量的抗氧化劑、含太高比例的多元不飽和脂肪酸(PUFAs)或血漿中太高濃度的Cu++、Fe++等因素，會導致LDL容易氧化，更是產(chǎn)生動脈粥樣硬化的最重要正相關危險因子。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的發(fā)明人乃以(1)降血脂；(2)抑制LDL氧化；(3)抑制ox-LDL致病機制；(4)抑制平滑肌細胞或內(nèi)皮細胞不正常增生等為著眼，針對常見的中藥植物或一般的草藥進行研究、節(jié)選，終于發(fā)現(xiàn)洛神花萃取物具有上述特性，而完成本發(fā)明。
亦即本發(fā)明的一目的是要提供洛神藥萃取物用于制備抑制動脈粥樣硬化藥物的用途。
本發(fā)明的另一目的是要提供洛神藥萃取物用于制備降低血漿中甘油三酸酯藥物的用途。
本發(fā)明的再一目的是要提供洛神花萃取物用于制備降低血漿中膽固醇藥物的用途。
本發(fā)明的再一目的是要提供洛神花萃取物用于制備抑制低密度脂蛋白氧化藥物的用途。
依發(fā)明人的體外實驗，顯示此洛神花萃取物具有抑制LDL氧化的作用，依此發(fā)明人并進一步進行動物活體實驗，確認洛神花萃取物具有抑制腦心血管病變效果。
本發(fā)明的發(fā)明人是依以下方法得到本發(fā)明的洛神花萃取物。亦即洛神花的花萼或花瓣加水一同加熱，過濾掉殘渣后即得本發(fā)明的洛神花萃取物。上述洛神花萃取物必要時得再予濃縮、干燥。


圖1A表示LDL經(jīng)10μM的CuSO4或100mM的SNP于攝氏三十七度下連續(xù)誘發(fā)二十四小時后，分別添加不同濃度(0.5、1、2mg/ml)的洛神花萃取物(圖中稱為HSE)或不添加洛神花萃取物的膠電泳圖。第一欄表示純粹的LDL，第二欄表示經(jīng)CuSO4誘導氧化的LDL，第三欄至第五欄分別表示分別以0.5mg/ml(第三欄)、1mg/ml(第四欄)、2mg/ml(第五欄)的洛神花萃取物處理經(jīng)CuSO4誘導氧化的LDL，第六欄表示經(jīng)SNP誘導氧化的LDL，第七欄至第九欄分別表示分別以0.5mg/ml(第七欄)、1mg/ml(第八欄)、2mg/ml(第九欄)的洛神花萃取物處理經(jīng)SNP誘導氧化的LDL；圖1B以圖表顯示A各欄的膠電泳相對移動速率(圖中稱為R.E.M)。
圖2A表示LDL經(jīng)10μM的CuSO4于攝氏三十七度下連續(xù)誘發(fā)二十四小時的同時或之后，分別添加不同濃度的洛神花萃取物(0.5、1、2mg/ml)或不添加洛神花萃取物的膠電泳圖。第一欄表示純粹的LDL，第二欄表示經(jīng)CuSO4誘導氧化的LDL，第三欄至第五欄分別表示分別以0.5mg/ml(第三欄)、1mg/ml(第四欄)、2mg/ml(第五欄)的洛神花萃取物加入同時以CuSO4誘導氧化的LDL，第六欄表示經(jīng)SNP誘導氧化的LDL，第七欄至第九欄分別表示分別以0.5mg/ml(第七欄)、1mg/ml(第八欄)、2mg/ml(第九欄)的洛神花萃取物處理經(jīng)CuSO4誘導氧化的LDL；圖2B以圖表示A各欄的膠電泳相對移動速率。
圖3表示洛神花萃取物對銅離子造成LDL的Apo B斷裂的抑制作用。于沒有洛神花萃取物或存有不同濃度的洛神花萃取物(0.01、0.05、0.1、0.5mg/ml)的情況下與120μg/ml的LDL及10μM的CuSO4于攝氏三十七度一同作用四小時后，加入EDTA使終濃度達1mM以避免進一步的氧化。然后取LDL大約6mg的蛋白質進行SDS-PAGE電泳。
圖4表示飲食中洛神花萃取物的有無及其濃度(0.5％、1％)對喂食高膽固醇飲食(圖中稱為高膽固醇)兔子的血漿中甘油三酸酯含量的影響。
圖5表示飲食中洛神花萃取物的有無及其濃度(0.5％、1％)對喂食高膽固醇飲食兔子的血漿中膽固醇含量的影響。
圖6表示飲食中洛神花萃取物的有無及其濃度(1％、2％)對喂食高膽固醇飲食大鼠的血漿中甘油三酸酯含量的影響。
圖7表示高膽固醇飲食中洛神花萃取物的有無及其濃度(0.5％、1％)對所喂食兔子的主動脈內(nèi)皮油脂沉積的影響。
圖8表示分別以正常飲食、高膽固醇飲食以及于上述飲食中加入不同濃度(0.5％、1％)洛神花萃取物的飲食所喂食兔子的動脈組織切片圖。A是喂食正常飲食兔子的動脈組織切片圖。B是喂食添加有1％洛神花萃取物的正常飲食兔子的動脈組織切片圖。C及D是喂食高膽固醇飲食的兔子的動脈組織切片圖。C中的▲表示泡沫細胞，↑表示平滑肌遷移的情形，D中的▲表示鈣化核。E及F分別顯示喂食添加有0.5％及1％洛神花萃取物的高膽固醇飲食的兔子的動脈組織切片圖。
實施例以下配合實例詳細說明本發(fā)明。此是具體地說明本發(fā)明，惟并非以之限定本發(fā)明。實例一對LDL氧化的抑制作用當LDL未被氧化時分子量較小，因此在相同的電位下于膠電泳實驗中移動速率較快，當LDL被氧化后分子量較大，相對地在相同的電位下于膠電泳實驗中移動速率較慢。我們分別添加不同濃度的洛神花萃取物(0.5、1、2mg/ml)與10μM的硫酸銅(CuSO4)及100mM的硝普酸鈉(SodiumNitroprusside(SNP))一同于攝氏三十七度下誘導LDL氧化持續(xù)二十四小時，可以發(fā)現(xiàn)洛神花萃取物的濃度愈高，抑制LDL氧化的作用愈顯著，電泳移動速率愈快。使用SNP誘導LDL氧化后添加洛神花萃取物抑制LDL氧化的作用，與使用CuSO4誘導LDL氧化后添加洛神花萃取物抑制LDL氧化的作用相仿，僅是作用較不顯著。其結果如圖1所示。
由圖1得知，可使用洛神花萃取物抑制受CuSO4誘導氧化的LDL的氧化。添加洛神花萃取物于經(jīng)誘導氧化的物質例如CuSO4誘導氧化的LDL，是否亦能抑制LDL的氧化則另須實驗證明。我們分別將10μM的CuSO4及不同濃度的洛神花萃取物與LDL一同于攝氏三十七度下作用持續(xù)二十四小時的結果，以及以10μM的CuSO4于攝氏三十七度下誘導LDL氧化持續(xù)二十四小時后再添加不同濃度的洛神花萃取物的結果作一比較，我們發(fā)現(xiàn)不論加入洛神花萃取物的時間是于LDL被誘導氧化后或者被誘導氧化的同時，洛神花萃取物均能有效抑制LDL的氧化，并且所加入的洛神花萃取物的濃度愈高，抑制氧化的效果愈好。其結果如圖2所示。
我們另將LDL預先以不同濃度(0.5、1、2mg/ml)的洛神花萃取物處理5分鐘后，再與10mM的CuSO4于攝氏三十七度下作用二十四小時，測量油脂氧化形成的TBARs量(nmol/mg)的結果，顯示洛神花萃取物預先處理可以顯著降低TBARs的形成，與對照組比較，1mg/dl洛神花萃取物可降低TBARs量1.8倍(p＜0.01)，2mg/dl洛神花萃取物則可降低18倍(p＜0.00001)。
表1預先以洛神花萃取物處理LDL后，CuSO4誘導脂質氧化的情形。誘導LDL氧化的物質 洛神花萃取物的數(shù)量 TBARs量(mg/ml) (nmol/mg)對照組- 0.19±0.01CuSO4- 10.12±0.49CuSO40.5 8.47±1.00CuSO41 5.61±0.56CuSO42 0.56±0.04再者，預先將LDL以10mM的CuSO4處理5分鐘后，再與不同濃度(0.5、1、2mg/ml)的洛神花萃取物于攝氏三十七度下作用二十四小時，測量油脂氧化形成的TBARs量(nmol/mg)的結果，顯示洛神花萃取物事后處理可以顯著降低TBARs的形成，與對照組比較，1mg/dl洛神花萃取可降低TBARs量1.9倍(p＜0.01)，2mg/dl洛神花萃取物則可降低17倍(p＜0.0001)。
表2事后以洛神花萃取物處理LDL，CuSO4誘導脂質氧化的情形。誘導LDL氧化的物質 洛神花萃取物的數(shù)量 TBARs量(mg/ml)(nmol/mg)對照組- 0.19±0.01CuSO4- 10.41±1.02CuSO40.5 8.90±0.20CuSO41 5.53±1.31CuSO42 0.60±0.05
銅離子會誘導LDL的氧化而造成LDL的蛋白質Apo B斷裂，我們將不同濃度的洛神花萃取物(0.01、0.05、0.1、0.5mg/ml)與120μg/ml的LDL及10μM的CuSO4于攝氏三十七度一同作用四小時后，加入EDTA使終濃度達1mM以避免進一步的氧化。然后取LDL大約6mg的蛋白質進行SDS-PAGE電泳。從電泳圖中可以發(fā)現(xiàn)，洛神花萃取物添加的濃度愈高，LDL的Apo B斷裂的情況愈輕微，亦即洛神花萃取物的濃度愈高，抑制氧化的效果愈好。其結果如圖3所示。
由以上的實驗可知，無論添加洛神花萃取物于LDL遭誘導氧化前、后或是同時，均可有效抑制LDL的氧化，且洛神花萃取物的濃度愈高，抑制LDL氧化的效果愈好。實例二降低血漿中的甘油三酸酯及膽固醇實驗動物本發(fā)明所用的實驗動物為紐西蘭白兔(體重約2～2.2公斤)及Sprague-Dawley系大鼠(體重約200～220公克)。兔子共30只，分為5組，每籠1只，每天150g飲食，其中三組以95.7％固狀食物，3％豬油及1.3％膽固醇，飼養(yǎng)10周，可誘導產(chǎn)生動脈粥樣硬化，洛神花萃取物試驗組則添加1％或0.5％的洛神花萃取物；大鼠共24只，分為4組，每籠6只，每天25g飲食，其中三組以95.7％固狀食物，3％豬油及1.3％膽固醇，飼養(yǎng)12周，可誘導產(chǎn)生動脈粥樣硬化，洛神花萃取物試驗組則添加1％或2％的洛神花萃取物。
將兔子分成5組，每組6只，第一組喂食正常飼料，第二組喂食添加1％洛神花萃取物的正常飼料，第三組喂食高膽固醇飲食(含有1.3％膽固醇和3％豬油)，第四組喂食添加0.5％洛神花萃取物的高膽固醇飲食，第五組喂食添加1％洛神花萃取物的高膽固醇飲食；10周后以硫噴妥鈉(sodiumpentothal)(16mg/kg，i.v.)麻醉后放血，血液收集入EDTA-涂敷的試管，然后離心，以分析血脂肪，包括測量血漿中甘油三酸酯及膽固醇的含量；結果顯示高膽固醇飲食中添加洛神花萃取物可以使血漿中甘油三酸酯的含量顯著下降(p＜0.05)，并恢復正常。其結果如圖4所示。高膽固醇飲食使兔子血中膽固醇增加8.4倍、LDL-C增加10.5倍、LDL-C/HDL-C增加4.4倍；添加洛神花萃取物0.5％可使血漿中膽固醇、LDL-C和LDL-C/HDL-C的含量顯著下降(p＜0.05)，添加洛神花萃取物1％亦可使血漿中膽固醇、LDL-C和LDL-C/HDL-C的含量顯著下降(p＜0.01)。其結果如圖5所示。證實洛神花萃取物可降低血漿中的甘油三酸酯及膽固醇。
將大鼠分成4組，每組6只，第一組喂食正常飼料，第二組喂食高膽固醇飲食(含有1.3％膽固醇和3％豬油)，第三組喂食添加1％洛神花萃取物的高膽固醇飲食，第四組喂食添加2％洛神花萃取物的高膽固醇飲食；12周后斷頭放血，血液收集入EDTA-涂敷的試管，然后離心，以分析血漿中膽固醇的含量，結果顯示，高膽固醇飲食使大鼠血中膽固醇增加1.6倍、LDL-C增加3倍、LDL-C/HDL-C/增加2.6倍；添加洛神花萃取物1％可使血漿中膽固醇和LDL-C的含量顯著下降(p＜0.05)，并恢復正常；2％洛神花萃取物可使血漿中膽固醇、LDL-C和LDL-C/HDL-C的含量更顯著下降(p＜0.01)。其結果如圖6所示。更加證實洛神花萃取物可降低血漿中的膽固醇。實例三抑制動脈粥樣硬化動脈中內(nèi)皮油脂的沉積為動脈粥樣硬化的前導階段，亦即動脈中內(nèi)皮油脂的沉積如達到一定的數(shù)量往往會導致動脈粥樣硬化的發(fā)生。取實例二的兔子的胸腔大動脈進行染色，觀察油脂沉積的情形。結果顯示，高膽固醇飲食組的動脈內(nèi)皮有許多油脂沉積，但隨著洛神花萃取物的添加，油脂沉積情形明顯降低。其結果如圖7所示。證實洛神花萃取物可抑制動脈粥樣硬化及腦心血管疾病的發(fā)生。
我們又取實例二兔子的動脈作組織切片，發(fā)現(xiàn)喂食添加有0.5％及1％洛神花萃取物的高膽固醇飲食的兔子動脈與喂食正常飲食的兔子動脈，均沒有泡沫細胞形成、沒有平滑肌遷移的現(xiàn)象、亦沒有鈣化核的形成。其結果如圖8所示。也證實洛神花萃取物可抑制動脈粥樣硬化及腦心血管疾病的發(fā)生。實例四對肝、腎功能并無負面的影響兔子分別喂食正常飲食及添加1％洛神花萃取物的正常飲食，大鼠分別喂食正常飲食及添加2％洛神花萃取物的正常飲食后，測量血清中的丙胺酸轉銨酶(ALT)、天門冬胺酸氨酸轉氨酶(AST)和堿性磷酸酶(ALP)；結果顯示喂食洛神花萃取物的組別與喂食正常飲食的組別所測得的肝功能指數(shù)均無明顯差異；證實洛神花萃取物不會對肝功能造成不良影響。其結果如表3所示。
表3喂食洛神花萃取物對兔子及大鼠肝功能的影響兔子 大鼠肝功能 正常飲食1％洛神花萃取物 正常飲食2％洛神花萃取物(UL/l)ALT 55.2±23.8 40.8±11.9 55.8±19.1 34.2±9.4AST 98.7±34.0 89.5±55.4 108.8±20.8 67.7±11.0ALP 38.0±3.8 26.8±9.5 121.0±101.0103.0±85.0兔子分別喂食正常飲食及添加1％洛神花萃取物的正常飲食，大鼠分別喂食正常飲食及添加2％洛神花萃取物的正常飲食后，測量血液中的尿素氮(BUN)、肌酸酐(Cr)和尿酸(UA)；結果顯示喂食洛神花萃取物的組別與喂食正常飲食的組別所測得的腎臟功能指數(shù)均無明顯差異；證實洛神花萃取物不會對腎臟功能造成不良影響。其結果如表4所示。
表4喂食洛神花萃取物對兔子及大鼠腎功能的影響兔子大鼠腎功能正常飲食 1％洛神花萃取物 正常飲食 2％洛神花萃取物(mg/dl)BUN 16.1±4.730.1±17.2 14.6±5.1 19.0±6.4Cr 1.6±0.2 1.5±0.4 0.5±0.1 0.7±0.1UA 0.1±0.1 0.2±0.1 1.9±0.6 1.6±0.權利要求
1.洛神花萃取物用于制備抑制低密度脂蛋白氧化藥物的用途。
2.洛神花萃取物用于制備降低血漿中甘油三酸酯藥物的用途。
3.洛神花萃取物用于制備降低血漿中膽固醇藥物的用途。
4.洛神花萃取物用于制備抑制動脈粥樣硬化藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了洛神花萃取物具有降低血漿中甘油三酸酯及膽固醇，抑制低密度脂蛋白的氧化，減少動脈內(nèi)皮的油脂沉積，改善因泡沫細胞形成于血管壁而造成的平滑肌遷移的現(xiàn)象等的用途，從而以此類洛神花萃取物為主成分提供了用于抑制腦心血管疾病藥物的用途。
文檔編號A61P3/06GK1421226SQ0114245
公開日2003年6月4日 申請日期2001年11月28日 優(yōu)先權日2001年11月28日
發(fā)明者王朝鐘 申請人:寰生生物科技股份有限公司