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適于生產(chǎn)病毒的人胚肺成纖維細(xì)胞二倍體細(xì)胞株和利用該細(xì)胞株生產(chǎn)水痘帶狀皰疹病的方法

文檔序號(hào):451107閱讀:261來(lái)源:國(guó)知局

專利名稱::適于生產(chǎn)病毒的人胚肺成纖維細(xì)胞二倍體細(xì)胞株和利用該細(xì)胞株生產(chǎn)水痘帶狀皰疹病的方法
技術(shù)領(lǐng)域
:本發(fā)明涉及適于生產(chǎn)病毒的新的人胚肺成纖維細(xì)胞二倍體細(xì)胞株和利用該細(xì)胞株作為宿主細(xì)胞制備水痘帶狀皰疹病毒的方法。現(xiàn)有技術(shù)的描述病毒引起各種疾病如麻疹,風(fēng)疹,流行性腮腺炎,水痘,流行性出血熱,流行性乙型腦炎,嬰兒脊髓灰質(zhì)炎,甲型肝炎,乙型肝炎,丙型肝炎和天花。用從滅活的或減毒的致病病毒制備的疫苗接種可以防止這些病毒疾病。通常,可以利用成胚胎的雞蛋,幼鼠的腦細(xì)胞和哺乳動(dòng)物的二倍體細(xì)胞作為生產(chǎn)這些病毒疫苗的宿主細(xì)胞。雖然可以利用成胚胎的雞蛋或幼鼠的腦細(xì)胞作為宿主細(xì)胞以便減少生產(chǎn)費(fèi)用,但由于對(duì)病毒的低敏感性,復(fù)雜的純化過(guò)程和由于存在外源蛋白污染引起的副作用,它們不具備優(yōu)勢(shì)。相反,使用起源于人的正常二倍體細(xì)胞能減少外源蛋白引起的副作用,所以,制備病毒疫苗時(shí)它們更優(yōu)選。代表性的二倍體細(xì)胞包括MRC-5細(xì)胞株(ATCCCCL171),WI-38細(xì)胞株(ATCCCCL75),和HEL299細(xì)胞株(ATCCCCL137)具體地說(shuō),MRC-5細(xì)胞株起源于14周齡的雄性胚胎的肺組織[Proc.Symp.HumanDiploidCells,Yugoslavia,Acad.SCI.Arts.Zagreb.,pp43-45(1970);和自然(倫敦),227,pp168-170(1970)];WI-38細(xì)胞起源于3個(gè)月大的雌性胚胎的肺組織[Exp.CellRes.,25,p585(1961);和Am.J.Hyg.,75,p240(1962)];HEL299細(xì)胞株從雄性胚胎的肺組織得到[W.D.Peterson,Jr.etal.,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,128,p772(1968)]。水痘是高度接觸傳染的疾病,它使免疫力降低的兒童,成年人由于感染了水痘帶狀皰疹病毒(VZV)而遭受折磨。已經(jīng)有報(bào)道,VZV可以在各種細(xì)胞如人羊膜細(xì)胞,人甲狀腺細(xì)胞,人肺細(xì)胞,人宮頸癌細(xì)胞和猴腎細(xì)胞中培養(yǎng)[E.V.Meurisseetal.,J.Microbiol.,2,317(1969)]。另外,美國(guó)專利3,985,615中公開(kāi)了通過(guò)在豚鼠初級(jí)胚胎組織細(xì)胞(GPEC)中多次減毒0ka病毒生產(chǎn)VZV疫苗;美國(guó)專利4,000,256敘述了將含有VZV病毒的人胚成纖維細(xì)胞WI-38細(xì)胞株傳代培養(yǎng)10-80次來(lái)生產(chǎn)VZV疫苗;美國(guó)專利5,360,736公開(kāi)了在MRC-5細(xì)胞株中生產(chǎn)VZV疫苗的改進(jìn)方法。然而,GPEC細(xì)胞中VZV的產(chǎn)量是非常低的。另外,WI-38和MRC-5細(xì)胞株有高的傳代數(shù),從而減低了它們生產(chǎn)VZV的能力。所以,上述方法不能用于大規(guī)模生產(chǎn)VZV疫苗。另外,由于其依賴細(xì)胞的特性,VZV在無(wú)細(xì)胞環(huán)境趨于失活。發(fā)明概述因此,本發(fā)明的一個(gè)目的是提供對(duì)于各種病毒特別是VZV具有高敏感性并提供高產(chǎn)量的VZV的新的人二倍體細(xì)胞株。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供改進(jìn)的生產(chǎn)VZV的方法。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面,提供了起源于人胚肺細(xì)胞的成纖維細(xì)胞二倍體細(xì)胞株LBHEL(KCTC0127BP)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面,提供了生產(chǎn)無(wú)細(xì)胞水痘帶狀皰疹病毒(VZV)的方法,該方法包括如下步驟(a)在培養(yǎng)容器中培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞二倍體細(xì)胞株LBHEL(KCTC0127BP)得到培養(yǎng)的LBHEL細(xì)胞;(b)用VZV感染培養(yǎng)的LBHEL細(xì)胞得到VZV感染的細(xì)胞;(c)培養(yǎng)和收獲VZV感染的細(xì)胞;(d)破碎收獲的細(xì)胞以得到細(xì)胞勻漿;和(e)離心細(xì)胞勻漿以得到含有無(wú)細(xì)胞VZV的上清液。附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明配合附圖,根據(jù)下面的說(shuō)明本發(fā)明的上面的和其它的目的和特征將變得明了圖1-1和1-2示出本發(fā)明的LBHEL細(xì)胞株的核型;圖2示出了本發(fā)明的LBHEL細(xì)胞株(◆),MRC-5細(xì)胞株(■)和HEL299細(xì)胞株(△)的生長(zhǎng)曲線;圖3示出了在含有5%或10%FBS的DME培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的LBHEL細(xì)胞株,MRC-5細(xì)胞株和HEL299細(xì)胞株后的細(xì)胞計(jì)數(shù);圖4表示了本發(fā)明的LBHEL細(xì)胞株中的無(wú)細(xì)胞VZV的噬斑形成單位(PFU)隨感染復(fù)數(shù)的變化;圖5表示在本發(fā)明的LBHEL細(xì)胞株中的無(wú)細(xì)胞VZV的PFU對(duì)細(xì)胞病變效應(yīng)的依賴性;圖6證明了作為未感染的LBHEL細(xì)胞株含量的函數(shù)的無(wú)細(xì)胞VZV的PFU的變化;和圖7說(shuō)明了無(wú)細(xì)胞VZV的PFU隨著細(xì)胞培養(yǎng)容器表面的細(xì)胞覆蓋程度而變化的方式。發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明如本文所用,術(shù)語(yǔ)“無(wú)細(xì)胞病毒”指未與其宿主細(xì)胞結(jié)合的病毒??梢园慈缦滤錾a(chǎn)源于人胚肺成纖維細(xì)胞二倍體細(xì)胞的本發(fā)明的新的LBHEL細(xì)胞株首先,從具有圖1-1和1-2的核型的20周齡的雌性胚胎中取出一小部分人胚肺組織。將組織切成小片并用磷酸鹽緩沖液(pH7.1-7.3)洗滌。然后在含有膠原酶和分散酶的磷酸鹽緩沖液(“酶溶液”)中在36-37℃,5%CO2氣氛下培養(yǎng)該組織5-10分鐘。在30-50xg離心得到的培養(yǎng)物并在上述酶溶液中在36-37℃培養(yǎng)沉淀的肺組織20-40分鐘。然后用5%(v/v)胎牛血清(FBS)中和得到的培養(yǎng)物的上清液。重復(fù)該酶處理3或4次直到只留下結(jié)締組織。然后,將合并的細(xì)胞提取液在4-5℃靜置約1小時(shí)沉淀細(xì)胞聚合體,分離得到的含有單個(gè)細(xì)胞的上清液并在800-100rpm離心1-2分鐘。收集沉淀的細(xì)胞,分散于含有5-10%(v/v)FBS的Dulbecco改良的eagle培養(yǎng)基(DME培養(yǎng)基)中直到濃度為5-10×106個(gè)細(xì)胞/ml,然后在T80培養(yǎng)瓶中在36-37℃培養(yǎng)直到細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)容器的表面。在用胰蛋白酶處理后,對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)。根據(jù)用于專利程序目的的國(guó)際承認(rèn)的微生物保藏布達(dá)佩斯條約的條款,將如上產(chǎn)生的本發(fā)明的LBHEL細(xì)胞株于1994年11月9日保存于韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)(地址GERI,KIST,P.O.BOX115,Yusong,Taejon,305-600,韓國(guó)),登記號(hào)為KCTC0127BP。通過(guò)染色體異常試驗(yàn)證明本發(fā)明的LBHEL細(xì)胞株是正常的二倍體細(xì)胞株并且在動(dòng)物試驗(yàn)中它不會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生腫瘤。另外,它比常規(guī)細(xì)胞株如MRC-5和HEL299生長(zhǎng)得更快并對(duì)各種病毒具有增強(qiáng)的敏感性。此外,甚至在30代傳代培養(yǎng)后它仍保持同樣的生長(zhǎng)速度。本發(fā)明的新的LBHEL細(xì)胞株具有下述特征(1)細(xì)胞生長(zhǎng)速度與MRC-5標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株相比,LBHEL細(xì)胞株的生長(zhǎng)約快2倍,并且在固定表面面積上產(chǎn)生的細(xì)胞的數(shù)目比MRC-5多1.7倍或更多倍。(2)噬斑鑒定當(dāng)利用本發(fā)明的LBHEL細(xì)胞株作宿主細(xì)胞測(cè)定病毒的效價(jià)時(shí),可以容易地鑒定形成的噬斑并且它的再生能力比MRC-5高。(3)FBS含量通常在含有10%(v/v)FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)常規(guī)人二倍體正常細(xì)胞株如MRC-5,WI-38和HEL299,而本發(fā)明的LBHEL細(xì)胞株在只具有5%的FBS含量的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。由于FBS是昂貴的,所以LBHEL細(xì)胞株在降低生產(chǎn)成本方面具有相當(dāng)大的優(yōu)點(diǎn)。(4)對(duì)VZV的易感性如表1所示,本發(fā)明的LBHEL細(xì)胞株比常規(guī)人二倍體正常細(xì)胞株如MRC-5,HEL299和Lu18具有更高的對(duì)VZV的敏感性。這表明VZV在本發(fā)明的LBHEL細(xì)胞株中比在上面提到的常規(guī)人二倍體正常細(xì)胞株中更容易生長(zhǎng)。表1在生產(chǎn)各種病毒如麻疹,風(fēng)疹,甲型肝炎和水痘疫苗時(shí)可以利用本發(fā)明的LBHEL細(xì)胞株作宿主細(xì)胞。通過(guò)利用本發(fā)明的LBHEL細(xì)胞株可以如下所述生產(chǎn)無(wú)細(xì)胞VZV(1)細(xì)胞培養(yǎng)在含有5-10%(v/v)FBS的DME培養(yǎng)基(GibcoBRL,U.S.A。,Cat.No.12800-082)中,于36-37℃,5%CO2氣氛下培養(yǎng)本發(fā)明的LBHEL細(xì)胞株;從而形成單層。在單層培養(yǎng)物中細(xì)胞分離比例(splitratio)可在1∶5-1∶10范圍。優(yōu)選地,將細(xì)胞培養(yǎng)直到細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)容器表面的70-80%,然后對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)的傳代培養(yǎng)。(2)VZV的繁殖可以將VZV以1∶15-1∶20的感染復(fù)數(shù)(MOI)接種到如上制備的培養(yǎng)的LBHEL細(xì)胞株中。接種1-1.5小時(shí)后,可以在含有2至5%FBS的DME培養(yǎng)基中,于36至37℃,5%CO2氣氛下將感染細(xì)胞培養(yǎng)40-48小時(shí)。當(dāng)顯微鏡(100x)下觀察到的細(xì)胞病變效應(yīng)達(dá)50%或更少,優(yōu)選地30-45%時(shí)收獲感染細(xì)胞。具體地說(shuō),用磷酸鹽緩沖液(pH7.2)洗滌細(xì)胞培養(yǎng)物并用0.01-0.03%的EDTA處理。培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物5分鐘,然后離心收集VZV感染的細(xì)胞。(3)破碎細(xì)胞和分離無(wú)細(xì)胞VZV通過(guò)常規(guī)方法如超聲波處理和玻璃珠可以破碎如上收集的VZV感染的細(xì)胞。然后,通過(guò)任何常規(guī)方法離心和過(guò)濾除去細(xì)胞碎片,得到含有無(wú)細(xì)胞VZV的上清液。由于依賴細(xì)胞的特性,當(dāng)離開(kāi)宿主細(xì)胞時(shí)VZV的成活力接近零。因此,當(dāng)將病毒感染的宿主細(xì)胞破碎時(shí)病毒容易失活。前面提到的美國(guó)專利4,000,256敘述了試圖通過(guò)在磷酸鹽緩沖液中加入約7.5%(重)的蔗糖而在細(xì)胞破碎步驟中保護(hù)VZV的計(jì)劃。當(dāng)用超聲波破碎病毒感染的細(xì)胞時(shí),病毒本身經(jīng)常被粉碎和失活,從而減少了無(wú)細(xì)胞病毒的產(chǎn)量。但是,使用蔗糖緩沖物可以防止病毒發(fā)生這樣的粉碎和失活。在超聲波步驟之前,將未感染的LBHEL細(xì)胞與感染細(xì)胞混合可以有效地防止超聲波處理過(guò)程中無(wú)細(xì)胞病毒的產(chǎn)量的減少。在實(shí)施本發(fā)明時(shí),將未感染的LBHEL細(xì)胞與感染的LBHEL細(xì)胞以1∶4-3∶2的比例混合。但是,上述方法經(jīng)常產(chǎn)生大量細(xì)胞碎片,從而在純化步驟如過(guò)濾和離心過(guò)程中引起一些無(wú)細(xì)胞病毒的損失。為了解決這一問(wèn)題,本發(fā)明在純化步驟如離心過(guò)程中使用了蔗糖溶液。蔗糖濃度可以是15wt%或更多,優(yōu)選為15-45wt%。通過(guò)如減弱病毒或加入病毒抗原等常規(guī)方法制備疫苗時(shí)可以利用上面得到的VZV。在實(shí)施例和試驗(yàn)實(shí)施例中進(jìn)一步說(shuō)明和解釋了本發(fā)明,但是它們不限制本發(fā)明的范圍。在實(shí)施例中使用了商業(yè)購(gòu)買得到的VZV,VaricellaBikenOka病毒(ATCCVR-795,Lotno.6w)。在本文中,從ATCC得到的MRC-5,HEL299和Lu18傳代培養(yǎng)物編號(hào)為傳代數(shù)1。除非特別定義,本文所用的術(shù)語(yǔ)和簡(jiǎn)寫具有通常的意義,例如“C”指攝氏溫度;“M”指摩爾數(shù);“v/v”指體積/體積;和“w/v”指重量/體積。實(shí)施例1制備LBHEL細(xì)胞株從具有圖1核型的20周齡雌性胚胎中取出一小部分人胚肺組織。將該組織切成小片(2mm×2mm),并用磷酸鹽緩沖液(pH7.2)洗滌3次。在含有130單位/ml的膠原酶和1mg/ml的分散酶的磷酸鹽緩沖液(pH7.2)(“酶溶液”)中,于36℃培養(yǎng)得到的組織薄片5分鐘。在200×g離心該培養(yǎng)物2分鐘以便沉淀肺組織。收集該組織,于37℃,在上述酶溶液中培養(yǎng)30分鐘。以50xg離心培養(yǎng)物2分鐘并加入5%胎牛血清(FBS)中和上清液。重復(fù)這一酶處理4次直到只留下結(jié)締組織。用5%FBS中和合并的上清液,在4℃靜置1小時(shí)沉淀細(xì)胞聚合體,并以1000rpm離心含有單個(gè)細(xì)胞的上清液2分鐘。收集沉淀細(xì)胞,分散于含有10%FBS的DME培養(yǎng)基(GibcoBRL,U.S.A.,Cat.No.12800-082)中至濃度為3×105個(gè)細(xì)胞/ml,然后在37℃,在T培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)直到細(xì)胞覆蓋了培養(yǎng)瓶表面。在用0.25%胰蛋白酶溶液處理后,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)的傳代培養(yǎng)。實(shí)施例2在LBHEL細(xì)胞株中生產(chǎn)VZV病毒(步驟1)細(xì)胞培養(yǎng)在含有5%FBS的DME培養(yǎng)基(GibcoBRL,U.S.A.,Cat.No.12800-082)中,在37℃,5%CO2氣氛下培養(yǎng)實(shí)施例1制備的LBHEL細(xì)胞株以形成單層。將單層培養(yǎng)物中細(xì)胞的分離比例調(diào)節(jié)成1∶4。進(jìn)行培養(yǎng)直到細(xì)胞覆蓋了培養(yǎng)容器的85-95%的表面,然后對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)的傳代培養(yǎng)。(步驟2)VZV的繁殖將VaricellaBikenOka病毒(ATCCVR-795lotNo.6W)以MOI為1∶20接種到培養(yǎng)的LBHEL細(xì)胞株中。病毒活性是100,000-200,000個(gè)噬斑形成細(xì)胞(PFC)/T80培養(yǎng)瓶(2ml)。在37℃,5%CO2氣氛下培養(yǎng)VZV感染細(xì)胞。當(dāng)顯微鏡下觀察到的細(xì)胞病變效應(yīng)達(dá)到25-45%時(shí),用磷酸鹽緩沖液(pH7.2)洗滌培養(yǎng)物3次,然后用0.02%EDTA處理。培養(yǎng)得到物5分鐘,以1000rpm離心約3分鐘收集感染細(xì)胞。(步驟3)破碎細(xì)胞將感染的LBHEL細(xì)胞懸浮于SPGE破碎溶液(pH7.2,7.5%(w/v)蔗糖,0.0038M磷酸鉀(一元堿的),0.0072M磷酸鉀(二元堿的),0,0049M谷氨酸鈉,0.2%EDTA)直到濃度為5-10×106個(gè)細(xì)胞/ml。用小尖頭(T80培養(yǎng)瓶)或角狀物(復(fù)盤裝置,CF-10)在冰浴上通過(guò)使用超聲波器(Sonifier,Branson450)破碎細(xì)胞直到?jīng)]有原生質(zhì)體留下。(步驟4)分離無(wú)細(xì)胞VZV在1000rpm離心得到物10分鐘以獲得含有VZV的上清液。試驗(yàn)實(shí)施例1LBHEL細(xì)胞株的正常狀態(tài)1)染色體異常試驗(yàn)對(duì)實(shí)施例1制備的LBHEL細(xì)胞株進(jìn)行染色體異常試驗(yàn)包括染色體多倍體試驗(yàn),二倍體試驗(yàn),形狀異常試驗(yàn),染色體切割試驗(yàn)和核型分析試驗(yàn)。根據(jù)韓國(guó)公共健康部出版的“生物學(xué)配方標(biāo)準(zhǔn)和其試驗(yàn)方法(1992)”,將MRC-5細(xì)胞株作陰性對(duì)照進(jìn)行所有試驗(yàn)。圖1-1和1-2顯示了本發(fā)明的LBHEL細(xì)胞株的核型。2)腫瘤發(fā)生試驗(yàn)將實(shí)施例1制備的LBHEL細(xì)胞株和ATCC提供的人宮頸癌(Hela)細(xì)胞株的各約2×106個(gè)細(xì)胞皮下注射到5個(gè)或更多個(gè)患有細(xì)胞免疫缺陷的裸鼠中。在注射的28天后,在注射LBHEL的鼠中沒(méi)有觀察到腫瘤,而在接受人宮頸癌細(xì)胞株注射的所有鼠中都形成了腫瘤。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明本發(fā)明的人胚肺成纖維細(xì)胞LBHEL細(xì)胞株是正常的二倍體細(xì)胞。試驗(yàn)實(shí)施例2比較細(xì)胞株的生長(zhǎng)曲線通過(guò)如下測(cè)定相對(duì)于生長(zhǎng)時(shí)間的細(xì)胞數(shù)制備本發(fā)明的LBHEL細(xì)胞株(KCTC0127BP)的生長(zhǎng)曲線,然后與MRC-5(ATCCCCL171)和HEL299(ATCCCCL137)細(xì)胞株的生長(zhǎng)曲線比較。根據(jù)實(shí)施例2的方法(步驟1)在T80培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)每種試驗(yàn)細(xì)胞株以形成單層。用磷酸鹽緩沖液(pH7.2)洗滌細(xì)胞3次并用0.25%胰蛋白酶處理。約2分鐘后,以1000rpm離心3分鐘收集細(xì)胞。將沉淀細(xì)胞懸浮于含有5%FBS(LBHEL)或10%FBS(MRC-5和HEL299)的DME培養(yǎng)基中,然后以2×106個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)瓶的量加入T80培養(yǎng)瓶中。在37℃,5%CO2氣氛下培養(yǎng)細(xì)胞。以24小時(shí)的間隔,如下測(cè)定細(xì)胞數(shù)首先,用磷酸鹽緩沖液溶液(pH7.2)洗滌培養(yǎng)物3次和用0.25%胰蛋白酶處理。在約2分鐘后,以1000rpm離心約3分鐘收集細(xì)胞。將沉淀細(xì)胞懸浮于DME培養(yǎng)基中并點(diǎn)在細(xì)胞計(jì)數(shù)器(HausserScientific)上。用顯微鏡(100X)計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)。圖2示出了對(duì)于本發(fā)明的LBHEL細(xì)胞株(◆),MRC-5細(xì)胞株(■)和HEL299細(xì)胞株(△),相對(duì)于培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞數(shù)。如圖2所示,LBHEL細(xì)胞株與MRC-5和HEL299細(xì)胞株相比早一天顯示對(duì)數(shù)期,并且LBHEL細(xì)胞株的細(xì)胞數(shù)比MRC-5和HEL299大約多1.5倍。圖3描述了在含有5%或10%FBS的DME培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天后本發(fā)明的LBHEL細(xì)胞株,MRC-5細(xì)胞株和HEL299細(xì)胞株的細(xì)胞數(shù)。如圖3所示,培養(yǎng)在含有5%FBS的培養(yǎng)基中的LBHEL細(xì)胞數(shù)接近于在含有10%FBS的培養(yǎng)基中得到的細(xì)胞數(shù)。相反,在含有5%FBS的培養(yǎng)基中MRC-5或HEL299細(xì)胞株生長(zhǎng)不良。這表明本發(fā)明的LBHEL比其它常規(guī)細(xì)胞株更具有經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)。另外,在20代傳代培養(yǎng)后,本發(fā)明的LBHEL細(xì)胞株仍生長(zhǎng)良好。在復(fù)盤裝置(Nunc164327,6000cm2)中它的生長(zhǎng)也好,這表明LBHEL細(xì)胞株可用于大規(guī)模的病毒生產(chǎn)。試驗(yàn)實(shí)施例3對(duì)VZV的易感性根據(jù)實(shí)施例2的程序(步驟1)將表2中顯示的各個(gè)細(xì)胞株在直徑為60m培養(yǎng)平皿中培養(yǎng)形成單層,用磷酸鹽緩沖液(pH7.2)將培養(yǎng)的細(xì)胞洗滌三次。用含有3%FBS的DME培養(yǎng)基連續(xù)稀釋VaricellaBikenOka病毒。以每個(gè)平皿0.1毫升的量將稀釋的疫苗接種到細(xì)胞。向其中加入含有3%FBS的DME培養(yǎng)基,將得到的培養(yǎng)物于37℃,5%CO2氣氛中培養(yǎng)7天。用顯微鏡(40X)對(duì)此形成的噬斑計(jì)數(shù),計(jì)算出PFU以便對(duì)各個(gè)細(xì)胞株對(duì)該病毒的易感性進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示于表2。表2</tables>如表2所示,LBHEL細(xì)胞株的易感性比MRC-5,HEL299和Lu18細(xì)胞株大約高10倍。因此,本發(fā)明的LBHEL細(xì)胞株可用于生產(chǎn)VZV疫苗。試驗(yàn)實(shí)施例4VZV在細(xì)胞株中的繁殖(步驟1)VZV的接種和感染細(xì)胞的收獲根據(jù)實(shí)施例2的程序(步驟1),將顯示于表3中的各個(gè)細(xì)胞株培養(yǎng)于T80培養(yǎng)瓶中形成單層,用磷酸鹽緩沖液(pH7.2)洗滌培養(yǎng)的細(xì)胞三次。以每瓶(2ml)100,000到200,000PFC的病毒活性將VaricellaBikenOka病毒感染的MRC-5細(xì)胞接種到這些細(xì)胞。1小時(shí)后,向其中加入含有3%FBS的DME培養(yǎng)基,于37℃,5%CO2氣氛中將得到的培養(yǎng)物培養(yǎng)約48小時(shí)。當(dāng)細(xì)胞病變效應(yīng)達(dá)到25-45%時(shí),用磷酸鹽緩沖液(pH7.2)將培養(yǎng)物洗滌3次,然后用0.02%EDTA處理。得到的培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)5分鐘,收集感染細(xì)胞,并以1000rpm離心約3分鐘以收獲被感染的細(xì)胞。(步驟2)病毒的分離將上述獲得的感染細(xì)胞加入到SPGE破碎溶液(pH7.2,7.5%(w/v)蔗糖,0.0038M磷酸鉀(一元堿),0.0072M磷酸鉀(二元堿),0.0049M谷氨酸鈉,0.2%EDTA)中至濃度為5-10×106個(gè)細(xì)胞/ml。使用超聲波處理器(Sonifier,Branson450),通過(guò)用于T80培養(yǎng)瓶的小尖頭或用于復(fù)盤裝置的角狀物,在冰浴中破碎細(xì)胞,直到?jīng)]有留下完整細(xì)胞。將得到的裂解液于4℃和1000rpm離心10分鐘,獲得含有該病毒的上清液。(步驟3)病毒的活性根據(jù)實(shí)施例2程序的(步驟1)在直徑為60mm的培養(yǎng)平皿中培養(yǎng)LBHEL細(xì)胞株,用磷酸鹽緩沖液(pH7.2)將培養(yǎng)的細(xì)胞洗滌3次。將在(步驟1)收獲的感染細(xì)胞以0.3ml/平皿的量加入到單層培養(yǎng)細(xì)胞中以測(cè)定感染細(xì)胞的活性。另外,用4倍體積的DME培養(yǎng)基將(步驟2)獲得的含有病毒的上清液連續(xù)稀釋,并以0.1ml/平皿的量加入到單層培養(yǎng)細(xì)胞,以測(cè)定無(wú)細(xì)胞病毒的活性。通過(guò)在37℃,5%CO2氣氛中培養(yǎng)60分鐘使病毒吸附到細(xì)胞。然后,向其中加入含3%FBS的DME培養(yǎng)基,以如上所述相同條件繼續(xù)培養(yǎng)。6天之后,用顯微鏡(40X)對(duì)形成的噬斑計(jì)數(shù),由此計(jì)算出PFC和PFU,以分別測(cè)定感染細(xì)胞和無(wú)細(xì)胞病毒的活性。結(jié)果顯示于表3中。表3如表3所示,在本發(fā)明的LBHEL中VZV的活性高于在其他常規(guī)細(xì)胞株中的活性。具體地說(shuō),其他常規(guī)細(xì)胞株的PFCs約為L(zhǎng)BHEL細(xì)胞的PFC的50%,而它們的PFU最高約為L(zhǎng)BHEL細(xì)胞的PFU的30%。試驗(yàn)實(shí)施例5感染復(fù)數(shù)(MOI)的影響根據(jù)試驗(yàn)實(shí)施例4的程序(步驟1),制備LBHEL宿主細(xì)胞的單層培養(yǎng)物并分別以1∶10,1∶15,1∶20,1∶25和1∶50的MOI用VaricellaBikenOka病毒感染的MRC-5細(xì)胞接種。根據(jù)試驗(yàn)實(shí)施例4(步驟2和3)的程序測(cè)定PFU值。圖4表示本發(fā)明的LBHEL細(xì)胞株中無(wú)細(xì)胞VZV的活性(PFU)隨MOI的變化。如圖4所示。當(dāng)MOI是1∶20時(shí),無(wú)細(xì)胞病毒的產(chǎn)量最高。試驗(yàn)實(shí)施例6細(xì)胞病變效應(yīng)對(duì)PFU的影響根據(jù)試驗(yàn)實(shí)施例4(步驟1)的程序,制備LBHEL細(xì)胞的單層培養(yǎng)物并以1∶20的MOI用VaricellaBikenOka病毒感染的MRC-5細(xì)胞接種。當(dāng)細(xì)胞病變效應(yīng)是12.5,25,37.5,50,62.5,75和87.5%時(shí)收獲感染細(xì)胞。通過(guò)超聲處理破碎收獲的細(xì)胞,根據(jù)試驗(yàn)實(shí)施例4(步驟2和3)的步驟測(cè)定PFU值。圖5顯示在處于各種細(xì)胞病變效應(yīng)的本發(fā)明的LBHEL細(xì)胞株中無(wú)細(xì)胞VZV的活性(PFU)。當(dāng)細(xì)胞病變效應(yīng)低于50%時(shí)無(wú)細(xì)胞病毒的產(chǎn)量是高的。試驗(yàn)實(shí)施例7未感染細(xì)胞的穩(wěn)定化作用根據(jù)試驗(yàn)實(shí)施例4(步驟1)的程序制備VZV感染的LBHEL細(xì)胞,以占LBHEL細(xì)胞總數(shù)的0%,20%,40%,60%和80%的量向感染的LBHEL細(xì)胞中加入未感染的LBHEL細(xì)胞。將混合物進(jìn)行超聲波處理,并且根據(jù)試驗(yàn)實(shí)施例4(步驟2和3)的程序測(cè)定PFU的值。圖6表示無(wú)細(xì)胞VZV的活性(PFU)變化與未感染LBHEL細(xì)胞含量的函數(shù)關(guān)系。如圖6所示,當(dāng)存在未感染細(xì)胞時(shí)無(wú)細(xì)胞病毒的活性增高,當(dāng)未感染細(xì)胞含量在LBHEL細(xì)胞總數(shù)中為20-60%時(shí)活性達(dá)到最高。另外,利用復(fù)盤裝置(CF-10)對(duì)混合未感染細(xì)胞的作用進(jìn)行評(píng)估,結(jié)果顯示于表4。表4如表4所示,可將未感染細(xì)胞有效地用于在大規(guī)模生產(chǎn)病毒時(shí)穩(wěn)定無(wú)細(xì)胞VZV。試驗(yàn)實(shí)施例8蔗糖的作用根據(jù)試驗(yàn)實(shí)施例4(步驟1和2)所述,制備感染的LBHEL細(xì)胞并通過(guò)超聲處理破碎。如表5所述,在沒(méi)有或有蔗糖溶液(pH7.2,15-37.5%(w/v)蔗糖,0.0038M磷酸鉀(一元堿),0.0072M磷酸鉀(二元堿),0.0049M谷氨酸鈉,0.2%EDTA)存在時(shí),以1000rpm將得到的混合物離心10分鐘,收集含有病毒的上清液。然后,根據(jù)試驗(yàn)實(shí)施例4(步驟3)的程序測(cè)定PFU的值。結(jié)果顯示于表5中。表·5</tables>如表5所示,加入15-37.5%(w/v)濃度的蔗糖溶液使VZV穩(wěn)定。試驗(yàn)實(shí)施例9培養(yǎng)容器表面細(xì)胞飽和度的作用根據(jù)實(shí)施例2(步驟1)所述,在T80培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)本發(fā)明的LBHEL細(xì)胞株,以形成覆蓋50,75或100%培養(yǎng)容器總表面的單層。將VZV感染的VaricellaOka株接種到所述細(xì)胞株,并在37℃,5%CO2氣氛中培養(yǎng)48小時(shí)。然后,根據(jù)試驗(yàn)實(shí)施例4(步驟2和3)的程序測(cè)量PFU值。圖7顯示了無(wú)細(xì)胞VZV的活性(PFU)隨細(xì)胞培養(yǎng)容器表面細(xì)胞飽和程度的變化,其中本發(fā)明的LBHEL細(xì)胞株在75%單層覆蓋時(shí)其對(duì)VZV的易感性高于在100%單層覆蓋時(shí)的易感性。上述結(jié)果顯示本發(fā)明的LBHEL細(xì)胞株可用于生產(chǎn)抗水痘,麻疹,風(fēng)疹,腮腺炎,流行性出血熱,流行性乙型腦炎,嬰兒脊髓灰質(zhì)炎,甲型肝炎,乙型肝炎,丙型肝炎和天花的各種病毒疫苗。前面已經(jīng)描述并闡明了本發(fā)明的實(shí)施方案,在不脫離本發(fā)明精神情況下對(duì)此進(jìn)行各種改變和修飾是顯而易見(jiàn)的,本發(fā)明僅受權(quán)利要求書的范圍的限制。權(quán)利要求1.一種人胚肺成纖維細(xì)胞二倍體細(xì)胞株LBHEL(KCTC0127BP)。2.用于生產(chǎn)無(wú)細(xì)胞水痘帶狀皰疹病毒(VZV)的方法,包括下列步驟(a)在培養(yǎng)容器中培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞二倍體細(xì)胞株LBHEL(KCTC0127BP)以得到培養(yǎng)的LBHEL細(xì)胞;(b)用VZV感染培養(yǎng)的LBHEL細(xì)胞得到VZV感染的細(xì)胞;(c)培養(yǎng)和收獲VZV感染的細(xì)胞;(d)破碎收獲的細(xì)胞,獲得細(xì)胞勻漿;和(e)離心細(xì)胞勻漿,獲得含有無(wú)細(xì)胞VZV的上清液。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其中利用含有3-10%(v/v)胎牛血清的Dulbecco′s改良的Eagl′s培養(yǎng)基在步驟(a)中培養(yǎng)LBHEL細(xì)胞株以形成單層。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其中在步驟(a)的單層培養(yǎng)物中培養(yǎng)的LBHEL細(xì)胞覆蓋70-80%的培養(yǎng)容器的表面。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,進(jìn)一步包括當(dāng)培養(yǎng)容器的70-80%表面被培養(yǎng)的LBHEL細(xì)胞覆蓋時(shí),將步驟(a)中獲得的培養(yǎng)的LBHEL細(xì)胞以1∶5-1∶10的分離比例加入到傳代培養(yǎng)物中的步驟。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其中步驟(b)中加入到培養(yǎng)的LBHEL細(xì)胞中的VZV感染復(fù)數(shù)為1∶15-1∶20。7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其中當(dāng)細(xì)胞病變效應(yīng)是50%或更低時(shí)在步驟(c)中收獲培養(yǎng)的LBHEL細(xì)胞。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法,其中當(dāng)細(xì)胞病變效應(yīng)為30-45%時(shí)收獲培養(yǎng)的LBHEL細(xì)胞。9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,進(jìn)一步包括在步驟(d)之前向步驟(c)中收獲的VZV感染的LBHEL細(xì)胞加入未感染的LBHEL細(xì)胞的步驟。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法,其中以占LBHEL細(xì)胞總數(shù)20-60%的量加入未感染的LBHEL細(xì)胞。11.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,進(jìn)一步包括在步驟(e)之前向步驟(d)中獲得的細(xì)胞勻漿加入濃度為15%(w/v)或更高濃度的蔗糖溶液的步驟。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法,其中蔗糖溶液的濃度為15-45%(w/v)。全文摘要人胚肺成纖維細(xì)胞二倍體細(xì)胞株LBHEL(KCTC0127BP)對(duì)水痘帶狀皰疹病毒(VZV)高度易感。無(wú)細(xì)胞水痘帶狀皰疹病毒(VZV)是由下列步驟產(chǎn)生的:(a)在培養(yǎng)容器中培養(yǎng)權(quán)利要求1的人胚肺成纖維細(xì)胞二倍體細(xì)胞株LBHEL(KCTC0127BP);(b)用VZV感染培養(yǎng)的LBHEL細(xì)胞得到VZV感染的細(xì)胞;(c)培養(yǎng)和收獲VZV感染的細(xì)胞;(d)破碎收獲的細(xì)胞以獲得細(xì)胞勻漿;和(e)離心細(xì)胞勻漿以獲得含有無(wú)細(xì)胞VZV的上清液。文檔編號(hào)C12N7/02GK1180377SQ97190080公開(kāi)日1998年4月29日申請(qǐng)日期1997年2月15日優(yōu)先權(quán)日1996年2月16日發(fā)明者金政民,樸福蓮,樸柱泓申請(qǐng)人:株式會(huì)社Lg化學(xué)
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