專利名稱：二苯乙烯甙在制備治療缺血性腦血管疾病的藥物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及二苯乙烯甙化合物、其衍生物和藥用鹽的用途，具體說(shuō)是在制備治療缺血性腦血管疾病，例如腦血栓、腦梗死、腦栓塞、腦供血不足等的藥物中的用途。
腦組織的急性或慢性缺血，會(huì)導(dǎo)致腦細(xì)胞缺氧、腦水腫，脂質(zhì)過(guò)氧化，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高等系列病理生理反應(yīng)，腦水腫引起細(xì)胞缺氧，酸中毒，自由基增多，細(xì)胞功能減低；脂質(zhì)過(guò)氧化是細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜受到自由基的損傷，形成過(guò)氧化脂質(zhì)，它可引起膜損傷、酶抑制、溶酶體釋放、蛋白交聯(lián)、DNA和RNA結(jié)構(gòu)破壞等生化毒性，最終可導(dǎo)致細(xì)胞死亡；細(xì)胞內(nèi)鈣離子增多，出現(xiàn)鈣超載，損傷神經(jīng)細(xì)胞。
發(fā)明人經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，二苯乙烯甙化合物能夠減低急性腦缺血再灌注小鼠腦含水量，抑制腦缺血再灌注小鼠模型腦組織脂質(zhì)過(guò)氧化，增強(qiáng)腦缺血再灌注小鼠模型腦組織超氧化物歧化酶活性，減低腦缺血再灌注小鼠模型腦片細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，減低光化學(xué)誘導(dǎo)急性腦梗塞小鼠模型腦血管損傷，提高雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉致腦缺血沙土鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力，該化合物同時(shí)具備腦保護(hù)劑、鈣拮抗劑、抗氧化劑等的用途，從而能夠有效地防治缺血性腦血管疾病。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有上述化合物、其衍生物或藥用鹽的藥物組合物作為缺血性腦血管疾病的治療劑的應(yīng)用。在該組合物中還可以含有載體(如賦型劑)和其它任選成分。在該組合物中，本發(fā)明的二苯乙烯甙占10-90wt％，優(yōu)選占50-90wt％。載體包括賦型劑等，例如硬脂酸鎂、淀粉、乳糖、纖維素等。任選成分例如是著色劑、甜味劑等。
本發(fā)明的化合物、其衍生物或藥用鹽可以制成任何一種適合于臨床上應(yīng)用的劑型，包括固體制劑，如膠囊、片劑、顆粒制劑等，液體制劑如口服液等，或者注射劑。本發(fā)明化合物、其衍生物或藥用鹽的日劑量例如可以是5-50mg/kg體重，可以分一次或多次使用。
該化合物可以從中藥何首烏中提取。該化合物可以用何首烏根通過(guò)普通高壓液相色譜法制備。例如在LIQ.CHROM.&TECHNOL.，21(18)，2897-2904(1998)(Xueli Cao等人)中公開(kāi)了它的制備方法。上式化合物可以進(jìn)行衍生化，例如用酸，使上述結(jié)構(gòu)式的化合物上的3-、5-和4’-位上的羥基的氫被?；缫阴；?、丙?；?、丁?；人〈?，或與鹵代烴反應(yīng)，使3-、5-和4’-位上的羥基的氫用烴基取代，如用C1-6烴基取代。上式化合物也可以其藥學(xué)可接受的鹽的形式使用。
實(shí)施例1 二苯乙烯甙(TSG)提高雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉致腦缺血沙土鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康募毙匀X缺血可造成神經(jīng)元功能減退，包括膽堿能神經(jīng)，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能降低。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察TSG對(duì)雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉致腦缺血沙土鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力降低的影響。(注沙土鼠天生缺如椎動(dòng)脈系統(tǒng)，雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉可造成嚴(yán)重全腦缺血)2.實(shí)驗(yàn)方法沙土鼠連續(xù)灌胃給TSG 7天。.第7天后行雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉10分鐘，再灌注5天后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)其學(xué)習(xí)記憶能力。
Morris水迷宮測(cè)定主要由由圓形水池和自動(dòng)錄象及分析系統(tǒng)兩部分組成。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天各組給藥60分鐘后，每只動(dòng)物第一天訓(xùn)練4次，入池位置為站臺(tái)所隊(duì)象限及所鄰象限，于象限邊1/2弧度處將動(dòng)物頭朝池壁入水，120S未找到站臺(tái)者，將其引致站臺(tái)，放置30S引導(dǎo)其學(xué)習(xí)與記憶。第2、3和4天重復(fù)測(cè)試，數(shù)據(jù)采集和處理均由有圖像自動(dòng)監(jiān)視和處理系統(tǒng)完成。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果TSG給藥組水迷宮游出時(shí)間和游泳距離與模型組相比明顯縮短(表1)，表明該藥能提高腦缺血沙土鼠學(xué)習(xí)記憶能力。
表1. TSG對(duì)腦缺血再灌注沙土鼠Morris水迷宮游出時(shí)間和距離的影響組別N游出時(shí)間(秒) 游泳距離(厘米)對(duì)照組(假手術(shù)組)518.28±15.38*377.4±354.7*模型組(缺血再灌)436.45±36.91 687.5±610.3TSG 38mg/kg+缺血再灌337.10±41.11 593.5±41.1TSG 114mg/kg+缺血再灌 525.57±22.75 508.6±422.6TSG 342mg/kg+缺血再灌 412.04±9.89**311.4±319.6*M±SD；*P＜0.05，**P＜0.01，與缺血模型組比較。實(shí)施例2 TSG減低急性腦缺血再灌注小鼠腦含水量1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康募毙匀X缺血再灌注導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞缺氧，能量代謝不足，離子通道開(kāi)放等，進(jìn)一步引起腦水腫，可產(chǎn)生嚴(yán)重的后果。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察TSG對(duì)急性腦缺血再灌注小鼠腦含水量增高的影響。
2.實(shí)驗(yàn)方法雄性昆明小鼠，體重22-28克，動(dòng)物隨機(jī)分組，實(shí)驗(yàn)前各組連續(xù)灌胃給藥7天，假手術(shù)組及缺血模型組分別給予自來(lái)水。手術(shù)當(dāng)日小鼠空腹給藥后1小時(shí)，麻醉后，用動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈15分鐘，再灌注15分鐘后迅速斷頭取腦，去掉小腦，采用干—濕重方法計(jì)算腦水分含量，將分離的腦組織立即在分析天平稱取濕腦重量，然后放入恒溫干燥箱(110C±2)24小時(shí)烘干至恒重，稱取干腦重量，根據(jù)濕腦重量和干腦重量差，計(jì)算出腦標(biāo)本水分含水量值。
計(jì)算公式腦水分％＝(腦濕重量-干腦重量)/濕腦重量*100％3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果TSG灌胃給藥可降低急性腦缺血再灌注小鼠腦含水量(表2)，表明該藥有利于防治腦缺血所致的腦水腫。
表2. TSG對(duì)急性腦缺血再灌注小鼠腦含水量的影響組別N腦含水量(％)對(duì)照組(假手術(shù)組)90.7796±0.0134*模型組(缺血再灌)90.7899±0.0041海得琴0.75mg/kg+缺血再灌10 0.7838±0.0116TSG 38mg/kg+缺血再灌10 0.7833±0.0119TSG 114mg/kg+缺血再灌 10 0.7801±0.0130*TSG 342mg/kg+缺血再灌 10 0.7830±0.0134M±SD；*P＜0.05，與缺血模型組比較實(shí)施例3 TSG抑制腦缺血再灌注小鼠模型腦組織脂質(zhì)過(guò)氧化1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康哪X缺血后產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化增高，過(guò)氧化脂質(zhì)增多。過(guò)氧化脂質(zhì)是生物膜和細(xì)胞中磷質(zhì)所含多元不飽和脂肪酸被自由基損傷、氧化而成的過(guò)氧化產(chǎn)物。它可引起膜損傷、酶抑制、溶酶體釋放、蛋白交聯(lián)、DNA和RNA結(jié)構(gòu)破壞等生化毒性，最終可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察TSG對(duì)腦缺血再灌注小鼠模型腦組織脂質(zhì)過(guò)氧化代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量增高的影響。
2.實(shí)驗(yàn)方法雄性昆明小鼠，體重22-28克，動(dòng)物隨機(jī)分組，實(shí)驗(yàn)前各組連續(xù)灌胃給藥7天，假手術(shù)組及缺血模型組分別給予自來(lái)水。手術(shù)當(dāng)日空腹給藥后1h，于小鼠麻醉后，用動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈15分鐘，再灌注15分鐘后迅速斷頭取腦，去掉小腦。腦組織稱重，1∶10加入0.2M磷酸鹽緩沖液勻漿，3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清0.5ml，用硫代巴比妥酸(TAB)法測(cè)定腦組織中MDA含量。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果TSG灌服可降低急性腦缺血再灌注小鼠腦組織MDA含量(表3)，表明該藥可抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，其機(jī)理可能為減少自由基生成或增強(qiáng)自由基清除。
表3. TSG對(duì)急性腦缺血再灌注小鼠腦組織MDA含量的影響組別N MDA(nmol/mg蛋白)對(duì)照組(假手術(shù)組)101.093±0.151*模型組(缺血再灌)9 1.180±0.190海得琴0.75mg/kg+缺血再灌101.111±0.116TSG 38mg/kg+缺血再灌101.158±0.150TSG 114mg/kg+缺血再灌 101.002±0.147**TSG 342mg/kg+缺血再灌 101.030±0.131**M±SD；*P＜0.05，**P＜0.01與缺血模型組比較實(shí)施例4 TSG增強(qiáng)腦缺血再灌注小鼠模型腦組織超氧化物歧化酶活性1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康某趸锲缁?SOD)對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基(O-2)，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察TSG對(duì)腦缺血再灌注小鼠模型腦組織SOD活性降低的影響，探討TSG抑制腦缺血小鼠模型脂質(zhì)過(guò)氧化的機(jī)理。
2.實(shí)驗(yàn)方法雄性昆明小鼠，體重22-28克，動(dòng)物隨機(jī)分組，實(shí)驗(yàn)前各組連續(xù)灌胃給藥7天，假手術(shù)組及缺血模型組分別給予自來(lái)水。手術(shù)當(dāng)日空腹給藥后1h，于小鼠麻醉后，用動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈15分鐘，再灌注15分鐘后迅速斷頭取腦，去掉小腦。腦組織稱重，1∶10加入0.2M磷酸鹽緩沖液勻漿，3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清0.1ml，用亞硝酸鹽法測(cè)定腦組織中SOD活性。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果TSG灌胃口服可增高急性腦缺血再灌注小鼠腦組織SOD活性(表4)，表明該藥具有增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的作用，這可能是其抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的機(jī)理。
表4. TSG對(duì)急性腦缺血再灌注小鼠腦組織SOD活性的影響組別N SOD(NU/mg蛋白)對(duì)照組(假手術(shù)組)105.219±0.051*模型組(缺血再灌)9 4.913±0.051海得琴0.75mg/kg+缺血再灌104.779±0.034TSG 38mg/kg+缺血再灌105.152±0.049TSG 114mg/kg+缺血再灌 105.111±0.074TSG 342mg/kg+缺血再灌 105.317±0.060**M±SD；*P＜0.05，**P＜0.01，與缺血模型組比較實(shí)施例5 TSG減低腦缺血再灌注小鼠模型腦片細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度
1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康哪X缺血再灌注后，出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，導(dǎo)致隨后的鈣超載、氧應(yīng)激等損傷，最終可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察TSG對(duì)腦缺血再灌注小鼠模型腦片細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高的影響。
2.實(shí)驗(yàn)方法雄性昆明小鼠，體重22-28克，動(dòng)物隨機(jī)分組，實(shí)驗(yàn)前各組連續(xù)灌胃給藥7天，假手術(shù)組及缺血模型組分別給予自來(lái)水。手術(shù)當(dāng)日空腹給藥后1h，于小鼠麻醉后，用動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈15分鐘，再灌注15分鐘后迅速斷頭取出全腦，放入通有95％的CO2和5％O2的預(yù)冷的人工腦脊液中，在振動(dòng)切片機(jī)上切出400um的腦片，放入CO2培養(yǎng)箱中，37℃孵育30min，加入5uM的Fluo-3AM 500ul，在CO2培養(yǎng)箱中負(fù)載1h后，沖洗數(shù)次，在激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)上進(jìn)行光學(xué)切片，觀察熒光強(qiáng)度。
光學(xué)切片(光切)是激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)的特色之一，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)離體活腦片進(jìn)行連續(xù)無(wú)損切割，又稱為“顯微CT”，光切可以獲得樣品表面的和深層的信息，通過(guò)三維重建技術(shù)，可以獲得三維圖象和立體結(jié)構(gòu)信息。鈣熒光指示劑Fluo-3AM是一種脂溶性試劑，本身無(wú)熒光，穿過(guò)細(xì)胞膜后，在膜內(nèi)酶的作用下，脫去酯基(AM)，與胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后，出現(xiàn)熒光，利用激光掃描共聚焦顯微鏡測(cè)定熒光強(qiáng)度可以檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離鈣的水平。
圖象處理利用LaserSharp圖象處理系統(tǒng)，測(cè)定左右海馬區(qū)、皮層區(qū)的面積或體積和總的熒光強(qiáng)度，以單位面積或單位體積熒光強(qiáng)度及熒光強(qiáng)度分布中值(即Mean，系統(tǒng)給出)為指標(biāo)，觀察海馬、皮層的細(xì)胞內(nèi)游離鈣的水平。
統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間差異的顯著性用t檢驗(yàn)。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果TSG灌胃口服可降低腦缺血再灌注小鼠模型大腦皮層和海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度(表5)，這對(duì)于保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞具有重要意義。
表5. TSG對(duì)腦缺血再灌注小鼠模型神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響組別 N 細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光值皮層(Pix/um2)海馬(Pix/um2)對(duì)照(假手術(shù)組) 3 0.6039±0.6350* 0.4718±0.4104*模型(缺血再灌組) 3 1.0439±0.26360.8385±0.2849海得琴0.75mg/kg+缺血再灌 3 0.3719±0.1379* 0.4406±0.2073*TSG 38mg/kg+缺血再灌 3 0.4476±0.1095** 0.4371±0.1013*TSG 114mg/kg+缺血再灌3 0.4735±0.2651** 0.6536±0.3179TSG 342mg/kg+缺血再灌3 0.5927±0.3140* 0.6607±0.3926M±SD；*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組比較實(shí)施例6 TSG減低光化學(xué)誘導(dǎo)急性腦梗塞小鼠模型腦血管損傷1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑炷Ｔ韺⒐饷粑镔|(zhì)(玫瑰紅)注入小鼠尾靜脈，以560nm波長(zhǎng)的冷光源照射小鼠顱部，發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，生成大量氧自由基，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血小板聚集，在照射區(qū)內(nèi)形成血栓，局部皮層缺血壞死。
本實(shí)驗(yàn)旨在觀察TSG對(duì)光化學(xué)誘導(dǎo)急性腦梗塞小鼠模型腦血管損傷及缺血半暗區(qū)的影響。
2.實(shí)驗(yàn)方法給小鼠灌服不同劑量TSG，15天后造模。將光敏物質(zhì)(玫瑰紅)注入小鼠尾靜脈，以560nm波長(zhǎng)的冷光源照射小鼠顱部。在造模后3小時(shí)經(jīng)舌靜脈注入伊文斯蘭染料，1小時(shí)后處死動(dòng)物。處死后取腦組織制成勻漿，并以比色法測(cè)定平均腦組織的光密度。梗塞嚴(yán)重者，染色深，光密度大，缺血半暗區(qū)面積大。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)灌服TSG可降低模型小鼠腦組織伊文斯蘭的光密度，表明減輕了腦血管損傷和腦梗塞程度；TSG可減少模型小鼠缺血半暗區(qū)的面積(見(jiàn)表6)。
表6. TSG對(duì)光化學(xué)誘導(dǎo)腦梗塞小鼠模型的影響組別 n伊文斯蘭(OD值)缺血半暗帶面積模型組60.1333±0.0759++++海得琴(1mg/kg)70.1121±0.0441* +TSG(33mg/kg) 60.1067±0.0452* ++TSG(100mg/kg) 90.1039±0.0843* +TSG(300mg/kg) 70.0805±0.0385* +M±SD；*p＜0.05，與模型組相比缺血半暗帶+，++，+++，++++代表面積依次由小到大。實(shí)施例7 化合物的制備在超聲破碎下，何首烏根的干燥粉末用氯仿萃取三次，除去蒽醌，然后殘留物以類似方式用乙醇萃取3次。合并乙醇萃取物并濃縮干燥。干燥的萃取物溶解在HSCCC(高速逆流液相色譜法)分離的流動(dòng)相中。HSCCC用北京新技術(shù)應(yīng)用研究所制造的GS10A2多層盤(pán)旋行星式離心機(jī)進(jìn)行。
在各分離中，盤(pán)旋柱首先完全填充上層有機(jī)固定相。然后儀器在800rpm下旋轉(zhuǎn)，同時(shí)下層含水流動(dòng)相泵入到柱中。在流動(dòng)相前面出現(xiàn)和體系建立穩(wěn)定狀態(tài)的流體動(dòng)力平衡之后，樣品溶液經(jīng)注射閥注入。來(lái)自柱的出口的流出物用在254nm的UV檢測(cè)器連續(xù)監(jiān)控。峰級(jí)分根據(jù)色譜圖收集，產(chǎn)物純度為96％。
上述化合物125mg，乳糖80mg，羧甲基淀粉40mg和硬脂酸鎂5mg，按常規(guī)方法壓片制成片劑。
權(quán)利要求
1.下式的二苯乙烯甙化合物、其衍生物或藥用鹽在制備治療缺血性腦血管疾病的藥物中的用途 其中R為-O-β-D-葡萄糖。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述缺血性腦血管疾病是腦血栓。
3.權(quán)利要求1的用途，其中所述缺血性腦血管疾病是腦梗死。
4.權(quán)利要求1的用途，其中所述缺血性腦血管疾病是短暫性腦缺血發(fā)作。
5.權(quán)利要求1的用途，其中所述缺血性腦血管疾病是腦栓塞。
6.權(quán)利要求1的用途，其中所述缺血性腦血管疾病是腦供血不足。
7.一種治療缺血性腦血管疾病的藥物組合物，其特征在于含有權(quán)利要求1的二苯乙烯甙化合物、其衍生物或藥用鹽的組合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的藥物組合物，它可以是固體制劑，如片劑、膠囊、顆粒制劑，液體制劑如口服液，或者注射劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的組合物，其中所述缺血性腦血管疾病是腦血栓、腦梗死、腦栓塞、短暫性腦缺血發(fā)作或腦供血不足。
10.權(quán)利要求1的二苯乙烯甙化合物、其衍生物或藥用鹽在制備腦保護(hù)劑中的應(yīng)用。
11.權(quán)利要求1的二苯乙烯甙化合物、其衍生物或藥用鹽在制備抗氧化劑或鈣拮抗劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及二苯乙烯甙化合物、其衍生物或藥用鹽在制備治療缺血性腦血管疾病的藥物中的用途。經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí),二苯乙烯甙化合物能夠減低急性腦缺血再灌注小鼠腦含水量,抑制腦缺血再灌注小鼠模型腦組織脂質(zhì)過(guò)氧化,增強(qiáng)腦缺血再灌注小鼠模型腦組織超氧化物歧化酶活性,減低腦缺血再灌注小鼠模型腦片細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度,減低光化學(xué)誘導(dǎo)急性腦梗塞小鼠模型腦血管損傷,以及提高雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉致腦缺血沙土鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力。
文檔編號(hào)A61K31/7034GK1347698SQ0113428
公開(kāi)日2002年5月8日 申請(qǐng)日期2001年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月30日
發(fā)明者李林 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院