一種苦蕎麥活性肽的制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于動(dòng)物食品領(lǐng)域，尤其涉及一種添加劑，具體來說是一種苦蕎麥活性肽 的制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)代養(yǎng)豬生產(chǎn)中，由于養(yǎng)殖環(huán)境和養(yǎng)殖技術(shù)水平滯后，使得動(dòng)物在繁殖生長過程 中很難發(fā)揮它應(yīng)有的遺傳潛能。為發(fā)揮母豬最佳生產(chǎn)性能、減少乳豬疾病感染幾率并提高 乳豬生產(chǎn)性能，常采用早期隔離斷奶技術(shù)。早期斷奶乳豬的消化系統(tǒng)尚未發(fā)育完善，難以承 受由液體母乳向谷物性固體飼料變換帶來的營養(yǎng)應(yīng)激；乳豬與母畜驟然分離引起的心理應(yīng) 激；以及重新建群和等級(jí)地位確定過程中乳豬個(gè)體之間的爭(zhēng)斗引起的環(huán)境應(yīng)激。營養(yǎng)、心 理和環(huán)境三重應(yīng)激不可避免地增加斷奶后乳豬對(duì)環(huán)境中潛在病原微生物的敏感性，導(dǎo)致斷 奶后乳豬腹瀉、采食量下降、煩躁不安、攻擊性加強(qiáng)、生長停滯、并發(fā)水腫病和抗病力下降等 綜合應(yīng)激，更容易發(fā)生消化道菌群失調(diào)，引起消化道正常微生物區(qū)系被破壞，大腸桿菌、沙 門氏桿菌等致病菌株大量繁殖引發(fā)細(xì)菌性腸炎。研宄表明，豬是最容易應(yīng)激的動(dòng)物種類，而 在集約化養(yǎng)殖過程中，斷奶又是最易誘發(fā)乳豬應(yīng)激的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。斷奶乳豬的應(yīng)激往往伴隨 乳豬生長的停滯，情況嚴(yán)重時(shí)產(chǎn)生僵豬，甚至造成乳豬死亡，給養(yǎng)豬生產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損 失。
[0003] 長期以來，抗生素在保證動(dòng)物健康、促進(jìn)生長、節(jié)省飼料和提高經(jīng)濟(jì)效益方面起著 非常重要的作用，但長期大量濫用抗生素會(huì)帶來諸多問題，如病原菌產(chǎn)生耐藥性，限制了動(dòng) 物免疫機(jī)能的發(fā)揮，降低了動(dòng)物的免疫力和抗病力，抑制動(dòng)物腸道有益菌的生長，破壞腸道 微生態(tài)平衡，限制動(dòng)物的生長。很多研宄表明，如果人類長期食用抗生素過量殘留的肉類食 品，將會(huì)使人類產(chǎn)生對(duì)抗生素的耐藥性，這不但會(huì)產(chǎn)生所謂的'耐藥寶寶'、'超級(jí)細(xì)菌'，而 且給人類健康生存帶來嚴(yán)重威脅，因此，世界上很多國家紛紛禁止或限制飼用抗生素的使 用。歐盟自2006年1月1日起，全面禁止在動(dòng)物飼料中使用抗生素，日本從2008年就開始 禁止所有抗生素動(dòng)物飼料中使用，韓國政府從2011年7月1日全面禁止在動(dòng)物飼料中添加 抗生素，而我國在飼料行業(yè)中，乳豬飼料添加劑中大量添加抗生素現(xiàn)象仍然比較普遍，造成 動(dòng)物產(chǎn)生耐藥性或抗藥性、免疫功能降低、抗病能力下降、豬肉中有抗生素殘留等問題，給 人們生活帶來了恐慌。另外，由于微量元素在動(dòng)物生長和腸道健康控制中起到非常關(guān)鍵的 作用，在飼料行業(yè)中過量添加現(xiàn)象也普遍存在，尤其是銅和鋅。而且由于傳統(tǒng)的無機(jī)微量元 素消化利用率低，過量添加必然產(chǎn)生過量排放，這不但造成浪費(fèi)，而且給環(huán)境造成污染，近 年來出現(xiàn)的海水赤潮和毒糧食現(xiàn)象都跟畜牧業(yè)有關(guān)聯(lián)。因此，提供一種腹瀉率低、消化利用 率高、采食量和生長發(fā)育較為良好適用于集約化養(yǎng)殖模式下非抗生素類環(huán)保飼料或環(huán)保飼 料添加劑顯得尤為重要。
[0004] 蕎麥全植株含有多種營養(yǎng)化學(xué)成分，包括豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、膳食纖維、礦物元 素以及植物留醇、黃酮類物質(zhì)等稀有化合物，尤其是苦蕎優(yōu)質(zhì)的氨基酸組成比例平衡，營養(yǎng) 價(jià)值明顯比小麥、玉米等其他谷類作物高得多。從蕎麥種子種分離得到的活性肽具有抗菌、 抗氧化、降膽固醇和抗腫瘤等作用。蕎麥種子蛋白含量豐富，種類較多，包括清蛋白、球蛋 白、谷蛋白和醇溶蛋白四種類型，研宄表明將蕎麥蛋白提取物水解成小的多肽片段后，能顯 著增強(qiáng)抗氧化等生理活性。 CN 101701036 A提供了一種抗真菌肽，是從苦蕎種子水溶性提取物中純化得到的， 分子量為3. 909kDa的多肽。該抗真菌肽的制備方法是取苦蕎種子粉碎，脫脂，使用緩沖 液抽提，經(jīng)抽提獲得粗蛋白后，經(jīng)過熱處理，蛋白質(zhì)層析分離即Resource S陽離子交換和 Superdex peptide凝膠排阻層析純化而獲得。該抗真菌肽對(duì)白腐菌，綠色木霉和鏈格孢霉 的生長有顯著的抑制作用。該抗真菌肽可作為食品防腐添加劑，農(nóng)作物抗真菌侵害的藥物 等，在食品防腐以及農(nóng)作物防病、抗病方面具有實(shí)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種苦蕎麥活性肽的制備方法和 應(yīng)用，通過本發(fā)明的方法獲得的苦蕎麥活性肽具有抗菌、抗氧化和吸附膽酸鹽活性，飼喂仔 豬后能提高生長性能，降低腹瀉率、死亡率。
[0006] 本發(fā)明還提供了一種苦蕎麥活性肽的制備方法，包括如下步驟： 1) 一個(gè)制備苦蕎蛋白提取物的步驟，苦蕎種子經(jīng)干燥、粉碎、脫脂得到苦蕎粉；以苦蕎 粉為原料，用硫酸銨鹽析法提取苦蕎水溶性蛋白，得到苦蕎蛋白提取物； 2) -個(gè)酶解苦蕎蛋白提取物的步驟，將步驟1)制備得到的苦蕎蛋白提取物分別經(jīng)胃蛋 白酶和胰蛋白酶依次酶解制備得到多肽酶解片段； 3) -個(gè)制備苦蕎麥活性肽的步驟，將多肽酶解片段經(jīng)過凝膠過濾進(jìn)行分離純化，紫外 檢測(cè)儀280nm檢測(cè)，并收集分離峰，即可得到苦蕎麥活性肽。
[0007] 進(jìn)一步的，在所述的一個(gè)制備苦蕎蛋白提取物的步驟中，采用硫酸銨鹽析法制備 苦蕎蛋白提取物，苦蕎籽粒經(jīng)干燥后粉碎制備得苦蕎粉，采用石油醚脫脂，將脫脂后的苦蕎 粉采用PH7. 0磷酸鹽緩沖液室溫下攪拌提取1~4小時(shí)，然后1~6 °C離心分離收集上清液， 其中離心轉(zhuǎn)速為3000~7000 r/min，離心時(shí)間為20~60 min ;向上清液中加入硫酸按使飽和 度達(dá)到80%以上，攪拌0. 5~2小時(shí)，1~6°C離心，離心轉(zhuǎn)速為3000~7000r/min，離心時(shí)間為 20~40 min，收集沉淀得苦蕎蛋白提取物。
[0008] 進(jìn)一步的，在一個(gè)酶解苦蕎蛋白提取物的步驟中，將苦蕎蛋白提取物復(fù)溶得苦蕎 蛋白水溶液，向苦蕎蛋白水溶液加入質(zhì)量百分比濃度為3~5%的胃蛋白酶酶解液，調(diào)節(jié)pH至 2. 0,30~40°C水浴震蕩酶解0. 5~1. 5小時(shí)；然后加入質(zhì)量百分比濃度為3~5%的胰蛋白酶酶 解液，調(diào)節(jié)pH至7. 5, 30~40°C水浴繼續(xù)酶解1~3小時(shí)，接著將水解液加熱至90~98°C煮3~6 分鐘終止酶解，凍干保存。
[0009] 進(jìn)一步的，在一個(gè)制備苦蕎麥活性肽的步驟中，將苦蕎蛋白酶解產(chǎn)物的凍干粉溶 解后經(jīng)凝膠色譜層析，用磷酸鹽緩沖液以0. 5~1. 2mL/min流速進(jìn)行洗脫，每18~22分鐘收集 一管，紫外檢測(cè)儀280nm檢測(cè)吸光值，收集主要分離峰，過夜透析，凍干保存。
[0010] 進(jìn)一步的，所述的磷酸鹽緩沖液的濃度為〇. 02 M，pH為7. 4。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種苦蕎麥活性肽，其氨基酸序列為絲氨酸-谷氨酸-丙氨 酸-甘氨酸-纈氨酸-蘇氨酸-谷氨酸-異亮氨酸-色氨酸。（如SEQ ID NO: 1所示。） 本發(fā)明還提供了另外一種苦蕎麥活性肽，其氨基酸序列為天冬氨酸-丙氨酸-異亮氨 酸-異亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸。（如SEQ ID NO :2所示。） 本發(fā)明還提供了上述的苦蕎麥活性肽作為飼料添加劑的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明還提供了上述的苦蕎麥活性肽作為飼料添加劑的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明通過采用硫酸銨鹽析法提取苦蕎水溶性蛋白，經(jīng)過1小時(shí)胃蛋白酶酶解和 2小時(shí)胰蛋白酶酶解制備多肽酶