專利名稱：香蕉束頂病毒的基因間區(qū)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及香蕉束頂病毒(BBTV)的DNA序列，特別是元件1到6的基因間區(qū)。
香蕉束頂病(BBTD)是香蕉最重要的病毒病(Dale，1987，《病毒研究進展》(Advances in Virus Research)33301-325)。這種病流行于亞洲和南太平洋并在澳大利亞和非洲具有有限的分布。還未有來自美洲的報道。最初推測該病是由一種黃矮病毒導(dǎo)致的，因為它是由蚜蟲持續(xù)傳播的而不是機械傳播的，誘導(dǎo)黃化病癥狀并感染具有受損的韌皮部的植物。然而，最近已經(jīng)從感染的植物中純化了18-20nm同組異序的病毒樣顆粒(VLPs)并已被證明與該病相關(guān)(Harding等，1991，《普通病毒學(xué)雜志》(Journal of General Virology)72225-230；Thomas和Dietzgen，1991，《普通病毒學(xué)雜志》72217-224；Wu和Su，1990，《植物病理學(xué)雜志》(Journal ofPhytopathology)128 153-160)。Harding等(Harding等，1991，《普通病毒學(xué)雜志》72 225-230；Harding等，1993，《普通病毒學(xué)雜志》74 323-328)已經(jīng)從這些VLPs分離了大約1kb的環(huán)狀、單鏈DNA并克隆和測定了一個ssDNA元件的序列。這個已知為BBTV DNA元件1的元件在病毒顆粒的意義上具有一個大的開放讀框(ORF)并編碼一個推定的復(fù)制酶。這個元件通過蚜蟲與疾病一同傳播。
在Burns等，1994，《病毒學(xué)文獻》(Arch Virol.)137 371-380中，他們報道了BBTV另一個元件的克隆和測序。他們發(fā)現(xiàn)一個93個核苷酸的序列在BBTV兩個ssDNA基因組元件之間強烈保守。由這段序列設(shè)計兩個向外延伸的簡并引物并與從純化的BBTV病毒顆粒提取的DNA用在一聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中。將PCR擴增出的由至少7條大約均為1kb的不同的片段組成的并且可能代表全長BBTV dsDNA的產(chǎn)物分離。將PCR擴增產(chǎn)物克隆并通過限制性酶切分析篩選克隆。鑒定出了4個不同的限制性分析組。這篇參考文獻推斷BBTV的基因組含有至少5個元件而且BBTV屬于一個以前未描述的可能還含有地下三葉草矮小病毒的植物病毒組。
在Karan等，1994，《普通病毒學(xué)雜志》75 3541-3546中，提到來自10個不同國家分離株并被克隆和測序的BBTV元件1，隨后將這些序列排列并此較。這個分析指出兩個組南太平洋組(來自澳大利亞、布隆迪、埃及、斐濟、印度、湯加、西薩摩亞群島的分離株)和亞洲組(來自菲律賓、臺灣和越南的分離株)。在每組內(nèi)的平均序列差異為1.9到3.0％而在來自兩組的分離株之間則為大約10％，但序列的一些部分比其它部分的差異更多。然而，由主要開放讀框編碼的蛋白質(zhì)差別大約為5％。由莖-環(huán)序列的起點到潛在的TATA盒之間的區(qū)域在所有的分離株中除了在西薩摩亞群島分離株中的一個兩個核苷酸的改變和在NSW分離株中的一個單核苷酸的改變外是相同的。這些結(jié)果同其它證據(jù)一起表明在香蕉由亞太地區(qū)到非洲和美洲的最初的遷移后BBTV已經(jīng)波及香蕉。
在Xie等，1995，《植物病理學(xué)》85 339-347中，從被感染的Williams香蕉品種純化了BBTV的夏威夷分離株?？寺〔y序了3個單鏈DNA(ssDNA)元件它們分別被命名為元件1、3和4。元件1在長度上為1110個核苷酸并與如上述在Harding等(1993)中所描述的澳大利亞分離株的BBTV DNA元件1具有98％的核酸序列一致性。這個元件含有能夠編碼一個可能以一種復(fù)制酶來發(fā)揮功能的33.5kDa蛋白和一個具有未知功能的大約15.2kDa蛋白的兩個開放讀框(ORF)。元件3在長度上為1057個核苷酸并且不含任何大于10kDa的ORF。元件4在長度上為1017個核苷酸并且潛在地編碼一個18.9kDa的蛋白。這3個ssDNA元件都具有一個相同的莖-環(huán)序列并具有一個保守的非編碼區(qū)。這3個元件的每一個的序列與兩個臺灣分離株的BBTV DNA元件不同。為了利用放射性和非放射性探針檢測在植物中的BBTV將BBTV特異性克隆用于斑點印跡雜交檢測。對于在香蕉樣品和單個蚜蟲中BBTV的檢測發(fā)展了一種聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測法。斑點印跡雜交檢測法與酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)同樣敏感而對于在香蕉中BBTV的檢測PCR比斑點印跡和ELISA檢測法敏感1000倍。
雖然在上述的Harding等，1993以及Xie和Hu，1995中已經(jīng)檢測到基因組元件1、3和4的所謂的基因間區(qū)。這些基因間區(qū)的唯一特征是如在上述的Harding等所公布的在元件1中的一個莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。
在一個較早的申請中(即國際申請PCT/AU95/00311)提到其本身要求的BBTV元件3、4和6。在這篇較早的申請中還公布了在ORF區(qū)外的區(qū)域(即所謂的“基因間區(qū)”)。在上述Xie和Hu，1995中公布的基因組元件1、3和4與在較早的申請PCT/AU95/00311中所提及的元件1、2和5相應(yīng)。
令人驚奇的是，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)BBTV基因組元件1-6的基因間區(qū)或其部分具有能夠促進、增強、調(diào)節(jié)或改善非BBTV基因轉(zhuǎn)錄的序列。
因而本發(fā)明包括用于促進、增強、調(diào)節(jié)或改善一非BBTV基因轉(zhuǎn)錄的前面提到的基因間區(qū)、或其部分、衍生自其中的序列和其突變體本身。
本發(fā)明在其范圍內(nèi)還包括一種作為BBTV元件基因間區(qū)部分片段的DNA分子或者說該DNA分子衍生自所說的基因間區(qū)，其中該DNA分子能夠促進、增強、調(diào)節(jié)或改善非BBTV基因轉(zhuǎn)錄。
在本說明中將部分片段定義為比BBTV元件的基因間區(qū)的全序列小但等于或大于一個來自BBTV元件的大約172個堿基對的序列的序列。所說的DNA分子的序列可能與BBTV元件基因間區(qū)的部分片段的互補序列相同。
在本說明中基因間區(qū)被用于定義一BBTV元件的非編碼區(qū)或在一BBTV元件中ORF外的區(qū)域。
DNA分子的序列可以同BBTV元件1-6的基因間區(qū)的部分片段基本相同或互補。在本說明中“基本”被用來指具有高達20％變異度的序列。通過標準的雜交方法或序列比較能夠確定序列變異度的量。20％的百分比為在不同地區(qū)的分離株之間元件1的ORF外區(qū)域所表現(xiàn)的變異度(Karan等，1994，《普通病毒學(xué)雜志》，75，3541-3546；和美國專利申請08/202186號)。此中這兩篇文獻都并入本文作為參考來支持BBTV所有元件的20％變異度的權(quán)利要求。對于不同地區(qū)分離株的元件1確定的變異度為來自不同地區(qū)分離株的每個元件之間的變異度的代表。因而，高達20％的變異度也用于下面討論的元件2到6的序列。
術(shù)語“衍生的”定義為已通過包括突變的任何方法由一BBTV元件基因間區(qū)的一個片段改變、替換或修飾的任何序列。
尤其是，該DNA分子的序列可以是BBTV基因間區(qū)元件6衍生的pBT6.1插入片段(大約623個堿基對的片段)、pBT6.2插入片段(大約351個堿基對的片段)、pBT6.3插入片段(大約239個堿基對的片段)和pBT6.4插入片段(大約172個堿基對的片段)；元件1衍生的pBT1.1插入片段(大約214個堿基對的片段)、pBT1.INT插入片段(大約980個堿基對的片段)；元件2衍生的pBT2.1插入片段(大約855個堿基對的片段)；元件3衍生的pBT3.1插入片段(大約526個堿基對的片段)；元件4衍生的pBT4.1插入片段(大約659個堿基對的片段)；以及元件5衍生的pBT5.1插入片段(大約454個堿基對的片段)。該DNA分子可以是包括在pBT6.1插入片段中存在而在pBT6.2插入片段中不存在的CR-M的275個堿基對的區(qū)域。該275個堿基對的區(qū)域可能是一個調(diào)節(jié)區(qū)。該DNA分子可以包含在CRSL區(qū)和BBTV元件1到6中任何一個的開放讀框的ATG之間的或包括它們的區(qū)域。pBT1.1、pBT2.1、pBT3.1、pBT4.1、pBT5.1和pBT6.1插入片段示于

圖11中。圖12展示pBT1.INT插入片段的序列。圖13展示(a)pBT6.1(b)pBT6.2(c)pBT6.3和(d)pBT6.4插入片段的DNA序列。
非BBTV基因可以是如GUS、NPTII、殺蟲劑抗性基因、除草劑抗性基因或一生長促進基因的任何適宜的基因。
該DNA分子可以在任何合適的原核或真核宿主中轉(zhuǎn)錄基因。優(yōu)選該DNA分子可以在一如來自Musa spp(香蕉)、小麥細胞類植物細胞的單子葉植物細胞中轉(zhuǎn)錄基因。該DNA分子可以在一如香蕉和小麥的單子葉植物中轉(zhuǎn)錄基因。優(yōu)選該DNA分子可以在一如來自煙草和密生西葫蘆細胞的雙子葉植物細胞中轉(zhuǎn)錄基因。該DNA分子可以在一如煙草和密生西葫蘆的雙子葉植物中轉(zhuǎn)錄基因。該DNA分子優(yōu)選在一雙子葉植物的未分化組織的細胞中轉(zhuǎn)錄基因。
在另一方面，本發(fā)明為一種在一個目的基因的上游具有一如上所述的DNA分子以能夠促進、增強、調(diào)節(jié)或改善該基因轉(zhuǎn)錄的嵌合載體或盒。
嵌合載體可以衍生自pBI101.3。該載體可以為下面提到的任何合適的構(gòu)建物。盒可以為下面提到的任何合適的構(gòu)建物。目的基因可以為上面提到的任何合適的基因。對于在宿主中的表達可以將嵌合載體或盒引入任何合適的包括單子葉植物細胞和雙子葉植物細胞的宿主中。
在第三方面本發(fā)明為一種具有如上所述的DNA分子的植物細胞。
在第四方面本發(fā)明為帶有如上所述的植物細胞的植物。
在第五方面本發(fā)明提供了一種利用如上所述的DNA分子在一植物細胞中表達一非BBTV基因的方法。
現(xiàn)在將參照優(yōu)選的實施方案描述本發(fā)明。然而，這些優(yōu)選的實施方案僅為舉例說明。實施例1描述BBTV的另外三個元件的發(fā)現(xiàn)和鑒定并為了便于允許本領(lǐng)域的技術(shù)人員分離這些BBTV元件將其引入本說明書中。這些信息基本上已經(jīng)發(fā)表在Burns等，1995，《普通病毒學(xué)雜志》，76，1471-1482中。實施例1BBTV元件方法cDNA的合成和克隆，從S-E昆士蘭的Nambour地區(qū)收集具有香蕉束頂病典型癥狀的香蕉。按照由Wu和Su，1990，《植物病理學(xué)雜志》128153-160以及Thomas和Dietzgen，1991，《普通病毒學(xué)雜志》72 217-224所描述的方法純化BBTV顆粒。從病毒顆粒中按照由Francki和Randles，1973，《病毒學(xué)》(Virology)54 359-368所描述的方法提取核酸。按照由Gubler和Hoffman，1983，《基因》(Gene)25 263-269所描述的方法利用隨機六聚體(Bresatec)引發(fā)第一鏈的合成來合成雙鏈DNA。用綠豆核酸酶(Promega)處理dsDNA并連接至SmaI消化的質(zhì)粒載體pUC18(Upcroft和Healey，1987，《基因》51 69-75)中。然后用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株JM109(Hanahan，1983，《分子生物學(xué)雜志》(Journal of Molecular Biology)166 557-580)并通過在X-gal底物上篩選來鑒定潛在的重組克隆(Vieira和Messing，1982，《基因》19 259-268)。
利用堿裂解法(Sambrook等，1989，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular CloningA Laboratory Manual)紐約冷泉港實驗室)分離質(zhì)粒。通過用EcoRI/HindIII消化切下插入片段，在瓊脂糖凝膠中電泳并利用0.4M NaOH毛細管點樣于Hybond N+(Amersham)上(Sambrook等，1989，《分子克隆實驗室手冊》紐約冷泉港實驗室)。利用一Gene-Clean試劑盒(Bresatec)從瓊脂糖凝膠中純化用作DNA探針的插入片段。利用一Ready-To-go標記試劑盒(Pharmacia)按照制造商建議的方法標記DNA探針。按照由Burns等，1994，《病毒學(xué)文獻》(Archives of Virology)137 371-380描述的方法進行預(yù)雜交和雜交。
測序和序列分析，通過堿裂解后聚乙二醇沉淀制備各個BBTV克隆的微量制備品(Hattori和Sakaki，1996，《分析生物化學(xué)》(Analytical Biochemistry)152 232-238)。利用35SdATP和一個Sequenase試劑盒(US Biochemicals)按照制造商推薦的方法進行測序。將反應(yīng)產(chǎn)物在含有7M尿素的8％(w/v)聚丙烯酰胺凝膠中電泳。將凝膠固定、吹干并暴露于X-線膠片。用于測序的引物為通用測序引物或利用Applied Biosystems(ABI)PCR Mate合成的并按照制造商所建議的方法處理的與所克隆的病毒DNA的適宜區(qū)域互補的17-30nt引物。
利用一Gene-Clean試劑盒(Bresatec)從瓊脂糖凝膠中純化用于測序的PCR產(chǎn)物，利用一Sequenase試劑盒(USB)基本上按照由制造商所描述的方法將DNA測序。通過在加入DMSO和3皮摩爾的測序引物后煮沸進行模板DNA(500ng)的變性。
利用通過澳大利亞悉尼大學(xué)ANGIS計算機室提供的GCG分析軟件包版本8分析核苷酸序列。利用Clustal V.軟件包排列核苷酸和氨基酸序列(Higgins等，1991，CABIOS 8 189-191)。利用2個數(shù)據(jù)庫檢索分析程序FASTA(Pearson和Lipman，1988，《美國國家科學(xué)院進展》 (Proceddings of the National Academy of Sciences，USA)85 2444-2448)和BLAST(Altschul等，1990，《分子生物學(xué)雜志》215 403-410)檢索4個DNA數(shù)據(jù)庫(GenBank、GenBank Weekly Updates、EMBL和EMBL weekly updates)和5個蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(SwissProt、SwissProt Weekly Updates、PIR、GenPeptide Proteins和GenPeptides Weekly Updates)尋找與BBTV核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列的序列同源性。
PCR分析和克隆，利用克隆(i)pBTRP-11、20、80和88以及(ii)pBTRP-P1和P2的各自的核苷酸序列以及BBTV元件1(Harding等，1993，《普通病毒學(xué)雜志》74 323-328)和2的核苷酸序列，合成3套緊密鄰接的向外延伸引物((i)引物A5’GCATCCAACGGCCCATA3’；引物B5’CTCCATCGGACGATGGA3’；(ii)引物C5’TATTAGTAACAGCAACA3’；引物D5’CTAACTTCCATGTCTCT3’；(iii)引物E5’CGGGa/tATa/cTGATTGt/gGT3’；和引物F5’TACa/tTTTGTCATAGc/tGT 3’)并按照由Burns等，1994，《病毒學(xué)文獻》137 371-380所描述的方法用于以BBTV DNA為模板的PCR中。利用TA克隆試劑盒(Invitrogen)按照制造商建議的方法將擴增產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒載體pCRII或pCR2000中或者克隆到T加尾的pUC19和Bluescript(Marchuk等，1990，《核酸研究》(NucleicAcids Research)19 1154)中。利用X-gal底物在含有適宜抗生素的Luria Bertani(LB)瓊脂上篩選重組克隆并利用堿裂解法分離質(zhì)粒(Sambrook等，1989，《分子克隆實驗室手冊》紐約冷泉港實驗室)。篩選具有明顯全長插入片段(大約1kb)的克隆用于測序。
病毒顆粒ssDNA的極性，提取BBTV ssDNA，在瓊脂糖中電泳并毛細管點樣至雙份尼龍膜上(Harding等，1993，《普通病毒學(xué)雜志》74 323-328)。對于元件2，利用一DNA3’末端標記試劑盒(Boehringer Mannheim)制備32P標記的鏈特異性寡核苷酸雜交探針(引物BT2F5.30(G)5’GGTCCCCTTTAAGATTCCTTTCTTCGTCGC 3’；引物BT2R5.30(H)5’CGGAAAATGAATAAGTATGAGGTGAAAGAG 3’)。在Rapid-hyb(Amersham)中于60℃將膜分別預(yù)雜交12小時和雜交20小時。用1％SDS、2×SSC(0.3M NaCL、0.03M檸檬酸鈉，pH7.0)在室溫下將濾膜洗滌一次隨后用2×SSC在65℃洗滌。在-80℃利用增感屏將吹干的膜暴露于X-線膠片。
對于元件3、4、5和6，利用鏈特異性探針。利用一個riboprob體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)按照制造商建議的方法合成4個元件中每個的全長BBTV克隆的全長RNA轉(zhuǎn)錄物。結(jié)果5個基因組元件的克隆和測序從兩個文庫(i)一個隨機引物文庫和(ii)一個PCR文庫中克隆并測序了BBTV的5個新的基因組元件。(i)隨機引物文庫由從純化的病毒顆粒提取的BBTV ssDNA產(chǎn)生一個隨機引物文庫。用綠豆核酸酶處理所獲的dsDNA，鈍端連到SmaI切開的pUC18中并克隆到大腸桿菌JM109中。利用來自BBTV病毒顆粒的、健康香蕉的和來自BBTV DNA元件1的一個部分克隆pBT338插入片段的32P標記的DNA篩選文庫(Harding等，1991，《普通病毒學(xué)雜志》72225-230；Harding等，1993，《普通病毒學(xué)雜志》74 323-328)。BBTV DNA元件24個克隆，pBTRP-11、20、80和88，與BBTV病毒顆粒DNA以及彼此之間雜交而不與健康香蕉DNA或pBT338雜交。將來自這些克隆的插入片段測序都有220bp插入片段的pBTRP-20和88具有相同的序列；pBTRP-80有一個188bp的插入片段且有148bp的序列與pBTRP-20和88相同而在一個末端的另外40bp序列是獨有的；pBTRP-11的115bp插入片段的序列與pBTRP-20和88的等價區(qū)域相同。由四個克隆的重疊序列設(shè)計兩個緊密鄰接的向外延伸引物(引物A和引物B)以便這些引物能夠引發(fā)一個環(huán)狀ssDNA分子的全長dsDNA拷貝的擴增(Harding等，1993，《普通病毒學(xué)》74 323-328)。利用這些引物和Pfu DNA聚合酶通過PCR擴增BBTV病毒顆粒的ssDNA，并將產(chǎn)物克隆入pCR2000。利用通用正向和反向引物以及序列特異性引物對所獲克隆中的四個在兩個方向上進行測序。這些克隆中的三個含有1060bp的插入片段而一個克隆含有一1059bp的插入片段。除了包括1個缺失的9個單核苷酸改變外這四個克隆具有相同的序列。另外，在四個PCR克隆中發(fā)現(xiàn)最初四個cDNA克隆的序列。將被稱為BBTV DNA元件2的這個元件的共有序列進行編輯(圖1a)并與BBTV DNA元件1的序列比較(Harding等，1993，《普通病毒學(xué)雜志》)；除了兩個顯著的同源性區(qū)域外這兩個序列基本上是不同的。
BBTV DNA元件6來自同一隨機引物文庫的另外兩個克隆pBTRP-P1和P2也與標記的BBTV病毒顆粒DNA雜交但不和來自健康香蕉或pBT338的DNA雜交。然而，用EcoRV消化這些克隆的都為大約1kb的插入片段而元件1和2都沒有EcoRV位點。利用通用的正向和反向引物將這兩個克隆測序。這兩個克隆的序列相同但卻與元件1和2的那些序列明顯不同。另外，由該序列設(shè)計并合成兩個緊密鄰接的向外延伸的引物，引物C和D。與這兩個引物一起在一個PCR反應(yīng)中將BBTV病毒顆粒ssDNA用作模板并將所獲產(chǎn)物克隆到T加尾Bluescript載體中。篩選出一個明顯的全長克隆pBT-P2A1，并由通過核酸外切酶III消化而產(chǎn)生的亞克隆和通用的正向和反向以及序列特異性引物將其在兩個方向上測序。然后將最終的1089bp元件6的序列進行編輯(圖1e)。(ii)PCR文庫當比較元件1和2的序列時，鑒別出兩個同源性的區(qū)域。第一個區(qū)域，后面定義為莖-環(huán)共同區(qū)(CR-SL)，包括以前在元件1中鑒定的潛在的莖/環(huán)序列(Harding等，1993，《普通病毒學(xué)雜志》74 323-328)；第二個區(qū)域，其被包含在后面被定義為主要共同區(qū)(CR-M)的區(qū)域中，是一個莖-環(huán)序列5’大約66個核苷酸的序列。據(jù)推測所有BBTV基因組元件都應(yīng)含有一個CR-M，因而由該區(qū)域設(shè)計兩個緊密鄰接的向外延伸的簡并引物，引物E和F，合成引物并利用BBTV病毒顆粒ssDNA作為模板通過PCR延伸(Burns等，1994，《病毒學(xué)文獻》137 371-380)。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出7種產(chǎn)物，每種大約1kb。將產(chǎn)物克隆到pCRII中?；谒鼈兣cBBTV病毒顆粒DNA雜交而不與來自健康香蕉的DNA雜交以及每組具有與其它兩組及元件1、2及6不同的限制性酶切模式，將所獲克隆分為3組，組B、C和D(Burns等，1994，《病毒學(xué)文獻》137 371-380)。組A具有與元件2無法區(qū)分的限制性酶切模式并且后來通過測序證實組A的克隆代表元件2的克隆。
假定每組克隆代表一個新的并且唯一的BBTV DNA元件。對于每組克隆，利用通用正向和反向引物對三個克隆(元件3)或四個克隆(元件4和5)進行部分測序。在每種情況下，一個組的所有克隆具有相同的序列，其中除了一個或兩個單核苷酸改變外這些序列重疊。另外，來自每組的序列與其它組的和元件1、2和6的序列不同。從每個組或元件中選擇一個克隆并在兩個方向上全長測序。重要地是，利用覆蓋一個衍生自元件1和2的保守CR-M的34個核苷酸的簡并引物產(chǎn)生這些克隆組的每一個。來自元件1和2的CR-M不是完全保守的因而預(yù)計假想的CR-M序列在其它元件之間可能變化。因而，設(shè)計對每個元件唯一的會聚引物并用于對來自BBTV病毒顆粒的ssDNA的每個元件擴增一段包括CR-M的序列。直接利用兩個元件特異性會聚引物將所獲PCR產(chǎn)物測序。
BBTV DNA元件3利用通用的正向和反向引物以及三個序列特異性引物從最初的克隆和通過核酸外切酶III消化或限制性酶切片段而產(chǎn)生的亞克隆中將元件3(組C克隆pBTP-64)在兩個方向上進行測序。由這個序列設(shè)計另外兩個會聚引物來擴增一個包括CR-M的380bp產(chǎn)物。這個產(chǎn)物的序列與pBTP-64的序列除了5個單核苷酸改變外是相同的，其中4個是在被最初的簡并引物覆蓋的序列中而1個在這個序列外位于947位核苷酸。然后編輯1075bp元件3的最終序列(圖1b)。
BBTV DNA元件4利用通用的正向和反向引物以及三個序列特異性引物從最初的克隆和通過核酸外切酶III消化或限制性酶切片段而產(chǎn)生的亞克隆中將元件4(組D克隆pBTP-62)在兩個方向上進行測序。由這個序列設(shè)計另外兩個會聚引物來擴增一個包括CR-M的350bp產(chǎn)物。除了在被最初的簡并引物覆蓋的序列中的2個單核苷酸改變外這個產(chǎn)物的序列與pBTP-62的序列相同。然后編輯1043bp元件4的最終序列(圖1c)。
BBTV DNA元件5利用通用的正向和反向引物以及三個序列特異性引物從最初的克隆和通過核酸外切酶III消化或限制性酶切片段而產(chǎn)生的亞克隆中將元件5(組B克隆pBTP-129)在兩個方向上進行測序。由這個序列設(shè)計另外兩個會聚引物來擴增一個包括CR-M的290bp產(chǎn)物。除了在被最初的簡并引物覆蓋的序列中的1個單核苷酸改變外這個產(chǎn)物的序列與pBTP-129的序列相同。然后編輯1018bp元件5的最終序列(圖1d)?；蚪M元件的方向和與香蕉束頂病的聯(lián)系我們以前已經(jīng)證明BBTV基因組被包殼包成單鏈DNA(Harding等，1991，《普通病毒學(xué)雜志》72 225-230；Harding等，1993，《普通病毒學(xué)雜志》74 323-328)。為了確定在病毒顆粒中每個元件的方向，合成了特異性針對每個元件的鏈特異性DNA或RNA探針并與BBTV病毒顆粒DNA雜交。元件2特異性探針為兩個3’末端標記的30體寡核苷酸而特異性針對元件3、4、5和6的探針為SP6、T3或T7啟動的32P標記的RNA轉(zhuǎn)錄物。對于每個元件，與在圖1中提供的元件序列互補的探針同BBTV病毒顆粒DNA強烈雜交而與圖1的序列相同的探針不雜交(圖2)。這表明每個元件被包殼包成ssDNA并且僅僅處于在圖1中提供的一種方向上。
另外，將與BBTV病毒顆粒ssDNA雜交的鏈和元件特異性探針用作探針來證明每個元件是與香蕉束頂病相關(guān)的。將從3個(對于元件2)或4個(對于元件3到6)不同BBTV分離株提取的植物DNA以及來自4個健康香蕉的DNA進行Southern印跡并與每種探針雜交。每個元件特異性探針與來自BBTV感染的香蕉的所有提取物中的一種預(yù)期大小的低分子量DNA雜交，但不同來自健康香蕉的提取物雜交(結(jié)果未示)。這表明每個元件是清楚地與疾病以及病毒相關(guān)的。BBTV基因組元件的分析將這里介紹的5個BBTV基因組元件的序列和元件1的序列排列并比較。6個序列的每個除了兩個顯著的在所有6個元件之間具有不同程度同源性的區(qū)域外都不同。
莖環(huán)共同區(qū)我們以前已經(jīng)在BBTV元件1中鑒定了一個潛在的具有與雙粒病毒不變的環(huán)序列(Lazarowitz，1992，《植物科學(xué)的重要綜述》(Critical Reviews in Plant Sciences)11 327-349)幾乎相同的環(huán)序列的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)(Harding等，1993，《普通病毒學(xué)雜志》74 323-328)。在元件2到6中也發(fā)現(xiàn)了一個等價的莖/環(huán)結(jié)構(gòu)(圖3)。每個元件具有一11個核苷酸的環(huán)序列，其中的9個連續(xù)的核苷酸在所有元件之間是保守的。每個元件還具有一10bp莖序列，其中14個核苷酸是完全保守的。然而，當比較所有的6個元件時，同源性的區(qū)域延伸達到莖-環(huán)結(jié)構(gòu)5’的25個核苷酸以及莖-環(huán)結(jié)構(gòu)3’的13個核苷酸。在元件1、3、4和5之間5’的25個核苷酸是完全保守的。在元件2和6中都明顯地有兩個缺失。在元件2中，8個核苷酸與元件1、3、4和5完全保守，而在元件6中，16個核苷酸與這些其它元件保守。莖-環(huán)3’的13個核苷酸除了在元件2中的一個明顯單核苷酸缺失外在所有6個元件中是完全保守的。包括莖-環(huán)序列的多達69個核苷酸的序列被稱為莖-環(huán)保守區(qū)或CR-SL。
主要共同區(qū)第二個共同區(qū)定位于CR-SL 5’的不同距離處并被稱為主要共同區(qū)或CR-M。該區(qū)在大小上從元件1中的65個核苷酸到元件5中的92個核苷酸之間變化(圖4)。元件1明顯地具有CR-M的前26個核苷酸的缺失和另一個單核苷酸的缺失。元件2、3和4具有兩個單核苷酸的缺失而元件6具有一個單核苷酸的缺失。在所有元件之間45個核苷酸是保守的而且在元件1中缺失的前26個核苷酸中的23個在元件2到6之間是保守的。另外在元件2到6中，有一個幾乎完全的從4到20位和21到36位核苷酸的16個核苷酸的直接重復(fù)序列(ATACAAc/gACa/gCTATGA)。另外將一15個核苷酸的GC豐富序列(平均86％的GC)定位于從78到92位核苷酸，并且其在所有的元件之間93％保守。
在CR-M的最后一個核苷酸和CR-SL的第一個核苷酸之間的序列在長度上從元件1中的22個核苷酸到元件2中的233個核苷酸之間變化(圖1和5)。有趣的是，在元件3和4中的175個核苷酸的該序列在這兩個元件之間97％保守。
潛在的TATA盒在BBTV元件1中鑒定出了一個潛在的TATA盒并定位于莖環(huán)最后核苷酸3’的20個核苷酸和推測的復(fù)制酶基因的啟始密碼子5’的43個核苷酸中(Harding等，1993，《普通病毒學(xué)雜志》74 323-328)。在元件2到6中也鑒定出了類似的潛在的TATA盒。在這些元件的每個中，潛在的TATA盒是一9個核苷酸的序列，CTATa/ta/tAt/aA，并定位于莖-環(huán)序列的下游(圖1)。然而，莖-環(huán)序列的最后一個3’核苷酸和潛在的TATA盒之間的序列在元件2到6中比在元件1中長得多，并且從元件5中的157個核苷酸到元件4中的227個核苷酸之間變化(圖1和5)。潛在聚腺苷酸化信號的分析鑒定出了6個潛在的與元件3到6的主要ORF的3’末端相連的聚腺苷酸化信號。一個10到17個核苷酸的GT豐富區(qū)位于這些聚腺苷酸化信號的每一個的0到23個核苷酸之間，并且每個GT豐富區(qū)含有三核苷酸序列TTG(圖4)。只有一個在元件2中鑒定出的潛在聚腺苷酸化信號具有一個相應(yīng)的含有三核苷酸序列TTG的GT豐富區(qū)，并且這位于在病毒顆粒意義上潛在TATA盒的九核苷酸3’的233核苷酸處。總結(jié)所有的6個元件在推測的基因間區(qū)或非翻譯區(qū)共享2個共同區(qū)，CR-SL和CR-M，并且6個元件中的5個在病毒顆粒的意義上具有一個與潛在的TATA盒和聚腺苷酸化信號相連的大的ORF(圖5)。CR-SL包括保守的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。11個核苷酸的環(huán)序列在所有的BBTV元件中除了2個核苷酸外都保守并且與在9個雙粒病毒中(Lazarowitz，1992，《雙粒病毒組基因組結(jié)構(gòu)和基因功能》(Geminivirusesgenome structure and gene function)2)、CFDV中(Rohde等，1990，《病毒學(xué)》176 648-651)和另一BBTV元件中(Yeh等，1994，《病毒學(xué)》198 645-652)存在的序列相似。對于雙粒病毒已經(jīng)描述了一個用于在滾環(huán)復(fù)制中影響環(huán)序列的模型(Saunders等，1993，雙粒病毒-非洲木薯花葉病毒的DNA形式與復(fù)制的滾環(huán)機制一致，第IX屆國際病毒學(xué)大會，格拉斯哥，1993年8月，摘要第60-18頁)。在BBTV中的環(huán)序列可能具有相似的功能。在所有BBTV元件中莖-環(huán)序列也是高度保守的并含有在小麥矮小雙粒病毒中作為病毒鏈DNA合成啟始位點的五核苷酸序列TACCC(Heyraud等，1993，《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》(EMBOJournal)12 4445-4452)。
在所有元件中鑒定了主要共同區(qū)(CR-M)并且定位于主要ORF的3’(除了未鑒定出主要ORF的元件2)和CR-SL的5’(圖5)。在除了元件1外的所有元件中于CR-M內(nèi)都鑒定出了六核苷酸重復(fù)序列。然而，除了這些序列可能與啟動子序列或部分啟動子序列相連外還沒有功能能夠直接歸因于這些序列。CR-M還含有一個定位于3’末端的15 nt GC豐富序列，并具有潛能形成一個小的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。這個GC豐富序列還含有與動物細胞和病毒中基因啟動子中發(fā)現(xiàn)的Sp1結(jié)合位點相似的兩個直接GC重復(fù)序列(Fenoll等，1990，《植物分子生物學(xué)》(Plant Molecular Biology)15 865-877)。一個單子葉感染玉米條紋雙粒病毒中的相似啟動子被表明是最大向右轉(zhuǎn)錄所需的，而且似乎還以一種非協(xié)同的方式結(jié)合玉米核因子(Fenoll等，1990，《植物分子生物學(xué)》15 865-877)。
Karan等，1994，《普通病毒學(xué)雜志》75 3541-3546報道元件1CR-M序列在南太平洋組的BBTV分離株中(96.5％的同源性)和亞洲組的分離株中(98.％的同源性)是高度保守的，但在兩個組的分離株之間是高度可變的(68.0％的同源性)。此處報道了在一種澳大利亞分離株的6個不同元件的CR-M序列之間有76％的同源性。因此，重要的是確定在來自不同組分離株的各個元件的CR-M序列之間的同源性水平來觀察在分離株的組內(nèi)這些序列是否高度保守而在組間和不同元件之間是否可變，進而確定這是否具有生物學(xué)意義。
在元件CR-M和CR-SL之間的核苷酸長度和序列在6個不同元件的4個中是不相似的。然而在元件3和4中，該175個核苷酸的區(qū)域是97％同源的，而從CR-M的5’末端到CR-SL的3’末端的334個核苷酸是98％同源的。在雙粒病毒組中已發(fā)現(xiàn)了一個相似的300個核苷酸的大的共同區(qū)，并且在每個二分的雙粒病毒組的A和B元件之間是相同的(Lazarowitz，1992，《雙粒病毒組基因組結(jié)構(gòu)和基因功能》。在雙粒病毒組中，該區(qū)包括莖一環(huán)區(qū)。在SCSV的包括基環(huán)區(qū)的7個元件的5個中也發(fā)現(xiàn)了一個與雙粒病毒類似但與6個BBTV元件的4個不同的同源性的區(qū)域(Surin等，1993，地下三葉草矮小病毒基因組，由編碼單一ORF的微染色體組成，第IX屆國際病毒學(xué)大會，格拉斯哥，1993年8月，摘要62-1頁。)。
元件3、4、5和6在病毒顆粒意義上于CR-SL的3’都有一個大的ORF。這些ORF的每個都有與它們相連的潛在的保守TATA盒和聚腺苷酸化信號(圖8)。潛在的TATA盒與Buchei等，1990，《分子生物學(xué)雜志》(Journal of Molecular Biology)212，563-578所描敘的基本相似的九核苷酸序列CTATa/ta/tAa/tA高度保守。在每個元件中，在潛在的TATA盒和翻譯啟始密碼子之間的距離從元件3中的13個核苷酸到元件1中的102個核苷酸之間變化。在編碼大的ORF的5個元件中鑒定出了一個ATGG翻譯啟始密碼子。然而，在元件3中鑒定了2個可能的翻譯啟始密碼子，第一個在213位核苷酸處(ATGT)，而第2個在227位核苷酸處(ATGG)，第2個啟始密碼子與第1個在同一框內(nèi)。這可能提示第2個啟始密碼子是正確的密碼子；這可通過5’RACE或ORF翻譯產(chǎn)物的N-末端測序來證實。在元件1、3、4、5和6中每個聚腺苷酸化信號3’的0到24個核苷酸被鑒定為GT豐富區(qū)域。這些GT豐富區(qū)域的每個都含有核苷酸序列TTG。在元件3和6中的聚腺苷酸化信號都含有這些序列。共有聚腺苷酸化信號(Aa/tTAAa/t)和一個含有TTG三核苷酸序列的3’近側(cè)GT豐富區(qū)的組合只與元件1、3、4、5、和6中單一的主要毒粒意義ORF相關(guān)，而在這些序列的其它處未發(fā)現(xiàn)，這表明這些元件每一個都編碼一個單一的基因。相似的序列已與許多聚腺苷酸化信號相關(guān)連并且可能是有效終止所需的(Gil和Proudfoot，1984，《自然》(Nature)312 473-474；Conway和Wickens，1985，《美國國家科學(xué)院進展》82，3949-3952)。實施例2BBTV基因間區(qū)對表達的修飾材料與方法質(zhì)粒土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將來自BBTV基因組的所有潛在啟動子連入土壤桿菌二分載體pBI101.3(Clontech)中。該質(zhì)粒具有一個由胭脂氨酸合成酶啟動子/NPTII基因(卡那霉素抗性基因)/胭脂氨酸合成酶(NOS)終止子和一個帶NOS終止子的“無啟動子”β-葡糖苷酸酶基因(GUS)組成的一個抗生素抗性盒。將BBTV衍生的序列分別連入無啟動子基因(GUS)5’的單一BamHI位點中。將質(zhì)粒pBI121(Clontech)用作對照質(zhì)粒。該質(zhì)粒除了具有GUS基因5’的啟動GUS表達的CaMV35S啟動子外與pBL101.3是相同的。
微粒轟擊對于通過微粒轟擊對BBTV啟動子活性的瞬時分析，將BBTV啟動子/GUS/nos盒亞克隆到pGEM3zf+(Promega)中。作為大部分實驗的一個陽性對照將CaMV 35S啟動子/GUS/nos盒同樣由pBI121亞克隆互入pGEM3zf+中(pGEM35S-GUS)。利用Qiagen Plasmid Maxi試劑盒(Qiagan)按照制造商的說明以高度純化的形式大量制備這些質(zhì)粒用于biolistics。
轉(zhuǎn)化通過微粒轟擊、電穿孔或土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Horseh等，1989，在《植物分子生物學(xué)手冊》(Plant Molecular Biology Manual)Gelvin等編Dordecht Kluwer學(xué)術(shù)出版社，A5/1-5/9頁；Hauptmam等，1987，《植物細胞報告》(Plant Cell Reports)6 265-270；Last等，1991，《理論和應(yīng)用遺傳學(xué)》(Theoretical and AppliedGenetics)81 581-588)將質(zhì)粒pBI121、pBI101.3或GUS基因5’帶有BBTV衍生序列的pBI101.3引入一系列植物物種和組織類型中。
對GUS表達的檢測基本上與在Jefferson，1987，《植物分子報道》(Plant Molecular Reporter)5(4)387-405中所描述的相同。BBTV啟動子構(gòu)建物的制備引物BT6.1 (25mer)5′ gcctgcagagttgtgctgtaatgtt 3′BT6.2 (24mer)gcggatccgcttctgccttccgctBT6.3 (25mer)gccctgcagcatggacgtcagcaaggBT3.1 (24mer)gcctgcagactattgtatggaatgBT3.2 (23mer)gcggatccctatctagacactggBT4.1 (23mer)gctctagaatgggtattgatgtaBT4.2 (25mer)gcggatccttagctgcgtcctatttBT5.2 (23mer)gcggatccgacgagtgatttcggBT129V3.17(17mer)gttatcatggcatcgacBT1R1.17 (17mer) gaacaagtaatgactttBT1.F4.30 (30mer)ggaagaagcctctcatctgcttcagagagcBT1. INT.R28 ggatcctacatgacaatttaaatgaaccBT1. INT.F25 aagcttataaaacgaaggcgatgaaPCR條件順序步驟1. 94℃×5分鐘2. 94℃×1分鐘42℃×1分鐘)×4072℃×1分鐘3.72℃×10分鐘1.BBTV基因間區(qū)的克隆BBTV元件6全長元件6(1089bp)1.利用引物BT6.1(+746)和BT6.2(+280)從BBTV6克隆P2A1PCR擴增基因間區(qū)。
2.將623bp基因間區(qū)以Pst和BamHI片段亞克隆入pUC19(pUC6.1)。
3.將基因間區(qū)從pUC6.1以一個HindIII和BamHI片段克隆入pBI101.2(pBT6.1)。
4.將BBTV6啟動子/GUS/nos片段從pBT6.1以一個HindIII和EcoRI片段亞克隆入pGEM3zf+(pGEM6.1-GUS)BBTV6基因間區(qū)5’缺失的產(chǎn)生pBT6.2的構(gòu)建1.通過用AccI，一個在元件6環(huán)中的+1018處存在的限制性位點和在pUC19的多克隆位點5’端存在的PstI消化pUC6.1產(chǎn)生一個BBTV6基因間區(qū)的272bp5’缺失。
2.用Klenow片段補平末端并再次連接產(chǎn)生pUC6.2。
3.將351bp片段從pUC6.2以一個HindIII和BamHI片段克隆入pBI101.3(pBT6.2)。
4.將BBTV6啟動子(351bp)/GUS/nos盒從pBT6.2以一個HindIII和EcoRI片段亞克隆入pGEM3zf+(pGEM6.2-GUS)。
pBT6.3的構(gòu)建1.利用引物BT6.3(+41)和BT6.2(+280)通過PCR擴增從BBTV6克隆P2A1產(chǎn)生一個BBTV6基因間區(qū)的384bp 5’缺失。
2.將239bp基因間區(qū)以一個PstI和BamHI片段克隆到pUC19中(pUC6.3)。
3.將基因間區(qū)從pUC6.3以一個HindIII和BamHI片段克隆到pBI101.3中(pBT6.3)。
4.將BBTV6啟動子(239bp)/GUS/nos盒從pBT6.3以一個HindIII和EcoRI片段克隆到pGEM3zf+中(pGEM6.3-GUS)。
pBT6.4的構(gòu)建1.通過用BamHI和HaeIII(在BBTV6環(huán)中的+108位點處存在的一個限制性位點)消化pUC6.3產(chǎn)生一個BBTV6基因間區(qū)451bp 5’缺失。
2.用Klenow片段補平末端并將172bp片段鈍端克隆到pBI101.3的SmaI位點中(pBT6.4)。
3.將BBTV6啟動子(172bp)/GUS/nos盒從pBT6.4以一個HindIII和EcoRI片段亞克隆到pGEM3zF+中(pGEM6.4-GUS)。
BBTV元件1全長元件1(1111bp)1.利用引物BT1R1.17(+986)和BT1F4.30(+129)從全長BBTV1克隆PCR擴增一個215bp含有BBTVI基因間區(qū)的片段。
2.用TaqI(一個在BBTV1環(huán)中的+118位點處存在的限制性位點)消化所獲的PCR產(chǎn)物。
3.利用Klenow片段將所獲214bp片段補成平端并克隆到pBI101.3的SmaI位點中(pBT1.1)。
4.將BBTVI啟動子(214bp)/GUS/nos盒以一個HindIII和EcoRI片段由pBT1.1亞克隆到pGEM3zf+中(pGEM1.1-GUS)。
注通過3’RACE實驗在BBTV-1鑒定出了一個小的ORF。這個ORF位于+430到+555位置處?；谶@個ORF的位置分離了另一個BBTV-1基因間區(qū)啟動子。
1.利用引物BT1.INT.28(+429)和BT1.INT.F25(+560)從全長BBTV-1克隆PCR擴增出了BBTV-1中基于最近鑒定的較小ORF的大基因間區(qū)。
2.將所獲額980bp基因間區(qū)以一個BamHI和HindIII片段克隆到pBI101.3中GUS報道基因的上游(pBT1.INT)。
BBTV元件2全長元件2(1059bp)以一個XbaI片段于+361位點處克隆到pUC19中的BBTV2全長雙鏈復(fù)制形式(pUC-BT2)獲自Raktham Wanitchakorn。
1.通過用XbaI和AccI(在元件2環(huán)的+565位點處存在的一個限制性位點)消化pUC-BT2產(chǎn)生一個855bp的基因間片段。利用Klenow片段補平AccI末端而保持XlaI位點為粘性。
2.將這個全長基因間區(qū)直接克隆到類似準備的pGEM3zf+載體中(pGEM2.1)。
3.將基因間區(qū)以一個HindIII和BamHI片段由pGEM2.1克隆到pBI101.3中(pBT2.1)。
4.將BBTV2啟動子(866bp)/GUS/nos盒從pBT2.1以一個HindIII和EcoRI片段克隆到pGEM3zf+中(pGEM2.1-GUS)。
BBTV元件3全長元件3(1075bp)1.利用引物BT3.1(+761)和BT3.2(+212)從BBTV感染的香蕉的細胞核提取物(Qld)PCR擴增出元件3全長基因間區(qū)。
2.以一個PstI和BamHI片段將這個526bp基因間區(qū)亞克隆到pGEM3zf+中(pGEM3.1)。
3.將基因間區(qū)以一個HindIII和BamHI片段由pGEM3.1克隆到pBI101.3中(pBT3.1)。
4.將BBTV3啟動子(526bp)/GUS/nos盒以一個HindIII和EcoRI片段由pBT3.1亞克隆到pGEM3zf+中(pGEM3.1-GUS)。
BBTV元件4全長元件4(1043bp)1.利用引物BT4.1(+662)和BT4.2(+278)從BBTV感染的香蕉的細胞核提取物(Qld)PCR擴增出元件4全長基因間區(qū)。
2.以一個Xbal和BamHI片段將這個659bp基因間區(qū)亞克隆到pGEM3zf+中(pGEM4.1)。
3.將基因間區(qū)以一個Xbal和BamHI片段由pGEM4.1克隆到pBI101.3中(pBT4.1)。
4.將BBTV4啟動子(659bp)/GUS/nos盒以一個XbaI和EcoRI片段由pBT4.1亞克隆到pGEM3zf+中(pGEM4.1-GUS)。
BBTV元件5全長元件5(1018bp)1.利用引物BT129V3.17(+639)和BT5.2(+230)從BBTV感染的香蕉的細胞核提取物(Qld)PCR擴增出元件5全長基因間區(qū)。
2.用BamHI和AccI(在元件5環(huán)中+794位點處存在的一個限制性位點)消化所獲得的PCR產(chǎn)物。用Klenow片段補平AccI位點而保持BamHI末端為粘性。
3.將所獲的454bp基因間區(qū)直接亞克隆到類似地準備的pGEM3zf+中(pGEM5.1)。
4.將基因間區(qū)以一個HindIII和BamHI片段由pGEM5.1克隆到pBI101.3中(pBT5.1)。
5.將BBTV5啟動子(454bp)/GUS/nos盒以一個HindIII和EcoRI片段由pBT5.1亞克隆到pGEM3zf+中(pGEM5.1-GUS)。2.通過Nicotiana tabacum(NT)細胞系的微粒轟擊瞬時分析BBTV啟動子活性NT細胞懸液的制備1.將25ml NT細胞懸液傳代培養(yǎng)到75ml新鮮NT液體培養(yǎng)基中并于28℃在適當光照下振蕩。
2.傳代培養(yǎng)后2天，將50ml活躍生長的NT培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到一個50mlFalcon試管中并放置5-10分鐘。
3.將所獲的收集的NT細胞重懸于一等體積的NT液體培養(yǎng)基中。
4.將200μl的NT細胞混合物在NT固體培養(yǎng)基上點樣，并在空氣中干燥3-4小時。
5.在28℃于適宜的光照下孵育NT斑點2天。
6.按照下面所描述的將NT斑點進行微粒轟擊。每個啟動子構(gòu)建物轟擊5個NT斑點。
7.Biolistics后將NT斑點在28℃于適宜的光照下孵育3天。
8.利用X-葡糖苷酸底物通過每個啟動子構(gòu)建物GUS染色一個NT斑點定性分析啟動子的活性。將剩余的4個NT斑點利用MUG底物進行定量GUS熒光法分析。這些技術(shù)基本上按照Jefferson 1987《植物分子報告》5(4)387-405所描述的進行。
用于微粒轟擊的DNA-金懸液的制備1.短暫振蕩金懸液并在冰水中超聲處理30秒。
2.在冰上通過向25μl金懸液(100mg/ml)中加入2μg的DNA、25μl CaCl.2H2O(2.5M)和5μl的無亞精胺的堿(0.1M)來制備DNA-金懸液。
3.斷續(xù)地振蕩DNA-金懸液5分鐘然后放置冰上10分鐘。
4.移走22μl體積的上清并棄去。振蕩剩余的懸液并將5μl的一份用于微粒轟擊。
5.每個啟動子構(gòu)建物使用一個金制備物。這種DNA-金懸液提供了足夠的懸液來轟擊5個NT斑點。
粒子流槍的轟擊條件25mmHg真空氦壓力大約550Kpa平臺高度10cm用于保護靶子的篩所用的構(gòu)建物試驗pGEM6.1-GUS、pGEM6.2-GUS、pGEM6.3-GUS、pGEMA6.4-GUSpGEM1.1-GUS、pGEM2.1-GUS、pGEM3.1-GUS、pGEM4.1-GUS、pGEM5.1-GUS對照pGEM35S-GUS結(jié)果實驗結(jié)果示于圖中。
BBTV6啟動子活性的比較1.BBTV元件6的全長基因間區(qū)具有與來自pBI121的800bpCaMV35S啟動子相當?shù)膯幼踊钚浴?br> 2.272bp的5’缺失(pGEM6.2-GUS)引起啟動子活性的顯著增加，這在另外的112bp 5’缺失(pGEM6.3-GUS)下仍維持。
3.具有另外的75bp 5’缺失(pGEM6.4-GUS)時，啟動子活性顯著降低。
結(jié)果的意義所觀察到的在質(zhì)粒pGEM6.1-GUS和pGEM6.2-GUS之間啟動子活性的增加提示CR-M周圍的272bp區(qū)可能含有一個對這種啟動子活性下降負責的推測的下調(diào)序列。
所觀察到的在質(zhì)粒pGEMA6.2-GUS、pGEM6.3-GOS和pGEM6.4-GUS之間的啟動子活性水平表明與BBTV基因間區(qū)相關(guān)的強啟動子活性的大部分與一個位于CR-S/L 3’的一個112bp區(qū)域相關(guān)。重要的是，這個區(qū)域含有一個推測的啟動子基元TGA-1b(+44位點處)，其含有與其它啟動子基元和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合域相似的核心序列TGACGT。
BBTV1-6啟動子的比較1.在NT細胞懸液的瞬時轉(zhuǎn)化中BBTV-1啟動子無活性。
2.BBTV-2啟動子具有6個BBTV元件中最高的啟動子活性，其水平比來自pBI121的800bp CaMV 35S啟動子高2-3倍。
3.BBTV-3，BBTV-4，BBTV-5啟動子相對弱，其活性水平比CaMV35S啟動子低大約50％。
4.BBTV-6全長基因間區(qū)具有與CaMV 35S啟動子相似的啟動子活性水平。
結(jié)果的意義與BBTV-1基因間區(qū)相關(guān)的啟動子活性的缺失可能提示這個啟動子具有高度的組織特異性表達模式或需要在煙草細胞核中缺乏的轉(zhuǎn)錄因子。在該啟動子中一個與S期特異性細胞表達相關(guān)的推測的啟動子基元(小麥組蛋白H3基因的1型元件)的鑒定可能暗示其活性局限于活躍分裂的分生組織類型。
與BBTV-2基因間區(qū)相關(guān)的高水平啟動子活性可能使該序列成為一個潛在的有用啟動子來驅(qū)動高水平的表達。盡管BBTV感染單子葉植物，但根據(jù)本研究似乎BBTV 2-6啟動子在雙子葉系統(tǒng)中是有不同程度活性的。3.在其它植物物種中BBTV啟動子活性的瞬時分析黃瓜的微粒轟擊1.將黃瓜胚前期愈傷組織在biolistic轉(zhuǎn)化前2周傳代培養(yǎng)于SQM2EV培養(yǎng)基上。
2.在biolistic轉(zhuǎn)化前4天將愈傷組織轉(zhuǎn)移至一小的SQM2EV平板上。
3.按照上面的方法進行微粒轟擊。
4.利用X-葡糖苷酸底物定性GUS染色，在轉(zhuǎn)化的愈傷組織中觀察GUS活性(biolistics后2天)。所用構(gòu)建物pBT6.1、pBT6.3、pBT1.1、pBI121.
結(jié)果1.GUS染色后pBT6.1和pBT6.3都產(chǎn)生了與pBI121相似數(shù)目的藍斑(轉(zhuǎn)化情況)。
2.在黃瓜愈傷組織中pBT1.1未表現(xiàn)啟動子活性的跡象(即未觀察到藍斑)。
密生西葫蘆原生質(zhì)體的電穿孔密生西葫蘆原生質(zhì)體的分離1.將1.5ml體積的胚胎密生西葫蘆愈傷組織懸液與20ml EnzymeMix(E3)混合并在25℃黑暗中于一慢搖床(30-50RPM)上孵育5-6小時。
2.通過450μm、105μm和51μm大小的篩并在40-50g下離心5分鐘分離原生質(zhì)體。
3.在PWS溶液中洗滌原生質(zhì)體一次，最后重懸于一已知容積的TBS中。
4.利用一校正的滑動計數(shù)儀估計細胞數(shù)，并將體積調(diào)節(jié)至含有1×106原生質(zhì)體/ml。
5.加入10μg質(zhì)粒DNA至1ml原生質(zhì)體中，并在冰上孵育10分鐘。
密生西葫蘆原生質(zhì)體的電穿孔1.原生質(zhì)體利用一個Gene Pulsar(BioRad)儀以300V的3個脈沖、10毫秒脈沖寬度和10毫秒脈沖延遲以10μg質(zhì)粒DNA在一BioRad電穿孔杯(0.4cm電極裂隙)中將DNA混合物電穿孔。
2.將原生質(zhì)體在冰上孵育另外10分鐘并在一個微型離心機中以1000RPM離心沉降。
3.在培養(yǎng)基415A中將原生質(zhì)體洗滌一次，最終重懸于1ml的415A中。
4.將原生質(zhì)體轉(zhuǎn)移至一個12孔微量滴定板并在黑暗中在一慢搖床上孵育48小時。
5.孵育后通過離心收獲原生質(zhì)體并檢測GUS活性。
熒光檢測法GUS的檢測1.將5μg提取的原生質(zhì)體蛋白標準地用于熒光檢測法(利用BioRad蛋白質(zhì)檢測試劑評價)。
2.用蛋白質(zhì)提取緩沖液將體積調(diào)整至100μl并與100μl MUG底物(2mM)在37℃孵育30分鐘。
3.通過加入1ml Na2CO3終止反應(yīng)。
4.利用一熒光分光光度計(激發(fā)365nm；發(fā)射455nm；積分時間-10)以一4-MU標準曲線(0-500nm)估計酶活性。
利用由Jefferson，1987，《植物分子報道》5(4)387-405所描述的一種熒光檢測法分析GUS活性。所用構(gòu)建物pBT6.3、pBT1.1、pBI121。
結(jié)果
無啟動子GUS二分載體(pBI101.3)未觀察到GUS活性。
由BBTV6基因間區(qū)(pBT6.3)的239bp片段驅(qū)動的GUS活性水平比800bp CaMV 35S啟動子(pBI121)大2倍。
由BBTV1啟動子(pBT1.1)觀察到少量至沒有GUS活性。
小麥細胞懸液的微粒轟擊1.在微粒轟擊前4天將小麥細胞懸液傳代培養(yǎng)至50ml WTL1培養(yǎng)基中。
2.通過低速離心沉淀小麥細胞并重懸在10ml WTL1培養(yǎng)基中。
3.就在轟擊前將細胞移至無菌濾紙上。
4.如前所述進行微粒轟擊。
5.biolistics后2天利用X-葡糖苷酸底物將轉(zhuǎn)化的小麥懸液進行GUS染色。
所用構(gòu)建物pBT1.1、pBT2.1、pBT3.1、pBT4.1、pBT5.1、pBT6.1、pBI121、DM8052(驅(qū)動GUS表達的水稻肌動蛋白增強的啟動子)。
結(jié)果1.每次轉(zhuǎn)化，水稻肌動蛋白增強的啟動子產(chǎn)生＞5000個藍斑。
2.每次轉(zhuǎn)化，pBI121平均產(chǎn)生大約70個藍斑。
3.在所有測試的BBTV啟動子構(gòu)建物中，只有pBT2.1是活性的，每次轉(zhuǎn)化平均產(chǎn)生100個藍斑。
香蕉雄花胚胎愈傷組織的微粒轟擊1.按照由Escalant等，1994，《體外細胞和發(fā)育生物學(xué)》(In VitroCellular and Developmental Biology)30P181-186描述的方法利用雄花產(chǎn)生Cavendish香蕉“Williams”變種的胚胎培養(yǎng)物。于一臨時浸透系統(tǒng)中將這種培養(yǎng)物維持在液體MP培養(yǎng)基中(Escalant等，1994，《體外細胞和發(fā)育生物學(xué)》30P的81-186)。
2.在微粒轟擊前5天將胚胎愈傷組織移至固體MP培養(yǎng)基上。
3.如前所述將組織進行微粒轟擊。
4.在biolistics后2天利用X-葡糖苷酸底物通過GUS染色使瞬時的GUS活性顯色。
所用的構(gòu)建物pGEM2.1-GUS、pGEM3.1-GUS、pGEM4.1-GUS、pGEM5.1-GUS、pGEM-Ubi(驅(qū)動GUS表達的玉米遍在蛋白啟動子)。
結(jié)果1.在這種組織類型中，玉米遍在蛋白啟動子驅(qū)動GUS高水平表達，具有強的藍染斑或轉(zhuǎn)化事件(因為強度和數(shù)量很難確定斑點的確切數(shù)目)。
2.所測試的BBTV啟動子構(gòu)建物中，所有啟動子都表現(xiàn)出低水平的活性(每次轉(zhuǎn)化＜10個藍斑)。
基于藍斑數(shù)目的強度的大概順序是pGEM2.1-GUS(最高)、pGEM4.1-GUS、pGEM3.1-GUS和pGEM5.1-GUS(最低)。
結(jié)果的意義來自在另外的植物物種中BBTV啟動子的活性的瞬時分析表明，BBTV6啟動子(尤其是239bp片段，pBT6.3)在未分化的葫蘆(雙子葉)組織類型中似乎是活躍的。
來自小麥細胞懸液的微粒轟擊結(jié)果提示，只有BBTV2啟動子具有顯著程度的活性。這個結(jié)果表明在未本科單子葉植物中至少一個BBTV啟動子在某種程度上是活躍的。
利用香蕉胚胎發(fā)育培養(yǎng)的瞬時檢測表明，目前所測試的BBTV啟動子在它們的宿主植物物種中具有某種水平的活性。另外，所測試的BBTV啟動子中最強的是BBTV元件2的啟動子，這可能反映在今后其作為一個潛在的有用的啟動子的重要性。4.通過土壤桿菌感染NT細胞懸液的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染1.在轉(zhuǎn)化前2到3天將5ml含有100μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)物用來自40％甘油貯液的被轉(zhuǎn)化的目的土壤桿菌屬接種。
2.在傳代培養(yǎng)后5-7天使用NT細胞(每次轉(zhuǎn)化利用4ml該培養(yǎng)物，以額外的4ml作為不接受細菌的對照)。注對每個構(gòu)建物進行雙份轉(zhuǎn)化。
3.每ml NT細胞加入1μl乙酰丁香酮(20mM乙醇溶液)。
4.利用一5ml移液器將NT細胞吹吸大約20次來幫助誘導(dǎo)損傷以及提高轉(zhuǎn)化事件。
5.將100μl的土壤桿菌培養(yǎng)物(密集生長)加入一個含有4ml處理過的NT細胞的微量滴定板中并徹底混合。
6.將平板于28℃在適度光照下孵育3天。
7.孵育后，每孔中加入10ml含有500μg/ml羧芐青霉素的NT液體培養(yǎng)基(NTC)。
8.在用NTC補足體積的50ml Falcon試管中將細胞以1K離心4min。
9.重復(fù)洗滌2次。
10.最后將細胞重懸于5ml NTC中，并將2ml接種于NTKC固體培養(yǎng)基(卡那霉素100μg/ml、羧芐青霉素500μg/ml)上。將平板在適度光照下于28℃孵育。
11.感染后3-4周，將轉(zhuǎn)化子分別傳代培養(yǎng)并以每兩周一次的傳代培養(yǎng)下維持篩選。
12.利用X-葡糖苷酸底物通過GUS染色觀察啟動子活性。
所用的構(gòu)建物pBT6.1(3個NT細胞系)、pBT6.2(3個NT細胞系)、pBT6.3(2個NT細胞系)、pBT2.1(25個NT細胞系)結(jié)果1.在用所有BBTV啟動子構(gòu)建物穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的NT愈傷組織中都觀察到了強的GUS活性。
2.在BT2.1轉(zhuǎn)化的不同NT細胞系之間表達的變化極可能是由于位點效應(yīng)(DNA整合入宿主基因組的位點)和整合的拷貝數(shù)。
結(jié)果的意義這些實驗表明在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的煙草未分化細胞系中BBTV6和BBTV2啟動子是高度活躍的。這些發(fā)現(xiàn)支持來自微粒轟擊實驗的結(jié)果，在其中這些啟動子表現(xiàn)出了強的瞬時活性。另外，這些結(jié)果證實來自這些啟動子的活性不受宿主基因組中穩(wěn)定整合的顯著影響。5.煙草通過土壤桿菌感染葉盤的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化1.通過電穿孔將啟動子的二分結(jié)構(gòu)引入土壤桿菌菌株LBA4404。
2.在卡那霉素篩選(100μg/ml)下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的土壤桿菌并通過改良的堿裂解法證實其含有啟動子結(jié)構(gòu)。
3.在轉(zhuǎn)化前2到3天由一個單一集落或40％甘油貯液啟始5ml待用的被轉(zhuǎn)化的土壤桿菌LB培養(yǎng)物，并在28℃振蕩。
4.用LB將培養(yǎng)物稀釋到20倍并移至一個無菌的10ml小管中。
5.切下3-6周齡Xanthii煙草的葉子并切成1cm×1cm的片。
6.將這些片移至稀釋的土壤桿菌培養(yǎng)物中并浸泡10-15min。
7.將煙草片于無菌濾紙上吸干，放在MS104培養(yǎng)基的近軸(上)側(cè)并在28℃孵育直至可看到輕微的細菌生長(2-3天)。
8.將葉子片轉(zhuǎn)移至MS104篩選培養(yǎng)基(100μg/ml卡那霉素和200μg/ml timentin)中并在適宜光照下于28℃孵育。
9.大約2周后，在感染的部位可見冠癭愈傷組織，另外2-5后芽變明顯。
10.當能看到確定的莖時，將芽切除并置于MS生根培養(yǎng)基中(100μg/ml卡那酶素和200μg/mltimentin)。
11.在篩選下將活躍生長的小植株(帶根系統(tǒng))維持在培養(yǎng)物中并利用X-葡糖苷酸底物將推測的轉(zhuǎn)化子進行定性GUS染色。
12.大體上每個啟動子構(gòu)建物獲得了6-12個推測的轉(zhuǎn)化子。
所用的構(gòu)建物測試 pBT6.1、 pBT6.2、 pBT6.3、 pBT6.4pBT2.1、 pBT2.2、 pBT2.3、 pBT2.4pBT1.1、 pBT3.1、 pBT4.1、 pBT5.1對照 pBI121結(jié)果1.在用pBI121轉(zhuǎn)化的葉、莖和根中有強的組成性GUS表達。
2.來自大約10％的BBTV啟動子構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的煙草小植株的葉和根部分中有弱的韌皮部局限的GUS表達。剩余的90％轉(zhuǎn)化子在葉和根內(nèi)未表現(xiàn)出GUS活性。
結(jié)果的意義來自BBTV啟動子構(gòu)建物穩(wěn)定轉(zhuǎn)化煙草的大部分(90％)組織的定性GUS染色結(jié)果提示，這些啟動子在整個植物或分化組織中具有小到無啟動子活性。一些BBTV基因間區(qū)(元件2和6)在瞬時系統(tǒng)中(煙草細胞系的微粒轟擊)表現(xiàn)高水平表達的事實表明這些啟動子的活性可能局限于未分化細胞類型或這些啟動子在從未分化愈傷組織到分化細胞類型的過度中被沉默化。這個原理進一步被由穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的煙草(未顯示GUS活性)葉子再生的愈傷組織在染色時展現(xiàn)改變的GUS表達水平這樣一個實驗所支持。
由于在未分化的細胞階段大部分植物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)依靠被轉(zhuǎn)化組織的強篩選，這樣一個獨特的表達模型的好處可能在于驅(qū)動篩選的抗性。因而一個含有驅(qū)動NPTII表達的BBTV啟動子(元件2或6)的轉(zhuǎn)化盒在植物轉(zhuǎn)化的早期階段(愈傷組織階段)提供強的卡那霉素抗性。但是一旦細胞分化(即形成芽、葉等)啟動子便被關(guān)閉。因為在轉(zhuǎn)基因植物中抗生素和除草劑篩選基因的表達在某些國家是一個主要的問題，所以這樣一個啟動子的應(yīng)用將是有好處的。
6.驅(qū)動NPTII表達的BBTV啟動子的分析BBTV6-NPTII構(gòu)建物的產(chǎn)生1.將來自pUC6.3的BBTV元件6基因區(qū)間的239bp片段以一個BamHI和PstI片段連同CaMV 35S終止子克隆在800bp NPTII基因的上游。
2.將所獲的BBTV6啟動子(239bp)/NPTII/CaMV 35S終止子盒以一個SacI和XbaI片段克隆在二分載體pTAB5中的土壤桿菌T-DNA的左和右邊界之間。
3.將來自pGUS2的CaMV 35S啟動子(550bp)/GUS/CaMV 35S終止子(200bp)盒以一個EcoRI片段克隆在下游(見圖14)。
4.隨后將所獲的下面詳細描述的載體pBT6.3-NPT用于土壤桿菌介導(dǎo)的煙草轉(zhuǎn)化(如前所述)。
轉(zhuǎn)化子的分析1.在土壤桿菌介導(dǎo)的以pBT6.3-NPT構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的Xanthii煙草中獲得8個推測的轉(zhuǎn)化子。在含有濃度為100μg/ml卡那霉素的培養(yǎng)基中對這8個植物進行篩選。
2.利用一個定量的NPTII ELISA試劑盒(5Prime-3Prime)按照制造商的說明對這些植物的NPTII表達進行估計。在組織類型之間(葉和根)以及啟動子之間(CaMV 35S啟動子和胭脂氨酸合成酶啟動子)進行比較。
結(jié)果實驗結(jié)果示于圖中。
1.在含有驅(qū)動NPTII表達的CaMV 35S的植物的葉和根中都獲得了高水平的NPTII表達。
2.大體上，8株在BBTV啟動子控制下表達NPT的植物中NPTII的水平顯著比CaMV 35S啟動子低。在葉中NPTII表達的水平不超過6ng NPTII/mg蛋白質(zhì)。根內(nèi)的水平略微高些，但不超過12ngNPTII/mg蛋白質(zhì)。這些表達水平與nos啟動子類似。
結(jié)果的意義這些實驗已經(jīng)表明BBTV6基因間區(qū)的239bp片段在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的煙草中能夠驅(qū)動篩選抗性。如所預(yù)料的，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物中(葉和根)NPTII表達的水平很低，但與胭脂氨酸合成酶啟動子的表達水平類似。7.在BBTV基因間區(qū)中存在的調(diào)節(jié)元件(i)TATA盒-存在于所有BBTV元件中并定位于轉(zhuǎn)錄啟始密碼子的上游。-保守的九核苷酸序列CTCTa/ta/tAa/tA-負責轉(zhuǎn)錄的正確啟始(ii)TGA1-a基元-共有序列TGACGTAA-參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的as-1結(jié)合基元(iii)TGA1-b基元-帶有共有序列TGACGT的六聚體結(jié)合基元(iv)小麥組蛋白H3基因的啟動子類型1元件(六聚體基元)—共有序列ACGTAA—在所有BBTV元件中緊接在CR-S/L的3’—六聚體基元結(jié)合相關(guān)的TAF-1和HBP-1蛋白—與特異性地在細胞周期的S期中的表達相關(guān)(Nakayama等，1992，《歐洲生化學(xué)會快報》(FEBS Letters)300167-170)表明啟動子活性局限于未分化的活躍分裂的細胞。(v)Adh1-US1—共有序列CCACG—未知的結(jié)合因子—存在于所有的BBTV基因間區(qū)(以病毒顆粒的或互補的意義)(vi)Adh1-US3—共有序列CGTGG—未知的結(jié)合因子—存在于所有的BBTV基因間區(qū)(以病毒顆粒的或互補的意義)8.植物組織培養(yǎng)溶液和培養(yǎng)基
PWS溶液-(1升)氯化鈣 735mgMES639.6mg甘露糖醇 109.3gpH5.6酶混合物(E3)2.0％纖維素酶(R-10)0.5％離析酶(R-10)0.5％半纖維素酶1.0％溶果膠酶0.5％BSA用PWS補足體積(pH5.6)TBS溶液-(200ml)Trizma堿 0.73g氯化鈉1.75g氯化鈣0.18g甘露糖醇 9.2gpH9.09CR-M的意義提供了BBTV元件1-6 CR-M的DNA序列排列。該區(qū)被認為是作為一個推測的引物結(jié)合位點并推測在BBTV復(fù)制中發(fā)揮作用。雖然BBTV的CR-M含有兩個與在動物和病毒(例如玉米條紋病毒)中基因啟動子中所發(fā)現(xiàn)的Sp1結(jié)合位點相似的直接的GC重復(fù)序列，但似乎該區(qū)無啟動子增強作用。這個假設(shè)由BBTV6基因間區(qū)的5’缺失分析支持，它證實包括CR-M的272bp區(qū)域的消除引起啟動子活性的顯著增加。另外，對BBTV2基因間區(qū)的基礎(chǔ)研究已經(jīng)表明消除CR-M，啟動子活性未降低。10總結(jié)我們已經(jīng)證明BBTV元件1到6的基因間區(qū)或DNA序列具有啟動子活性以及這種活性從一個基因間區(qū)到另一個而改變。利用瞬時和穩(wěn)定表達系統(tǒng)，我們已經(jīng)表明BBTV啟動子似乎擁有一種可能與BBTV在其天然宿主中復(fù)制和蓄積的位置類似的組織特異性表達模式。另外我們已經(jīng)鑒定出BBTV啟動子的至少一個(元件6)之中存在似乎影響報道基因表達的潛在的調(diào)節(jié)元件。
BBTV是一種感染芭蕉屬單子葉植物的病毒。因而可以預(yù)計衍生自BBTV的啟動子在香蕉和潛在的其它單子葉植物中應(yīng)該具有最強的活性。用小麥細胞懸液和香蕉胚胎愈傷組織的瞬時研究已經(jīng)表明，在這些系統(tǒng)中一些BBTV啟動子在某種程度上是活躍的。重要的是，我們還發(fā)現(xiàn)了在雙子葉植物(煙草、黃瓜和密生西葫蘆)的未分化組織類型中驅(qū)動高水平的瞬時表達。
插圖說明圖1在圖1(a)、(b)、(c)、(d)和(e)中分別給出了BBTV DNA元件2、3、4、5和6的核苷酸序列以及推導(dǎo)的這些元件主要ORF的氨基酸序列。潛在的TATA盒為粗體并有雙下劃線；潛在的聚腺苷酸化信號為粗體并有下劃線；莖-環(huán)結(jié)構(gòu)為斜體并有下劃線，莖序列標以箭頭；CR-SL有下劃線；CR-M為粗體和斜體；而ORF為粗體。圖2BBTV DNA元件2到6的病毒顆粒意義方向的確定。分別用對每個元件病毒顆粒或互補意義鏈特異的32P標記的寡核苷酸(元件2)或全長RNA轉(zhuǎn)錄物(元件3到6)探測兩個點。面板(a)中用與圖1中所示的元件序列互補的探針同斑點雜交，而面板(b)中用圖1中所示的同樣序列的探針同斑點雜交。1道每個元件的全長克?。?道健康香蕉的核酸；3道從純化的BBTV病毒顆粒中提取的DNA。圖3排列的BBTV DNA元件1到6的莖-環(huán)共同區(qū)(CR-SL)。在各個元件中的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)有下劃線并且環(huán)序列為斜體。星號表示在所有元件之間都保守的核苷酸。在一些序列中包括點來使序列排列最大化。圖4排列的BBTV DNA元件1到6的主要共同區(qū)(CR-M)。在15個核苷酸的GC豐富序列下劃線。星號表示在所有元件之間都保守的核苷酸。而菱形表示元件2到6之間在覆蓋元件1中缺失的前面26個核苷酸中保守的核苷酸。在一些序列中包括點來使序列排列最大化并且不完整的重復(fù)序列以斜體表示。圖5所提出的BBTV基因組結(jié)構(gòu)的圖式。(i)所有元件的大體結(jié)構(gòu)以及(ii)每個元件的線性表示。圖6元件1基因間區(qū)的各種結(jié)構(gòu)。圖7元件2基因間區(qū)的各種結(jié)構(gòu)。圖8元件3和4基因間區(qū)的各種結(jié)構(gòu)。圖9元件5基因間區(qū)的各種結(jié)構(gòu)。圖10元件6基因間區(qū)的各種結(jié)構(gòu)。圖11排列的BBTV元件1到6的基因間區(qū)核苷酸序列。bbtvpro1是pBT1.1的插入片段；bbtvpro2是pBT2.1的插入片段；bbtvpro3是pBT3.1的插入片段；bbtvpro4是pBT4.1的插入片段；bbtvpro5是pBT5.1的插入片段；而bbtvpro6是pBT6.1的插入片段。在bbtvpro1中注意Adh1 US1存在于位點1004處。關(guān)于bbtvpro2，注意TGA-1b存在于位點953和1053處，Adh1 US3存在于位點137處，G-BOX存在于位點225處。關(guān)于bbtvpro3，注意Adh1 US1存在于位點1069處。關(guān)于bbtvpro4，注意TGA-1b存在于位點182處；Adh1 US1存在于位點1037處；而G-BOX存在于位點45、63、128和148處。關(guān)于bbtvpro5，注意TGA-1b存在于位點96處；Adh1 US1存在于位點1012處；而G-BOX存在于位點45和64處。關(guān)于bbtvpro6，注意TGA-1a存在于位點1083處；TGA-1b存在于位點44處；Adh1US1存在于位點173處；而G-BOX存在于位點46處。還要注意G-BOX是一個與轉(zhuǎn)錄核心序列CACGTG相關(guān)的植物啟動子基元。圖12pBT1.INT的插入片段的DNA序列(982個堿基對)。注意BBTV元件1的基因間區(qū)序列是以小的開放讀框為基礎(chǔ)。圖13(a)pBT6.1(622個堿基對)；(b)pBT6.2(351個堿基對)；(c)pBT6.3(238個堿基對)和(d)pBT6.4(182個堿基對)的插入片段的DNA序列。注意在pBT6.3中黑體區(qū)域是與元件6基因間區(qū)的大部分啟動子活性相關(guān)的序列。在pBT6.4中該區(qū)域被消除。圖14BBTV6-NPTII構(gòu)建物。
權(quán)利要求
1.一種DNA分子，其為一BBTV元件基因間區(qū)的一個部分片段或者該DNA分子衍生自所說的基因間區(qū)，其中該DNA分子能夠促進、增強、調(diào)節(jié)或改善一種非BBTV基因的轉(zhuǎn)錄。
2.一種在權(quán)利要求1中所要求的DNA分子，其中該DNA分子具有與BBTV元件基因間區(qū)的序列基本相同或基本互補的序列。
3.一種在權(quán)利要求1中所要求的DNA分子，其中該DNA分子的序列與BBTV元件基因間區(qū)的基本相同或基本互補的序列有高達20％的變異度。
4.一種在權(quán)利要求1中所要求的DNA分子，其中該DNA分子具有與圖1、3、4、11、12或13中所示序列中任意一個基本相同的序列。
5.一種DNA嵌合載體或盒，其具有在前面權(quán)利要求中任何一項所要求的DNA分子并在一個目的基因的上游以便能夠促進、增強、調(diào)節(jié)或改善目的基因的轉(zhuǎn)錄。
6.一種在權(quán)利要求5中所要求的DNA嵌合載體或盒，其中DNA嵌合載體或盒包括在圖14中所示的BBTV6-NPTII基因構(gòu)建物。
7.一種在植物細胞中表達一種非BBTV基因的方法，其中利用在權(quán)利要求1到4中任何一項中所要求的DNA分子。
8.一種在權(quán)利要求7中所要求的表達非BBTV基因的方法，其中的植物細胞是一種單子葉或雙子葉植物的部分。
9.一種植物細胞，其具有在權(quán)利要求1到4中所要求的DNA分子。
10.一種在權(quán)利要求9中所要求的植物細胞，其中植物細胞為一種單子葉或雙子葉植物的部分。
11.一種植物，其具有在權(quán)利要求9或10中所要求的一種植物細胞。
12.一種在權(quán)利要求11中所要求的植物，其為單子葉植物。
13.一種在權(quán)利要求11中所要求的植物，其為雙子葉植物。
14.一種在權(quán)利要求1到4任何一項中所要求的DNA分子，其中該DNA分子能夠在單子葉植物細胞中表達一種非BBTV基因。
15.一種在權(quán)利要求1到4任何一項中所要求的DNA分子，其中該DNA分子能夠在單子葉植物中表達一種非BBTV基因。
16.一種在權(quán)利要求1到4任何一項中所要求的DNA分子，其中DNA分子能夠在雙子葉植物細胞中表達一種非BBTV基因。
17.一種在權(quán)利要求1到4任何一項中所要求的DNA分子，其中DNA分子能夠在雙子葉植物中表達一種非BBTV基因。
全文摘要
一種DNA分子,其為一BBTV元件基因間區(qū)的一個部分片段或者該DNA分子衍生自所說的基因間區(qū),其中該DNA分子能夠促進、增強、調(diào)節(jié)或改善一種非BBTV基因的轉(zhuǎn)錄。
文檔編號C12N5/10GK1190436SQ96195418
公開日1998年8月12日 申請日期1996年5月31日 優(yōu)先權(quán)日1995年5月31日
發(fā)明者J·L·達爾, R·M·哈丁, B·杜格達爾, P·R·比薩姆, G·J·哈夫納, D·K·貝克 申請人:昆士蘭技術(shù)大學(xué)