專利名稱：檢測真菌的材料及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本項(xiàng)發(fā)明涉及用于檢測各種真菌的核酸以及應(yīng)用該核酸進(jìn)行的各種真菌的檢測方法。
現(xiàn)有技術(shù)作為深部真菌病的主要病原菌包括假絲酵母屬(Candida以下簡稱C.)真菌、曲霉屬真菌(Aspergillus以下簡稱A.)、隱球酵母屬真菌(Cryptococcus.以下簡稱Cr.)等。假絲酵母屬的主要病原菌包括白色假絲酵母、乳酒假絲酵母、光滑假絲酵母、熱帶假絲酵母等；隱球酵母屬的主要病原菌包括新型隱球酵母。在與假絲酵母屬同樣重要的病原菌曲霉屬中，有關(guān)的病原菌包括煙曲霉、黃色曲霉、黑色曲霉、構(gòu)巢曲霉、土曲霉等?？赏蟹椒軐?duì)這些菌種迅速地檢出、分類并鑒定。
近年來，深部真菌病在免疫功能不全的患者當(dāng)中感染的機(jī)會(huì)增多了，但是這些患者多伴有危重的原發(fā)疾病，因此，早期明確致病菌并給予恰當(dāng)?shù)闹委熓潜匾?。深部真菌病的診斷以血液培養(yǎng)方法為基本但在檢出率方面還存在問題。至此，用于診斷的抗體已成為商品，但依據(jù)抗體進(jìn)行診斷對(duì)免疫功能不全的患者不起作用。基于這種現(xiàn)狀，近年來開發(fā)出了直接檢測抗原及其他菌體成分的方法。例如依據(jù)甘露聚糖，D-阿拉伯糖醇、葡聚糖等的檢驗(yàn)而診斷感染的方法。另外，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，開發(fā)出了通過提取結(jié)核菌、衣原體等各種病原菌的DNA、即所謂的通過采用PCR方法等檢出核酸而進(jìn)行診斷的方法。在深部真菌病的方面，也提出了通過檢測核糖體RNA進(jìn)行診斷的方法(臨床病理、43卷附冊、119頁、1995年)。
發(fā)明的公開本發(fā)明的目的，旨在提供用于檢測導(dǎo)致深部真菌病的病原菌即曲霉屬真菌的核酸，并提供利用這些核酸而能簡便、迅速、特異并且高敏感度地檢測這些真菌的方法。
發(fā)明人，通過對(duì)各種真菌癥的病原菌、特別是對(duì)曲霉屬真菌的基因進(jìn)行反復(fù)研究，把著眼點(diǎn)放在了存在于線粒體中的能引起各種真菌癥的真菌的細(xì)胞色素b基因上，為了對(duì)基因進(jìn)行部分?jǐn)U增而合成了各種核酸。通過在那些核酸當(dāng)中查尋能導(dǎo)致真菌的細(xì)胞色素b的基因擴(kuò)增的引物，而發(fā)現(xiàn)了序列表中的序列號(hào)1-4的核酸。而且通過利用序列號(hào)1-4的核酸而對(duì)存在于線粒體中的細(xì)胞色素b基因進(jìn)行部分?jǐn)U增，而成功地解讀了那些序列。發(fā)明人以那些序列為基礎(chǔ)進(jìn)行了反復(fù)研究，發(fā)現(xiàn)了曲霉屬真菌的各種特異的序列，并以此為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)了不同特異的引物。例如，發(fā)現(xiàn)了作為煙曲霉的特異性引物在序列表中的序列號(hào)為10、65、68、69，黃曲霉菌的特異性引物的序列號(hào)為11、12、66、67，黑色曲霉菌的特異性引物的序列號(hào)為13、64、70、71，構(gòu)巢曲霉菌的特異性引物的序列號(hào)為14、63、72、73，土曲菌的特異性引物的序列號(hào)為15、62、74、75。
通過提取能簡便、迅速、特異并高度敏感地檢測分類及鑒定曲霉屬真菌的核酸，并據(jù)此建立起了應(yīng)用該核酸的檢驗(yàn)方法從而完成了本發(fā)明。進(jìn)一步，利用含序列表序列號(hào)1及2表示的堿基序列的引物進(jìn)行改良，并提供序列號(hào)為57所示的堿基配對(duì)的引物，由此除上述真菌外，使巴西果小克銀漢霉(Cunninghamella bertholletiae)及卷枝毛霉的檢測成為可能。
總之，本發(fā)明提供了用于擴(kuò)增真菌線粒體細(xì)胞色素b基因的引物，它由序列表中序列號(hào)57所示的堿基序列(但任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可換為尿嘧啶)或其互補(bǔ)的堿基序列中連續(xù)的至少含有10個(gè)以上堿基序列的核酸片段所組成。而且本發(fā)明還提供了堿基對(duì)序列表中序列號(hào)3、58-61所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶)或其互補(bǔ)序列中連續(xù)的至少由10個(gè)以上堿基對(duì)的核酸片段所組成的真菌線粒體細(xì)胞色素b基因片段擴(kuò)增用的引物。而且本發(fā)明還提供了含有序列表中序列號(hào)5、6、7、8、9中各堿基序列(但任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可置換為尿嘧啶)或其互補(bǔ)堿基對(duì)序列中連續(xù)的10至100個(gè)堿基組成的堿基序列的核酸片段各自組成的用于檢測煙曲酶(序列號(hào)5)、黃曲霉菌(序列號(hào)6)、黑色曲霉(序列號(hào)7)、構(gòu)巢曲霉(序列號(hào)8)、土曲霉(序列號(hào)9)的核酸。進(jìn)一步說，本發(fā)明提供了至少由10個(gè)堿基以上的核酸構(gòu)成的檢測煙曲霉的核酸，該核酸由序列表中序列號(hào)5所示的序列第24位的T、第99位的T、144位的T，252位的C、277位的G、304位的G、312位的A或393位的G作3′末端，至少含有10個(gè)堿基以上核酸或在序列號(hào)5所示的序列的互補(bǔ)序列的與上述相對(duì)應(yīng)的堿基作3′端。此外，本發(fā)明還提供了序列號(hào)6的所示的序列第174位的Y作為3′端，至少由10個(gè)以上堿基組成的核酸或在序列號(hào)6中所示的互補(bǔ)堿基序列中與上面相對(duì)應(yīng)的堿基作3′端，至少由10個(gè)堿基以上核酸組成的黃曲霉菌的檢測用核酸。此外，本發(fā)明還提供了檢測黑色曲霉用的核酸。此核酸由序列號(hào)7所示的堿基序列第42位的A、第69位的C、第126位的C、第207位的A、第213位的A、第246位的A或第396位的G作3′端，至少含10個(gè)堿基以上的核酸，或把序列號(hào)7所示的與上述堿基相對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)堿基當(dāng)作3′端，至少含10個(gè)以上堿基的核酸。本發(fā)明還提供了構(gòu)巢曲霉檢測用核酸。此核酸為由序列號(hào)8所示的序列第60位的T、第221位的C、第271位的A、第285位的A、第366位的T及第387位的A為3′端，至少10個(gè)堿基以上的核酸或者為與序列號(hào)8所示上述堿基相互補(bǔ)的堿基作為3′端，由至少含10個(gè)堿基以上核酸組成構(gòu)巢曲霉檢測用核酸。本發(fā)明還提供了土曲霉檢測用核酸。此核酸為序列號(hào)9所示的序列第25位的T、第48位的T、第162位的T、第225位的C、第261位的C、第339位的C、第360位的A、第375位的A或第411位的A作為3′末端，含至少10個(gè)堿基以上的核酸或者如序列序列號(hào)9所示與上述堿基相對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)堿基作為3′端，由至少10個(gè)堿基以上核酸組成了土曲霉檢測用核酸。另外，本發(fā)明還提供了利用基因擴(kuò)增的方法而擴(kuò)增曲霉屬真菌的細(xì)胞色素b基因片段，從而檢出曲霉屬真菌并進(jìn)行鑒定的方法，此方法是將序列表中序列號(hào)1、2及57所示的堿基序列(但是任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶所置換)中連續(xù)的至少有10個(gè)堿基的核酸片段作為正向引物，而將序列號(hào)11～15及62～65中所示的堿基序列(任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶所置換)中互補(bǔ)的堿基序列中至少含有10個(gè)堿基的核酸片段中至少任一個(gè)的核酸片段作為反向引物。本發(fā)明還提供了將序列號(hào)66～75中所示的堿基序列(但任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶所置換)中連續(xù)至少10個(gè)堿基構(gòu)成的堿基序列的核酸片段中至少任何一個(gè)作為正向，而將序列號(hào)3、4、58～61中所示堿基序列(任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶所置換)中互補(bǔ)的堿基配對(duì)中連續(xù)的至少由10個(gè)堿基構(gòu)成的堿基序列的核酸片段作為反向引物，利用這些引物通過基因擴(kuò)增方法而擴(kuò)增曲霉屬真菌的細(xì)胞色素b的基因片段從而提供了對(duì)曲霉屬真菌的檢測及鑒定的方法。本發(fā)明還通過將序列號(hào)1、2及57中所示的堿基序列(任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶所置換)中連續(xù)的至少由10個(gè)堿基構(gòu)成的堿基序列的核酸片段中至少任何一個(gè)作為5′端引物，將序列號(hào)3、4、58～61的任一個(gè)中所示的堿基序列(任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶所置換)中互補(bǔ)的堿基序列中連續(xù)至少由10個(gè)堿基構(gòu)成的堿基序列而成的核酸片段中至少任何一個(gè)作為正向引物，利用這些引物通過基因擴(kuò)增的方法而擴(kuò)增真菌細(xì)胞色素b的基因片段從而提供了真菌的檢測方法。
本發(fā)明使分類、鑒定曾很費(fèi)時(shí)的病原真菌現(xiàn)在能被迅速、簡便而且高效地檢出、分類并鑒定。本發(fā)明的核酸即可作為擴(kuò)增反應(yīng)用的引物，也可作為直接檢測用的探針。而且可用探針和限性制酶檢測通過引物擴(kuò)增的產(chǎn)物，其敏感度、特異性得到了進(jìn)一步的提高，其臨床意義很大。
附圖簡述

圖1為應(yīng)用本發(fā)明實(shí)施例的各種引物，通過PCR方法將各種真菌的線粒體的細(xì)胞色素b的基因進(jìn)行擴(kuò)增、將擴(kuò)增產(chǎn)物走電泳所得到的電泳帶型的模式圖。
圖2為應(yīng)用本發(fā)明其它實(shí)施例的各種引物將各種真菌的線粒體的細(xì)胞色素b基因應(yīng)用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳所得的電泳帶型的模式。
圖3為應(yīng)用本發(fā)明的其他的實(shí)施例的各種引物將各種真菌的線粒體的細(xì)胞色素b基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物電泳所得的電泳帶型的模式圖。
圖4為應(yīng)用本發(fā)明其它實(shí)施例中的各中引物將各種真菌的線粒體的細(xì)胞色素b基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物電泳所得的電泳帶型的模式圖。
發(fā)明的最佳實(shí)施方案將序列號(hào)1、2及57的核酸與序列號(hào)3、4及58～61的互補(bǔ)配對(duì)序列構(gòu)成的核酸進(jìn)行組合而選擇出的核酸對(duì)作為引物，使之與曲霉屬真菌或假絲酵母屬真菌的線粒體中的細(xì)胞色素b基因進(jìn)行雜交，通過使引物延長反應(yīng)周期性反復(fù)進(jìn)行，就能夠?qū)⒄婢惖木€粒體的細(xì)胞色素b基因片段進(jìn)行擴(kuò)增。再者，在這樣的序列中，序列號(hào)1、2及4中所記錄的序列，是以構(gòu)巢曲霉的線粒體的細(xì)胞色素b基因序列(Waring，R.B.et al.，細(xì)胞27，4-11(1981))為基礎(chǔ)進(jìn)行設(shè)定的。另一方面，含有序列號(hào)57、3、58～61中所示堿基序列的核酸為復(fù)數(shù)(序列號(hào)27、3、58～61中的堿基序列用一般式表示)，各序列號(hào)中各自所示的核酸可以單獨(dú)應(yīng)用，但將之作為混合物應(yīng)用將會(huì)更好。將這些核酸作為混合物應(yīng)用的時(shí)候，可對(duì)曲霉屬真菌以外(土曲霉除外)的真菌、例如土曲霉、假絲酵母屬真菌、毛癬菌屬真菌、小克銀漢霉屬真菌、毛霉屬真菌的線粒體的細(xì)胞色素b基因片段進(jìn)行初步的擴(kuò)增。再者，含有序列號(hào)57、3、58～61中所示的堿基序列的核酸，如果是有至少10個(gè)以上連續(xù)堿基的核酸，可以作為引物使用。如果有各序列號(hào)中所示的全部序列的話將會(huì)更好。
應(yīng)用上述各種核酸作為引物對(duì)各種真菌類的多數(shù)菌珠的線粒體的細(xì)胞色素b基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，從而測定其堿基序列。擴(kuò)增后的DNA片段在各自菌種中共同的堿基序列如序列號(hào)5～9中所示。序列號(hào)5所示由煙曲霉而來，序列號(hào)6所示由黃曲霉而來，序列號(hào)7所示由黑色曲霉而來，序列8所示由構(gòu)巢曲霉而來，序列9所示由土曲霉而來的擴(kuò)增了的DNA片段的序列。將這些擴(kuò)增的片段為模板就可以利用后面所講的各種真菌不同種類特異的引物進(jìn)一步地進(jìn)行核酸擴(kuò)增。或者用限制性內(nèi)切酶將這些擴(kuò)增產(chǎn)物切斷，通過比較那些片段形成的帶型而能檢出引物的延長物(PCR-RFLP)。
而且，含有這些擴(kuò)增片段的任意連續(xù)的10～100個(gè)堿基，優(yōu)選是由15～30個(gè)堿基而成的序列的核酸，可以作為上述各個(gè)真菌的檢出用核酸。在此，所說的檢出用核酸，包含核酸擴(kuò)增用的引物及探針，作為探針應(yīng)用的時(shí)候，可以用眾所周知的方法對(duì)核酸進(jìn)行標(biāo)記。
象下面實(shí)施例中具體記載的，發(fā)明人對(duì)曲霉屬真菌中不同種類的菌株進(jìn)行了基因擴(kuò)增，并測定了其堿基序列，通過將那些堿基序列進(jìn)行深入比較，發(fā)現(xiàn)了不同菌株其各自特異的部位。這些特異的部位1個(gè)堿基，例如煙曲霉在序列號(hào)5所示的序列中第24位的T、第99位的T、144位的T、252位的C、277位的G、304位的G、312位的A、393位的G，黃曲霉在序列號(hào)6所示的序列中的第174位的Y，黑曲霉在序列號(hào)7所示序列中第42位的A、第69位的C、第126位的C、207位的A、213位的A、246位的A、396位的G，構(gòu)巢曲霉在序列號(hào)8所示的序列中第60位的T、第221位的C、第271位的A、第285位的A、第366位的T、第387位的A，土曲霉在序列號(hào)9所示序列中第25位的T、第48位的T、第162位的T、第225位的C、第262位的C、第339位的C、第360位的A、第375位的A、第411位的A分別為不同菌株的特異的堿基部位。這些特異的部位也在序列號(hào)5～9中所示的序列的互補(bǔ)序列中作為互補(bǔ)堿基而存在。把這些特異的部位(1個(gè)堿基)作為3′端寡核苷酸核酸擴(kuò)增用的引物，只擴(kuò)增不同種類的各自線粒體的細(xì)胞色素b的基因片段，因此可以將不同菌種特異性地檢出，也就是說，不同菌種的鑒定成為可能。
將含有序列號(hào)1、2和/或57中所示堿基序列的核酸(作為正向引物應(yīng)用)組合起來，如上所述可以作為引物應(yīng)用的核酸(作為反向引物應(yīng)用)的序列的實(shí)例表示在序列號(hào)10～15、62～65中。這些在序列號(hào)5～9中所示的序列互補(bǔ)的序列中，上述的任何特異部位作為3′端的寡核苷酸，是至少含有10個(gè)堿基以上的核酸。也就是說，含有序列號(hào)10及65(都將序列號(hào)5第304位的G和相對(duì)應(yīng)的C作為3′端，序列號(hào)5的互補(bǔ)鏈)中所示堿基配對(duì)序列的核酸作為煙曲霉的檢出用核酸，將含有序列號(hào)11及12(全部將與序列號(hào)6的第174位的Y(C或者T)相對(duì)應(yīng)的G或A作為3′末端、序列號(hào)6的互補(bǔ)鏈)中所示堿基序列的核酸作為黃曲霉的檢出用核酸。將含有序列號(hào)13(序列號(hào)7的第126位的C相應(yīng)的G作為3′末端，序列號(hào)7的互補(bǔ)鏈)及序列號(hào)64(序列號(hào)7的第207位的A相對(duì)應(yīng)的T作為3′末端，序列號(hào)7的互補(bǔ)鏈)中所示的堿基配對(duì)序列的核酸作為黑曲霉的檢出用核酸，將含有序列號(hào)14(序列號(hào)8的第221位的C相對(duì)應(yīng)的G作為3′末端、序列號(hào)8的互補(bǔ)鏈)及序列號(hào)63(序列號(hào)8的第271位的A相對(duì)應(yīng)的T作為3′末端，序列號(hào)8的互補(bǔ)鏈)中所示堿基序列的核酸作為構(gòu)巢曲霉的檢出用核酸，將含有序列號(hào)15(序列號(hào)9的第375位的A相應(yīng)的T作為3′末端，序列號(hào)9的互補(bǔ)鏈及序列號(hào)62(序列號(hào)9的第360位的A相對(duì)應(yīng)的T作為3′末端，序列號(hào)9的互補(bǔ)鏈)所示的堿基配對(duì)序列的核酸作為土曲霉的檢出用核酸。
另一方面，將含有序列號(hào)3、4、58、59、60和/或61中所示堿基序列的核酸(作為反向引物應(yīng)用)與上述的特異的部位(1個(gè)堿基)作為3′端的寡核苷酸作為正向引物相結(jié)合，可以設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增鑒定不同種類真菌的核酸的引物。例如可以從以下的寡核苷酸中進(jìn)行選擇。諸如煙曲霉的序列號(hào)5所示的序列中第24位的T、第99位的T、第144位的T、第252位的C、第277位的G、第304位的G、第312位的A及第393位的G中的任一個(gè)堿基作為3′末端的至少含10個(gè)堿基以上寡核苷酸中選擇。對(duì)于黃曲霉菌可以從序列號(hào)6所示的序列中第174位的Y作為3′末端的至少含10個(gè)堿基以上的寡核苷酸中選擇。對(duì)于黑曲霉可以從序列號(hào)7所示的序列中第42位的A，第69位的C、第126位的C、第207位的A、第213位的A、第246位的A及第396位的G中任意一個(gè)作為3′端的至少含10個(gè)堿基以上的寡核苷酸中進(jìn)行選擇。對(duì)于構(gòu)巢曲霉可以在序列號(hào)8所示的序列中第60位的T、第221位的C、第271位的A、第285位的A、第366位的T及第387位的A中的任何一個(gè)作為3′端的至少含10個(gè)堿基以上寡核苷酸中選擇。對(duì)于土曲霉可以從序列號(hào)9所示序列中第25位的T、第48位的T、第162位的T、第225位的C、第261位的C、第339位的C、第360位的A、第375位的A及第411位的A中的任意一個(gè)作為3′末端的至少含有10個(gè)以上堿基的寡核苷酸中選擇。其中優(yōu)選用作正向引物的序列是序列號(hào)66至75。含有序列號(hào)66及67(全部將序列號(hào)6的第174位的Y(C或T)作為3′末端)所示堿基序列的核酸作為黃曲霉菌的檢出用核酸。將含有序列號(hào)68(序列號(hào)5的第304位的G作為3′末端)及序列號(hào)69(序列號(hào)5的第312位的A作為3′末端)中所示的堿基序列的核酸作為煙曲霉的檢出用核酸。將含有序列號(hào)70(序列號(hào)7的第126位的C作為3′末端)及序列號(hào)71(序列號(hào)7的第213位的A作為3′末端)中所示的堿基序列的核酸作為黑曲霉的檢出用核酸，將序列號(hào)72(序列號(hào)8的第221位的C作為3′末端)及序列號(hào)73(序列號(hào)8的第285位的A作為3′末端所示堿基序列的核酸作為構(gòu)巢曲霉的檢出用核酸。將含有序列號(hào)74及75所示的堿基序列的核酸作為土曲霉的檢出用核酸(全部將序列號(hào)9的第375位的A作為3′末端)。
而且，這些寡核苷酸不僅可以用作引物，當(dāng)連上適當(dāng)?shù)臉?biāo)記之后還可以當(dāng)作不同種類真菌的特異的探針。被當(dāng)作引物或探針用的上述的核酸，如果從3′末端起有連續(xù)10個(gè)以上堿基，就可以用于作引物或探針。不過，核酸的堿基數(shù)優(yōu)選為10～100，特別優(yōu)選是15～30個(gè)堿基。而且如果有序列號(hào)10-15、62-75中所示序列的全部堿基序列的話將會(huì)更優(yōu)選。
上述本發(fā)明的核酸的各序列號(hào)中所示的堿基序列中的胸腺嘧啶(T)可以為尿嘧啶(U)。也就是說，本發(fā)明的核酸包括脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)兩種。而且，本發(fā)明的核酸可以是在堿基序列中任意位點(diǎn)的T可作為含有U這樣的尿苷的DNA，同樣任意位點(diǎn)的U可以是含有T這樣胸苷殘基的RNA。進(jìn)一步講就是各核酸的互補(bǔ)鏈也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。因?yàn)檎婢腄NA有兩條鏈組成，因此各核酸的互補(bǔ)鏈也對(duì)于各核酸雜交鏈的互補(bǔ)鏈進(jìn)行雜交。而且各核酸僅限于上述的用途，當(dāng)核酸中發(fā)生缺失、插入或置換這種點(diǎn)突變及修飾核苷酸存在也沒有問題。這些也包含本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的核酸的獲取方法沒有特別地限定。較好的方法是化學(xué)合成。這種方法可以容易、大量且便宜地獲得一定品質(zhì)的核酸。其化學(xué)合成可以根據(jù)亞磷酸胺法、磷酸三酯法等常法進(jìn)行。
本發(fā)明的曲霉屬真菌的檢出、分類、鑒定的方法，是以利用上述的曲霉屬真菌的檢出、分類、鑒定核酸為特征建立的方法。該方法是(1)將該核酸作為探針對(duì)曲霉屬真菌進(jìn)行檢出、分類、鑒定的方法；(2)列舉了將該核酸作為引物通過PCR等方法進(jìn)行延伸反應(yīng)通過測定引物的延伸物而將曲霉屬真菌進(jìn)行檢出、分類、鑒定的方法，這些檢出方法所使用的核酸，加入標(biāo)記物后可作為標(biāo)記核酸。而且利用標(biāo)記了的核酸進(jìn)行檢測曲霉屬真菌將更容易。標(biāo)記物可選用抗原、半抗原、酶、熒光素、發(fā)光物質(zhì)、酶底物、放射性物質(zhì)、不溶性載體等。標(biāo)記在核酸的末端或核酸序列之中都可以。而且標(biāo)記物可以與核苷酸的糖、磷酸基、堿基的任何部分結(jié)合。
本發(fā)明將曲霉屬真菌的檢出、分類、鑒定用核酸作為探針或引物對(duì)其進(jìn)行檢測、分類、鑒定的方法列舉如下(1)、(2)。
(1)將本發(fā)明的曲霉屬真菌的檢出、分類、鑒定用核酸當(dāng)作特征應(yīng)用，將該核酸探針同檢測物進(jìn)行雜交后，將探針作為指標(biāo)來檢測樣品中的檢測物。在這種方法中，探針最好應(yīng)用經(jīng)標(biāo)記物標(biāo)記了的核酸。這種檢出方法的實(shí)施，就是將該標(biāo)記核酸作為探針，使被測樣品中曲霉屬真菌基因同該標(biāo)記探針進(jìn)行雜交后，將曲霉屬真菌基因同標(biāo)記探針的結(jié)合物或非結(jié)合的標(biāo)記探針通過適于標(biāo)記物的適當(dāng)?shù)臋z測方法進(jìn)行檢出。
檢測物，就是被檢樣品中的曲霉屬真菌基因與探針的雜交物，將檢測物用通常的方法進(jìn)行預(yù)處理、純化而成的物質(zhì)作為被檢樣品，將此與作為探針的標(biāo)記核酸相混合，從室溫加熱到70℃，從10分鐘到48小時(shí)以處理。而且檢測物質(zhì)可以提前將本發(fā)明的核酸作為引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
(2)以本發(fā)明的將曲霉屬真菌的檢出用核酸作為引物，通過DNA聚合酶等進(jìn)行延長反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)基因擴(kuò)增，從而只對(duì)曲霉屬真菌的細(xì)胞色素b的基因片段進(jìn)行特異性地?cái)U(kuò)增，通過檢測擴(kuò)增產(chǎn)物而實(shí)現(xiàn)對(duì)曲霉屬真菌的檢出、分類及鑒定。在這種情況下，可以用經(jīng)前面所講標(biāo)記物標(biāo)記過的核酸作為引物應(yīng)用。在此所用的基因擴(kuò)增法具體講是指PCR方法，但并不特定僅限于此種方法，將短鏈的寡核苷酸作為引物而用于基因合成的開始的任意的基因擴(kuò)增法都可應(yīng)用。本發(fā)明曲霉屬真菌的檢測法是通過依據(jù)上述方法而擴(kuò)增了的擴(kuò)增產(chǎn)物即細(xì)胞色素b基因片段的檢出而得以實(shí)施。或者將擴(kuò)增了的細(xì)胞色素b的基因片段通過限制性內(nèi)切酶的剪切而成的片段，將片段形成的帶型進(jìn)行比較而得以實(shí)施。這里用的限制性內(nèi)切酶可單獨(dú)，也可合并應(yīng)用。擴(kuò)增了的細(xì)胞色素b的基因片段或者經(jīng)限制性內(nèi)切酶進(jìn)一步剪切下的片段的檢出方法并非是特別限定的，可使用普通的基因檢測方法(如電泳法)。擴(kuò)增產(chǎn)物例如通過電泳所形成的分級(jí)分離的特異而且對(duì)于檢出非常鮮明的泳帶可以很容易地檢出。當(dāng)要檢測復(fù)數(shù)的病原真菌時(shí)，將復(fù)數(shù)的引物混合應(yīng)用，通過電泳分層而檢測的帶，由于各病原真菌各自的分子量不同，帶的位點(diǎn)也不同，為了實(shí)施對(duì)各病原真菌的檢測及鑒定而設(shè)計(jì)不同的引物。引物再次進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，將通過恰當(dāng)標(biāo)記物標(biāo)記過的脫氧核酸(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)或者核糖核酸(ATP、UTP、GTP、CTP)作為DNA或者RNA的合成原料應(yīng)用，據(jù)此而能使擴(kuò)增產(chǎn)物高強(qiáng)度地被直接檢測出?；蛘咭部梢詰?yīng)用本發(fā)明的曲霉屬真菌檢出、分類、鑒定用核酸經(jīng)過標(biāo)記后的標(biāo)記核酸作為引物而可以同樣高敏感度地檢測出擴(kuò)增產(chǎn)物。此時(shí)，用于標(biāo)記用的物質(zhì)優(yōu)選選用放射性物質(zhì)、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)或發(fā)光誘導(dǎo)物質(zhì)。
下面將用一個(gè)例子詳細(xì)說明本發(fā)明的曲霉屬真菌的檢出，分類、鑒定用核酸的應(yīng)用方法。從被檢物質(zhì)中提取出核酸，將序列號(hào)2的核酸同序列號(hào)10～15的核酸的混合物作為引物進(jìn)行PCR核酸延伸反應(yīng)，當(dāng)煙曲霉存在時(shí)有323個(gè)堿基對(duì)長度的的核酸被擴(kuò)增，當(dāng)黃曲霉菌存在時(shí)有193或194個(gè)堿基對(duì)長度的核酸被擴(kuò)增，當(dāng)黑曲霉存在時(shí)有148個(gè)堿基對(duì)長度的核酸被擴(kuò)增，當(dāng)構(gòu)巢曲霉存在時(shí)有244個(gè)堿基對(duì)長度的核酸被擴(kuò)增，當(dāng)土曲霉存在時(shí)有397個(gè)堿基對(duì)長度的核酸被擴(kuò)增。擴(kuò)增后的核酸由于其各自不同的分子量通過各種電泳法而可以被分離和檢出，從而可以判定有何種曲霉屬真菌存在。還有將序列號(hào)2的核酸同序列號(hào)62～65的核酸的混合物作為引物進(jìn)行PCR等核酸延伸反應(yīng)，當(dāng)有煙曲霉存在時(shí)有329個(gè)堿基對(duì)長度的核酸被擴(kuò)增，當(dāng)有黃曲霉菌存在時(shí)有193或194個(gè)堿基對(duì)長度的核酸被擴(kuò)增，當(dāng)有黑曲霉存在時(shí)有231個(gè)堿基對(duì)長度的核酸被擴(kuò)增，當(dāng)有構(gòu)巢曲霉存在時(shí)有294個(gè)堿基對(duì)長度的核酸被擴(kuò)增。當(dāng)有土曲霉存在時(shí)有379個(gè)堿基對(duì)長度的核酸被擴(kuò)增。將序列號(hào)57的核酸(混合物)與序列號(hào)62～65的核酸的混合物作為引物進(jìn)行PCR等核酸延伸反應(yīng)，當(dāng)煙曲霉存在時(shí)有330個(gè)堿基對(duì)長度的核酸被擴(kuò)增，有黃曲霉菌存在時(shí)有194或195個(gè)堿基對(duì)長度的核酸，當(dāng)有黑曲霉存在時(shí)有232個(gè)堿基對(duì)長度的核酸，當(dāng)有構(gòu)巢曲霉存在時(shí)有295個(gè)堿基對(duì)長度的核酸，當(dāng)有土曲霉存在時(shí)有380個(gè)堿基對(duì)長度的核酸進(jìn)行擴(kuò)增。將序列號(hào)3、58、59、60和/或61(各序列為混合物)同序列號(hào)66～75的核酸的混合物作為引物進(jìn)行PCR等核酸延伸反應(yīng)，當(dāng)有煙曲霉存在時(shí)有163個(gè)堿基對(duì)(依據(jù)序列號(hào)68)及146個(gè)堿基對(duì)(依據(jù)序列號(hào)69)長度的核酸被擴(kuò)增，當(dāng)有黃曲霉菌存在時(shí)有287個(gè)堿基對(duì)長度的核酸，當(dāng)有黑曲霉存在時(shí)有337個(gè)堿基對(duì)(依據(jù)序列號(hào)70)及245個(gè)堿基對(duì)(參照序列號(hào)71)長度的核酸，當(dāng)有構(gòu)巢曲霉存在時(shí)有236個(gè)堿基對(duì)(參照序列號(hào)72)及180個(gè)堿基對(duì)(依據(jù)序列號(hào)73)長度的核酸，當(dāng)有土曲霉存在時(shí)，有86個(gè)堿基對(duì)長度(依據(jù)序列號(hào)74)及83個(gè)堿基對(duì)長度(依據(jù)序列號(hào)75)的核酸各自進(jìn)行擴(kuò)增。另外，序列號(hào)66～75中各包含兩個(gè)使各種曲霉屬真菌擴(kuò)增用的引物，從中各選一個(gè)引物，共應(yīng)用5個(gè)正向的引物的混合物能夠?qū)⑸鲜龅?種曲霉屬真菌同時(shí)檢出及鑒定。
本發(fā)明用于曲霉屬真菌檢出用的樣品盒的特征是含有對(duì)此真菌檢出用核酸或者將此核酸經(jīng)適當(dāng)標(biāo)記物標(biāo)記過的核酸。本發(fā)明的試劑盒可以含有上述的核酸，也可以含有作為其他成分的標(biāo)記檢出用試劑及緩沖液。試劑盒中的核酸，既可以當(dāng)作引物用，也可以當(dāng)作探針用。不管是將核酸當(dāng)作引物用還是當(dāng)作探針用，雖然兩者的手段不同，但對(duì)于曲霉屬真菌的檢出來說其本質(zhì)是相同的。當(dāng)該試劑盒中的核酸作為探針用時(shí)可依據(jù)上述方法(1)作為曲霉屬真菌的檢出用試劑盒，當(dāng)該試劑盒中的核酸作為引物應(yīng)用時(shí)，可依據(jù)上述方法(2)進(jìn)行。
如果將試劑盒中的核酸當(dāng)作探針應(yīng)用時(shí)本發(fā)明的試劑盒中，除含有曲霉屬真菌檢出用核酸或標(biāo)記過的核酸外，還含有標(biāo)記檢出用的試劑及緩沖液等。當(dāng)將試劑盒中的核酸當(dāng)作引物應(yīng)用的時(shí)候，樣品盒中除含有曲霉屬真菌檢出用核酸或標(biāo)記過的核酸之外，還含有核酸合成酶(如DNA聚合物、RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等)，脫氧核糖核酸(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)、核糖核苷酸(ATP、UTP、GTP、CTP)、限制性內(nèi)切酶、緩沖液等。而且，本發(fā)明的核酸同固相載體結(jié)合，可以作為捕捉探針應(yīng)用。此時(shí)，可以將捕捉探針與標(biāo)記探針合在一起進(jìn)行。而且也有將核酸進(jìn)行標(biāo)記的捕捉方法。此外還有將核酸用生物素標(biāo)記后進(jìn)行雜交，用抗生物素蛋白結(jié)合載體進(jìn)行捕捉的方法。對(duì)于原位雜交來說，如果將一方用作本發(fā)明的核酸，可以對(duì)本發(fā)明的核酸進(jìn)行特異的測定，而其他核酸的特異性將會(huì)非常低下。
以下將基于本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行更具體的說明，但是本發(fā)明并不僅限于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例1(各種DNA的合成)有序列表中序列號(hào)為1～4、10～15及57～75中所顯示的序列DNA，是利用商業(yè)用委托DNA合成服務(wù)而合成的。下面，將序列號(hào)1～4、10～15及57～75中所示的各種DNA，分別稱作DNA 1～4、10～15及57～75。
實(shí)施例2(煙曲霉的細(xì)胞色素b基因擴(kuò)增反應(yīng))將應(yīng)用ポテトデキストロ-ス液體培養(yǎng)基培養(yǎng)而得的煙曲霉各株(Aspergillus fumigatus IFM 40804、40806、40807、40819、41206、41392、45916、45917、46980、5355)的菌體經(jīng)75％酒精處理后滅菌，經(jīng)150g、10分鐘離心獲得菌體，各加入40ml分離用緩沖液(0.9M山梨糖醇、10mM EDTA、10mM Tris鹽酸緩沖液pH7.1)，充分振蕩混勻后經(jīng)1500g、10分鐘離心后棄上清液，再加入30ml的相同緩沖液，同樣離心后棄上清，再加入9ml的相同緩沖液。另外加入1ml溶在相同緩沖液中的酶解酶(Zymolyase)生化工業(yè)(株)制(10 mg/ml)37℃溫育1小時(shí)。再加入0.9～1.33mm玻璃珠，渦流混合器處理1～2分鐘以破壞細(xì)胞壁。然后經(jīng)500g，10分鐘離心后取上清，再經(jīng)20000g 15分鐘離心后得沉淀。將沉淀用分離用緩沖液洗干凈、再次20000g離心15分鐘，就會(huì)得到煙曲霉各株的線粒體級(jí)分。將得到的線粒體級(jí)分中分別加入1mg/ml蛋白酶K 0.5ml，37℃溫育1小時(shí)，加入苯酚、氯仿、異戊醇的混合液(25∶24∶1)1ml，振蕩混勻后，經(jīng)1500g、10分鐘離心后取上層，加入1ml飽和苯酚，振蕩混勻后經(jīng)1500g、10分鐘離心取上層。再加入0.1ml 3M的醋酸鈉、0.1M氯化鎂，3ml酒精，-20℃放置一夜。然后經(jīng)20000g、10分鐘離心取沉淀，將沉淀物用-20℃的75％的酒精洗凈，1500g、10分鐘離心后棄上清、得到DNA、干燥后-20℃保存。
以獲得的DNA為模板、將實(shí)施例1得到的DNA 1(序列號(hào)1)同DNA 3(序列號(hào)3)(IFM40804、40819用)或4(IFM 40806、40807、41206、41392、45916、45917、46980、5355)作為引物，使用寶酒造公司的TaKaRa PCR Amplification Kit(Roll)、三洋公司的DNA擴(kuò)增裝置(MIR-D30)按以下方法進(jìn)行PCR反應(yīng)，將細(xì)胞色素b基因的一部分進(jìn)行擴(kuò)增。
反應(yīng)液的組成如下×10PCR緩沖液 (試劑盒中所帶) 5μlPCR dNTP混合液 (試劑盒中所帶) 4μlTaq DNA合成酶 (試劑盒中所帶) 1μl(2.5u)DNA11μlDNA 3或41μl線粒體DNA 1μl加水總量至50μl反應(yīng)條件如下加熱變性94℃1分鐘退火50℃1分鐘延伸反應(yīng)72℃2分鐘將擴(kuò)增后的DNA用瓊脂糖凝膠電泳法分離純化，按以下的方法分析其堿基對(duì)序列。
應(yīng)用PE公司的DNA測序儀(ABI Prism377)根據(jù)其操作指南，用ダィタ一シネ一タ一法進(jìn)行分析。分析堿基序列用的引物選用正向側(cè)的DNA2(序列號(hào)2)、反向側(cè)為DNA3(IFM 40804、40819用)或4(IFM40806、40807、41206、41392、45916、45917、46980、5355)。確定后的堿基序列如序列號(hào)16～25所示。
實(shí)施例3(黃曲霉細(xì)胞色素b基因的擴(kuò)增反應(yīng))采用同實(shí)施例2同樣的方法將黃曲霉菌各株(Aspergillus flavusIFM 40603、40800、41087、41933、45909、45910、45911、46870、5364、5366)中細(xì)胞色素b基因的一部分進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增，測定堿基序列。引物包括DNA2和DNA3(IFM41933、45910、5366用)或者4(IFM40603、40800、41087、45909、45911、46870、5364用)。堿基序列分析用正向引物用DNA2、反向引物為DNA 3(IFM41933，45910、5366用)或者4(IFM 40603、40800、41087、45909、45911、46870、5364用)。確定后的堿基序列為序列號(hào)26～35所示。
實(shí)施例4(黑曲霉的細(xì)胞色素b的基因擴(kuò)增反應(yīng))同例2一樣的方法將黑曲霉各株(Aspergillus niger IFM 40606、41398、41399、46897、5367、5368)中的細(xì)胞色素b基因的一部分進(jìn)行擴(kuò)增。測定其堿基序列。引物用DNA2和DNA3(IFM 41399用)或者4(IFM 40606、41398、46897、5367、5368)。堿基序列分析用引物為正向引物是DNA2，反向引物用DNA3或DNA4。確定后的堿基序列為序列號(hào)36～41中所示。
實(shí)施例5(構(gòu)巢曲霉的細(xì)胞色素b基因擴(kuò)增反應(yīng))用與實(shí)施例2同樣的方法對(duì)構(gòu)巢曲霉各株(Aspergillus niduransIFM 41094、46999、47004、47006、41395)的細(xì)胞色素b基因的一部分進(jìn)行PCR擴(kuò)增測定其堿基序列。引物應(yīng)用DNA2和DNA3(IFM47004、47006用)或4(IFM41094、46999、41395用)堿基序列分析用正向引物用DNA2，反向引物用DNA3或DNA4，確定后的堿基序列為序列號(hào)42～46所示)。
實(shí)施例6(土曲霉的細(xì)胞色素b基因擴(kuò)增反應(yīng))同實(shí)施例2一樣的方法將土曲霉各株(Aspergillus terreus IFM40851、40852、41092、5372、40850)細(xì)胞色素b基因的一部分用RCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，測定其堿基序列。引物用DNA2和DNA3。堿基序列分析時(shí)正向引物用DNA2、反向引物用DNA3。確定后的堿基序列為序列號(hào)47～51所示。
實(shí)施例7(乳酒假絲酵母的細(xì)胞色素b基因擴(kuò)增反應(yīng))同實(shí)施例2一樣的方法，用實(shí)施例1所得的DNA1和DNA3，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增假絲酵母屬(乳酒假絲酵母IFM5773、5800)的細(xì)胞色素b的基因的一部分，并測定其堿基序列。作為堿基序列分析正向引物用DNA2，反向引物用DNA3，其堿基序列如序列號(hào)52～53所示。
實(shí)施例8(熱帶假絲酵母細(xì)胞色素b基因擴(kuò)增反應(yīng))
同實(shí)施例2一樣的方法，用實(shí)施例1所得的DNA1和DNA3，將熱帶假絲酵母(Candida tropicalis IFM 40018，46816)細(xì)胞色素b基因的一段通過PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，測定其堿基序列。堿基序列分析正向引物用DNA2，反向引物用DNA3，其堿基序列為序列號(hào)54～55所示。
實(shí)施例9(深紅色發(fā)癬菌的細(xì)胞色素b基因擴(kuò)增反應(yīng))同實(shí)施例2一樣的方法，用實(shí)施例1所得的DNA1和DNA3，將深紅色發(fā)癬菌(Trichophyton rubrum IFM 45593)細(xì)胞色素b基因的一段通過PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增測定其堿基序列。序列分析的引物正向?yàn)镈NA2，反向用DNA3。其堿基配對(duì)序列如序列號(hào)56所示。
實(shí)施例10(對(duì)煙曲霉依據(jù)PCR方法進(jìn)行鑒定)使用實(shí)施例1的DNA2溶液和DNA10溶液。用寶酒造公司TaKaRaPCR Amplifcation Kit(R011)，三洋的DNA擴(kuò)增裝置(MIR-D30)，用同實(shí)施例2一樣的方法進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增煙曲霉的細(xì)胞色素b基因的一部分。煙曲霉的DNA通過苯酚提取法獲得。將含有10μl擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)液進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后經(jīng)紫外線照射發(fā)生熒光(圖1、帶1和2)。電泳條件為電壓75V，時(shí)間為45分鐘。反應(yīng)液中其他分子量標(biāo)記物也同時(shí)泳動(dòng)，通過比較相對(duì)泳動(dòng)度，算出被檢出的DNA的長度，約323個(gè)堿基對(duì)。
實(shí)施例11(對(duì)黃曲霉依據(jù)PCR法進(jìn)行鑒定)使用實(shí)施例1和DNA2、DNA11和12(序列號(hào)分別為11和12)溶液，采用同實(shí)施例10的方法將黃曲霉的細(xì)胞色素b基因的一部分用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，用電泳法檢出擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1、帶3、4及5)。算出檢出的DNA片段的長度，約193至194個(gè)堿基對(duì)。
實(shí)施例12(黑曲霉的PCR法鑒定)使用實(shí)施例1的DNA2溶液及DNA13(序列號(hào)13)溶液，用實(shí)施例10的方法將黑曲霉的細(xì)胞色素b基因的一部分用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物用電泳檢出(圖1帶6、7及8)。計(jì)算檢出的DNA片段的長度，約148個(gè)堿基對(duì)。
實(shí)施例13(構(gòu)巢曲霉的PCR法鑒定)使用實(shí)施例1的DNA2及DNA14(序列號(hào)14)溶液，用實(shí)施例10的方法將構(gòu)巢曲霉的細(xì)胞色素b基因的一部分用PCR法擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物用電泳檢出(圖1、帶9和10)。計(jì)算檢出的DNA的長度，約244個(gè)堿基對(duì)。
實(shí)施例14(土曲霉的PCR法鑒定)使用實(shí)施例1的DNA2和DNA15(序列號(hào)15)溶液，同實(shí)施例10一樣的方法將土曲霉的細(xì)胞色素b基因的一部分用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，計(jì)算擴(kuò)增后的DNA片段的長度，將擴(kuò)增產(chǎn)物用電泳法檢出，(圖1，帶11和12)，其DNA片段長度約397個(gè)堿基對(duì)。
上述圖1各帶的菌株具體描述如下帶1 煙曲霉 IFM40819帶2 黃曲霉 IFM40806帶3 黃曲霉 IFM41933帶4 黃曲霉 IFM5366帶5 黃曲霉 IFM45910帶6 黑曲霉 IFM41398帶7 黑曲霉 IFM41399帶8 黑曲霉 IFM46897帶9 構(gòu)巢曲霉 IFM47004帶10構(gòu)巢曲霉 IFM41094帶11土曲霉 IFM40850帶12土曲霉 IFM41092帶13大小標(biāo)記(100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500bp)實(shí)施例15(巴西果小克銀漢霉(Cunninghamella bertholetiae)色素b基因擴(kuò)增反應(yīng))采用與實(shí)施例2 同樣的方法將巴西果小克銀漢霉菌(Cunninghamella bertholletiae IFM 46114)的細(xì)胞色素b基因的一部分通過PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。測其堿基序列，引物用DNA57和DNA58。堿基序列分析時(shí)正向引物用DNA57，反應(yīng)引物DNA58，確定后的堿基序列為序列號(hào)76所示。
實(shí)施例16(卷枝毛霉的細(xì)胞色素b基因擴(kuò)增反應(yīng))采用與例2同樣的方法將卷枝毛霉(Mueor circinelloides IFM40507)的細(xì)胞色素b基因的一部分用PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，測定其堿基配對(duì)序列。引物用DNA57和DNA60及DNA61。堿基序列分析時(shí)正向引物用DNA57，反向引物用DNA60及DNA61，測定后的堿基序列為序列號(hào)77所示。
實(shí)施例17用同實(shí)施例10～14一樣的方法將曲霉屬各菌種用PCR方法進(jìn)鑒定。所用引物為煙曲霉用DNA57和DNA65，黃曲霉用DNA11及DNA12，黑曲霉用DNA64，構(gòu)巢曲霉用DNA63，土曲霉用DNA62。電泳結(jié)果見圖2，圖2各泳帶所示菌株與圖1一樣。
實(shí)施例18采用同實(shí)施例10～14一樣的方法將曲霉屬各株用PCR方法進(jìn)行鑒定。所用引物如下煙曲霉用DNA3和DNA68，黃曲霉菌用DNA66和DNA67，黑曲霉用DNA70，構(gòu)巢曲霉用DNA72，土曲霉用DNA74。電泳結(jié)果見圖3。圖3所示各帶的菌株順序同圖1。
實(shí)施例19采用同實(shí)施例10～14一樣的方法將曲霉屬各菌株用PCR方法進(jìn)行鑒定。所用引物如下煙曲霉用DNA58和DNA69，黃曲霉用DNA66和DNA67，黑曲霉用DNA71，構(gòu)巢曲霉用DNA73，土曲霉用DNA75。電泳結(jié)果見圖4，圖4所示各菌株帶如圖1。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明能使病原真菌特別是曲霉屬真菌能迅速、簡便地特異而且高度敏感地被檢查出，分類及鑒定。因此對(duì)于感染了真菌的患者，能早期明確致病菌并給予恰當(dāng)?shù)闹委?。序列表序列?hào)1序列的長度20序列的類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC 20序列號(hào)2序列的長度21序列的類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無序列GAGGTGCTAC AGTTATTACT A 21序列號(hào)3序列的長度20序列的類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無序列GGTATAGMTC TTAAWATAGC 20序列號(hào)4序列的長度20序列的類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無序列AAAATAGCAT AGAAAGGTAA 20序列號(hào)5序列的長度425序列的類型核酸鏈數(shù)雙鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無來源煙曲霉(Aspergillus fumigatus)序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA GTTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420ATTTT 425序列號(hào)6序列的長度425序列的類型核酸鏈數(shù)兩種類型拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無來源黃曲霉(Aspergillus flavus)序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGAYATA 60GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCATTT AATYGCTATG 180CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATATCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240TTTGCTCCAT ATTTCATATT TAAAGATTTA GTWACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300TCTATATTTG TTTTCTTYAT GCCTAATGCT TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATYGTT CCAGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420ATTTT 425序列號(hào)7序列的長度425序列的類型核酸鏈數(shù)兩種類型拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無來源黑曲霉(Aspergillus niger)序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CATGAATAGG TCAAGATATA 60GTTGAGTTCA TATGAGGWGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAACAG ATTCTTTGCA 120TTACACTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCACTT AATAGCTATG 180CACGATACAG TAGGATCAGG TAATCCATTA GGAATATCAG GTAATTACGA TAGATTACCT 240TTTGCACCAT ATTTTATATT TAAAGATTTA GTAACTATCT TTATTTTCTT TATTGTATTA 300TCAATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCA TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360AAYCCAATGC AAACTCCACC TGCWATTGTA CCAGAGTGAT ATCTTTTACC TTTCTATGCT 420ATTTT 425序列號(hào)8序列的長度425序列的類型核酸鏈數(shù)兩種類型拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無來源構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTAATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATT 60GTTGAGTTTA TTTGAGGAGG TTTYTCTGTA AATAATGCAA CTTTAAACAG ATTCTTTGCA 120TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCTTTAGCAT TAATGCATTT AATAGCTATG 180CACGATACAG TAGGATCAGG KAATCCTTTA GGTATTTCAG CTAATTACGA TAGATTACCT 240TTTGCTCCTT ATTTTATATT TAAAGATTTA ATAACTATAT TTATATTCTT TATTGTATTA 300TCAATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCT TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360AATCCTATGC AAACTCCACC TGCTATAGTT CCAGAATGAT ATCTTTTACC TTTCTATGCT 420ATTTTA425序列號(hào)9序列的長度425序列的類型核酸鏈數(shù)兩種類型拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無來源土曲霉(Aspergillus terreus)序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACTTAATG AGTGCTATAC CTTGAATTGG TCAAGATATA 60GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CTTTAAATAG ATTCTTTGCA 120TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCWTTAGTTA TTATGCACTT AATAGCAATG 180CACGATACTG TAGGATCAGG TAATCCTTTA GGTATATCAG GTAACTACGA TAGATTACCT 240TTCGCTCCAT ATTTCGTATT CAAAGATTTA GTAACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300TCTATATTTG TTTTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGAGACA GTGAAAATTA TGTTATGGCA 360AACCCAATGC AAACACCACC TGCTATTGTA CCAGAATGAT ACTTATTACC ATTCTATGCT 420ATTTTA425序列號(hào)10序列的長度21序列的類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無序列AGGCATGAAG AATACAAATA C 21序列號(hào)11序列的長度22序列的類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無序列TCCTACAGTA TCGTGCATAG CG 22序列號(hào)12序列的長度21序列的類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無序列CCTACAGTAT CGTGCATAGC A 21序列號(hào)13序列的長度24序列的類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無序列GCTAATACAA AAGGTAATAA GAAG 24序列號(hào)14序列的長度25序列的類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無序列GCAAAAGGTA ATCTATCGTA ATTAG 25序列號(hào)15序列的長度24序列的類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無序列CATTCTGGTA CAATAGCAGG TGGT 24序列號(hào)16序列的長度437序列的類型核酸鏈數(shù)兩種類型拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無來源煙曲霉IFM40804序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA GTTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420ATTTTAAGAT CTATACC437序列號(hào)17序列的長度425序列的類型核酸鏈數(shù)兩種類型拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無來源煙曲霉IFM40806序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA GTTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420ATTTT 425序列號(hào)18序列的長度425序列的類型核酸鏈數(shù)兩種類型拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無來源煙曲霉IFM40807序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA GTTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420ATTTT 425序列號(hào)19序列的長度437序列的類型核酸鏈數(shù)兩種類型拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無來源煙曲霉IFM40819序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA GTTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420ATTTTAAGAT CTATACC437序列號(hào)20序列的長度425序列的類型核酸鏈數(shù)兩種類型拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無來源煙曲霉IFM41206序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA GTTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420ATTTT 425序列號(hào)21序列的長度425序列的類型核酸鏈數(shù)兩種類型拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無來源煙曲霉IFM41392序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA GTTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420ATTTT 425序列號(hào)22序列的長度425序列的類型核酸鏈數(shù)兩種類型拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無來源煙曲霉IFM45916序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA GTTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420ATTTT 425序列號(hào)23序列的長度425序列的類型核酸鏈數(shù)兩種類型拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無來源煙曲霉IFM45917序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA GTTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420ATTTT 425序列號(hào)24序列的長度425序列的類型核酸鏈數(shù)兩種類型拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無來源煙曲霉IFM46980序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA GTTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420ATTTT 425序列號(hào)25序列的長度425序列的類型核酸鏈數(shù)兩種類型拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無來源煙曲霉IFM5355序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60GTTGAATTTA TATGAGGTGG TTTCTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120TTACATTTCT TATTACCTTT TGTTTTAGCT GCATTAGTAA TAATGCATTT AATAGCAATG 180CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATTTCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240TTCGCTCCTT ACTTTGTATT TAAAGATTTA GTTACTGTAT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300TCTGTATTTG TATTCTTCAT GCCTAACGCA TTAGGTGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCGGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420ATTTT 425序列號(hào)26序列的長度425序列的類型核酸鏈數(shù)兩種類型拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無來源黃曲霉IFM40603序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGACATA 60GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCATTT AATCGCTATG 180CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATATCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240TTTGCTCCAT ATTTCATATT TAAAGATTTA GTTACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300TCTATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCT TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATCGTT CCAGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420ATTTT 425序列號(hào)27序列的長度425序列的類型核酸鏈數(shù)兩種類型拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無來源黃曲霉IFM40800序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCATTT AATCGCTATG 180CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATATCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240TTTGCTCCAT ATTTCATATT TAAAGATTTA GTAACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300TCTATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCT TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATTGTT CCAGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420ATTTT 425序列號(hào)28序列的長度425序列的類型核酸鏈數(shù)兩種類型拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無來源黃曲霉IFM41087序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGACATA 60GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCATTT AATCGCTATG 180CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATATCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240TTTGCTCCAT ATTTCATATT TAAAGATTTA GTTACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300TCTATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCT TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATCGTT CCAGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420ATTTT 425序列號(hào)29序列的長度437序列的類型核酸鏈數(shù)兩種類型括撲學(xué)直鏈假定序列無來源黃曲霉IFM41933序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGATATA 60GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCATTT AATTGCTATG 180CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATATCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240TTTGCTCCAT ATTTCATATT TAAAGATTTA GTTACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300TCTATATTTG TTTTCTTCAT GCCTAATGCT TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATCGTT CCAGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420ATTTTAAGAT CTATACC437序列號(hào)30序列的長度425序列的類型核酸鏈數(shù)兩種類型拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無來源黃曲霉IFM45909序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGACATA 60GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCATTT AATCGCTATG 180CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATATCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240TTTGCTCCAT ATTTCATATT TAAAGATTTA GTTACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300TCTATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCT TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATCGTT CCAGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420ATTTT 425序列號(hào)31序列的長度437序列的類型核酸鏈數(shù)兩種類型拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無來源黃曲霉IFM45910序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACCTTATG AGTGCTATAC CTTGAATAGG TCAAGACATA 60GTTGAATTTA TTTGAGGAGG TTTCTCTGTA AATAATGCAA CATTAAATAG ATTCTTTGCA 120TTACATTTCT TATTACCTTT TGTATTAGCT GCATTAGCTT TAATGCATTT AATCGCTATG 180CACGATACTG TAGGATCTGG TAATCCTTTA GGTATATCTG GTAATTATGA TAGATTACCT 240TTTGCTCCAT ATTTCATATT TAAAGATTTA GTTACTATCT TTATTTTCTT TATAGTATTA 300TCTATATTTG TTTTCTTTAT GCCTAATGCT TTAGGAGATA GTGAAAATTA TGTTATGGCT 360AATCCAATGC AAACTCCACC TGCTATCGTT CCAGAATGAT ACTTATTACC TTTCTATGCT 420ATTTTAAGAT 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TTATGCTATW 420TTAAGATCTA TACC 434序列號(hào)53序列的長度434序列的類型核酸鏈數(shù)兩種類型拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無來源乳酒假絲酵母IFM5800序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATTTATTC TCAGCTATTC CATTAATTGG ACAAGATATT 60GTATTATGAT TATGAGGAGG TTTCTCAGTA TCTAACCCTA CAATTCAAAG ATTCTTTGCA 120TTCCATTACT TAGTACCATT TATTATTGCT GCTTGTGTAA TTATGCATTT AATGGCTTTA 180CATACACATG GTTCATCAAA TCCTTTAGGT GTAACAGGTA ATTTAGATAG ATTACCAATG 240CATGGATACT TTATTTTTAA AGATTTAATT ACAGTATTTG TATTCTTAAT TTTCTTCTCA 300TTATTTGTAT TCTTCTCACC TAATACATTA GGACATCCTG ATAACTATAT TCCAGGTAAT 360CCATTAGTAA CACCAGCATC AATTGTACCT GAATGATACT TATTACCATT TTATGCTATT 420TTAAGATCTA TACC 434序列號(hào)54序列的長度434序列的類型核酸鏈數(shù)兩種類型拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無來源熱帶假絲酵母IFM40018序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAACTTATTA TCAGCTATAC CATTTATAGG TAATGATATA 60GTACCATTTA TATGAGGAGG TTTCTCTGTA TCAAATCCTA CAATACAAAG ATTTTTTGCA 120TTACATTATT TATTACCATT TATTTTAGCA GCATTAGTAG TAATGCATTT TATAGCATTA 180CATACTCATG GATCATCTAA TCCTGTAGGA ATATCAAGTA ATTTAGATAG AATACCAATG 240CATAGTTACT TTATATTTAA AGATTTAATT ACTGTATTTG TATTTATATT AGTATTTAGT 300TTATTTGTAT TCTTCTCACC TAATACTTTA GGACATCCTG ATAACTATAT ACCAGGTAAT 360CCTATGGTTA CACCTGCATC TATAGTACCT GAATGATATT TATTACCATT CTATGCTATA 420TTAAGATCTA TACC 434序列號(hào)55序列的長度434序列的類型核酸鏈數(shù)兩種類型拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無來源熱帶假絲酵母IFM46816序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC WAACTTATTA TCAGCTATAC CATTTATAGG TAATGATATA 60GTACCATTTA TATGAGGAGG TTTCTCTGTA TCAAATCCTA CAATACAAAG ATTTTTTGCA 120TTACATTATT TATTACCATT TATTTTAGCA GCATTAGTAG TAATGCATTT TATAGCATTA 180CATACTCATG GATCATCTAA TCCTGTAGGA ATATCAAGTA ATTTAGATAG AATACCAATG 240CATAGTTACT TTATATTTAA AGATTTAATT ACTGTATTTG TATTTATATT AGTATTTAGT 300TTATTTGTAT TCTTCTCACC TAATACTTTA GGACATCCTG ATAACTATAT ACCAGGTAAT 360CCTATGGTTA CACCTGCATC TATAGTACCT GAATGATATT TATTACCATT CTATGCTATW 420TTAAGATCTA TACC 434序列號(hào)56序列的長度437序列的類型核酸鏈數(shù)兩種類型拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無來源深紅色發(fā)癬菌IFM45593序列TGAGGTGCTA CAGTTATTAC TAATTTATTA AGTGCTATAC CTTGAATTGG TCAAGATTTA 60GTAGAATTTA TTTGAGGAGG TTTTTCTGTA AATAATGCTA CATTAAATAG ATTTTTTTCT 120TTACATTATT TATTACCTTT 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26序列號(hào)65序列的長度27序列的類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無序列TGCGTTAGGC ATGAAGAATA CAAATAC 27序列號(hào)66序列的長度24序列的類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無序列GCATTAGCTT TAATGCATTT AATC24序列號(hào)67序列的長度24序列的類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無序列GCATTAGCTT TAATGCATTT AATT24序列號(hào)68序列的長度30序列的類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無序列CTGTATTTAT TTTCTTTATA GTATTATCTG 30序列號(hào)69序列的長度21序列的類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無序列ATAGTATTAT CTGTATTTGT A 21序列號(hào)70序列的長度26序列的類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無序列CATTAAACAG ATTCTTTGCA TTACAC 26序列號(hào)71序列的長度21序列的類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無序列GGATCAGGTA ATCCATTAGG A21序列號(hào)72序列的長度20序列的類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無序列AATCCTTTAG GTATTTCAGC 20序列號(hào)73序列的長度28序列的類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無序列ATTTAAAGAT TTAATAACTATATTTATA 28序列號(hào)74序列的長度24序列的類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無序列GTTATGGCAA ACCCAATGCA AACA 24序列號(hào)75序列的長度21序列的類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無序列ATGGCAAACC CAATGCAAAC A 21序列號(hào)76序列的長度434序列的類型核酸鏈數(shù)兩種類型拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無來源巴西果小克銀漢霉(Cunninghamella bertholletiae)序列TGGGGAGCAA CAGTTATTAC TAATTTATTA TCTGCTATTC CTTGGATTGG TAAAGATCTT 60GTAGAATTTA TTTGGGGTGG TTTCAGTGTT GATAATGCTA CTTTAAATCG ATTCTTTAGT 120CTACATTATT TATTACCATT CATTCTTGCT GCTTTAGCAG TTATGCATTT AATTGCAAAA 180GAAGAAAATG GATCAAGTAA TCCATTAGGA ATTACAGCTA ATGCTGATAT GATTTATATG 240CATCCATATT ATATCTTTAA AGATTTAGTA ACTATTTTCT TATTCTTCTT AGTATTAGGA 300TTATTCTTAT TTTATGCTCC TAATAAATTA GGACATCCTG ATAATTATAT TCCAGCTAAT 360CCAATGCAAA CTCCAGCTTC TATTGTTCCT GAGTGGTATC TATTACCATT TTATGCTATT 420TTAASWKCTA TWCC434序列號(hào)77序列的長度434序列的類型核酸鏈數(shù)兩種類型拓?fù)鋵W(xué)直鏈假定序列無來源卷枝毛霉(Mucor circinelloides)序列TGGGGAGCAA CAGTTATTAC TAACCTATTA TCGGCTATCC CTTGGATTGG TAAAGATTTA 60GTAGAATTCA TCTGGGGAGG TTTCTCTGTA GATAATGCGA CATTAAACCG ATTCTTCAGT 120CTTCACTACT TATTACCATT CATCTTAGCA GCTTTATCTT TAATGCATTT AATTGCTAAA 180GAAGAAAATG GATCTAATAA TCCACTAGGA ATTACAGCAA ACACTGATAT GGTTTATCTT 240CATCCTTATT ACGTATTTAA AGATTTAGTA ACAATTTTCT TATTCTTCTT AGTATTAGCT 300TTATTCTTAT TCTATGCACC TAATAAATTA GGTCATCCTG ATAATTATAT TCCAGCTAAC 360CCAATGCAAA CTCCTGCATC TATTGTACCA GAATGGTATC TATTACCTTT CTATGCTATT 420TTAASWKCTA TWCC 43權(quán)利要求
1.真菌線粒體細(xì)胞色素b基因片段擴(kuò)增用引物，它是由含有序列表中序列號(hào)57所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列中連續(xù)的至少10個(gè)堿基的堿基序列構(gòu)成的核酸片段構(gòu)成的。
2.權(quán)利要求1的引物，它是由含有序列表中序列號(hào)57所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
3.真菌線粒體細(xì)胞色素b基因片段擴(kuò)增用引物，它是由含有序列表中序列號(hào)3所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列中連續(xù)的至少10個(gè)堿基的堿基序列構(gòu)成的核酸片段構(gòu)成的。
4.權(quán)利要求3的引物，它是由含有序列表中序列號(hào)3所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
5.真菌線粒體細(xì)胞色素b基因片段擴(kuò)增用引物，它是由含有序列表中序列號(hào)58所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列中連續(xù)的至少10個(gè)堿基的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
6.權(quán)利要求5的引物，它是由含有序列表中序列號(hào)58所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
7.真菌線粒體細(xì)胞色素b基因片段擴(kuò)增用引物，它是由含有序列表中序列號(hào)59所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列中連續(xù)的至少10個(gè)堿基的堿基序列構(gòu)成的核酸片段構(gòu)成的。
8.權(quán)利要求7的引物，它是由含有序列表中序列號(hào)59所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
9.真菌線粒體細(xì)胞色素b基因片段擴(kuò)增用引物，它是由含有序列表中序列號(hào)60所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列中連續(xù)的至少10個(gè)堿基的堿基序列構(gòu)成的核酸片段構(gòu)成的。
10.權(quán)利要求9的引物，它是由含有序列表中序列號(hào)60所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
11.真菌線粒體細(xì)胞色素b基因片段擴(kuò)增用引物，它是由含有序列表中序列號(hào)61所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列中連續(xù)的至少10個(gè)堿基的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
12.權(quán)利要求11的引物，它是由含有序列表中序列號(hào)61所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
13.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的引物，它是由含有各序列號(hào)中的通式所表示的堿基序列的核酸片段的混合物構(gòu)成的。
14.權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的引物，其中上述真菌是曲霉屬的真菌。
15.權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的引物，其中上述真菌是假絲酵母屬的真菌。
16.權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的引物，其中上述真菌是小克銀漢霉菌屬的真菌。
17.權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的引物，其中上述真菌是毛霉屬的真菌。
18.權(quán)利要求14的引物，其中曲霉屬的真菌選自煙曲霉，黃曲霉，黑曲霉，構(gòu)巢曲霉和土曲霉。
19.煙曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)5所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列的連續(xù)的10-100個(gè)堿基的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
20.黃曲霉檢測用核酸，它是有由含有序列表中序列號(hào)6所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列的連續(xù)的10-100個(gè)堿基的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
21.黑曲霉檢測用核酸，它是有由含有序列表中序列號(hào)7所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列的連續(xù)的10-100個(gè)堿基的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
22.構(gòu)巢曲霉檢測用核酸，它是有由含有序列表中序列號(hào)8所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列的連續(xù)的10-100個(gè)堿基的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
23.土曲霉檢測用核酸，它是有由含有序列表中序列號(hào)9所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列的連續(xù)的10-100個(gè)堿基的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
24.權(quán)利要求19-23任一項(xiàng)的檢測用核酸，它是連續(xù)的10-100的堿基，15-30的堿基。
25.煙曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)5所示的序列的24位的T作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的；或由序列表中序列號(hào)5中所示的互補(bǔ)序列上對(duì)應(yīng)的堿基作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的。
26.煙曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)5所示的序列的99位的T作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的；或由序列表中序列號(hào)5中所示的互補(bǔ)序列上對(duì)應(yīng)的堿基作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的。
27.煙曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)5所示的序列的144位的T作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的；或由序列表中序列號(hào)5中所示的互補(bǔ)序列上對(duì)應(yīng)的堿基作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的。
28.煙曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)5所示的序列的252位的C作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的；或由序列表中序列號(hào)5中所示的互補(bǔ)序列上對(duì)應(yīng)的堿基作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的。
29.煙曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)5所示的序列的277位的G作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的；或由序列表中序列號(hào)5中所示的互補(bǔ)序列上對(duì)應(yīng)的堿基作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的。
30.煙曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)5所示的序列的304位的G作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的；或由序列表中序列號(hào)5中所示的互補(bǔ)序列上對(duì)應(yīng)的堿基作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的。
31.煙曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)5所示的序列的312位的A作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的；或由序列表中序列號(hào)5中所示的互補(bǔ)序列上對(duì)應(yīng)的堿基作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的。
32.煙曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)5所示的序列的393位的G作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的；或由序列表中序列號(hào)5中所示的互補(bǔ)序列上對(duì)應(yīng)的堿基作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的。
33.黃曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)6所示的序列的174位的Y作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的；或由序列表中序列號(hào)6中所示的互補(bǔ)序列上對(duì)應(yīng)的堿基作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的。
34.黑曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)7所示的序列的42位的A作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的；或由序列表中序列號(hào)7中所示的互補(bǔ)序列上對(duì)應(yīng)的堿基作為3’末端，至少10個(gè)以上的堿基核酸構(gòu)成的。
35.黑曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)7所示的序列的69位的C作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的；或由序列表中序列號(hào)7中所示的互補(bǔ)序列上對(duì)應(yīng)的堿基作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的。
36.黑曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)7所示的序列的126位的C作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的；或由序列表中序列號(hào)7中所示的互補(bǔ)序列上對(duì)應(yīng)的堿基作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的。
37.黑曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)7所示的序列的207位的A作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的；或由序列表中序列號(hào)7中所示的互補(bǔ)序列上對(duì)應(yīng)的堿基作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的。
38.黑曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)7所示的序列的213位的A作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的；或由序列表中序列號(hào)7中所示的互補(bǔ)序列上對(duì)應(yīng)的堿基作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的。
39.黑曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)7所示的序列的246位的A作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的；或由序列表中序列號(hào)7中所示的互補(bǔ)序列上對(duì)應(yīng)的堿基作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的。
40.黑曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)7所示的序列的396位的G作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的；或由序列表中序列號(hào)7中所示的互補(bǔ)序列上對(duì)應(yīng)的堿基作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的。
41.構(gòu)巢曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)8所示的序列的60位的T作為3’末端，至少10個(gè)堿基以上的核酸構(gòu)成的；或由序列表中序列號(hào)8中所示的互補(bǔ)序列上對(duì)應(yīng)的堿基作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的。
42.構(gòu)巢曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)8所示的序列的221位的C作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的；或由序列表中序列號(hào)8中所示的互補(bǔ)序列上對(duì)應(yīng)的堿基作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的。
43.構(gòu)巢曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)8所示的序列的271位的A作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的；或由序列表中序列號(hào)8中所示的互補(bǔ)序列上對(duì)應(yīng)的堿基作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的。
44.構(gòu)巢曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)8所示的序列的285位的A作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的；或由序列表中序列號(hào)8中所示的互補(bǔ)序列上對(duì)應(yīng)的堿基作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的。
45.構(gòu)巢曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)8所示的序列的366位的T作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的；或由序列表中序列號(hào)8中所示的互補(bǔ)序列上對(duì)應(yīng)的堿基作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的。
46.構(gòu)巢曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)8所示的序列的387位的A作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的；或由序列表中序列號(hào)8中所示的互補(bǔ)序列上對(duì)應(yīng)的堿基作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的。
47.土曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)9所示的序列的25位的T作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的；或由序列表中序列號(hào)9中所示的互補(bǔ)序列上對(duì)應(yīng)的堿基作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的。
48.土曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)9所示的序列的48位的T作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的；或由序列表中序列號(hào)9中所示的互補(bǔ)序列上對(duì)應(yīng)的堿基作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的。
49.土曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)9所示的序列的162位的T作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的；或由序列表中序列號(hào)9中所示的互補(bǔ)序列上對(duì)應(yīng)的堿基作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的。
50.土曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)9所示的序列的225位的C作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的；或由序列表中序列號(hào)9中所示的互補(bǔ)序列上對(duì)應(yīng)的堿基作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的。
51.土曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)9所示的序列的261位的C作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的；或由序列表中序列號(hào)9中所示的互補(bǔ)序列上對(duì)應(yīng)的堿基作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的。
52.土曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)9所示的序列的339位的C作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的；或由序列表中序列號(hào)9中所示的互補(bǔ)序列上對(duì)應(yīng)的堿基作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的。
53.土曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)9所示的序列的360位的A作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的；或由序列表中序列號(hào)9中所示的互補(bǔ)序列上對(duì)應(yīng)的堿基作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的。
54.土曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)9所示的序列的375位的A作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的；或由序列表中序列號(hào)9中所示的互補(bǔ)序列上對(duì)應(yīng)的堿基作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的。
55.土曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)9所示的序列的411位的A作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的；或由序列表中序列號(hào)9中所示的互補(bǔ)序列上對(duì)應(yīng)的堿基作為3’末端，至少10個(gè)以上堿基的核酸構(gòu)成的。
56.權(quán)利要求25-55任一項(xiàng)的核酸，其中核酸的堿基數(shù)是10-100。
57.權(quán)利要求56的核酸，其中核酸的堿基數(shù)是15-30。
58.權(quán)利要求25-57任一項(xiàng)的檢測用核酸，其中檢測用核酸是核酸擴(kuò)增用的引物。
59.權(quán)利要求25-57任一項(xiàng)的檢測用核酸，其中檢測用核酸是標(biāo)記的引物。
60.權(quán)利要求30的煙曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)10所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
61.權(quán)利要求33的黃曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)11所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
62.權(quán)利要求33的黃曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)12所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
63.權(quán)利要求36的黑曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)13所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
64.權(quán)利要求42的構(gòu)巢曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)14所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
65.權(quán)利要求54的土曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)15所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
66.權(quán)利要求53的土曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)62所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
67.權(quán)利要求43的構(gòu)巢曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)64所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
68.權(quán)利要求37的黑曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)64所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
69.權(quán)利要求30的煙曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)65所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
70.權(quán)利要求37的黃曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)66所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
71.權(quán)利要求37的黃曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)67所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
72.權(quán)利要求30的煙曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)68所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
73.權(quán)利要求31的煙曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)69所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
74.權(quán)利要求36的黑曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)70所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
75.權(quán)利要求38的黑曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)71所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
76.權(quán)利要求42的構(gòu)巢曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)72所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
77.權(quán)利要求44的構(gòu)巢曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)73所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
78.權(quán)利要求54的土曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)74所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
79.權(quán)利要求54的土曲霉檢測用核酸，它是由含有序列表中序列號(hào)75所示的堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可以被尿嘧啶替換)或其互補(bǔ)的堿基序列的核酸片段構(gòu)成的。
80.權(quán)利要求1或2的引物，其是正向引物。
81.權(quán)利要求70或79的核酸，其是正向引物。
82.權(quán)利要求3至11任一項(xiàng)的引物，其為反向引物。
83.權(quán)利要求60至69任一項(xiàng)的引物，其為反向引物。
84.通過用基因擴(kuò)增方法對(duì)曲霉屬真菌的細(xì)胞色素b基因片段進(jìn)行擴(kuò)增從而對(duì)曲霉屬真菌進(jìn)行檢測和/或鑒定的方法，其中在基因擴(kuò)增方法中使用了由含有序列表中序列號(hào)1和2所示堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可以用尿嘧啶替換)中連續(xù)的至少10個(gè)堿基的堿基序列的核酸構(gòu)成的正向引物以及權(quán)利要求80的正向引物中的至少一個(gè)，和權(quán)利要求83的反向引物中的至少一個(gè)。
85.通過用基因擴(kuò)增方法對(duì)曲霉屬真菌的細(xì)胞色素b基因片段進(jìn)行擴(kuò)增從而對(duì)曲霉屬真菌進(jìn)行檢測和/或鑒定的方法，其中在基因擴(kuò)增方法中使用了權(quán)利要求81的正向引物中的至少一個(gè)，和權(quán)利要求82的反向引物以及由含有序列表中序列號(hào)4所示堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可以用尿嘧啶替換)的互補(bǔ)序列中連續(xù)的至少10個(gè)堿基的堿基序列的核酸構(gòu)成的反向引物中的至少一個(gè)。
86.通過用基因擴(kuò)增方法對(duì)曲霉屬真菌的細(xì)胞色素b基因片段進(jìn)行擴(kuò)增從而對(duì)曲霉屬真菌進(jìn)行檢測和/或鑒定的方法，其中在基因擴(kuò)增方法中使用了由含有序列表中序列號(hào)1和2所示堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可以用尿嘧啶替換)中連續(xù)的至少10個(gè)堿基的堿基序列的核酸構(gòu)成的正向引物以及權(quán)利要求80的正向引物中的至少一個(gè)，和權(quán)利要求82的反向引物以及由含有序列表中序列號(hào)4所示堿基序列(但是，任意位點(diǎn)的胸腺嘧啶可以用尿嘧啶替換)的互補(bǔ)序列中連續(xù)的至少10個(gè)堿基的堿基序列的核酸構(gòu)成的反向引物中的至少一個(gè)。
87.含有序列表中序列號(hào)5到9任一項(xiàng)的堿基序列的DNA片段。
全文摘要
一種用于檢測真菌的核酸,它含有序列表中序列號(hào)3、57～75所示的序列。該核酸可用作基因擴(kuò)增用的探針或引物。當(dāng)用作引物的時(shí)候,通過選擇適當(dāng)?shù)囊?該核酸可對(duì)曲霉屬真菌進(jìn)行檢測及鑒定,這是因?yàn)楦鶕?jù)真菌菌種的不同,被擴(kuò)增的核酸片段的大小不同。
文檔編號(hào)C12N15/31GK1207129SQ97191609
公開日1999年2月3日 申請日期1997年9月9日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月9日 公開號(hào)97191609.8
發(fā)明者橫山耕治, 王麗 申請人:愛詩愛詩制藥株式會(huì)社