專利名稱：Pf1022物質(zhì)、其制備方法及含該物質(zhì)的驅(qū)蟲組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及命名為PF1022物質(zhì)的具有驅(qū)蟲活性的新物質(zhì)，該物質(zhì)的制備方法、含該物質(zhì)的驅(qū)蟲組合物以及使用該物質(zhì)的治療和預(yù)防方法。
至今，我們已經(jīng)知道了許多微生物產(chǎn)生的生理活性物質(zhì)。但是，它們之中就所知道的而言，還沒(méi)有一個(gè)具有和本發(fā)明的這些PF1022物質(zhì)相同的物理化學(xué)特性。另外，還已知一些具有驅(qū)蟲活性的化合物。但是由微生物產(chǎn)生的且具有驅(qū)蟲活性，如PF1022物質(zhì)、連同越霉素A、潮霉素B和阿凡曼菌素在內(nèi)還是很少數(shù)的。
另外，還已知與本發(fā)明物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的一種物質(zhì)如bassianolide(Agric.Biol.Chem.，42(3)，629-635(1978))，但是這種物質(zhì)不具有驅(qū)蟲活性。
通常在宿主動(dòng)物體內(nèi)，被寄生蟲寄生或感染引起的寄生蟲疾病，對(duì)人體、動(dòng)物和農(nóng)作物造成嚴(yán)重的危害。因此，人們總是期望一種新的驅(qū)蟲劑出現(xiàn)。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種有驅(qū)蟲活性的新化合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一個(gè)確定的該物質(zhì)的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種含有該物質(zhì)作為活性成分的驅(qū)蟲組合物，以及利用該驅(qū)蟲組合物治療和預(yù)防寄生蟲感染的方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明者耐心地尋找了具有驅(qū)蟲活性的物質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)霉菌菌株的培養(yǎng)物含有驅(qū)蟲物質(zhì)。本發(fā)明者分離出了該活性物質(zhì)。并確定了該物質(zhì)的物理化學(xué)特性。
因此，本發(fā)明一方面提供了具有以下特性的PF1022物質(zhì)
(1)外觀無(wú)色晶體;
(2)熔點(diǎn)104-106℃;
(3)分子式C52H76N4O12;
(4)元素分析計(jì)算值(%)C，65.80;H，8.07;N，5.90實(shí)驗(yàn)值(%)C，65.46;H，8.25;N，6.10;
(5)質(zhì)譜(EI-MS)m/z 948(M+);
(6)旋光率[α]22D-102°(C＝0.1，甲醇);
(7)紫外線吸收光譜如
圖1所示;
(8)紅外線吸收光譜如圖2所示;
(9)1H NMR光譜如圖3所示;
(10)13C NMR光譜如圖4所示;
(11)溶解性溶于甲醇、乙酸乙脂、丙酮、三氯甲烷和二甲亞砜;難溶于水;
(12)堿、酸或中性分類中性物質(zhì)。
X射線分析數(shù)據(jù)表明PF1022物質(zhì)具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)
第二方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)PF1022物質(zhì)的方法，該方法包括培養(yǎng)一種能產(chǎn)生PF1022物質(zhì)的霉菌菌株，并且從培養(yǎng)物中回收PF1022物質(zhì)。
第三方面，本發(fā)明提供了含有PF1022物質(zhì)的驅(qū)蟲組合物。
圖1顯示了在甲醇(100微克/毫升)中PF1022物質(zhì)的紫外線吸收光譜。
圖2顯示了由溴化鉀圓盤法記錄的PF1022物質(zhì)的紅外吸收光譜。
圖3顯示了在400MHz氘氯仿溶液中記錄的PF1022物質(zhì)的質(zhì)子核磁共振光譜。
圖4顯示了在100MHz氘氯仿溶液中記錄的PF1022物質(zhì)的碳13核磁共振光譜。
可以產(chǎn)生PF1022物質(zhì)的微生物菌株，被稱之為菌株P(guān)F1022，是一種從在1988年于日本Ibaraki縣收集的植物試樣中新分離出的菌株，并且具有以下的真菌學(xué)特性。
菌株P(guān)F1022的真菌學(xué)特性該菌株在25℃以下四種介質(zhì)中生長(zhǎng)充分土豆葡糖瓊脂(PDA)，土豆胡蘿卜瓊脂(PCA)，麥芽提取物瓊脂(MEA)，和燕麥粥瓊脂(OA)，7天中白色絨毛狀菌絲覆蓋整個(gè)陪替氏培養(yǎng)皿(＞85毫米)。該菌落的反面是白色至淡黃色的。生長(zhǎng)約3周后在所說(shuō)的反面可觀察到直徑為2-3毫米的深褐色斑點(diǎn)。沒(méi)有觀察到任何其它特殊的形態(tài)特性，如分生孢子形成。可溶的色素形成是微不足道的，在pH5-7的范圍內(nèi)可以生長(zhǎng)得很好。
該菌株在25℃以下介質(zhì)中生長(zhǎng)貧乏CzapekDox瓊脂(CzA)，Miura瓊脂(LcA)和玉米粉瓊脂(CMA)。生長(zhǎng)7天后白色絨毛狀菌落的尺寸約為10-20毫米。沒(méi)有觀察到分生孢子及其類似物形成。在37℃該菌株不生長(zhǎng)。在15℃，該菌株在PCA、PDA、MEA和OA中生長(zhǎng)成約35-50毫米大小，而另一方面，其培養(yǎng)物特征與在25℃時(shí)觀察到的幾乎相同。
在25℃用麥桿、香焦葉、麝香石竹葉或類似物質(zhì)覆蓋普通瓊脂的培養(yǎng)物，觀察一個(gè)月沒(méi)有出現(xiàn)任何特殊的形態(tài)特征，如分生孢子形成。
鑒于以上的特征，將這個(gè)菌株命名為列屬于Agonomycetales(Myceliasterilia)目的菌株P(guān)F1022。
根據(jù)布達(dá)佩斯條約，該菌株已寄存在工業(yè)科學(xué)技術(shù)機(jī)構(gòu)發(fā)酵研究所處，寄存號(hào)為FERMBP-2671。
就象其它霉菌菌株一樣，菌株P(guān)F1022的特性是易變的。因此，例如由這個(gè)菌株衍生的任何突變體(由自發(fā)產(chǎn)生或人工誘導(dǎo)的突變)、表型合子(phenozygote)或遺傳重組體，只要它們能產(chǎn)生該P(yáng)F1022物質(zhì)就可用于本發(fā)明。在本發(fā)明方法的實(shí)踐中，上面提及的霉菌菌株或任何其它的產(chǎn)生PF1022物質(zhì)的霉菌菌株是在含有一般可以被微生物利用的普通營(yíng)養(yǎng)素的介質(zhì)中培養(yǎng)的?？梢允褂迷诂F(xiàn)有技術(shù)中對(duì)霉菌生長(zhǎng)有用的那些營(yíng)養(yǎng)源。
菌株P(guān)F1022的培養(yǎng)方法可使用的碳源是葡萄糖、蔗糖、淀粉漿、糊精、淀粉、甘油、糖蜜，動(dòng)物和植物油亦包括在內(nèi)?？墒褂玫牡词抢绱蠖癸?、麥胚、玉米漿、棉子餅、肉羹、胨、酵母膏、硫酸銨、硝酸鈉和尿素。必要時(shí)也可有效地向介質(zhì)中加入可以提供鈉、鉀、鈣、鎂、鈷、氯化物磷酸鹽、硫酸鹽和其它離子的無(wú)機(jī)鹽。此外，可以適當(dāng)?shù)丶尤胍恍┠艽偈乖撁咕晟L(zhǎng)和產(chǎn)生PF1022物質(zhì)的有機(jī)和無(wú)機(jī)物質(zhì)。
培養(yǎng)在需氧條件下，尤其是浸沒(méi)培養(yǎng)的方式協(xié)調(diào)地進(jìn)行。溫度范圍為15-30℃時(shí)適合于培養(yǎng)，大多數(shù)情況下，最佳生長(zhǎng)溫度為約26℃，在震搖培養(yǎng)或水罐培養(yǎng)中，盡管所需的期限取決于所使用的介質(zhì)和培養(yǎng)條件。但PF1022物質(zhì)的產(chǎn)生在2-10天中通常達(dá)到最大積累。當(dāng)PF1022物質(zhì)的積累達(dá)到峰值時(shí)，停止培養(yǎng)過(guò)程，從培養(yǎng)液中分離和提純所需的產(chǎn)品。
PF1022物質(zhì)的純化通過(guò)普通的分離方式，利用其物理化學(xué)特性，如溶劑萃取、離子交換樹(shù)脂處理、吸附或分配柱層析、凝膠過(guò)濾、滲析、沉淀等等，或者是單一的或者以適當(dāng)結(jié)合的形式，可以從培養(yǎng)物中回收用以上方法生產(chǎn)的PF1022物質(zhì)。因此，例如用丙酮-水或甲醇-水可以從培養(yǎng)的細(xì)胞中萃取該P(yáng)F1022物質(zhì)。在培養(yǎng)物上清液中積累的PF1022物質(zhì)可以被合成的吸附劑DiaionHP-20(MitsubishiKaseiCorporation)吸附，例如或者可以被萃取到水不可混溶的有機(jī)溶劑例如丁醇或乙酸乙酯中。
為了進(jìn)一步提純，可以使用吸附劑如硅膠(如Wakogel C-200，Wako Pure Chemical Industries)或氧化鋁或凝膠過(guò)濾介質(zhì)如Sephadex LH-20(Pharmacia)對(duì)該P(yáng)F1022物質(zhì)進(jìn)行層析。反相高效液相色譜是另一個(gè)用于此目的的有效的手段。
在純化步驟期間，可通過(guò)硅膠薄層色譜或高效液相色譜對(duì)該P(yáng)F1022物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。用薄層色譜檢測(cè)時(shí)，樣品被應(yīng)用于硅膠板(例如，Merck，art.5715)并用氯仿-乙酸乙酯(體積比2∶1)展開(kāi)，用一種能產(chǎn)生彥色的鉬試劑，在Rf值為0.57處，可檢測(cè)到為一藍(lán)斑的該P(yáng)F1022物質(zhì)。用高效液相色譜檢測(cè)時(shí)，將樣品加到一個(gè)柱(例如，ODS-H，ShimazuTechno-Reserach，Inc.，4mm(i.d.)×150mm)上并用80%乙腈溶液，以0.75ml/min的流量展開(kāi)，通過(guò)在220nm處測(cè)定吸收度，在保留時(shí)間為7.1min.時(shí)出現(xiàn)的一個(gè)峰可檢測(cè)到該P(yáng)F1022物質(zhì)。
第三方面，本發(fā)明提供了含有該P(yáng)F1022物質(zhì)作為活性成分的驅(qū)蟲組合物。
可以用該P(yáng)F1022物質(zhì)作為驅(qū)蟲劑的動(dòng)物包括豬、牛、馬、兔、綿羊、山羊、雞、鴨、火雞、大鼠、小鼠、豚鼠、猴子、狗、貓、小鳥(niǎo)、以及類似的家庭動(dòng)物、家禽、試驗(yàn)動(dòng)物和供玩賞的動(dòng)物等等，該P(yáng)F1022物質(zhì)也可用于人類。用該P(yáng)F1022物質(zhì)可以從宿主動(dòng)物中除去的寄生物包括，尤其是牛和羊的寄生蟲例如捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchuscontortus)，胃蟲(Ostertagiaostertagi)，屬于毛園線蟲屬(Trichostrongylus)的小毛蟲(例如T、colubriformis)、屬于庫(kù)柏絲蟲(Cooperiacurticei)屬的哪些、屬于結(jié)節(jié)線蟲屬(Oesophagostomumradiatum，Oesophagostomumcolumbianum，Oesophagostomumvenulosum)的小結(jié)蟲、端吸盤蟲(Paramphistomumcervi)、腸絳蟲(Monieziabenedeni)，肺蟲(Dictyocaulusfilaria，Dictyocaulusviviparus)和肝吸蟲(Fasciolahepatica)，豬的寄生蟲例如大腸蛔蟲(Ascarissuum)，鞭蟲(Trichurissuis)，和小結(jié)蟲(Oesophagostomumdentatum)，馬的寄生蟲如大蛔蟲(Parascariseguorum)、蟯蟲(Oxyurisegui)、屬于胃線蟲屬(例如，Habronemamegastoma)的胃蟲、屬蟲圓線蟲屬(例如，S.eguinus)的大圓線蟲，屬于三齒線蟲屬(例如，T.serratus)的小圓線蟲，狗的寄生蟲，例如蛔蟲(Toxocaracanis)，鉤蟲(Ancylostomacanium)，鞭蟲(Trichurisvulpis)，和大惡絲蟲(Dirofilariaimmitis)，貓的寄生蟲，例如蛔蟲(Toxocaracati)，和絳蟲(Diphyllobothriumerinacei)，以及雞的寄生蟲，例如蛔蟲(Ascaridiagalli)，屬于毛線蟲屬(如C.annulate)的毛細(xì)線蟲或毛蟲和盲腸蟲(Heterakisgallinae)以及人體內(nèi)消化道寄生蟲，例如蛔蟲(Ascarislumbricoides)，蟯蟲(Enterobiusvermicularis)，鉤蟲(Ancylostomaduodenale，Ancylostomaceylanicum，Necatoramericanus)，東方毛蟲(Trichostrongylusorientalis)，糞類圓線蟲(Strongyloidesstercoralis)和鞭蟲(Trichuristrichiura)。
該P(yáng)F1022物質(zhì)可用于治療和預(yù)防寄生蟲感染。為了便于治療，該P(yáng)F1022物質(zhì)可以口服或非腸胃投藥。為了口服，該物質(zhì)可以以甘油、聚乙二醇等溶液、懸浮液或以油如花生油、大豆油等乳濁液的形式通過(guò)胃管或類似裝置，以用普通喂料或飲用水稀釋或混合物的形式強(qiáng)迫服用，或以制成適于口服的通常劑型，如片劑、膠囊、小丸、大丸、粉末或軟膠囊服用。為了非腸胃施用，可以通過(guò)注射或其它手段以在花生油、大豆油或類似物質(zhì)中的水難溶制劑的形式或以在甘油、聚乙二醇或類似物質(zhì)中的水溶性制劑的形式進(jìn)行皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或通過(guò)類似的途徑投藥。為了預(yù)防目的，通常是以與喂料混合使用方式給予口服。在用于預(yù)防時(shí)，投藥的持續(xù)時(shí)間是不受限制的，但在大多數(shù)情況下，對(duì)于用于烤焙的雞或類似動(dòng)物投藥約2個(gè)月是足夠的，對(duì)于豬需要投藥5個(gè)月。
PF1022物質(zhì)的劑量可以取決于待治療的動(dòng)物，一種寄生蟲或多種寄生蟲以及投藥方式而變化。例如，為了限制雞的蛔蟲時(shí)，使用胃管口服給予液體制劑，每天的劑量不少于0.05mg/kg，最好是0.2-3mg/kg，每天一次或2-5次。為了預(yù)防目的，將該物質(zhì)加入到喂料中，每份喂料中其濃度不低于1ppm，最好每份喂料中為5-10ppm，并且連續(xù)投藥。
此外，可以將液體載體中的該P(yáng)F1022物質(zhì)的溶液或懸浮液通過(guò)皮下或肌內(nèi)注射腸胃外給動(dòng)物施用。使用植物油如花生油和大豆油的非水制劑以及含水溶性賦形劑如甘油和聚乙二醇的水溶性腸胃外制劑可用于非腸胃道給藥。這些制劑通常含有0.1-10%重量的該P(yáng)F1022物質(zhì)。每天的腸胃外劑量一般不低于0.01mg/kg，最好在0.1-10mg/kg范圍內(nèi)。
即使當(dāng)將該P(yáng)F1022物質(zhì)以300mg/kg的劑量給大鼠口服時(shí)，體重正常，沒(méi)有任何反?，F(xiàn)象。這表明這種物質(zhì)的毒性非常低，該P(yáng)F1022物質(zhì)在埃姆斯試驗(yàn)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)中呈陰性結(jié)果，這表明該物質(zhì)不存在有誘變性問(wèn)題。
下面的實(shí)施例僅僅是為了說(shuō)明本發(fā)明，而不意味限制本發(fā)明的范圍。當(dāng)然，各種改進(jìn)或改變可以在不違反本發(fā)明要旨的方式下作出。
實(shí)施例1將具有下列組成的介質(zhì)用作為種子培養(yǎng)基1.0%淀粉，1.0%葡萄糖，0.5%棉子餅，0.5%麥芽，0.5%大豆餅，0.5%酵母膏，0.1%硫酸鎂(七水合物)，0.2%碳酸鈣和0.2%氯化鈉。
所使用的產(chǎn)品培養(yǎng)基具有以下組份3.0%淀粉漿，1.0%大豆油、0.8%麥芽，1.0%大豆餅，1.0%干酵母，0.3%碳酸鈣，0.2%硫酸鎂(七水合物)和0.2%氯化鈉。
殺菌前將該介質(zhì)調(diào)整到pH7.0。
將以上提到的該種子培養(yǎng)基質(zhì)以每份20ml分配到100ml的錐形燒瓶中，于120℃下殺菌15分鐘，并且在每個(gè)燒瓶中接種2-3滿環(huán)的不完全的霉菌菌株P(guān)F1022(FERMBP-2671)的斜面瓊脂培養(yǎng)物于26℃搖瓶培養(yǎng)7天以得到第一種子培養(yǎng)物。然后，將種子培養(yǎng)基以每份80ml置入500ml的錐形燒瓶中，在120℃下殺菌15分鐘，在每個(gè)燒瓶中接種4ml上述的第一種子培養(yǎng)物。在26℃下?lián)u瓶培養(yǎng)2天得到第二種子培養(yǎng)物。將該產(chǎn)品培養(yǎng)基以每份35升分到兩個(gè)50升的發(fā)酵罐中，在120℃下殺菌30分鐘，接種上述第二種子培養(yǎng)物(每個(gè)發(fā)酵罐中的總量從5個(gè)500ml的燒瓶而來(lái)。在26℃下通氣(20升/分鐘)，攪拌(先以250rpm的速率攪拌65小時(shí)，然后以400rpm的速率攪拌)培養(yǎng)5天。
培養(yǎng)完成后，將硅藻土(助濾劑)加到培養(yǎng)物中，過(guò)濾該混合物。把60%丙酮-水(62升)加到這樣獲得的含固體物質(zhì)的細(xì)胞中，攪拌該混合物1小時(shí)，然后過(guò)濾除去細(xì)胞。從所得的細(xì)胞提取物中蒸餾掉丙酮，得到濃縮物(11.7升)從這個(gè)濃縮物中用乙酸乙酯(23升)來(lái)萃取該P(yáng)F1022物質(zhì)。該乙酸乙酯的濃縮物是一種油狀物質(zhì)(19.8g)，將該油狀物質(zhì)通過(guò)硅膠(Wakogel C-200 250g)色譜柱，用三氯甲烷(2升)和由三氯甲烷和甲醇(100∶1，1.5升)組成的混合溶劑作為推進(jìn)劑。用硅膠TLC板(Merck，Art.5715)，一種氯仿和乙酸乙酯(2∶1體積)的混合溶劑作為推進(jìn)劑并用鉬試劑作為產(chǎn)生彥色的試劑，通過(guò)硅膠薄層色譜對(duì)該P(yáng)F1022物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，在Rf值為0.57處檢測(cè)到為藍(lán)斑點(diǎn)的該P(yáng)F1022。將含該P(yáng)F1022物質(zhì)的組分合并，濃縮至干得到一種棕色的油(4.25克)。將如此得到的粗PF1022物質(zhì)溶于少量甲醇中并用預(yù)先經(jīng)甲醇平衡的Sephadex LH-20(1升)柱，以甲醇作為推進(jìn)劑，進(jìn)行柱色譜層析，合并含有該P(yáng)F1022物質(zhì)的各組分并濃縮至干，得到一種淡黃色的粉末(594毫克)。將100毫克的這種粉末通過(guò)高效液相色譜(YMC，D-ODS-5)，使用乙腈和水的混合溶劑作為推進(jìn)劑進(jìn)一步提純。合并含該P(yáng)F1022物質(zhì)的組份，蒸餾掉溶劑得到一種無(wú)色粉末(65.5毫克)。將這種粉末溶解在0.5毫升的丙酮中，向該溶液中加入5毫升的己烷，然后將該混合物在室溫下放置過(guò)夜，得到無(wú)色柱形(24.9毫克)的該P(yáng)F1022物質(zhì)。將如此得到的PF1022物質(zhì)用于下面實(shí)施例。
實(shí)施例2給通過(guò)糞便鏡查證人工感染了腸蛔蟲(Ascaridiagalli)的雞以3個(gè)動(dòng)物為一組進(jìn)行試驗(yàn)，將PF1022物質(zhì)從0.2mg/kg到3mg/kg分成5個(gè)劑量水平使用，將18只雞分成6組，其中包括未處理的對(duì)照組。
稱重該P(yáng)F1022物質(zhì)，使其量精確地等于以每只雞的體重為基礎(chǔ)計(jì)算的劑量，并將該物質(zhì)懸浮在含羧甲基纖維素(CMC)的水中，將該懸浮液以一次劑量通過(guò)胃管給雞口服。給藥后，計(jì)算每只雞每天排出的蛔蟲，7天后，處死每只雞，進(jìn)行尸體解剖，計(jì)算保留在腸道中的蛔蟲，百分排除率計(jì)算如下百分排除數(shù)＝ (7天內(nèi)排出的蛔蟲數(shù))/(7天內(nèi)排出的蛔蟲數(shù)+保留的蛔蟲數(shù)目) ×100此外，測(cè)量每只雞給藥前的體重和給藥7天后的體重并如下計(jì)算體重增重百分率體重增重百分率 (給藥7天后的體重-給藥前的體重)/(給藥前的體重) ×100上述試驗(yàn)結(jié)果列于表1表1.PF1022物質(zhì)的雞大腸蛔蟲排出試驗(yàn)
正如表1所示，該P(yáng)F1022物質(zhì)在劑量為0.2mg/kg時(shí)呈現(xiàn)出驅(qū)蟲活性，并且隨著劑量的增加，驅(qū)蟲效率增加，在3mg/kg時(shí)達(dá)到近似100%。達(dá)到100%排出的劑量的體重增重百分率與沒(méi)有給藥的對(duì)照組相近，表明該物質(zhì)是一個(gè)具有很高安全性的物質(zhì)。
實(shí)施例3給通過(guò)糞便鏡查證感染了大腸蛔蟲(Ascarissuum)的豬口服該P(yáng)F1022物質(zhì)，來(lái)估價(jià)該物質(zhì)的驅(qū)蟲效果。
該P(yáng)F1022物質(zhì)或以5mg/kg或以10mg/kg一次給藥，或以每天劑量為1.25mg/kg，2.5mg/kg或5mg/kg每天一次，連續(xù)給藥2天通過(guò)將一定量(例如相當(dāng)于每次劑量)的該物質(zhì)與一小部分飼料混合給予施用。給藥后，計(jì)算排出的蛔蟲數(shù)目，并每天檢查糞便的每克糞便蛔蟲卵的數(shù)量(EPG)。開(kāi)始給藥一周后，處死該動(dòng)物，進(jìn)行尸體解剖，計(jì)算保留在腸道中的蛔蟲數(shù)目。
所得結(jié)果示于表2
表2PF1022物質(zhì)對(duì)豬大腸蛔蟲的驅(qū)蟲活性
正如表2所示，在1.25mg/kg給藥2天的情況下，該物質(zhì)已顯示出驅(qū)蟲活性。在以2.5mg/kg給藥2天和以5mg/kg或10mg/kg一次給藥時(shí)，蛔蟲排出百分率不低于50%。以5mg/kg給藥2天時(shí)，蛔蟲排出百分率達(dá)到100%。
所以，該P(yáng)F1022物質(zhì)對(duì)豬大腸蛔蟲產(chǎn)生明顯的驅(qū)蟲效果。
實(shí)施例4給通過(guò)糞便鏡查證感染了鞭蟲(Trichurissuis)的豬口服PF1022物質(zhì)，從而估價(jià)該物質(zhì)對(duì)豬的驅(qū)蟲效果。
將該物質(zhì)或者是以1mg/kg、5mg/kg或10mg/kg一次給藥?；蛘呤且悦刻靹┝?.5mg/kg或5mg/kg每天一次、連續(xù)給藥2天，通過(guò)將一定量(例如相當(dāng)于每個(gè)劑量)的該物質(zhì)與一小部分飼料混合給予施用。給藥后，每天測(cè)定每個(gè)動(dòng)物每克糞便中的鞭蟲卵數(shù)量，并計(jì)算在三個(gè)動(dòng)物中排出的鞭蟲，開(kāi)始給藥一周后，處死所有的動(dòng)物，進(jìn)行尸體解剖，計(jì)算保留在腸道中的鞭蟲。
所得結(jié)果示于表3。
表3PF1022物質(zhì)對(duì)豬鞭蟲的驅(qū)蟲活性
＊沒(méi)有數(shù)據(jù)可得到。
正如表3所示，當(dāng)以1mg/kg一次給藥時(shí)，該物質(zhì)表現(xiàn)出輕微的驅(qū)蟲活性，當(dāng)以5mg/kg一次給藥時(shí)，得到的蟲排出百分率達(dá)到約80%-100%。當(dāng)以10mg/kg一次給藥或者以5mg/kg給藥2天時(shí)，在這些動(dòng)物中沒(méi)有保留腸蟲，排出率達(dá)到100%。當(dāng)以2.5mg/kg給藥2天，在1只動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)保留了一條鞭蟲，而其它動(dòng)物中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)鞭蟲。
由此發(fā)現(xiàn)該P(yáng)F物質(zhì)對(duì)豬鞭蟲具有明顯的驅(qū)蟲活性。
實(shí)施例5給通過(guò)糞便鏡查證感染了貓蛔蟲(Toxocaracati)的12只貓一次口服PF1022物質(zhì)，來(lái)估價(jià)該物質(zhì)對(duì)貓蛔蟲的驅(qū)蟲活性。
將受感染的貓分成4只一組共3組，分別給予0.2mg/kg、1mg/kg和5mg/kg的該物質(zhì)與少量的通常飼料混合物進(jìn)行給藥。觀察給藥后7天期間排出的蛔蟲條數(shù)和給藥7天后進(jìn)行尸體解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)保留的蛔蟲數(shù)目。
結(jié)果示于表4。
表4PF1022物質(zhì)對(duì)貓大腸蛔蟲的驅(qū)蟲活性
正如表4所示，劑量為0.2mg/kg時(shí)，4只動(dòng)物中有3只排出為100%。劑量為5mg/kg時(shí)，所有動(dòng)物排出為100%。
由此發(fā)現(xiàn)該P(yáng)F1022物質(zhì)對(duì)貓蛔蟲具有明顯的驅(qū)蟲活性。
實(shí)施例6給通過(guò)糞便鏡查證感染了貓鉤蟲(Ancylostomatubaeforme)的12只貓一次口服給藥該P(yáng)F1022物質(zhì)，來(lái)估價(jià)該物質(zhì)對(duì)貓鉤蟲的驅(qū)蟲效果。
將該受了感染的貓分成3組每組4只，分別給予0.2mg/kg、1mg/kg和5mg/kg的該物質(zhì)與少量的普通飼料混合物進(jìn)行給藥。觀察給藥后7天內(nèi)排出的鉤蟲條數(shù)和給藥7天后進(jìn)行尸體解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)保留的鉤蟲數(shù)目。
結(jié)果示于表5
表5PF1022物質(zhì)對(duì)貓鉤蟲的驅(qū)蟲活性
正如表5所示，劑量為0.2mg/kg時(shí)，有一只貓的排出率為100%。隨著劑量的增加排出百分率也增加。劑量為5mg/kg時(shí)，所有的貓的排出率為100%。
由此證實(shí)該P(yáng)F1022物質(zhì)對(duì)貓鞭蟲具有明顯的驅(qū)蟲效果。
實(shí)施例7為了測(cè)定該P(yáng)F1022物質(zhì)對(duì)混合感染了第四胃蟲(Ostertagiacircumcincta)和小腸毛蟲(Trichostrongytuscolubriformis)的綿羊的驅(qū)蟲效果，將該物質(zhì)給24只人工感染了所說(shuō)的兩種腸蟲的綿羊口服。
將受了感染的綿羊6只一組分成4組，通過(guò)胃導(dǎo)管分別服用1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和0mg/kg(對(duì)照試驗(yàn))的懸浮在0.5%CMC中的該物質(zhì)。觀察給藥前每克糞便中寄生蟲卵數(shù)量(EPG)、給藥后7天內(nèi)的EPG，以及給藥7天后進(jìn)行尸體解剖發(fā)現(xiàn)的保留在第四胃中的以及保留在腸道中的寄生蟲數(shù)量。
結(jié)果示于表6，每個(gè)給出的數(shù)值是6只動(dòng)物的平均值。
表6PF1022物質(zhì)對(duì)綿羊消化道毛蟲的驅(qū)蟲效果
正如表6所示，在10mg/kg組中，腸道中保留在第四胃中的和保留在腸道的寄生蟲數(shù)目分別為對(duì)照感染組的一半。
由此發(fā)現(xiàn)該P(yáng)F1022物質(zhì)對(duì)胃蟲和毛蟲具有驅(qū)蟲效果。
實(shí)施例8為了估價(jià)該P(yáng)F1022物質(zhì)對(duì)通常稱為消化道線蟲寄生的牛的驅(qū)蟲效果，將該物質(zhì)口服給通過(guò)糞便鏡檢證感染了線蟲(Haemonchuscontrotus，Ostertagiaostertagi，hairworms，cooperids等)的3頭牛。
通過(guò)胃管將該物質(zhì)以水中懸浮液的形式或者一次服用5mg/kg，或者以每天12.5mg/kg服用2天。計(jì)算給藥前3天和給藥后7天糞便中寄生蟲卵數(shù)(EPG)。
結(jié)果示于表7表7PF1022物質(zhì)對(duì)牛消化道線蟲的驅(qū)蟲效果
＊天0給藥的第一天。
正如表7所示，盡管數(shù)據(jù)變化很廣，但EPG表明具有逐漸降低的傾向。當(dāng)以12.5mg/kg給藥2天后，給藥后第二天的EPG約為給藥前的一半。
由此發(fā)現(xiàn)該P(yáng)F1022物質(zhì)對(duì)消化道線蟲具有驅(qū)蟲效果。
實(shí)施例9給通過(guò)糞便鏡檢證實(shí)感染了蛔蟲(Parascarisequorum)和園線蟲(Strongylusspp.)的馬口服該P(yáng)F1022物質(zhì)，用來(lái)估價(jià)PF1022物質(zhì)對(duì)馬的驅(qū)蟲效果。
把該P(yáng)F1022物質(zhì)懸浮在水中用胃管第一天5mg/kg，第二天服用2.5mg/kg，對(duì)于蛔蟲和園線蟲，每天計(jì)算每克糞便中的寄生蟲卵(EPG)，維持一周并計(jì)算排出的寄生蟲數(shù)。確定100克糞便中園線蟲的數(shù)目。
所得結(jié)果示于表8。
表8PF1022物質(zhì)對(duì)雌馬蛔蟲和園線蟲的驅(qū)蟲效果
注＊每100克糞便數(shù)目-未給藥正如表8所示，在給藥第二天，EPG開(kāi)始減少，在第三天急劇減少。在給藥的第二天和第三天觀察到蛔蟲排蟲。在隨后的連續(xù)幾天內(nèi)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)蛔蟲排出。僅在給藥的第二天發(fā)現(xiàn)大量地排出蛔蟲(每100克糞便82尾蟲)，在隨后的幾天內(nèi)沒(méi)有大量地排出蛔蟲。
由此表明，該P(yáng)F1022物質(zhì)對(duì)雌馬蛔蟲和園線蟲有強(qiáng)烈的驅(qū)蟲效果。
實(shí)施例10為了估價(jià)該P(yáng)F1022物質(zhì)對(duì)經(jīng)過(guò)糞便鏡檢確證感染了大腸蛔蟲(Ascaridiagalli)的9只雞的驅(qū)蟲效果，將該物質(zhì)與飼料混合給雞服用。
將雞分成3組每組3只，分別為1ppm、5ppm和10ppm組，含有以上給出各濃度的該P(yáng)F1022物質(zhì)的飼料，給雞服用3周。在一周內(nèi)每天計(jì)算以“EPG”表達(dá)的每克糞便中的寄生蟲卵和排出的蟲數(shù)。在給藥結(jié)束時(shí)，將雞處死，進(jìn)行尸體解剖，計(jì)算保留的蟲數(shù)。
所得結(jié)果示于表9表9PF1022物質(zhì)對(duì)豬鞭蟲的驅(qū)蟲效果
正如表9所示，在1ppm組中，僅在2只動(dòng)物中觀察到了排出的寄生蟲。在5ppm組中，開(kāi)始給藥2周時(shí)，所有動(dòng)物的糞便中卵數(shù)為零。而有一些寄生蟲保留在動(dòng)物體內(nèi)。在10ppm組中，2只動(dòng)物寄生蟲的排出為100%。
由此發(fā)現(xiàn)該P(yáng)F1022物質(zhì)對(duì)雞大腸蛔蟲具有強(qiáng)的驅(qū)蟲效果。
實(shí)施例11為了估價(jià)該P(yáng)F1022物質(zhì)對(duì)牛扭轉(zhuǎn)胃蟲(Haemonchuscontortus)的驅(qū)蟲活性，將該物質(zhì)加到試管中，試管中有從牛第四胃中分離出來(lái)正在游動(dòng)的牛扭轉(zhuǎn)胃蟲。
將生理食鹽溶液分到4只試管中，加熱到39-40℃，將從牛第四胃中收集的3-5條扭轉(zhuǎn)胃蟲放到每個(gè)試管的介質(zhì)中，使之在試管中游動(dòng)。將適當(dāng)量的該P(yáng)F1022物質(zhì)溶解在少量的二甲亞砜中，將溶液滴加到該介質(zhì)中，攪拌混合后，觀察每個(gè)蟲子的狀態(tài)。調(diào)整該P(yáng)F1022物質(zhì)的量，使得該物質(zhì)在三個(gè)試管介質(zhì)中的最終濃度分別為2ppm、8ppm和40ppm、將二甲亞砜單獨(dú)滴加到剩余的試管中，作為對(duì)照。
當(dāng)PF1022物質(zhì)濃度達(dá)到40ppm時(shí)，該蟲子在10分鐘內(nèi)停止游動(dòng)，濃度達(dá)到8ppm時(shí)，15分鐘內(nèi)停止游動(dòng)，濃度為2ppm時(shí)，25分鐘內(nèi)停止游動(dòng)。在對(duì)照試管中(只加了二甲亞砜)，蟲子的游動(dòng)變?nèi)?，即使?jīng)過(guò)1小時(shí)后仍然能觀察到蟲子游動(dòng)。
由此顯示出該P(yáng)F1022物質(zhì)對(duì)扭轉(zhuǎn)的胃蟲具有極大的麻痹活性。
實(shí)施例12通過(guò)給經(jīng)糞便鏡檢確證分別感染了蛔蟲(ToxocaraCanis)，鉤蟲(Ancylostomacaninum)和鞭蟲(Trichurisvulpis)的狗口服該P(yáng)F1022物質(zhì)，以測(cè)定該物質(zhì)對(duì)狗寄生蟲的驅(qū)蟲效果。
將該物質(zhì)以5mg/kg的劑量通過(guò)與少量的普通飼料混合給感染了蛔蟲或鉤蟲的狗一次口服，計(jì)算給藥后7天內(nèi)狗排蟲和保留的蟲數(shù)，狗排出了6條蛔蟲，而沒(méi)有發(fā)現(xiàn)蛔蟲留在狗體內(nèi);排出了12條鉤蟲，而沒(méi)有發(fā)現(xiàn)鉤蟲留在體內(nèi)。因此，兩種情況下排出率為100%。另一方面，給兩只感染了以上提到的鞭蟲中的一只狗僅口服5mg/kg的一次劑量的該物質(zhì)，而另一只服用10mg/kg，計(jì)算給藥后7天內(nèi)排出的和未排出的蟲數(shù)。在5mg/kg時(shí)，發(fā)現(xiàn)排出了327條鞭蟲保留了504條，因此排蟲百分率為39.4%，在10mg/kg時(shí)，排出了22條鞭蟲，而沒(méi)有未排出的保留。因此，排蟲的百分率為100%。
以上所提到的數(shù)據(jù)表明該P(yáng)F1022物質(zhì)對(duì)犬的蛔蟲、鉤蟲和鞭蟲有很強(qiáng)的驅(qū)蟲效果。
本發(fā)明已進(jìn)行了詳細(xì)的描述，參照具體的實(shí)施例，對(duì)本領(lǐng)域熟練的技術(shù)工人來(lái)說(shuō)，顯然可以在不脫離本發(fā)明的精神和范圍之下作出各種變化和改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)由結(jié)構(gòu)式表示的一種物質(zhì)的方法
其中包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)有能力產(chǎn)生所說(shuō)物質(zhì)的霉菌菌株，由此在培養(yǎng)物中產(chǎn)生和聚集所說(shuō)的物質(zhì)，并從培養(yǎng)物中回收該物質(zhì)。
2.生產(chǎn)具有以下特性的物質(zhì)的方法(1)外觀無(wú)色晶體;(2)熔點(diǎn)104-106℃;(3)分子式C52H76N4O12;(4)元素分析計(jì)算值(%)C，65.80;H，8.07;N，5.90實(shí)驗(yàn)值(%)C，65.46;H，8.25;N，6.10;(5)質(zhì)譜(EI-MS)m/z 948(M+);(6)旋光率[α]22D-102°(C＝0.1，甲醇);(7)紫外線吸收光譜示于圖1;(8)紅外線吸收光譜示于圖2;(9)1H NMR光譜示于圖3;(10)13C NMR光譜示于圖4;(11)溶解度溶于甲醇、乙酸乙脂、丙酮、三氯甲烷和二甲亞砜;難溶于水;(12)堿性、酸性或中性分類中性物質(zhì)。其中包括在介質(zhì)中培養(yǎng)有能力產(chǎn)生所說(shuō)物質(zhì)的霉菌菌株，由此在培養(yǎng)物中產(chǎn)生和聚積所說(shuō)的物質(zhì)，并從該培養(yǎng)物中回收該物質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中該霉菌菌株具有菌株P(guān)F1022的特性。
全文摘要
具有驅(qū)蟲活性的新物質(zhì)，即PF1022物質(zhì)，是通過(guò)培養(yǎng)有能力產(chǎn)生所說(shuō)的物質(zhì)的霉菌菌株，并從該培養(yǎng)物中回收所說(shuō)的物質(zhì)產(chǎn)生的。
文檔編號(hào)C12P17/14GK1046940SQ9010117
公開(kāi)日1990年11月14日 申請(qǐng)日期1990年2月7日 優(yōu)先權(quán)日1989年2月7日
發(fā)明者高木誠(chéng)之, 岡田忠昭, 赤井直利, 矢口貴志, 宮道慎二, 莊村喬, 佐佐木徹, 瀨崎正次, 清水功雄, 新井田昌志 申請(qǐng)人:明治制菓株式會(huì)社