專利名稱：用于治療和預(yù)防與異常血凝固有關(guān)的疾病的藥用組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于患有凝血病癥例如凝血因子失調(diào)(包括缺乏)，特別是攜帶凝血因子抑制劑的患者的止血處理的藥劑。更詳細(xì)地講，本發(fā)明涉及一種用于治療和預(yù)防與凝血病癥有關(guān)的出血的藥用組合物，所述組合物包含作為活性組分的活化因子VII(在下文中也被稱為“FVIIa”)和因子X(在下文中也被稱為“FX”)。
為了治療患有血友病的患者，已經(jīng)開發(fā)出了包含因子VIII或因子IX的濃縮制劑以補(bǔ)充所述缺乏的因子，并用于被稱為是補(bǔ)充療法的止血處理。然而，眾所周知，經(jīng)常被稱為“抑制劑”的抗因子VIII抗體或抗因子IX抗體在約2-24％經(jīng)受補(bǔ)充療法治療的患者中產(chǎn)生(Thromb.Haemost.67第600-602頁(1992年)；Int.J.Hematol.62第175-181頁(1995年)；Lancet 339期(總8793期)第594-598頁(1992年)；和Blood83第2428-2435頁(1994年))，這是補(bǔ)充療法最嚴(yán)重的副作用之一。一旦抑制劑在患者體內(nèi)產(chǎn)生，補(bǔ)充療法就會變得無效而導(dǎo)致止血處理極端困難。這里也有很多報(bào)告關(guān)于抑制劑即使在缺乏遺傳傾向例如血友病情況下也會本能地或以自身免疫疾病的方式產(chǎn)生(Thromb.Haemost.45第200-203頁(1981年))。
目前用于治療攜帶抑制劑的患者的主要療法如下(a)中和療法給予超過抑制劑的過量濃縮制劑以中和抑制劑并補(bǔ)充止血所需的因子。(b)旁路療法由于因子VIII和因子IX都參與內(nèi)凝固途徑，因此，止血不通過(即“繞過”)內(nèi)凝固途徑而是通過外凝固途徑來實(shí)現(xiàn)的。為了增強(qiáng)所述外凝固途徑的能力，給予稱為“APCC”的活化凝血酶原復(fù)合濃縮物或FVIIa制劑。(c)免疫耐受療法長時間內(nèi)給予高劑量濃縮制劑以使得患者產(chǎn)生抑制劑的能力免疫上枯竭，從而導(dǎo)致抗體的消失。
然而，上面提到的傳統(tǒng)療法在個別方面有缺陷。中和療法(a)只對具有低效價抑制劑的患者有效而對高效價抑制劑的患者無效。
在旁路療法(b)中，已經(jīng)報(bào)道APCC會引起副作用例如心肌梗塞(Am.J.Med.85第245-249頁(1988年))或DIC(Thromb.Haemost.48第339-340頁(1982年))而出現(xiàn)安全性問題。另一方面，F(xiàn)VIIa制劑是不利地，在于FVIIa半衰期短因此它必須經(jīng)常給藥(Transfus.Med.Rev.7第78-83頁(1993年))，而且使患者承擔(dān)了許多身體上以及在經(jīng)濟(jì)上對所述藥物高支出的負(fù)擔(dān)。此外，F(xiàn)VIIa制劑并不是十分地有效。免疫耐受療法(c)只對有限數(shù)量的患者有效而且也使患者承擔(dān)了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
鑒于此，所述對于攜帶抑制劑患者的止血處理的傳統(tǒng)方法不是十分地有效，因此，存在對更安全、更有效和易于止血處理的制劑的需要。
現(xiàn)有技術(shù)包括題目為“用于治療凝血因子抑制劑的含水組合物”的第145072號(1995年)到第145075號(1995年)的日本專利公開說明書，其中研究了在所述傳統(tǒng)APCC中的活化水平但沒有闡明擔(dān)負(fù)旁路活性的活性物質(zhì)。另外一個現(xiàn)有技術(shù)是題目為“用于治療凝血病癥的藥用組合物及其制備方法”的第110715號(1997年)日本專利公開說明書，其中提高了FVIIa在APCC中的含量這樣增強(qiáng)了治療有效性。然而，這個組合物僅僅是在APCC中增加了FVIIa，它在單獨(dú)使用時被證明是有效地，因此跟上面提到的方法一樣仍然有缺點(diǎn)。
依照本發(fā)明的所述藥用組合物的優(yōu)點(diǎn)是(1)它是完全安全的，因?yàn)樗鼘?shí)質(zhì)上不含凝血酶原、凝血酶、因子IX、活化因子IX、磷脂和相似物，它們包含在傳統(tǒng)的APCC中并被認(rèn)為是副作用的引發(fā)劑；和(2)它不需要經(jīng)常給藥(所述FVIIa制劑的缺點(diǎn))，除此之外，它還顯示出比所述FVIIa制劑更高的止血作用。總體來說，本發(fā)明的所述藥用組合物是一個期待已久的藥劑，它是安全、高效并易于處理止血。它與所述傳統(tǒng)APCC截然不同在于它實(shí)質(zhì)上不含F(xiàn)II、FIX，并與所述FVIIa制劑截然不同在于它含有FX。
圖2顯示在FVIII或FIX缺乏血漿中FVIIa對APTT的作用。
圖3顯示在FVIII或FIX缺乏血漿中FX對APTT的作用。
圖4顯示在FVIII或FIX缺乏血漿中FII對APTT的作用。
圖5顯示在FVIII缺乏血漿中FVIIa和FX對APTT的協(xié)同作用。
圖6顯示在FIX缺乏血漿中FVIIa和FX對APTT的協(xié)同作用。
圖7顯示在血友病B抑制劑樣血液中FVIIa+FX對TEG參數(shù)“r”(反應(yīng)時間)的作用。
圖8顯示在血友病B抑制劑樣血液中FVIIa+FX對TEG參數(shù)“r+k”(反應(yīng)時間+凝固時間)的作用。
圖9顯示在血友病B抑制劑動物模型中FVIIa單獨(dú)給藥和FVIIa+FX給藥對APTT作用的比較。


圖10顯示在血友病B抑制劑動物模型中FVIIa單獨(dú)給藥和FVIIa+FX給藥對次級出血時間作用的比較。
圖11顯示在血友病B抑制劑動物模型中FVIIa單獨(dú)給藥和FVIIa+FX給藥對TEG參數(shù)“r”(反應(yīng)時間)作用的比較。
圖12顯示在血友病B抑制劑動物模型中FVIIa單獨(dú)給藥和FVIIa+FX給藥對TEG參數(shù)“r+k”(反應(yīng)時間+凝固時間)作用的比較。
實(shí)施本發(fā)明的最適方式FVII，本發(fā)明的藥用組合物中一個活性組分的前體，是由406個氨基酸殘基組成的、分子量約為50,000的維生素K依賴性凝固因子。FVII以大約0.5μg/ml存在血漿中。當(dāng)所述分子中的Arg152-Ile153鍵水解時，F(xiàn)VII轉(zhuǎn)化為具有酶活性的雙鏈FVIIa。FVIIa與組織因子結(jié)合在鈣離子存在下活化FIX和FX。因而，F(xiàn)VIIa在外凝固途徑中起最重要的作用。
另一方面，F(xiàn)X也是一個由448個氨基酸殘基組成的、分子量約為59,000的維生素K依賴性血凝固因子，以5到10μg/ml存在血漿中。FX通過由FVIIa/組織因子復(fù)合物在鈣離子存在下(外凝固途徑)或由活化因子IX在活化因子VIII、鈣離子和磷脂存在下(內(nèi)凝固途徑)引起的活化轉(zhuǎn)化為具有酶活性的活化FX(在下文中也被稱為“FXa”)。然后，F(xiàn)Xa在活化因子V、鈣離子和磷脂存在下將凝血酶原活化為凝血酶，從而引發(fā)纖維蛋白形成。
用于本發(fā)明的FVIIa和FX可以通過任何本領(lǐng)域所熟知的方法包括從人血液中分離或利用基因重組技術(shù)來制備。
FVIIa可以通過例如在日本專利公開說明書第155797號(1991年)、第059866號(1998年)和第059867號(1998年)中所公開的方法從血液中制備?；蛘?，使通過在低溫下融化和離心新鮮冷凍的人血漿來去除冷沉淀物而制備的低冷沉淀物血漿，經(jīng)陰離子交換色譜以產(chǎn)生粗純化的FVII，然后通過使用帶有固定抗-FVII單克隆抗體色譜柱的親和色譜進(jìn)一步純化。然后，所得到的純化FVII被其他血漿蛋白，如活化因子XII或FXa活化成為FVIIa。出于安全目的，優(yōu)選所得到的FVIIa盡可能少地被FII、FIIa、FIX和FIXa污染。
為了從血液中制備FX，例如，使通過在低溫下融化和離心新鮮冷凍的人血漿來去除冷沉淀物而制備的低冷沉淀物血漿，經(jīng)陰離子交換色譜以產(chǎn)生粗純化的FX，然后通過使用帶有固定抗-FX單克隆抗體色譜柱的親和色譜進(jìn)一步純化。如上對于FVIIa所述，優(yōu)選所得到的FX盡可能少地被FII、FIIa、FIX和FIXa污染以保證安全性。
這樣制備的FVIIa和FX中的每一種可以通過與保證維持FVIIa和FX的活性處于最高水平的適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑一起凍干來保存。或者，F(xiàn)VIIa或FX的溶液可以凍干保存。也有可能凍干與用于保存的合適濃度的適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑混合的FVIIa和FX或凍干FVIIa和FX溶液的混合物。
依照本發(fā)明，包含F(xiàn)VIIa或FX作為活性組分的組合物與本領(lǐng)域所熟知的合適的賦形劑混合，利用本領(lǐng)域熟知的工藝來配制用于治療和預(yù)防由凝血病癥引起的止血障礙的藥劑。本發(fā)明的所述藥劑可以給予就患有凝血病癥引起的止血障礙而言的任何患者。
雖然FVIIa和FX的有效劑量可以根據(jù)，例如患者年齡、疾病的癥狀和嚴(yán)重程度而變化，但是止血作用預(yù)期是通過5μg/體重(kg)到160μg/體重(kg)的FVIIa和50μg/體重(kg)到16,000μg/體重(kg)的FX來達(dá)到的。FVIIa和FX最適于利用單一給藥法(大劑量注射(Bolus))或通過靜脈滴注給藥。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，依照本發(fā)明用于治療和預(yù)防止血障礙的所述藥劑包含F(xiàn)VIIa和FX作為活性組分?？墒窃诹硗庖粋€實(shí)施方案中，如果兩次給藥的間隔足夠短，F(xiàn)VIIa和FX可以分別給藥從而來發(fā)揮本發(fā)明的作用。
通過以下實(shí)施例，更詳細(xì)地介紹本發(fā)明。實(shí)施例1通過APTT分析對本發(fā)明組合物止血效價的評估“活化部分促凝血酶原激酶時間”(下文中也被稱為“APTT”)是利用APTT試劑來篩選內(nèi)途徑的檢測方法。具體地說，將APTT試劑和鈣離子加入到檢測血漿中，然后測量纖維蛋白形成時間來評估內(nèi)凝固途徑中的酶效價。當(dāng)內(nèi)部凝血因子同典型血友病A和血友病B中一樣具有定量或定性異常或者存在內(nèi)部凝血因子的抑制劑時，APTT就會延長。
正常的APTT時間是30-40秒，而延長的APTT的程度(rate)依賴于具有定量或定性異常的內(nèi)部凝固因子的凝血活性。在血友病具有嚴(yán)重臨床癥狀，包括抑制劑的情況下，APTT格外地延長。根據(jù)Saito等報(bào)道的FVIIa制劑的臨床評估(Jpn.J.Thromb.Hemost.第5卷(第3期)158-172頁(1994年))，在12個攜帶抑制劑的血友病患者中，APTT延長到122.0±18.7秒(平均值±SD)?？墒牵诮o予基因工程FVIIa后20分鐘，APTT縮短到82.9±21.6秒。也有報(bào)道在體外當(dāng)將FVIIa加入到FVIII或FIX缺乏血漿中時，APTT明顯降低(Thromb.Res.56603-609頁(1989年))。
在這個實(shí)施例中，利用因子VIII或因子IX缺乏血漿(Dade BehringMarburg GmbH制造)作為血友病樣血漿，評估FVIIa、FX和FII縮短APTT的作用。肌動蛋白(商品名)(Dade Behring Marburg GmbH制造)被用作APTT試劑。在FVIIa終濃度為0到4μg/ml血漿；FX終濃度為0到80μg/ml血漿(人血漿中的正常水平約10μg/ml血漿)；和FII終濃度為0到400μg/ml血漿(人血漿中的正常水平約100μg/ml血漿)下評估所述凝固因子。結(jié)果顯示于圖2到圖6中，其中圖2到圖4以濃度依賴的方式顯示出在所述缺乏血漿中FVIIa、FX和F II中的每一種對APTT的作用，而圖5和圖6顯示出在所述缺乏血漿中FVIIa和FX組合對APTT的協(xié)同作用。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)FVIIa和FX均以濃度依賴的方式在所述缺乏血漿中縮短APTT而FII幾乎不能夠縮短APTT。同樣利用在血漿中的終濃度分別為0到1μg/ml和0到40μg/ml來檢測FVIIa和FX的組合，它們是同時加入到所述缺乏血漿中來評估APTT矯正。它揭示了在更高濃度下的FVIIa和FX可能將APTT縮短到更高程度。此外，與單獨(dú)使用FVIIa或FX時觀察到的作用相比，當(dāng)將這些凝血因子結(jié)合時觀察到了更高的作用，提供了明顯的協(xié)同作用。實(shí)施例2通過凝血彈性圖對本發(fā)明組合物止血效價的評估測量凝血過程中粘彈性變化的“凝血彈性圖”(下文中也稱為“TEG”)為各種各樣的凝血病癥提供了特定圖譜，并用于測定血液的凝血能力。在血友病情況下或在存在內(nèi)部凝血因子的抑制劑情況下，由于凝血被抑制因而會顯示出異常的TEG圖形。在數(shù)值上，TEG參數(shù)“r”(反應(yīng)時間)和“r+k”(k凝固時間)在正常人血漿中是按“r”在10到15分鐘之間、“k”在6到8分鐘之間和“r+k”在16到23分鐘之間變化。在血友病情況下或在存在內(nèi)部凝血因子的抑制劑情況下，這些參數(shù)不在所述顯示出的正常范圍內(nèi)而且被顯著地延長。根據(jù)Yoshioka等的報(bào)道(Haemostasis26(副刊1)143-149頁(1996年))，給予患有血友病A的患者FVIIa制劑，抑制劑從延長至此的參數(shù)，即“r”(超過60分鐘)和“r+k”(超過80分鐘)幾乎恢復(fù)到正常水平，而“r”和“r+k”會隨著活體中FVIIa水平下降而再次被延長。這證明了對TEG的測量可以有利地用于評估血液能力。
以上面所提到的原則為基礎(chǔ)，將抗人FIX山羊抗體加入到人血液中來制備血友病B抑制劑樣血液，其中“r”和“r+k”分別延長超過120分鐘和達(dá)到不能測量的程度。將濃度分別為0.125到1μg/ml血和2.5到20μg/ml血的FVIIa和FX加入到這個血友病B抑制劑樣血液中。結(jié)果，它顯示出“r”和“r+k”以依賴FVIIa和FX濃度的方式被縮短，證明了在血友病B抑制劑樣血液中已喪失的凝血能力被FVIIa和FX矯正了。所述結(jié)果顯示于圖7和圖8中。實(shí)施例3通過動物模型對本發(fā)明組合物止血效價的評估這個實(shí)施例是利用通過給予獼猴抗人FIX山羊抗體制備的血友病B抑制劑模型進(jìn)行的。所述血友病B抑制劑模型顯示出APTT和出血時間的延長、TEG參數(shù)“r”(反應(yīng)時間)和“r+k”(k凝固時間)的極度延長和最大幅度(ma)的降低。
血友病B抑制劑模型是通過給獼猴快速靜脈注射和靜脈滴注給予抗人FIX山羊抗體制備的。比較單獨(dú)FVIIa給藥(80μg/kg)和組合FVIIa和FX給藥(分別為80μg/kg和800μg/kg)對(1)APTT、(2)出血時間和(3)TEG的作用。所述結(jié)果顯示于圖9、圖10和圖11到圖12中。
發(fā)現(xiàn)在給藥(單獨(dú)FVIIa或與FX組合)后縮短了APTT，其中組合FVIIa和FX比單獨(dú)FVIIa縮短APTT更多。
出血時間按下列方法測量利用SimplateIIR(Organon Teknika制造)在獼猴尾部沿與尾平行的方向在離尾根部約15厘米處切口而避開動脈和靜脈。血壓套箍纏繞到尾根部，在40mmHg血壓下切割兩次，然后測量出血時間(初次出血時間)。用濾紙吸去滲出血但不要碰到創(chuàng)口。為了測量二次出血時間，一旦出血停止，用棉片多次擦拭創(chuàng)口使之出血，然后如對初次出血時間所描述的測量出血時間。
已知初次出血時間通常反映由血小板引起的止血反應(yīng)。實(shí)際上，與抗人FIX山羊抗體給藥后正常條件相比，初次出血時間僅僅輕微地而不是顯著地延長。恰恰相反，在抗人FIX山羊抗體給藥后二次出血時間顯著地延長了但被給予FVIIa或同時給予FVHa和FX所縮短。比較這些作用，出血時間被矯正至更接近于正常條件，而且由同時給予FVIIa和FX產(chǎn)生的出血時間矯正會比由單獨(dú)給予FVIIa產(chǎn)生的矯正維持更長的時間。
同樣地，TEG參數(shù)“r”和“r+k”被矯正至更接近于正常條件，而且由同時給予FVIIa和FX產(chǎn)生的作用會比由單獨(dú)給予FVIIa產(chǎn)生的作用維持更長的時間。
權(quán)利要求
1.一種用于治療和預(yù)防與凝血病癥有關(guān)的出血的藥用組合物，所述藥用組合物包含作為活性組分的活化因子VII和因子X。
2.權(quán)利要求1的藥用組合物，其中所述凝血病癥是包括凝血因子缺乏在內(nèi)的凝血因子失調(diào)，特別是顯示由抗凝血因子抑制劑(抗體)引起止血障礙的凝血病癥。
3.權(quán)利要求1或2的藥用組合物，其中所述組合物包含濃度為1μg/ml或更高的活化因子VII和濃度為20μg/ml或更高的因子X作為活性組分。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的藥用組合物，其中所述組合物是以5-160μg/體重(kg)活化因子VII和50-1,600μg/體重(kg)因子X的劑量給藥來用于止血。
5.一種治療與凝血病癥有關(guān)的出血的方法，該方法包括給予患有與凝血病癥有關(guān)的出血的患者活化因子VII和因子X的組合。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述凝血病癥是包括凝血因子缺乏在內(nèi)的凝血因子失調(diào)，特別是顯示由凝血因子抑制劑(抗體)引起止血障礙的凝血病癥。
7.權(quán)利要求5或6的方法，其中給予5-160μg/體重(kg)的活化因子VII和50-1,600μg/體重(kg)的因子X。
全文摘要
本發(fā)明提供用于治療和預(yù)防與異常血凝固有關(guān)的出血癥并包含作為主要活性組分的活化凝血因子VII(FVIIa)及凝血因子X(FX)的藥用組合物。所述藥用組合物不含主要引起的副作用的組分，是高度安全、有效并易于處理止血。因此，所述藥用組合物可以用于例如患有與凝血病癥有關(guān)的出血，例如凝血因子異常(包括缺乏)，特別是由凝血因子抑制劑(抗體)引起的凝血病癥的患者的止血處理。
文檔編號A61P7/04GK1434720SQ00819097
公開日2003年8月6日 申請日期2000年12月21日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月24日
發(fā)明者中富靖, 友清和彥, 荒木辰也, 手嵨香織, 渡邊朋子, 中垣智弘 申請人:財(cái)團(tuán)法人化學(xué)及血清療法研究所