專利名稱：高活性纖維素酶的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物的生產(chǎn)工藝。
目前，纖維素酶的生產(chǎn)多采用對纖維素酶有誘導(dǎo)作用的天然纖維素類物質(zhì)作為碳源的固體發(fā)酵方式進(jìn)行。這些天然纖維素類物質(zhì)，諸如玉米秸粉、麥秸粉、稻草粉、高梁秸粉等等，在發(fā)酵之后，作為大量的殘?jiān)z留下來。由于這些殘?jiān)且驯晃⑸锓纸?、利用過的，故成為難以再分解和利用的廢物，若不處理將造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。日本曾特許(昭58-42759)鈴木修藏等人的發(fā)明利用纖維素酶水解天然纖維素的殘?jiān)鳛榕囵B(yǎng)基的碳源使用，來制取纖維素酶。這樣雖利用了殘?jiān)?，并能縮短發(fā)酵周期，但不能提高酶活。并且，更為關(guān)鍵的是，他們是先用纖維素酶來水解天然纖維素，這需要大量的酶，故生產(chǎn)成本頗高，目前難以應(yīng)用。而且由于利用水解后的天然纖維素殘?jiān)a(chǎn)出來的纖維素酶，其酶活未有明顯提高，也影響了這一技術(shù)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明旨在克服已有技術(shù)的不足，利用天然纖維素類物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的過程中殘留下來的發(fā)酵殘?jiān)?，?fù)又用來代替培養(yǎng)基中的天然纖維素類物質(zhì)，來制取纖維素酶，其既能變廢為寶，使發(fā)酵殘?jiān)匦碌靡岳?，克服由此帶來的污染問題，又能成倍地節(jié)約發(fā)酵用原料，降低生產(chǎn)成本，同時還能生產(chǎn)出活性更高的纖維素酶。
真菌纖維素酶是誘導(dǎo)酶，木霉能很好地利用葡萄糖等易被吸收、利用的低分子碳水化合物，但生產(chǎn)出的纖維素酶活性卻很低。為了生產(chǎn)高活性纖維素酶，通常把纖維素酶的誘導(dǎo)物質(zhì)-天然纖維素作為培養(yǎng)基的碳源使用。盡管天然纖維素類物質(zhì)是比較難以分解、利用的，但天然纖維素類物質(zhì)對纖維素酶卻具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)作用。一般認(rèn)為，利用木質(zhì)素的含量越高的，纖維素的結(jié)晶度越高的，越難被微生物分解、利用的天然纖維素物質(zhì)，所生產(chǎn)出的纖維素酶的活性亦越高。應(yīng)用天然纖維素物質(zhì)做碳源，培養(yǎng)木霉，生產(chǎn)纖維素酶時，微生物在生長發(fā)育過程中，把天然纖維素中易被吸收、利用的單糖、低分子寡糖及結(jié)晶度較低，易被分解利用的纖維素優(yōu)先分解利用。因而，發(fā)酵后剩下來的未被分解利用的發(fā)酵殘?jiān)斜愫休^多的難分解的纖維素和木質(zhì)素。倘若利用這些在通常情況下難以被微生物分解利用的發(fā)酵殘?jiān)?，來代替培養(yǎng)基中的天然纖維素類物質(zhì)，進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶時，便能得到具有更高活性的纖維素酶。同時又可節(jié)省發(fā)酵原料和解決由于發(fā)酵殘?jiān)鼛淼沫h(huán)境污染問題。
本發(fā)明使用的菌種有木霉(Trichoderma T和Trichoderma S)、黑曲霉(Aspergillus niger P1)、及青霉菌(Penicillium Ju)(以上菌株均為本校保存菌種)。
本發(fā)明使用的天然纖維素類物質(zhì)有玉米秸、麥草、稻草、高梁秸等用粉碎機(jī)粉成粗糠，此外還有Mandels氏營養(yǎng)液，其組成如下
(NH4)2SO4～1.4gKH2PO4～2.0gMgSO4·7H2o～0.3g尿素～0.3gCaCl2～0.3g微量元素FeSO4·7H2O～5mgMnSO4·H2O～1.56mgZnSO4～1.4mgCoCl2～2.0mg水1l經(jīng)發(fā)酵后的天然纖維素類物質(zhì)的殘?jiān)浣M成的分析結(jié)果，以玉米秸粉為例，列于附表1中。由表1可見，隨著天然纖維素類物質(zhì)的發(fā)酵次數(shù)的增加，由于低分子糖類及部分易分解的纖維素的利用，使之纖維素含量降低了，總糖量也降低了。而木質(zhì)素的含量增加了，蛋白質(zhì)的含量也因菌體蛋白的增加有所增加。
附圖
為本發(fā)明的工藝流程圖。其中，1～天然纖維素類物質(zhì)2～營養(yǎng)液3～滅菌蒸球4～發(fā)酵室5～提取罐6～水7～酶液如圖所示，將天然纖維素類物質(zhì)1加營養(yǎng)液2制成發(fā)酵培養(yǎng)基，置入蒸球3中滅菌后，冷卻、接種，再輸送到發(fā)酵室4中發(fā)酵，發(fā)酵完畢，送到提取罐5中，加水6進(jìn)行抽濾或壓榨，將酶液7從發(fā)酵物中分離出來，并得到了新鮮的發(fā)酵殘?jiān)?，將這些發(fā)酵殘?jiān)苯铀偷綔缇羟?中，(或者將其風(fēng)干備用)，通過控制50～75%的含水量，并補(bǔ)加和原培養(yǎng)基相同的營養(yǎng)液2后，重新作為培養(yǎng)基的碳源使用，重復(fù)下面的工藝過程。
纖維素酶活性的測定方法，用20mg新華濾紙為底物，加pH4.80.1M的醋酸緩沖液0.9ml，再加經(jīng)適當(dāng)稀釋過的酶液0.1ml，在40℃反應(yīng)30分鐘，用3，5-二硝基水楊酸法(DNS法)測定生成的還原糖，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)糖。酶活性以國際單位表示，即每分鐘產(chǎn)生1μmol的葡萄糖為一個國際單位IU。
下面是本發(fā)明的一個最佳實(shí)施例。
取用粉碎機(jī)粉成的玉米秸粗粉(25目)100g加Mandels營養(yǎng)渡200ml，裝入5l的三角瓶內(nèi)，于120℃滅菌15分鐘，接種木霉(TrichodermaT)后，于28℃發(fā)酵3天，發(fā)酵完畢，加水1000ml，室溫下放置2～3小時(常攪)，然后用尼龍布過濾，濾出酶液待用，并得到81.2g發(fā)酵殘?jiān)?。再將一次發(fā)酵殘?jiān)?0g加Mandels營養(yǎng)液100ml，裝入1l的三角瓶，重復(fù)上面的滅菌、接種及培養(yǎng)過程，然后加水浸提酶，再經(jīng)過濾，將酶和殘?jiān)珠_，即得到了二次發(fā)酵殘?jiān)?5.4g，依次循環(huán)往復(fù)，可得到第三次發(fā)酵殘?jiān)⒌谒拇伟l(fā)酵殘?jiān)?br> 為了比較由玉米秸粉和發(fā)酵殘?jiān)a(chǎn)的纖維素酶的活性，分別取用上述方法制備的一次、二次、三次發(fā)酵殘?jiān)霸衩捉辗鄹?0g，加Mandels營養(yǎng)液20ml，裝入250ml的三角瓶內(nèi)，按上述同樣條件滅菌、接種(TrichodermaT)，于28℃培養(yǎng)4天，測得活性結(jié)果列于附表2中。
權(quán)利要求
1.一種高活性纖維素酶的制造方法，采用纖維素類物質(zhì)作為培養(yǎng)基中的碳源，經(jīng)滅菌、接種、發(fā)酵、抽濾的工藝過程，制取纖維素酶，其特征是，將天然纖維素類物質(zhì)的發(fā)酵殘?jiān)c酶液分離后，復(fù)又作為培養(yǎng)基中的碳源使用，進(jìn)行多次重復(fù)發(fā)酵的過程，制取高活性纖維素酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高活性纖維素酶的制造過程，其特征在于，上述發(fā)酵殘?jiān)鼜?fù)作培養(yǎng)基中的碳源使用進(jìn)行再次發(fā)酵時，需控制50～75%的含水量和補(bǔ)加與原培養(yǎng)基相同的Mandels氏營養(yǎng)液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高活性纖維素酶的制造方法，其特征在于，上述發(fā)酵殘?jiān)鼜?fù)作培養(yǎng)基中的碳源使用進(jìn)行多次重復(fù)發(fā)酵時，需再次經(jīng)滅菌、接種、發(fā)酵、抽濾的工藝過程。
全文摘要
一種高活性纖維素酶的制造方法，利用天然纖維素類物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的過程中殘留下來的發(fā)酵殘?jiān)?，?fù)又用來代替培養(yǎng)基中的天然纖維素類物質(zhì)而作為碳源使用，進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，不僅能得到具有更高活性的纖維素酶，同時又可節(jié)省發(fā)酵原料和解決由于發(fā)酵殘?jiān)鼛淼沫h(huán)境污染問題。
文檔編號C12N9/42GK1036792SQ88105339
公開日1989年11月1日 申請日期1988年9月23日 優(yōu)先權(quán)日1988年9月23日
發(fā)明者宋桂經(jīng) 申請人:山東大學(xué)