專利名稱：新氨基轉(zhuǎn)移酶在氨基轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用的制作方法
L-2-氨基-4-甲基膦基丁酸(下面用L-Phosphinothricin或L-PPT表示)或它的鹽是化學(xué)容易得到的消旋體的有效成分，正如DE-OS 2939269已公開的。按照DE-OS 2717440，后者對于多種單子葉和雙子葉、一年生和多年生的雜草具有很好而且廣泛的除草劑效果。因為L-PPT和它的上述衍生物與消旋化合物相比功效強大約2倍，早就想望有一個方法能以簡單的方式、較大量地得到L-PPT。
已知L-PPT可以通過微生物的生物轉(zhuǎn)化進行生產(chǎn)(EP0248357)，在該專利申請中還提及，大腸桿菌DH-1具有氨基轉(zhuǎn)移酶，該酶可以把相應(yīng)的前物質(zhì)轉(zhuǎn)化成L-叔，L-亮氨酸和L-PPT。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌DH-1合成一種特殊的氨基轉(zhuǎn)移酶，它對于生產(chǎn)L-PPT具有意外的特異性。
本發(fā)明涉及1.一種來自大腸桿菌DH-1的氨基轉(zhuǎn)移酶，它具有——20,000至250,000道爾頓的分子量——PH3.0至8.0的等電點——PH最佳范圍為5.0至10.0——對于L-PPT，γ-氨基丁酸和谷氨酸作為氨基供體以及相應(yīng)的酮化合物作為受體的底物的特異性。
2.特征如1的氨基轉(zhuǎn)移酶的一種生產(chǎn)方法，其特征在于培養(yǎng)大腸桿菌DH-1并分離所說的氨基轉(zhuǎn)移酶。
3.具有如特性1的氨基轉(zhuǎn)移酶用作將(3-羧基-3-氧代丙基)-甲基-次膦酸轉(zhuǎn)變?yōu)長-Phosphinothricin和將琥珀酸半醛轉(zhuǎn)化成γ-氨基丁酸的應(yīng)用。
下面將詳細地說明本發(fā)明，特別是本發(fā)明的最佳實施例，此外由權(quán)利要求限定發(fā)明。
氨基轉(zhuǎn)移酶是從大腸桿菌DH-1或它的突變體或變種分離的，為此，在該微生物生長的最佳營養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)該微生物。微生物的培養(yǎng)例如在振蕩燒瓶或發(fā)酵器中在需氧、振蕩或攪拌下進行，需要時導(dǎo)入空氣或氧。發(fā)酵可以在約20℃至40℃的溫度下進行，25℃至37℃較好，最好在30℃至37℃。培養(yǎng)胨的PH范圍為5至8.5之間，最好在5.5至8.0之間。在該條件下，一般在1至3天后可以看到所提及的酶的積累，氨基轉(zhuǎn)移酶的合成在對數(shù)期的中間開始，在對數(shù)期的結(jié)束達到它的最高值。酶的產(chǎn)生可以通過HPLC分析或光度法測定活性而進行跟蹤。
生產(chǎn)該氨基轉(zhuǎn)移酶所使用的營養(yǎng)液含有0.2至5％、最好是0.5至2％的有機氮化合物以及無機鹽，作為有機氮化合物，可考慮氨基酸、胨、此外肉提取物，碾碎的種子，例如玉米、小麥、豆類、大豆或棉的種子、酒精生產(chǎn)的蒸餾殘渣、肉粉或酵母提取物。營養(yǎng)液中可以含有無機鹽，例如堿或堿土金屬、鐵、鋅或鎂的氯化物、碳酸鹽、硫酸鹽或磷酸鹽，還有銨鹽和硝酸鹽。
該酶可以通過經(jīng)典的溶菌酶溶解硫酸銨沉淀、離子交換層析和凝膠滲透色譜法實現(xiàn)其分離和純化。
該酶的特性分子量20,000至250,000道爾頓，25,000至100,000為好，最好是40,000至50,000道爾頓，等電點PH值為3.0至8.0，最好是3.5至5.5，特別是4.0至5.0。酶產(chǎn)品的最佳PH是5.0至10.0，特別是8.0至9.0。
用氣相定序分析測定精制的氨基轉(zhuǎn)移酶的N-末端最初33氨基酸為Met-Asn-Ser-Asn-Lys-Glu-Leu-Met-Gln-Arg-Arg-Ser-Gln-Ala-Ile-Pro-Arg-Gly-Val-Gly-Gln-Ile-His-Pro-Ile-Phe-Ala-Asp-Arg-Ala-Glu(Thr)-Asn-Asn(Gly)。
該氨基酸序列表明與已有文獻中已知的氨基轉(zhuǎn)移酶沒有同源性。
該氨基轉(zhuǎn)移酶可以被文獻已知的抑制劑0-(羧甲基)-羥胺所抑制。在標準試驗條件下(例3，酶活性)被大約0.1至1μm的0-(羧甲基)-羥胺抑制50％。
測定證明，該酶對于高溫出乎意料地穩(wěn)定，因此在純化時，可以利用酶在70℃連續(xù)培育10分鐘，使其它的蛋白質(zhì)由于熱變性而與該氨基轉(zhuǎn)移酶分離。
用本發(fā)明的氨基轉(zhuǎn)移酶不能生產(chǎn)20種蛋白基因氨基酸，它僅對于(3-羧基-3-氧化丙基)-甲基次膦酸以及丁二酸半醛或它們的鹽具有特異性，通過谷氨酸的氨基的轉(zhuǎn)移可以由它們生產(chǎn)無蛋白基因氨基酸L-PPT以及γ-氨基丁酸，作為相應(yīng)的酮酸酯，可以加入低級烷基(C1-C6)酯。
根據(jù)本發(fā)明，有效量的氨基轉(zhuǎn)移酶以游離或固定形式加入到氨基轉(zhuǎn)移過程中去，對于該酶的固定，可考慮已知的方法，例如在德國公開說明書3237341和3243591中描述的方法。已證實，使用醋酸乙烯酯和丁二烯乙烯-脲的共聚物具有實質(zhì)的優(yōu)點，它的表面在乙酸鹽基團水解后用環(huán)氧乙烷基團進行了改進。本發(fā)明的氨基轉(zhuǎn)移酶以高效率在該環(huán)氧乙烷上交鏈。并證明在載體上交鏈的酶非常穩(wěn)定，并且長時間也幾乎沒有酶的活性損失。其優(yōu)點還有該酶根據(jù)需要用少量的大約5μm的磷酸吡多醛進行再生。
氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)可以在一種PH范圍約為4至12，最好在8至10范圍的生理學(xué)中性溶液中進行，使得該酶沒有值得注意的陰性影響。反應(yīng)溫度可在20°～70℃范圍中變化，在較低的溫度下酶反應(yīng)過程增長，而在較高溫度下酶會失活。酶的反應(yīng)在溫度為20℃至60℃時進行，30℃至60℃較好，40℃至55℃最好。
加入谷氨酸及其鹽作為氨基供體，該氨基供體以一個等當量或?qū)Ζ?酮酸或它的酯過量加入，證明對反應(yīng)是有利的。比例從1∶1至5∶1，而1∶1至2∶1已證明是合適的。向反應(yīng)混合物中加入反應(yīng)成分可以以水溶液或固態(tài)物質(zhì)、同時或連續(xù)方式加入。
形成的產(chǎn)品可以由反應(yīng)溶液通過已知方法經(jīng)離子層析和噴霧脫水得到以下給出的實例是用于進一步解釋發(fā)明的，所給出的百分比如果沒有特別說明均以重量計例1大腸桿菌DH-1的培養(yǎng)為了得到本發(fā)明的氨基轉(zhuǎn)移酶，由一個凍于永久型的該菌種培養(yǎng)(如微生物學(xué)中通常的方式)大腸桿菌DH-1。培養(yǎng)首先在液態(tài)、滅菌的完全培養(yǎng)基中進行，生長的細菌然后在滅菌佩特利培養(yǎng)皿中涂在固體營養(yǎng)基質(zhì)上，個別的菌落接著在液體介質(zhì)中繼續(xù)培養(yǎng)。
液體培養(yǎng)基
酪蛋白胨3.5克/升肉胨3.5克/升氯化鈉 5.1克/升PH 7.5滅菌120℃，20分鐘固體培養(yǎng)基如液體培養(yǎng)基的組成一樣，再另加15克/升的瓊脂。
為了得到本發(fā)明的氨基轉(zhuǎn)移酶，在每個含有1升滅菌介質(zhì)的5升的埃倫邁厄燒瓶中，于37℃用每分鐘200轉(zhuǎn)的攪拌器在液體介質(zhì)中培養(yǎng)微生物。
在對數(shù)生長期結(jié)束時將培養(yǎng)物離心收獲，在液氮中深凍并于-80℃貯存。
例2從大腸桿菌DH-1中分離氨基轉(zhuǎn)移酶將深凍的微生物懸浮在2倍體積(2ml/g細菌)的緩沖劑A〔220mM磷酸緩沖液，20μM磷酸吡哆醛，10mM巰基乙醇(PH7.0)〕加1mM苯甲基磺酰氯(PMSF)中，并超聲溶解，細胞碎片通過離心除去，澄清的上清液通過硫酸銨沉淀分級，所需要的氨基轉(zhuǎn)移活性物是在40％到70％硫酸銨沉淀中從溶液中沉淀出并通過離心得到。在緩沖液A中重新懸浮并對50倍體積的緩沖液A進行滲析。
滲析物在1mM α-酮戊二酸(Ketoglutarat)存在下于770℃加熱10分鐘并將變性蛋白通過離心除去，澄清的上清液通過一個0.45μM膜過濾后加到具有季胺基團的瓊脂糖的陰離子交換劑(Q-Sepharose HP，Pharmacia)上，該交換劑已用緩沖劑A平衡過。未結(jié)合的蛋白通過用緩沖劑A洗液柱除去，結(jié)合的蛋白用線性梯度液(0至1.0M KCl的緩沖液A)洗提交換柱，并分組收集，氨基轉(zhuǎn)移酶可以在大約0.3M KCl下從柱中提洗出來。
合并酶的活性組分，從溶液中完全沉淀體積縮小的蛋白質(zhì)(80％飽和硫酸銨)，并通過一個分級范圍為10-400千道爾頓的凝膠過濾柱(Ultrogel ACA 44，Serva)進行分級，凝膠過濾時的推進緩沖液是20mM哌嗪-N，N′-(2-乙基磺酸)，10μM磷酸吡哆醛，5mM 2-巰基乙醇，0.1M KCl(PH7.0)在凝膠過濾以后得到的酶活性成分對25mM咪唑(PH 7.5)滲析，將所得到的具有相對應(yīng)等電點的蛋白質(zhì)在Polybuffer交換劑94(Firma Pharmacia)上用Polybuffer 74(Pharmacia)分級。本發(fā)明的氨基轉(zhuǎn)移酶在PH值為4.35時從柱上提洗出來。將酶活性成分蛋白質(zhì)完全地從溶液中沉淀出來(80％硫酸胺)，對緩沖劑A滲析，并在具有季銨基團的瓊脂糖的高效分析陰離子交換劑(Mono Q，Pharmacia)上進行色層分析(緩沖液系統(tǒng)同Q-Sepharose HP)。
在該純化步驟后，氨基轉(zhuǎn)移酶已從所有的異種蛋白中分離。
例3酶的特性——分子量大約44000道爾頓(用聚丙烯酰胺SDS-凝膠電泳法測定)——等電點PH 4.35(在Pharmacia公司的PBE 94/Polybuffer 74上通過聚焦色譜法測定)——酶活性酶活性的測定或是在存在α-酮戊二酸作為氨基受體的情況下，通過L-PPT的轉(zhuǎn)氨基作用測定(試驗1)，或通過以谷氨酸作為氨基供體由(3-羧基-3-氧代-丙基)-甲基磷酸生產(chǎn)L-PPT試驗測定(試點2)，兩個試驗提供了可對比的結(jié)果，基于比較容易實施，技術(shù)不很高的試驗1是適用的。試驗1在100mM Tris-(羥甲基)-氨基甲烷(Tris)/10μM磷酸吡哆醛(PH 7.5)中將10mM PPT，10mM α-酮戊二酸在30℃下保溫30分鐘。生成的谷氨酸可按照Enzymology 113卷PP 245 ff中的方法，通過以后與谷氨酸脫氨酶的反應(yīng)被確定。試驗2除用10mM(3-羧基-3-氧代-丙基-甲基-次膦酸)，10μM谷氨酸代替PPT和α-酮戊二酸外，其余和試驗1相同，用一種氨基酸分析儀證明生成的L-PPT。
用這些試驗測得純化蛋白質(zhì)的特異酶活性為265nkat/mg蛋白質(zhì)(1katal＝每秒轉(zhuǎn)變1Mol)——這樣測定酶反應(yīng)的最佳PH在約9，溫度約為55℃?！@種純化的氨基轉(zhuǎn)移酶N-端最初的40個氨基酸序列經(jīng)氣相定序儀測定如下Met-Asn-Ser-Asn-Lys-Glu-Leu-Met-Gln-Arg-Arg-Ser-Gln-Ala-Ile-Pro-Arg-Gly-Val-Gly-Gln-Ile-His-Pro-Ile-Phe-Ala-Asp-Arg-Ala-Glu(Thr)-Asn-Asn(Gly)-20。
例4用純化的氨基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)L-PPT。
純化的氨基轉(zhuǎn)移酶以0.1mg/ml的濃度(特別是酶活性為15U/mg的蛋白質(zhì))在50mM Tris/10μM磷酸吡哆醛(PH 9.0)中與30g/l鈉-(3-羧基-3-氧代-丙基)-甲基次磷酸和60g/l，L-谷氨酸于55℃下保溫。在0至24小時的保溫時間采取樣品，取樣后在95℃將酶滅活10分鐘，離心并將上清液在氨基酸分析儀中檢查形成的L-PPT。所達到的轉(zhuǎn)化率為16.6g L-PPT/升/小時。提高酶的濃度可以明顯提高收率。
反應(yīng)結(jié)束后，加入的α-酮酸的94.3％轉(zhuǎn)變成L-PPT(28.3g/l)。
例5氨基轉(zhuǎn)移酶的固定為了固定氨基轉(zhuǎn)移酶，使用一種實例2部分純化的酶成分。在該酶制劑中，氨基轉(zhuǎn)移酶占總蛋白量的20％，其酶活性為76.4nkat/ml(1kat＝1 katal＝Mol轉(zhuǎn)化/秒)。
在1M磷酸鉀緩沖液(PH＝8.0)中將47ml該氨基轉(zhuǎn)移酶制劑加到8g聚合物載體VA-Epoxy Biosynth(Riedelde Haёn生產(chǎn)的一種注冊商標)上并在室溫下?lián)u晃2天。在用1. 50mM磷酸鉀緩沖液PH 7.0，2. 1M磷酸鉀緩沖液PH 8.0和3. 50mM磷酸鉀緩沖液PH 7.0沖洗后獲得31克濕樹脂。
將樹脂與10mM 2-巰基乙醇(在50mM磷酸鉀緩沖液中)保溫1小時使多余的環(huán)氧乙烷轉(zhuǎn)化。
該載體樹脂呈現(xiàn)1975 nkat的結(jié)合酶活性(64nkat/g濕樹脂)，達到55％的結(jié)合率。
在50mM磷酸鉀緩沖液中(PH 7.0)與0.02％疊氮化鈉一起在4℃下貯存。
例6用固定化氨基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)L-PPT將例5的結(jié)合了的氨基轉(zhuǎn)移酶加入到一個柱式反應(yīng)器中，來生產(chǎn)L-PPT。為此，用固定化的氨基轉(zhuǎn)移酶充填20ml的層析柱，將柱恒溫于42℃，以0.5ml/分的流率從柱上泵入底物溶液(20g/l 3-羧基-3-氧代-丙基-甲基-次磷酸(Keto-PPT)/60g/l L-谷氨酸/10μM磷酸吡哆醛PH 8.0)。在通過該柱后，加入的keto-PPT有90.4％轉(zhuǎn)化為L-PPT。
權(quán)利要求
1.氨基轉(zhuǎn)移酶在氨基轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用，其特征在于，使用提純了的得自大腸桿菌DH-1(ATCC33849)的且具有下列性質(zhì)的氨基轉(zhuǎn)移酶——分子量為20,000至250,000道爾頓，——等電點pH為3.0至8.0，——pH最佳范圍為5.0-10.0，——一種底物的特異性，以進行下述氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)(3-羥基-3-氧代-丙基)-甲基-次膦酸或其酯轉(zhuǎn)氨基生成L-PPT，琥珀酸半醛或其酯轉(zhuǎn)氨基生成γ-氨基丁酸，其中用谷氨酸作為氨基供體。
2.如權(quán)利要求1的應(yīng)用，其特征在于，氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)在20℃至60℃進行。
3.如權(quán)利要求1的應(yīng)用，其特征在于，氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)在pH為4至12下進行。
4.如權(quán)利要求1的應(yīng)用，其特征在于，該氨基轉(zhuǎn)移酶是以固定化了的形式加入。
5.如權(quán)利要求4的應(yīng)用，其特征在于，醋酸乙烯酯和丁二烯乙烯-脲的共聚物作為載體物質(zhì)被加入。
全文摘要
新的氨基轉(zhuǎn)移酶在氨基轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用,可以從大腸桿菌DH－1分離出一種氨基轉(zhuǎn)移酶。在該酶的作用下,可以以很好的效果將谷氨酸的氨基轉(zhuǎn)移,從相應(yīng)的原料生產(chǎn)L－PPT和γ－氨基丁酸。
文檔編號C12N9/10GK1250101SQ9911195
公開日2000年4月12日 申請日期1999年8月4日 優(yōu)先權(quán)日1988年6月3日
發(fā)明者阿諾·舒爾茨, 克勞斯·巴茨, 多米尼克·提普埃爾, 克勞斯·索伯 申請人:赫徹斯特股份公司