專利名稱：激活目的基因的組合物和方法
相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求1997年6月25日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/050,772的優(yōu)先權(quán)。
本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及特別是在靶基因存在下激活目的基因的方法和組合物。
本發(fā)明的背景癌癥治療的本質(zhì)和基本方法一直是變化的。目前，局部癌癥治療后常規(guī)是輔助性化療?，F(xiàn)在的臨床方案中正在探索基因療法，免疫系統(tǒng)操縱，正常造血因子的激活，在腫瘤組織中誘導(dǎo)分化，以及血管形成的抑制。這些新領(lǐng)域的研究已經(jīng)用于非惡性疾病。
同時(shí)，新的臨床方案有狹窄的治療指數(shù)并且有很大可能導(dǎo)致有害的副作用。完整的理解藥理學(xué)，藥物相互作用，及臨床藥物動(dòng)力學(xué)對(duì)于安全和有效的用于人體是必需的。
病毒感染的治療正處于萌芽階段。典型的使用藥物諸如利用了感染的生物體與其宿主代謝的差別的抗生素來(lái)治療細(xì)菌感染。然而，病毒大部分使用宿主自身的酶完成復(fù)制，從而很少有機(jī)會(huì)進(jìn)行藥物干涉。通過(guò)使用強(qiáng)調(diào)節(jié)元件，病毒利用宿主基因?qū)崿F(xiàn)其自身基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。
在哺乳動(dòng)物中，天然的由細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞對(duì)抗病毒感染，它在宿主細(xì)胞表面表達(dá)時(shí)識(shí)別病毒蛋白質(zhì)，并裂解感染的細(xì)胞。破壞感染的細(xì)胞阻止了病毒的進(jìn)一步復(fù)制。其它的防御包括表達(dá)抑制蛋白質(zhì)合成和病毒芽殖的干擾素，以及表達(dá)從體液中清除游離病毒顆粒的抗體。但是，這些天然機(jī)制的誘導(dǎo)需要將病毒蛋白質(zhì)暴露于免疫系統(tǒng)。許多病毒顯示休眠或潛伏期，在此時(shí)期很少或不進(jìn)行蛋白質(zhì)合成。在這種時(shí)期對(duì)免疫系統(tǒng)而言病毒感染實(shí)際上是不可見(jiàn)的。
逆轉(zhuǎn)錄病毒具有RNA鏈的基因組感染形式。感染時(shí)，RNA基因組反轉(zhuǎn)成DNA，典型地隨后在隨機(jī)位點(diǎn)整合到宿主染色體DNA。當(dāng)整合發(fā)生在截短的編碼關(guān)鍵的細(xì)胞受體或生長(zhǎng)因子的位點(diǎn)，或?qū)⑦@類基因置于強(qiáng)病毒順式作用調(diào)節(jié)元件的控制下，將導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化成惡性狀態(tài)。
由于它們的反式作用調(diào)節(jié)元件對(duì)宿主調(diào)節(jié)序列的作用，病毒可能是致癌的。事實(shí)上，致癌性是導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)第一個(gè)已知感染人體的逆轉(zhuǎn)錄病毒的特征。在感染成人T-細(xì)胞白血病(ATL)病人的血細(xì)胞中鑒定了HTLV-I和HTLV-II(人嗜T-淋巴細(xì)胞病毒I和II)，相信通過(guò)它們的反式激活因子對(duì)淋巴細(xì)胞啟動(dòng)子區(qū)域的作用誘導(dǎo)致瘤性轉(zhuǎn)化。亦發(fā)現(xiàn)另外兩種逆轉(zhuǎn)錄病毒感染人體。這些病毒，HIV-I和HIV-II，是愛(ài)滋病的病原體。
現(xiàn)在對(duì)HIV感染的治療方法包括叫作蛋白酶抑制劑的新藥物。當(dāng)與其它抗病毒復(fù)合物諸如AZT一起使用時(shí)，這些藥物能顯著降低血液中HIV水平。同時(shí)，在免疫系統(tǒng)防御多肽分子中叫作趨化因子的天然武器顯示出是HIV的頸敵。
反義寡聚脫氧核苷酸已經(jīng)推薦為重要的一類新藥物。簡(jiǎn)言之，反義是指使用類似單鏈DNA的小的合成的寡核苷酸抑制基因表達(dá)。基因表達(dá)是依據(jù)Watson-Crick堿基配對(duì)即腺嘌呤和胸腺嘧啶或者鳥嘌呤與胞嘧啶通過(guò)氫鍵相互作用通過(guò)與特定靶信使RNA(mRNA)中編碼(有義)序列的雜交實(shí)現(xiàn)抑制的。
依據(jù)控制反義寡聚脫氧核苷酸和細(xì)胞RNA相互作用的簡(jiǎn)單堿基配對(duì)法則，可以設(shè)計(jì)靶向任何已知序列基因的分子。這種策略的主要優(yōu)勢(shì)在于作用的潛在特異性。理論上，可以設(shè)計(jì)靶向整個(gè)人類基因組中任何單個(gè)基因的反義分子，可能制造出已知致病基因的任何疾病的專一性藥物。結(jié)果是，存在多種反義寡聚脫氧核苷酸(ODN)活性的應(yīng)用物用于可能的抗病毒和抗癌應(yīng)用。
反義ODN提供了阻礙細(xì)胞中特定基因表達(dá)的可能性。雖然有許多在培養(yǎng)細(xì)胞中明顯反義抑制基因表達(dá)的報(bào)道，但只在很少的情況下嚴(yán)格證明了專一性抑制。在許多研究中，專一性是從反義的生物學(xué)作用與對(duì)照ODN的比較推導(dǎo)的，沒(méi)有測(cè)定靶RNA或蛋白質(zhì)的水平來(lái)評(píng)價(jià)專一性。反義技術(shù)不想要的副反應(yīng)可能通過(guò)多種機(jī)制發(fā)生。
目前正在認(rèn)真研究寡聚核苷酸作為基因表達(dá)調(diào)節(jié)子的可能性。多數(shù)的努力集中于抑制諸如癌基因或病毒基因等靶基因的表達(dá)。寡聚核苷酸靶向RNA(反義寡核苷酸)或DNA，形成三鏈結(jié)構(gòu)抑制RNA聚合酶II的轉(zhuǎn)錄。為了達(dá)到所需的作用，寡核苷酸必須通過(guò)有效防止其從頭合成來(lái)促進(jìn)先存的不需要的蛋白質(zhì)的衰變。
因而需要開發(fā)比以前研究所用方法更有效，可靠和特異的新反義方法。
本發(fā)明的總結(jié)提供了激活目的基因表達(dá)的組合物和方法。組合物是含有雙鏈核苷酸序列的反義隱藏表達(dá)盒。第一條鏈含有一段伸出臂的(armed)表達(dá)盒，即連接在側(cè)翼序列下游的編碼目的蛋白質(zhì)的RNA分子并且在RNA序列上游可操作的插入翻譯起始點(diǎn)。側(cè)翼序列編碼靶分子。也就是說(shuō)，側(cè)翼序列編碼靶基因或編碼感興趣的RNA。側(cè)翼序列對(duì)應(yīng)于靶的“有義”鏈。同時(shí)提供了能與第一條核苷酸序列的側(cè)翼序列雜交的第二條核苷酸鏈，即反義鏈。結(jié)合時(shí)反義鏈掩蓋了翻譯起始點(diǎn)。可設(shè)計(jì)側(cè)翼序列使反義序列與側(cè)翼序列沒(méi)有100％同源性。這樣，存在靶核苷酸分子時(shí)，反義鏈傾向于與靶互補(bǔ)結(jié)合。此時(shí)，反義鏈從伸出臂的鏈解離并與靶配對(duì)。反義鏈的解離暴露出核糖體結(jié)合位點(diǎn)使伸出臂的盒在靶的存在下翻譯。
發(fā)現(xiàn)該組合物可用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)，治療疾病，以及阻止致瘤細(xì)胞的增殖。另外，該組合物在植物和動(dòng)物學(xué)應(yīng)用中也可廣泛使用。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1提供了作為抗病毒藥物的掩藏靶向表達(dá)盒的示意圖。
圖2提供了有義鏈靶序列與反義鏈完全互補(bǔ)的掩藏靶向表達(dá)盒的示意圖。
圖3提供了具有用于增加靶特異性的多聯(lián)體幾何結(jié)構(gòu)的掩藏表達(dá)盒的示意圖。
圖4提供了具有需要定量閾值的靶分子以起始所需基因翻譯的多聯(lián)體幾何結(jié)構(gòu)的掩藏靶向表達(dá)盒的示意圖。
圖5提供了增加緊湊度和降低粘度的環(huán)狀掩藏靶向表達(dá)盒的示意圖。
圖6提供了增加緊湊度的莖環(huán)掩藏靶向表達(dá)系統(tǒng)的示意圖。
圖7提供了產(chǎn)生靶向盒有義鏈的構(gòu)建體實(shí)施例。
圖8提供了使用掩藏靶向表達(dá)盒的體外實(shí)驗(yàn)的示意圖。
本發(fā)明的詳細(xì)描述后面將參照優(yōu)選實(shí)施方案更完整的描述本發(fā)明。本發(fā)明可通過(guò)不同形式實(shí)施而不應(yīng)認(rèn)為限于此處敘述的實(shí)施方案；更確切地，提供的實(shí)施方案是使本公開物將本發(fā)明的范圍傳遞給本技術(shù)領(lǐng)域熟練人員。
提供了控制目的基因表達(dá)的組合物和方法。通過(guò)使用與靶分子反義的寡核苷酸調(diào)節(jié)表達(dá)。此方式下，目的基因只在對(duì)應(yīng)于靶分子的RNA或DNA存在時(shí)表達(dá)。
該方法涉及使用一種反義掩藏表達(dá)盒。反義掩藏表達(dá)盒設(shè)計(jì)為雙鏈核酸分子。第一條鏈含有連接到側(cè)翼序列下游的目的蛋白質(zhì)的RNA分子。側(cè)翼序列含有一段靶基因部分有義序列的核苷酸序列。第一條鏈還在側(cè)翼序列下游含有一個(gè)翻譯起始點(diǎn)。需要認(rèn)識(shí)到插入核糖體結(jié)合位點(diǎn)的部位可以是變化的?？蛇x地，可包括7個(gè)甲基鳥嘌呤帽子以穩(wěn)定分子。參看圖1。
掩藏表達(dá)盒的第二條鏈含有對(duì)應(yīng)于靶基因或序列的反義寡核苷酸。也就是說(shuō)，反義序列至少部分與側(cè)翼序列包含的靶序列互補(bǔ)。反義寡核苷酸可以是RNA分子，DNA分子或其混合物。第二條反義鏈與第一條鏈的相應(yīng)側(cè)翼序列結(jié)合形成的雙鏈體排斥了對(duì)下游序列包括翻譯起始點(diǎn)，目的序列或兩者都有的核糖體掃描。因而，通過(guò)反義鏈與側(cè)翼序列的結(jié)合掩藏了目的蛋白質(zhì)的翻譯和表達(dá)。從側(cè)翼序列置換反義鏈中斷對(duì)目的蛋白質(zhì)表達(dá)和翻譯的掩藏。
目的蛋白質(zhì)可依據(jù)組合物的用途變化。例如，當(dāng)掩藏盒示意圖作為抑制致瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制時(shí)，目的蛋白質(zhì)可選自毒素蛋白質(zhì)，細(xì)胞因子，細(xì)胞調(diào)節(jié)子，或類似物。另外，RNA分子可以是非編碼RNA，諸如具有RNA酶活性的RNA。
已知多種毒素蛋白質(zhì)可用于本發(fā)明。它們包括核糖體滅活劑，假單胞桿菌外毒素A(Pseudomonas exotoxin A)(Chandhary等，(1990)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem)26516303-16310)；細(xì)胞代謝破壞劑，諸如核糖核酸酶(參看例如，Mariani等，(1990)自然(Nature)347737-741)；芽胞桿菌RNA酶毒素(Barnase toxin)，從假單胞桿菌外毒素A和核糖核酸酶衍生的嵌合毒素(Prior等，(1990)，細(xì)胞(Cell)64；1017-1023)；百日咳毒素(Pertussis)(接收號(hào)M14378M16494，Micosia等(1986)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)834631-4635)；霍亂毒素(Cholera)(Dams等，(1991)生化與生物物理學(xué)報(bào)(Biochim，Biophys，Acta)1090139-141)；白喉毒素(Diphtheria)，蓖麻毒素(Gelfand等，EP 0335476-A2)；等等。另外，來(lái)自皰疹序列的胞腺嘧啶激酶可用作毒素或效應(yīng)分子。在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄使它對(duì)9-(1，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤(gancyclovir)敏感。這樣，可標(biāo)記目的細(xì)胞并隨后在兩步系統(tǒng)中破壞細(xì)胞。
可使用含有上述毒素序列的掩藏盒靶向和破壞任何細(xì)胞，器官，生物體或物種；前提是可鑒定出對(duì)這些細(xì)胞器官，生物體或物種特異的靶序列。例如，可使用表達(dá)盒選擇性靶向和消滅脊椎動(dòng)物環(huán)境。有害動(dòng)物。這類有害動(dòng)物包括農(nóng)業(yè)有害動(dòng)物包括澳大利亞的狐貍和野兔。
可使用盒選擇性破壞感染病毒的細(xì)胞。在這一方面，靶序列包含病毒特異性序列，而目的蛋白質(zhì)是如上所述的毒素。
掩藏盒可用于治療多種疾病。這類疾病包括，但不限于涉及過(guò)度活化器官諸如亢進(jìn)活性的甲狀腺的疾病。在這一方面，掩藏盒包括一段甲狀腺特異性靶序列和如上所述的蛋白質(zhì)毒素。
這種盒可用于治療涉及缺陷基因的疾病。在這一方面，靶序列含有缺陷mRNA序列，而目的序列含有正常蛋白質(zhì)序列。想得到的效應(yīng)是雙重的。反義鏈與缺陷mRNA的結(jié)合可停止缺陷蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，而目的序列的表達(dá)導(dǎo)致正常蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。
這種盒可用于在缺乏某蛋白質(zhì)的器官中產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)。在這一方面，靶序列含有器官特異性序列，而目的序列含有該器官中缺乏的蛋白質(zhì)的序列。
本發(fā)明亦可用于測(cè)定靶分子存在的檢測(cè)系統(tǒng)。在這種情況下目的蛋白質(zhì)將是一種易于通過(guò)例如簡(jiǎn)單的細(xì)胞染色或酶檢測(cè)測(cè)定的報(bào)告蛋白質(zhì)。這類報(bào)告序列包括但不限于β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)，葡糖醛酸酶(GUS)，等等。
盒中亦包括一個(gè)翻譯起始點(diǎn)。這類序列在本技術(shù)領(lǐng)域?yàn)槿耸熘⑶野↘ozak序列。參看例如，Kozak，Marilyn(1988)分子和細(xì)胞生物學(xué)(Mol.andCell Biol.)，82737-2744；Kozak，Marilyn(1991)生物化學(xué)雜志(J.Biol，Chem)，26619867-19870；Kozak，Marilyn(1990)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc Natl.Acad.Sci.USA)，878301-8305；Kozak，Marilyn(1989)細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell Biol.)，108229-241；以及它們引用的文獻(xiàn)。這些文獻(xiàn)并于此處。
可將翻譯起始點(diǎn)插入到對(duì)應(yīng)于目的基因的序列的上游?？蓪ozak序列設(shè)計(jì)為能在所有3個(gè)閱讀框起始翻譯。參看例如，Murphy和Efstratiadias(1987)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，848277-8281。通常，Kozak序列將包含識(shí)別為在高等真核生物中的起始的共有序列。這種共有序列是GCCGCCAGCCAUGG。在Kozak序列中這種共有序列重復(fù)多次，以提供在所有三種閱讀框中的翻譯起始。
Kozak序列的長(zhǎng)度是可變的。一般而言，增加前導(dǎo)序列的長(zhǎng)度增強(qiáng)翻譯。
已認(rèn)識(shí)到在適當(dāng)時(shí)候亦可使用原核翻譯起始點(diǎn)；例如靶向原核生物時(shí)。這類序列包括Shine-Dalgamo序列(UAAGGAGG)，典型地在起始子AUG上游5-10個(gè)堿基。
側(cè)翼序列含有對(duì)應(yīng)于靶基因或序列的一段序列。也就是說(shuō)，側(cè)翼序列包括靶分子的全部或部分有義鏈并且可能是RNA或DNA。有義鏈意思是指能與反義部分雜交的序列，該反義部分當(dāng)靶是基因時(shí)能夠與靶表達(dá)的信使RNA雜交或與靶RNA或DNA分子雜交。
側(cè)翼序列長(zhǎng)度可變。已認(rèn)識(shí)到其長(zhǎng)度可根據(jù)靶基因的長(zhǎng)度和豐度，以及反義部分對(duì)靶的特異性和親合性而變化?？墒褂玫膫?cè)翼序列的長(zhǎng)度通常在大約10至大約200核苷酸，優(yōu)選地大約20至大約150核苷酸，更優(yōu)選地大約40至大約100核苷酸范圍變化。
側(cè)翼序列可以是天然存在的或合成的序列。當(dāng)序列是合成的，可在結(jié)構(gòu)中摻入錯(cuò)配核苷酸，以促進(jìn)靶分子對(duì)反義分子的熱力學(xué)取代。已認(rèn)識(shí)到如果將翻譯起始點(diǎn)插入到側(cè)翼序列，這種序列插入將提供非雜交序列并進(jìn)一步降低側(cè)翼序列和反義寡核苷酸之間的同源性。雖然認(rèn)識(shí)到高至100％的同源性可與設(shè)計(jì)的反義鏈從側(cè)翼序列的置換相兼容，但通常預(yù)設(shè)低于90％的同源性，優(yōu)選地大約75％同源性，更優(yōu)選地大約65％同源性。
已知7-甲基鳥嘌呤(TMeG)帽子增加翻譯的效率。因而，可在側(cè)翼序列的5′端包括這樣一個(gè)7-甲基鳥嘌呤帽子。參看例如，Shatikin，A.J.(1976)細(xì)胞(Cell)，9645-653；Malone等(1989)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，866077-6081；Fuerst和Mossc 1989)分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)，206333-348和Kozcok，Marilyn(1991)基因表達(dá)(GeneExpression)，1117-125。
本發(fā)明表達(dá)盒反義序列的構(gòu)建是為了與目的核苷酸序列雜交。這類目的核苷酸序列包括來(lái)自靶基因的信使RNA，病毒RNA或DNA等等。反義鏈構(gòu)建為與靶同源。通常，這種同源性高于反義鏈與側(cè)翼序列的同源性。因而，存在靶分子時(shí)，反義鏈從盒的側(cè)翼序列取代并與靶分子雜交。為了增強(qiáng)取代，盒可構(gòu)建為反義序列比側(cè)翼序列長(zhǎng)，提供3′或5′不配對(duì)突出端或“粘末端”與靶分子結(jié)合。此粘末端將增強(qiáng)反義寡核苷酸的替換。
如上面討論，靶分子是可變的。為了治療惡性或致瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，靶分子將對(duì)應(yīng)于只在致瘤細(xì)胞表達(dá)或存在的核苷酸。這種情況下，表達(dá)盒的目的序列將編碼一種毒素蛋白質(zhì)，它在靶存在時(shí)表達(dá)以殺死細(xì)胞。表達(dá)盒也可編碼一種細(xì)胞因子或干擾素來(lái)對(duì)抗腫瘤性生長(zhǎng)。有些情況下，可提供編碼不同蛋白質(zhì)的表達(dá)盒的組合。靶分子可以是基因。本技術(shù)領(lǐng)域已知多種靶基因。這類基因包括c-myc，n-myc，c-myb，c-abl，c-kit，c-mos，bcr-abl，bcl-2，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤-1(retinoblastoma-1)，P-53，GM-CSF，G-CSF，Ick，IGF-1，egr-1(A.Krieg，免疫方法(Immuno Methods)1，191(1992))；c-fes CS.Ferrari等，細(xì)胞生長(zhǎng)分化(Cell Growth Differ.)1，543(1990))；c-fms(J.Wu等，癌基因(Oncogene)5,873(1990))；c-fos(A.Block等，in(77).PP.63-70)；N-ras(T.Skorski等，實(shí)驗(yàn)藥物雜志(J.Exp.Med.)175，743(1992))；Ha-ras(T.Saison-Behmoaras等，EMBO J.MD.，1111(1991))；B-myb(M.Arsura等，血液(Blood)79，2708(1992))；CSF-1(M.Birchenall-Roberts等，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)145，3290(1990)；Myeloblastin(D.Bories等，細(xì)胞(Cell)59，959(1988)；紅細(xì)胞生成素基因(Erythropoietin)(O.Hermine等，血液(Blood)78，2253(1991))；MZF-1(L′.Bavisotto等，實(shí)驗(yàn)藥物雜志(J.Exp.Med.)174，1097(1991)；mdr 1(L.Rivoltini等，Int.J.Cancer 46，727(1990)；IGF-1受體(P.Porcu等，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)12，5069(1992))；生長(zhǎng)激素(P.Weinent，J.Blalock，R，LeBoeuff，內(nèi)分泌學(xué)(Endocrinology)128，2053(1991))；EGR-1(L，Neyses，JNouskas，H.Vetter，生化生物物理研究通訊(BiochemBiophys.Res.Commun.)181，22(1991))；G蛋白質(zhì)(Supra(1992))；MHC-1#(M.Cambe等，抗癌藥物設(shè)計(jì)(Anti-Cancer Prug Des.7 7,341(1992))；血緊張素原基因(Angiotensinogen)(J.Cook等，反義研究開發(fā)(Antisense Res.Dev.)2，199(1992)；Myogenin(A.Brunetti等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)265，13435(1990))；LH受體**(A.West和B.Cooke，分子細(xì)胞內(nèi)分泌學(xué)(Moll.Cell.Endocrinol.179，R9(1991))；細(xì)胞視黃醇結(jié)合蛋白I，F(xiàn).Cope，J.Wille，L.D.Tomei，in(77)，PP.125-142；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)(A.Witsell和L.Schook，英國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)89，4754(1992))。
靶分子包括但不限于CD4基因，參看接收號(hào)X87579；CFTR基因(Varon等(1995)人類分子遺傳(Hum.Mol.Genet)41463-1464)；人C3d/Epstein-Barr病毒受體(Fujisaku等，U989)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)2642118-2125)；人主要組織相容性復(fù)合體I CD8 α-鏈基因(接收號(hào)M27 161，Nakayama等(1989)免疫遺傳學(xué)(Immunogenetics)30393-397；人彈性蛋白酶2mRNA(接收號(hào)M16631)，F(xiàn)letcher等(1987)生物化學(xué)(Biochemistry)267256-7261)；人彈性蛋白mRNA(接收號(hào)M36860，F(xiàn)azio等，(1988)J.Invest.Dermatol，91458-464)；人細(xì)胞間粘附分子1基因(接收號(hào)U86814)；人白介素1-β轉(zhuǎn)變酶同I βmRNA(接收號(hào)U13697 Alnemri等(1998)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)2704312-4317)；人免疫球蛋白Cmu-Cdelta基因座(接收號(hào)X57331，Word等(1989)Int.Immunoll296-309)；人白介素2基因(接收號(hào)J00264，Maeda等(1983)生化與生物物理研究通訊(Biochem，Biophys，Res.Commun.)1151040-1047；Fujita等(1983)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc，Natl，Acad.Sci.USA807437-7441)；人主要組織相容性復(fù)合體I抗原人類白細(xì)胞抗原-B(接收號(hào)U88407)；人主要組織相容性復(fù)合體II人類白細(xì)胞抗原-DPA1抗原(接收號(hào)U87556)；等等，以參考文獻(xiàn)并于此處。
類似地，靶分子可以是來(lái)自病毒的RNA或DNA。在這種狀況下可抑制病毒復(fù)制和生長(zhǎng)。這類病毒基因包括但不限于來(lái)自下列病毒的序列，柯薩奇病毒(Marquardt和Ohlinger(1995)病毒學(xué)方法雜志(J.Virol.Methods)53189-199)；登草熱病毒，參看接收號(hào)U88535；腦炎病毒，參看接收號(hào)AB001026；埃博拉病毒(Sanchez等(1989)病毒學(xué)(Virology)17081-91，接收號(hào)L11365)；非淋淋巴細(xì)胞瘤病毒(Baer等(1984)自然(Nature)310207-211)；?？刹《?2(Huttunen等(1996)J.Gen.Virol.77715-725)；腸道病毒(VP4-VP2衣殼3DRNA聚合酶基因Pulli等(1995)病毒學(xué)(Virology)21230-38)；甲型流感病毒(Guan等，(1996)病毒學(xué)雜志(J.Virol.)708041-8046)；乙肝病毒(Fukuda等(1995)傳染性疾病雜志(J.Infect.Dis.)1721191-1197)；丙肝病毒(Hitomi等(1995))病毒免疫學(xué)(Viral Immunol.)8109-119)；D型肝炎病毒(Khudyakov等(1993)病毒研究(Virus Res.)2713-247；E型肝炎病毒(Tam等(1990)科學(xué)(Science)2471335-1449，接收號(hào)M32400)；G型肝炎病毒(接收號(hào)U86023)；人免疫缺陷病毒(接收號(hào)U04908，Gao等(1996)病毒學(xué)雜志(J.Virol)701651-1667)；人乳頭瘤病毒(接收號(hào)U37537，Wu等(1993)Lancet 341522-524)；甲型流感病毒(接收號(hào)U86987)；人鼻病毒(接收號(hào)D00239，Hughes等(1988)J.Gen.Virol.6949-58)；仙臺(tái)病毒(接收號(hào)D00053，Morgan和RakeStraw(1986)病毒學(xué)(Virology)15431-40)胃腸炎病毒TFI病毒粒子蛋白質(zhì)基因(接收號(hào)Z35758；Chen等(1995)病毒研究(Virus Res.)3883-89)；單純皰疹2型病毒(接收號(hào)Z86099，Mc Geoch等(1987)J.Gen Vird.6819-38)；委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(接收號(hào)L01442，Kinney等(1986)病毒學(xué)(Virology)152400-413)；以參考文獻(xiàn)并于此處。
其它目的基因包括例如巨細(xì)胞病毒的.jun，bFGF，wnt-1，TGF-beta，spi-1；單純皰疹病毒1型和2型的NDR，c-erbB-2；人乳頭瘤病毒的bcl-2和bci-abl；乙肝的P53和c-myb；流感病毒的l-myc和ras；等等。
構(gòu)建掩藏表達(dá)盒的方法一般是本技術(shù)領(lǐng)域現(xiàn)有的。參看例如Sambrook等，冷泉港，紐約。可依據(jù)已知技術(shù)制備RNA/DNA分子以及反義寡核苷酸。參看例如美國(guó)專利號(hào)5,149,797；5,175,273；Uhlmann和Peyman(1990)Chem.Rev.，90543-584及它們引用的文獻(xiàn)。反義寡核苷酸是能與靶分子互補(bǔ)結(jié)合的脫氧核糖核酸或核糖核酸。這種反義寡核苷酸可能是至少一個(gè)或所有核苷酸間橋聯(lián)磷酸酯殘基是修飾的磷酸酯，諸如膦酸甲酯，硫代膦酸甲脂，嗎啉磷酸酯(phosphoromorpholidates)，哌嗪磷酸酯(phosphoropiperazidates)和氨基磷酸酯。舉例，某些例如每隔一個(gè)的核苷酸間橋聯(lián)磷酸酯殘基可以是如上所述修飾的。在另一個(gè)例子中，這種反義寡核苷酸是至少一個(gè)或全部核苷酸含有2′-低級(jí)烷基組分(例如C1-C4，線性或分枝，飽和或不飽和烷基，諸如甲基，乙基，乙烯基，丙基，1-丙烯基，2-丙烯基，和異丙基)的核苷酸。亦可參看Furdon等(1989)核酸研究(Nucleic Acids Res.)，179193-9204；Agrawal等(1990)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，871401-1405；Baker等(1990)核酸研究(Nucleic Acids Res.)，183537-3543；Sproat等(1989)核酸研究(Nucleic Acids Res.)，173373-3389；Walder和Walder(1988)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，855011-5015。
磷酸二酯骨架的修飾顯示賦予穩(wěn)定性并且可能提供增強(qiáng)的親合性以及增強(qiáng)ODN的細(xì)胞穿入。另外，可利用化學(xué)方案用新的連接取代整個(gè)磷酸二酯骨架?？赏ㄟ^(guò)自動(dòng)ODN合成制備硫代磷酸脂和膦酸甲脂修飾的ODN。
可以合成二硫代磷酸脂形式的硫代磷酸脂。在二硫代酯連接中，非橋聯(lián)的氧原子可由硫取代。這種連接是高度抗核酸酶的。
亦可使用糖修飾增強(qiáng)分子的穩(wěn)定性和親合性。與天然β-異頭物相比，2′-脫氧核糖糖的α-異頭物的堿基翻轉(zhuǎn)。含有α-異頭物糖的ODN對(duì)核酸酶降解是抗性的。
如果需要，可修飾靶向盒來(lái)增加體內(nèi)穩(wěn)定性。因而，可使用抗核酸酶寡核苷酸，諸如PS和MP寡核苷酸。參看例如，Miller，P.(1991)生物技術(shù)(Biotechnology)，9358和Stein等(1991)藥物治療(Pharmacol Ther.)，52365。
可以容易和大量的合成本發(fā)明的靶向表達(dá)盒。亞磷酰胺化學(xué)的發(fā)展及其精心制成自動(dòng)技術(shù)大大加強(qiáng)了用它合成寡聚物的容易程度并從而容易獲得它們。參看例如，Beaucage和Caruthers(1981)Tetra hedron Lett.，373557以及Zon和Geiser(1991)抗癌藥物設(shè)計(jì)(Anti-Cancer Drug Des.)，6539。
本發(fā)明的方法，寡核苷酸和制劑有多種用途。它們可用于阻止致瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。本發(fā)明的方法，寡核苷酸和組合物亦可在治療疾病中用作治療藥物。亦發(fā)現(xiàn)他們可用于需要一種調(diào)節(jié)需在特定時(shí)間或任何所需時(shí)期表達(dá)的基因的表達(dá)的方法的發(fā)酵工藝中來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)。
術(shù)語(yǔ)“反義寡核苷酸”包括其生理和藥物可接受鹽類即保持親本化合物的所需要的生物學(xué)活性并且不引入不需要的毒理效應(yīng)的鹽。這類鹽的例子是(a)與陽(yáng)離子諸如鈉，鉀，亞精胺等形成的鹽；(b)與無(wú)機(jī)酸例如鹽酸，氫溴酸，硫酸，磷酸，硝酸等形成的酸加成鹽；(c)與有機(jī)酸諸如乙酸，草酸，酒石酸，琥珀酸，順丁烯二酸，反丁烯二酸，葡糖酸，檸檬酸，蘋果酸，抗壞血酸，安息香酸，丹寧酸，棕櫚酸，褐藻酸，聚谷氨酸，萘磺酸，甲磺酸，對(duì)-甲苯磺酸，萘二磺酸，聚半乳糖醛酸(polygalacturonic acid)等等形成的鹽；以及(d)從元素陰離子諸如氯，溴，碘形成的鹽。
本發(fā)明的制劑將掩藏盒包含在生理或藥物學(xué)可接受載體諸如水溶液載體中。因此，本發(fā)明中使用的制劑包括但不限于那些適于非腸道用藥，包括皮下，皮內(nèi)，肌肉內(nèi)，靜脈內(nèi)和動(dòng)脈內(nèi)用藥，以及局部用藥(即可吸入顆粒的氣霧化制劑對(duì)囊纖維化病人肺的用藥)的制劑。制劑可方便地制成單位劑量形式并且可由本技術(shù)領(lǐng)域任何熟知方法制備。這類劑型描述于例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences 19th ed.，Osol，A.(ed.)，Mack EastonPA(1980)。一在任何情況下最合適的用藥途徑依賴于對(duì)象，要治療的狀況的性質(zhì)和嚴(yán)重性，以及要使用的特定活性組合物。
本發(fā)明提供了使用具有上面陳述的特征的靶向掩藏盒制備的治療不同疾病的藥物。在依據(jù)本發(fā)明的藥物制造中，典型地將掩藏盒與可接受載體等其它組分混合。當(dāng)然，載體必須與制劑中其它組分相容并且必須對(duì)病人無(wú)害。載體可以是固體或液體。可在本發(fā)明制劑中摻入一種或多種寡核苷酸，制劑是通過(guò)制藥業(yè)任何熟知技術(shù)包括實(shí)質(zhì)上混合各組分，可選地包括一種或多種附屬治療成分來(lái)制備的。
本發(fā)明的制劑可包含活性組合物的無(wú)菌水溶液和非水溶液注射液，該制劑優(yōu)選地與預(yù)期受體血液等滲并基本不含熱原。這些制劑可含有抗氧化劑，緩沖液，抑菌劑以及使制劑與預(yù)期受體血液等滲的溶質(zhì)。水溶液和非水溶液無(wú)菌懸浮液可包括懸浮劑和增濃劑。制劑可以是含單位劑量或多劑量形式存在，例如密封的安瓿管和小瓶，并且可以保存在只需在使用前加入無(wú)菌溶液載體，例如注射用鹽或水的凍干狀態(tài)。
在制劑中靶向盒可包含在脂粒子或囊泡中，諸如適于非腸胃用藥的脂質(zhì)體或微晶。只要其中含有靶向盒，顆?？梢允侨魏芜m當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)，諸如單層或多層的。帶正電的脂諸如N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲銨硫酸甲酯，或“DOTAP”對(duì)這類顆粒和囊泡是特別優(yōu)選的。這類脂顆粒的制備是眾所周知的。參看例如美國(guó)專利號(hào)4,880,635，Janoff等；4,906,477，Kurono等；4,911,928，Wallach；4,917,951，Wallach；4,920,016，Allen等；4,921,757，Wheatley等；等等。
靶向盒的用藥劑量將依賴于使用的特定方法，并且當(dāng)用于病體時(shí)，將依賴于疾病，病體狀況，特定劑型，用藥途徑等等。一般而言，需要的細(xì)胞內(nèi)盒濃度從.05至50μm，或更特定地.2至5μm。向病體諸如人體用藥時(shí)，使用的劑量從大約.01，.1，或1mg/kg至50，100，或150mg/kg。
現(xiàn)在的技術(shù)僅集中于反義分子。在細(xì)胞中反義寡核苷酸結(jié)合犯錯(cuò)的RNA分子。為了有效，必須向各細(xì)胞傳送高劑量的反義分子。本發(fā)明提供了一種增強(qiáng)反義技術(shù)效能的效應(yīng)分子。這種情況下，可更容易地操縱細(xì)胞并且更低的劑量，潛在地甚至1個(gè)細(xì)胞1個(gè)分子的比率可以有效。
是特異性的思想提供了本發(fā)明的潛在特征。用于諸如腫瘤疾病等病況的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞毒性化療充滿了系統(tǒng)毒性。毒性劑量與治療劑量的比率相當(dāng)?shù)?，反映了在化療藥物影響了大量?xì)胞靶以及藥物不能區(qū)分正常和疾病細(xì)胞。理論上，可以通過(guò)利用Watson-Crick堿基對(duì)形成所傳遞的特異性確認(rèn)適當(dāng)?shù)陌衼?lái)解決這個(gè)問(wèn)題。
下列實(shí)驗(yàn)是以說(shuō)明而不是限制的方式提供的。
實(shí)驗(yàn)使用靶向盒殺死致瘤細(xì)胞根據(jù)本質(zhì)上是上述的方法，構(gòu)建了第一鏈含有編碼毒素A的RNA的靶向盒。毒素RNA上游連接編碼p53DNA序列有義部分的DNA序列。在多種癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了p53蛋白質(zhì)。在p53分子中插入了Kozak序列。對(duì)應(yīng)于p53有義核苷酸構(gòu)建了反義結(jié)構(gòu)。
在藥物可接受溶液中以從大約.01，.1或1mg/kg至50,100，或150mg/kg的濃度提供了靶向盒。將靶向盒用作抗病毒藥物圖1描繪了將掩藏靶向表達(dá)盒用作抗病毒藥物(黑RNA藥物(Black RNADrug))。由提供的要點(diǎn)確認(rèn)盒的特征。有義鏈在其5′末端具有7meG帽子。在滅活形式中，反義鏈與有義鏈側(cè)翼序列雜交；這樣Kozak序列被掩藏。Kozak序列和反義鏈之間的錯(cuò)配區(qū)域通過(guò)缺乏氫鍵表示。出現(xiàn)與反義鏈完全同源的活性病毒RNA時(shí)，反義鏈從有義鏈解離并結(jié)合病毒RNA，使病毒RNA失活。進(jìn)一步，隨著反義鏈的解離，暴露出Kozak序列從而使毒素蛋白質(zhì)從AUG起始密碼子開始翻譯。產(chǎn)生毒性量的成熟毒素時(shí)，破壞宿有病毒的細(xì)胞。具有完全互補(bǔ)的反義和側(cè)翼序列的靶向盒圖2描繪了有義鏈病毒靶序列與反義鏈完全互補(bǔ)的掩藏靶向表達(dá)盒。在滅活靶向盒中，核糖體組裝和從5′末端的掃描被反義鏈和側(cè)翼序列的雙鏈阻止。在此實(shí)施例中，可通過(guò)檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性來(lái)測(cè)試反義鏈的取代及目的基因(lacz)的活性表達(dá)。具有增強(qiáng)的靶特異性的靶向盒圖3描繪了用于增強(qiáng)靶特異性以起始目的基因翻譯的具有多聯(lián)體幾何結(jié)構(gòu)的掩藏靶向表達(dá)盒。每一反義/有義組合(1-3)對(duì)應(yīng)不同靶序列。例如，1應(yīng)于病毒RNA，2應(yīng)于細(xì)胞因子RNA，3應(yīng)于宿主特異性蛋白質(zhì)。只有在靶細(xì)胞中存在所有3種靶序列，從盒的有義鏈有效取代所有3種反義序列，從而使核糖體組裝并從5′末端掃描至Kozak序列和AUG起始密碼子時(shí)，才能表達(dá)編碼目的蛋白質(zhì)的RNA。具有靶定量閾值的靶向盒圖4描繪了具有需要定量閾值以起始翻譯的多聯(lián)體幾何結(jié)構(gòu)的掩藏靶向表達(dá)盒。所有的有義/反義組合(1-3)對(duì)應(yīng)相同的靶RNA。在靶細(xì)胞中只有存在足夠量(此實(shí)施例中3個(gè)拷貝)靶RNA，從盒的有義序列有效替換所有3個(gè)反義序列，從而使核糖體組裝并從5′末端掃描至Kozak序列和AUG起始密碼子時(shí)，才能表達(dá)編碼目的蛋白質(zhì)的RNA。因而多聯(lián)體幾何結(jié)構(gòu)需要閾值量的靶RNA起始翻譯。這種多聯(lián)體盒構(gòu)建體特別適用于靶向具有不正常的高拷貝數(shù)特定mRNA的癌細(xì)胞。該構(gòu)建體也可與圖3的構(gòu)建體組合制成。環(huán)狀靶向盒圖5描繪了環(huán)狀掩藏靶向表達(dá)盒。
與靶分子互補(bǔ)的反義分子與靶向表達(dá)盒3′和5′末端的互補(bǔ)序列結(jié)合，從而阻止核糖體組裝和從5′末端的掃描。這樣，在互補(bǔ)靶分子存在時(shí)反義鏈的替代能使目的蛋白翻譯和表達(dá)。環(huán)狀構(gòu)型可能更緊湊和低粘度，從而具有藥物傳遞使用所需的特別特性。莖環(huán)靶向盒圖6描繪了莖環(huán)掩藏靶向表達(dá)盒。與靶分子互補(bǔ)的反義分子與環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)的互補(bǔ)序列結(jié)合，進(jìn)一步穩(wěn)定了莖環(huán)結(jié)構(gòu)。通過(guò)復(fù)合體的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)阻止了核糖體從5′末端至Kozak序列和起始AUG密碼子的掃描?；パa(bǔ)靶分子存在時(shí)反義鏈的替代使莖環(huán)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低，不能阻止從5′末端開始的核糖體掃描。圖7伸出臂的有義鏈質(zhì)粒構(gòu)建體圖7描繪了用于產(chǎn)生靶向表達(dá)盒有義RNA鏈的pCI-Neo(Promega公司)質(zhì)粒構(gòu)建體。描繪的MCS-Kozak-lacZ的全序列陳列于序列1。將對(duì)應(yīng)于部分螢火蟲螢光素酶mRNA的可替換的側(cè)翼序列插入到多克隆位點(diǎn)(MCS)，這樣從T7啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA從5′末端含有螢光素酶片段-Kozak-β gal?？商娲奈灩馑孛赣辛x片段陳列于序列2，3，4，5，6，7或8。圖8體外測(cè)定掩藏靶向表達(dá)盒的活性使用Riboprobe組合系統(tǒng)(目錄號(hào)P1450，Promega公司)，通過(guò)圖7所示構(gòu)建體的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生了掩藏靶向盒的有義鏈RNA。
對(duì)應(yīng)于部分靶分子(螢火蟲熒光素酶RNA，目錄號(hào)L4561，Promega公司)的反義序列與互補(bǔ)的靶向盒有義鏈側(cè)翼序列雜交。序列2，3，4，5，6，7或8分別列出可替代的側(cè)翼序列，序列9，10，11，12，13，14或15分別列出對(duì)應(yīng)的反義序列。制備側(cè)翼有義序列和相應(yīng)反義序列所依據(jù)的全長(zhǎng)螢火蟲熒光素酶RNA列于序列16。將雜交的混合物引入含有核糖體和全長(zhǎng)螢火蟲螢光素酶RNA(Flex，兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物系統(tǒng)，目錄號(hào)L4540，Promega公司)的體外翻譯混合物中。對(duì)照反應(yīng)沒(méi)有掩藏盒。
翻譯完成后，檢測(cè)混合物的β-半乳糖苷酶(β-gal)和螢光素酶活性。陰性螢光素酶和陽(yáng)性β-gal活性表示成功的抑制了靶分子并成功的表達(dá)了目的基因。
示意圖描繪了檢測(cè)機(jī)理。圖框1中，反義序列結(jié)合到互補(bǔ)的靶向盒的側(cè)翼序列。反義/有義雙鏈阻礙了核糖體從5′末端開始的掃描，從而阻止了β-galRNA的翻譯。取代和反義對(duì)靶螢光素酶RNA的結(jié)合(圖框2)具有雙重效應(yīng)(圖框3)。從暴露的盒可表達(dá)β-gal(β-gal陽(yáng)性)并且通過(guò)反義與靶的結(jié)合阻止了靶的表達(dá)(螢光素酶陰性)。
本技術(shù)領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將會(huì)想到與本發(fā)明有關(guān)的得益于此處展示教程的本發(fā)明的其它修改和實(shí)施方案。因而，必須知道本發(fā)明不限于公開的特定實(shí)施方案。雖然使用了特定的術(shù)語(yǔ)，但僅以通常和描述意義使用它們而不是為了限制，而修改和實(shí)施方案預(yù)計(jì)包括在附錄的權(quán)利要求書的范圍中。
序列表(1)一般資料(i)申請(qǐng)人Black Jr.，Charles A.
(ii)發(fā)明的題目激活目的基因的組合物和方法(iii)序列數(shù)16(iv)通訊地址(A)收信人W.Murray Spruill(B)街道3605 Glenwood Ave.Suite 310(C)城市Raleigh(D)州NC(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵編27622(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM兼容PC(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release # 1.0，版本 # 1.30(vi)當(dāng)前申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)填表日期(C)分類(vii)律師/代理人資料(A)名字Spruill，W.Murray(B)登記號(hào)32,943(C)參考/大綱號(hào)5722-2(ix)電訊資料(A)電話919 420 2202(B)電傳919 881 3175(2)序列資料1(1)序列特征(A)長(zhǎng)度4279堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“重組分子(多克隆位點(diǎn)/Kozack序列/LacZ基因)”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞混合特征(misc_feature)(B)位置1..64(D)其它資料/產(chǎn)物＝“多克隆位點(diǎn)”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞混合特征(B)位置65..79(D)其它資料/功能＝“翻譯起始點(diǎn)共有序列”/產(chǎn)物＝“Kozack序列”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞主要轉(zhuǎn)錄物(prim_transcript)(B)位置80..4279(D)其它資料/基因＝“LacZ”/標(biāo)準(zhǔn)名稱＝“β半乳糖苷酶”(xi)序列描述序列1TTAATACGAC TCACTATAGG CTAGCCTCGA GAATTCACGC GTGGTACCTC TAGAGTCGAC 60CCGGGCCGCC GCCACCATGG CGCAGCACCA TGGCCTGAAA TAACCTCTGA AAGAGGAACT120TGGTTAGGTA CCTTCTGAGG CGGAAAGAAC CAGCTGTGGA ATGTGTGTCA GTTAGGGTGT180GGAAAGTCCC CAGGCTCCCC AGCAGGCAGA AGTATGCAAA GCATGCATCT CAATTAGTCA240GCAACCAGGT GTGGAAAGTC CCCAGGCTCC CCAGCAGGCA GAAGTATGCA AAGCATGCAT300CTCAATTAGT CAGCAACCAT AGTCCCGCCC CTAACTCCGC CCATCCCGCC CCTAACTCCG360CCCAGTTCCG CCCATTCTCC GCCCCATGGC TGACTAATTT TTTTTATTTA TGCAGAGGCC420GAGGCCGCCT CGGCCTCTGA GCTATTCCAG AAGTAGTGAG GAGGCTTTTT TGGAGGCCTA480GGCTTTTGCA AAAAGCTTGG GATCTCTATA ATCTCGCGCA ACCTATTTTC CCCTCGAACA540CTTTTTAAGC CGTAGATAAA CAGGCTGGGA CACTTCACAT GAGCGAAAAA TACATCGTCA600CCTGGGACAT GTTGCAGATC CATGCACGTA AACTCGCAAG CCGACTGATG CCTTCTGAAC660AATGGAAAGG CATTATTGCC GTAAGCCGTG GCGGTCTGGT ACCGGTGGGT GAAGACCAGA 720AACAGCACCT CGAACTGAGC CGCGATATTG CCCAGCGTTT CAACGCGCTG TATGGCGAGA 780TCGATCCCGT CGTTTTACAA CGTCGTGACT GGGAAAACCC TGGCGTTACC CAACTTAATC 840GCCTTGCAGC ACATCCCCCT TTCGCCAGCT GGCGTAATAG CGAAGAGGCC CGCACCGATC 900GCCCTTCCCA ACAGTTGCGC AGCCTGAATG GCGAATGGCG CTTTGCCTGG TTTCCGGCAC 960CAGAAGCGGT GCCGGAAAGC TGGCTGGAGT GCGATCTTCC TGAGGCCGAT ACTGTCGTCG 1020TCCCCTCAAA CTGGCAGATG CACGGTTACG ATGCGCCCAT CTACACCAAC GTAACCTATC 1080CCATTACGGT CAATCCGCCG TTTGTTCCCA CGGAGAATCC GACGGGTTGT TACTCGCTCA 1140CATTTAATGT TGATGAAAGC TGGCTACAGG AAGGCCAGAC GCGAATTATT TTTGATGGCG 1200TTAACTCGGC GTTTCATCTG TGGTGCAACG GGCGCTGGGT CGGTTACGGC CAGGACAGTC 1260GTTTGCCGTC TGAATTTGAC CTGAGCGCAT TTTTACGCGC CGGAGAAAAC CGCCTCGCGG 1320TGATGGTGCT GCGTTGGAGT GACGGCAGTT ATCTGGAAGA TCAGGATATG TGGCGGATGA 1380GCGGCATTTT CCGTGACGTC TCGTTGCTGC ATAAACCGAC TACACAAATC AGCGATTTCC 1440ATGTTGCCAC TCGCTTTAAT GATGATTTCA GCCGCGCTGT ACTGGAGGCT GAAGTTCAGA 1500TGTGCGGCGA GTTGCGTGAC TACCTACGGG TAACAGTTTC TTTATGGCAG GGTGAAACGC 1560AGGTCGCCAG CGGCACCGCG CCTTTCGGCG GTGAAATTAT CGATGAGCGT GGTGGTTATG 1620CCGATCGCGT CACACTACGT CTGAACGTCG AAAACCCGAA ACTGTGGAGC GCCGAAATCC 1680CGAATCTCTA TCGTGCGGTG GTTGAACTGC ACACCGCCGA CGGCACGCTG ATTGAAGCAG 1740AAGCCTGCGA TGTCGGTTTC CGCGAGGTGC GGATTGAAAA TGGTCTGCTG CTGCTGAACG 1800GCAAGCCGTT GCTGATTCGA GGCGTTAACC GTCACGAGCA TCATCCTCTG CATGGTCAGG 1860TCATGGATGA GCAGACGATG GTGCAGGATA TCCTGCTGAT GAAGCAGAAC AACTTTAACG 1920CCGTGCGCTG TTCGCATTAT CCGAACCATC CGCTGTGGTA CACGCTGTGC GACCGCTACG 1980GCCTGTATGT GGTGGATGAA GCCAATATTG AAACCCACGG CATGGTGCCA ATGAATCGTC 2040TGACCGATGA TCCGCGCTGG CTACCGGCGA TGAGCGAACG CGTAACGCGA ATGGTGCAGC 2100GCGATCGTAA TCACCCGAGT GTGATCATCT GGTCGCTGGG GAATGAATCA GGCCACGGCG 2160CTAATCACGA CGCGCTGTAT CGCTGGATCA AATCTGTCGA TCCTTCCCGC CCGGTGCAGT 2220ATGAAGGCGG CGGAGCCGAC ACCACGGCCA CCGATATTAT TTGCCCGATG TACGCGCGCG 2280TGGATGAAGA CCAGCCCTTC CCGGCTGTGC CGAAATGGTC CATCAAAAAA TGGCTTTCGC 2340TACCTGGAGA GACGCGCCCG CTGATCCTTT GCGAATACGC CCACGCGATG GGTAACAGTC 2400TTGGCGGTTT CGCTAAATAC TGGCAGGCGT TTCGTCAGTA TCCCCGTTTA CAGGGCGGCT 2460TCGTCTGGGA CTGGGTGGAT CAGTCGCTGA TTAAATATGA TGAAAACGGC AACCCGTGGT 2520CGGCTTACGG CGGTGATTTT GGCGATACGC CGAACGATCG CCAGTTCTGT ATGAACGGTC 2580TGGTCTTTGC CGACCGCACG CCGCATCCAG CGCTGACGGA AGCAAAACAC CAGCAGCAGT 2640TTTTCCAGTT CCGTTTATCC GGGCAAACCA TCGAAGTGAC CAGCGAATAC CTGTTCCGTC 2700ATAGCGATAA CGAGCTCCTG CACTGGATGG TGGCGCTGGA TGGTAAGCCG CTGGCAAGCG 2760GTGAAGTGCC TCTGGATGTC GCTCCACAAG GTAAACAGTT GATTGAACTG CCTGAACTAC 2820CGCAGCCGGA GAGCGCCGGG CAACTCTGGC TCACAGTACG CGTAGTGCAA CCGAACGCGA 2880CCGCATGGTC AGAAGCCGGG CACATCAGCG CCTGGCAGCA GTGGCGTCTG GCGGAAAACC 2940TCAGTGTGAC GCTCCCCGCC GCGTCCCACG CCATCCCGCA TCTGACCACC AGCGAAATGG 3000ATTTTTGCAT CGAGCTGGGT AATAAGCGTT GGCAATTTAA CCGCCAGTCA GGCTTTCTTT 3060CACAGATGTG GATTGGCGAT AAAAAACAAC TGCTGACGCC GCTGCGCGAT CAGTTCACCC 3120GTGCACCGCT GGATAACGAC ATTGGCGTAA GTGAAGCGAC CCGCATTGAC CCTAACGCCT 3180GGGTCGAACG CTGGAAGGCG GCGGGCCATT ACCAGGCCGA AGCAGCGTTG TTGCAGTGCA 3240CGGCAGATAC ACTTGCTGAT GCGGTGCTGA TTACGACCGC TCACGCGTGG CAGCATCAGG 3300GGAAAACCTT ATTTATCAGC CGGAAAACCT ACCGGATTGA TGGTAGTGGT CAAATGGCGA 3360TTACCGTTGA TGTTGAAGTG GCGAGCGATA CACCGCATCC GGCGCGGATT GGCCTGAACT 3420GCCAGCTGGC GCAGGTAGCA GAGCGGGTAA ACTGGCTCGG ATTAGGGCCG CAAGAAAACT 3480ATCCCGACCG CCTTACTGCC GCCTGTTTTG ACCGCTGGGA TCTGCCATTG TCAGACATGT 3540ATACCCCGTA CGTCTTCCCG AGCGAAAACG GTCTGCGCTG CGGGACGCGC GAATTGAATT 3600ATGGCCCACA CCAGTGGCGC GGCGACTTCC AGTTCAACAT CAGCCGCTAC AGTCAACAGC 3660AACTGATGGA AACCAGCCAT CGCCATCTGC TGCACGCGGA AGAAGGCACA TGGCTGAATA 3720TCGACGGTTT CCATATGGGG ATTGGTGGCG ACGACTCCTG GAGCCCGTCA GTATCGGCGG 3780AATTCCAGCT GAGCGCCGGT CGCTACCATT ACCAGTTGGT CTGGTGTCAA AAATAATAAT 3840AACCGGGCAG GCCATGTCTG CCCGTATTTC GCGTAAGGAA ATCCATTATG TACTATTTAA 3900AAAACACAAA CTTTTGGATG TTCGGTTTAT TCTTTTTCTT TTACTTTTTT ATCATGGGAG 3960CCTACTTCCC GTTTTTCCCG ATTTGGCTAC ATGACATCAA CCATATCAGC AAAAGTGATA 4020CGGGTATTAT TTTTGCCGCT ATTTCTCTGT TCTCGCTATT ATTCCAACCG CTGTTTGGTC 4080TGCTTTCTGA CAAACTCGGA ACTTGTTTAT TGCAGCTTAT AATGGTTACA AATAAAGCAA 4140TAGCATCACA AATTTCACAA ATAAAGCATT TTTTTCACTG CATTCTAGTT GTGGTTTGTC 4200CAAACTCATC AATGTATCTT ATCATGTCTG GATCCTCTAG AGTCGACCTG CAGGCATGCA 4260AGCTGGCACT GGCCGTCGT 4279(2)序列資料2(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成的寡核苷酸”(xi)序列描述序列2GAATACAAAG CTTATGCATG(2)序列資料3(i)序列特征(A)長(zhǎng)度13個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成寡核苷酸”(xi)序列描述序列3GAATACAAAG CTT(2)序列資料4(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成寡核苷酸”(xi)序列描述序列4AAAGCTTATG CATGCGGCCG(2)序列資料5
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成寡核苷酸”(xi)序列描述序列5CGGCCGCATC TAGAGGGCCC(2)序列資料6(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成寡核苷酸”(xi)序列描述序列6GCGGCCGCAT CTAGAGGGCC CGGAT(2)序列資料7(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成寡核苷酸”(xi)序列描述序列7AATACAAAGC TTATGCATGC GGCC(2)序列資料8(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度30堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成寡核苷酸”(xi)序列描述序列8AATACAAAGC TTATGCATGC GGCCGCATCT(2)序列資料9(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成寡核苷酸”(xi)序列描述序列9CATGCATAAG CTTTGTATTC(2)序列資料10(i)序列特征(A)長(zhǎng)度13堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成寡核苷酸”(xi)序列描述序列10AAGCTTTGTA TTC(2)序列資料11(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成寡核苷酸”(xi)序列描述序列11CGGCCGCATG CATAAGCTTT(2)序列資料12(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成寡核苷酸”(xi)序列描述序列12GGGCCCTCTA GATGCGGCCG(2)序列資料13(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成寡核苷酸”(xi)序列描述序列13ATCCGGGCCC TCTAGATGCG GCCGC(2)序列資料14(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成寡核苷酸”(xi)序列描述序列14GGCCGCATGC ATAAGCTTTG TATT(2)序列資料15(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成寡核苷酸”(xi)序列描述序列15AGATGCGGCC GCATGCATAA GCTTTGTATT(2)序列資料16(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1798堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型mRNA(xi)序列描述序列16GAAUACAAAG CUUAUGCAUG CGGCCGCAUC UAGAGGGCCC GGAUCCAAAU GGAAGACGCC 60AAAAACAUAA AGAAAGGCCC GGCGCCAUUC UAUCCUCUAG AGGAUGGAAC CGCUGGAGAG 120CAACUGCAUA AGGCUAUGAA GAGAUACGCC CUGGUUCCUG GAACAAUUGC UUUUACAGAU 180GCACAUAUCG AGGUGAACAU CACGUACGCG GAAUACUUCG AAAUGUCCGU UCGGUUGGCA 240GAAGCUAUGA AACGAUAUGG GCUGAAUACA AAUCACAGAA UCGUCGUAUG CAGUGAAAAC 300UCUCUUCAAU UCUUUAUGCC GGUGUUGGGC GCCGUUAUUU AUCGGAGUUG CAGUUGCGCC 360CGCGAAGCAC AUUUAUAAUG AACGUGAAUU GCUCAACAGU AUGAACAUUU CGCAGCCUAC 420CGUAGUGUUU GUUUCCAAAA AGGGGUUGCA AAAAAUUUUG AACGUGCAAA AAAAAUUACC 480AAUAAUCCAG AAAAUUAUUA UCAUGGAUUC UAAAACGGAU UACCAGGGAU UUCAGUCGAU 540GUACACGUUC GUCACAUCUC AUCUACCUCC CGGUUUUAAU GAAUACGAUU UUGUACCAGA 600GUCCUUUGAU CGUGACAAAA CAAUUGCACU GAUAAUGAAU UCCUCUGGAU CUACUGGGUU 660ACCUAAGGGU GUGGCCCUUC CGCAUAGAAC UGCCUGCGUC AGAUUCUCGC AUGCCAGAGA 720UCCUAUUUUU GGCAAUCAAA UCAUUCCGGA UACUGCGAUU UUAAGUGUUG UUCCAUUCCA 780UCACGGUUUU GGAAUGUUUA CUACACUCGG AUAUUUGAUA UGUGGAUUUC GAGUCGUCUU 840AAUGUAUAGA UUUGAAGAAG AGCUGUUUUU ACGAUCCCUU CAGGAUUACA AAAUUCAAAG 900UGCGUUGCUA GUACCAACCC UAUUUUCAUU CUUCGCCAAA AGCACUCUGA UUGACAAAUA 960CGAUUUAUCU AAUUUACACG AAAUUGCUUC UGGGGGCGCA CCUCUUUCGA AAGAAGUCGG 1020GGAAGCGGUU GCAAAACGCU UCCAUCUUCC AGGGAUACGA CAAGGAUAUG GGCUCACUGA 1080GACUACAUCA GCUAUUCUGA UUACACCCGA GGGGGAUGAU AAACCGGGCG CGGUCGGUAA 1140AGUUGUUCCA UUUUUUGAAG CGAAGGUUGU GGAUCUGGAU ACCGGGAAAA CGCUGGGCGU 1200UAAUCAGAGA GGCGAAUUAU GUGUCAGAGG ACCUAUGAUU AUGUCCGGUU AUGUAAACAA 1260UCCGGAAGCG ACCAACGCCU UGAUUGACAA GGAUGGAUGG CUACAUUCUG GAGACAUAGC 1320UUACUGGGAC GAAGACGAAC ACUUCUUCAU AGUUGACCGC UUGAAGUCUU UAAUUAAAUA 1380CAAAGGAUAU CAGGUGGCCC CCGCUGAAUU GGAAUCGAUA UUGUUACAAC ACCCCAACAU 1440CUUCGACGCG GGCGUGGCAG GUCUUCCCGA CGAUGACGCC GGUGAACUUC CCGCCGCCGU 1500UGUUGUUUUG GAGCACGGAA AGACGAUGAC GGAAAAAGAG AUCGUGGAUU ACGUCGCCAG 1560UCAAGUAACA ACCGCGAAAA AGUUGCGCGG AGGAGUUGUG UUUGUGGACG AAGUACCGAA 1620AGGUCUUACC GGAAAACUCG ACGCAAGAAA AAUCAGAGAG AUCCUCAUAA AGGCCAAGAA 1680GGGCGGAAAG UCCAAAUUGU AAAAUGUAAC UGUAUUCAGC GAUGACGAAA UUCUUAGCUA 1740UUGUAAUCCU CCGAGGGGGC GAGCUCCCAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA1798
權(quán)利要求
1.含有雙鏈核酸分子的掩藏表達(dá)盒，其中第一條鏈含有連接到側(cè)翼序列下游的編碼目的蛋白的RNA序列，并且有一個(gè)可操作的插入RNA序列的上游的翻譯起始點(diǎn)；以及，結(jié)合到側(cè)翼序列的第二條反義鏈，其中上述第二條鏈對(duì)應(yīng)靶分子的反義寡核苷酸。
2.權(quán)利要求1的盒，其中上述盒進(jìn)一步含有連接到側(cè)翼序列5′末端的7-甲基鳥嘌呤帽子。
3.權(quán)利要求1的盒，其中上述目的蛋白編碼一種毒素。
4.權(quán)利要求1的盒，其中上述靶含有為致瘤細(xì)胞獨(dú)有的寡核苷酸。
5.抑制致瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的一種方法，包括將上述細(xì)胞與含有雙鏈核酸分子的掩藏表達(dá)盒接觸；其中第一條鏈含有連接到側(cè)翼序列下游的編碼目的蛋白質(zhì)的RNA序列，以及可操作的插入到該RNA序列上游的翻譯起始點(diǎn)；以及結(jié)合到側(cè)翼序列的第二條反義鏈，其中上述第二條鏈對(duì)應(yīng)于靶分子的反義寡核苷酸。
6.權(quán)利要求5的方法，其中上述盒進(jìn)一步含有連接到側(cè)翼序列5′末端的7-甲基鳥嘌呤帽子。
7.權(quán)利要求5的方法，其中上述翻譯起始點(diǎn)含有Kozak序列。
8.權(quán)利要求5的方法，其中上述目的蛋白質(zhì)是一種毒素。
9.權(quán)利要求8的方法，其中上述靶含有為致瘤細(xì)胞特有的核苷酸序列。
10.在靶分子存在時(shí)控制目的蛋白質(zhì)表達(dá)的一種方法，上述方法包括將含有靶分子的細(xì)胞與含有雙鏈核酸分子的掩藏表達(dá)盒接觸，其中第一條鏈含有連接到側(cè)翼序列下游的編碼目的蛋白的RNA序列，并且一個(gè)可操作插入到該RNA序列的上游的翻譯起始點(diǎn)；以及，結(jié)合到側(cè)翼序列的第二條反義鏈，其中上述第二條鏈對(duì)應(yīng)靶分子的反義寡核苷酸。
11.權(quán)利要求10的方法，其中上述盒進(jìn)一步包括連接到側(cè)翼序列5′末端的7-甲基鳥嘌呤帽子。
12.權(quán)利要求10的方法，其中上述目的蛋白編碼一種毒素。
13.權(quán)利要求10的方法，其中上述靶含有為致瘤細(xì)胞特有的核苷酸序列。
14.在特定器官中產(chǎn)生目的蛋白的一種方法，包括將上述器官的細(xì)胞與含有雙鏈核酸分子的掩藏表達(dá)盒接觸，其中第一條鏈含有連接到側(cè)翼序列下游的編碼上述目的蛋白的RNA序列，并且有一個(gè)可操作的插入RNA序列的上游的翻譯起始點(diǎn)；以及，結(jié)合到側(cè)翼序列的第二條反義鏈，其中上述反義鏈對(duì)應(yīng)上述器官特異的靶分子。
15.權(quán)利要求14的方法，其中上述盒進(jìn)一步含有連接到側(cè)翼序列5′末端的7-甲基鳥嘌呤帽子。
全文摘要
提供了激活目的基因的組合物和方法。該組合物含有一個(gè)只有存在靶分子時(shí)才表達(dá)基因產(chǎn)物的隱藏靶向表達(dá)盒。表達(dá)盒可用于治療疾病和防止致瘤細(xì)胞增殖。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1261373SQ9880655
公開日2000年7月26日 申請(qǐng)日期1998年6月24日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月25日
發(fā)明者小查爾斯·A·布萊克 申請(qǐng)人:小查爾斯·A·布萊克