本發(fā)明涉及一種雞腿菇固態(tài)轉化山藥的發(fā)酵物，屬于生物工程
技術領域：
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背景技術：
：隨著我國經濟的發(fā)展、人民生活水平的提高以及人們飲食結構的變化，尤其是高脂膳食攝入的增多，高血壓、高和高血糖等“三高”疾病的發(fā)病率逐年上升?！叭摺奔膊∫殉蔀橛绊憞裆眢w健康的頭號大敵，每年因“三高”疾病死亡的人數居各種疾病死亡人數的首位?？刂坪皖A防“三高”，西藥雖然效果較好,但因副作用大、價格相對較高，并非每個病人都能接受，因此開發(fā)療效更好、副作用更小的藥品及保健食品有著良好的發(fā)展前景。山藥為薯預科薯蕷屬中能形成地下肉質塊莖的栽培種,一年生或多年生纏繞性藤本植物，別名淮山、薯損、懷山藥等。山藥是一種藥食兼用的高產、高效經濟作物，干制入藥為滋補強壯劑,對虛弱、慢性腸炎、糖尿病等有輔助療效。山藥富含蛋白質、氨基酸、淀粉等營養(yǎng)物質以及多糖、皂苷、維生素、尿囊素、多巴胺、山藥堿、多酚氧化酶等生物活性成分?！侗静菥V目》山藥治諸虛百損，療五勞七傷，止腰痛、除煩熱、補心氣不足，開達心孔、多記事、強筋骨、益腎氣、健脾胃、止瀉痢、化痰涎、潤皮毛等功效，《醫(yī)學衷中參西錄》記載山藥具有止消渴(糖尿病)。現代醫(yī)學研究證明山藥具有調節(jié)或增強機體免疫、降低血壓和功效以及抗腫瘤、抗氧化、抗衰老和抗突變等作用。山藥最初食用方法是去皮、曬干、磨粉后長期保藏，通常將山藥粉通過蒸煮做成各種食品或者將山藥直接煲成湯來食用。近些年來，隨著科學技術的進步，人們對山藥的開發(fā)也逐漸的向深層次發(fā)展，有關山藥產品研究開發(fā)的報道很多：將山藥直接干燥制成全粉、精粉，將山藥直接打漿制成系列飲料，將山藥淀粉制成營養(yǎng)米粉，將山藥和純奶、大米等復合發(fā)酵成山藥酸奶和山藥酒等。但質量不穩(wěn)定，而且山藥還具有中藥的共性，見效慢。將山藥的有效成分直接提取出來開發(fā)成具有保健功能的食品正逐漸成為山藥開發(fā)利用的新思路。雞腿菇(coprinuscomatus)是藥用真菌的一種，又名雞腿蘑，學名毛頭鬼傘，隸屬于真菌門(eumycota)，擔子菌亞門(basidiomycotina)，層菌綱(hymenomycetes)，傘菌目(agaricales)，鬼傘科(coprinaceae)，鬼傘屬(coprinus)。雞腿菇不僅具有多種營養(yǎng)功能，還具有抑制腫瘤、增強肌體免疫、降低血糖，預防治療高血壓、冠心病及動脈硬化等多方面的藥學作用。目前已經公開的雞腿菇專利主要是如何獲得雞腿菇菌種、雞腿菇的栽培或是雞腿菇多糖的提取，沒有利用其生產含有皂苷、甾醇、多酚和多糖的保健品或藥品的報道，而且都是實驗室規(guī)模，其工藝技術能否用于工業(yè)化還不能確定。技術實現要素：本發(fā)明的目的在于：提供一種雞腿菇固態(tài)轉化山藥的發(fā)酵物，將液體菌種擴大培養(yǎng)技術與固態(tài)生物轉化相結合，以雞腿菇為菌種，大米山藥為主要原料，采用發(fā)酵與轉化相結合，生產具有降血糖功能的保健食品和中藥。技術方案本發(fā)明人經過深入的研究，摸索出一種以大米山藥為主要原料，通過雞腿菇菌體液態(tài)搖瓶培養(yǎng)、液體種子罐擴大培養(yǎng)獲得含有雞腿菇液體菌種。利用該液體菌種與滅過菌的大米山藥和輔料混合，平攤于固態(tài)發(fā)酵床上，進行固態(tài)發(fā)酵。具體方案如下：一種雞腿菇固態(tài)轉化山藥的發(fā)酵物，其由如下方法制備而成：a.試管擴大培養(yǎng)：將雞腿菇菌種接種于馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基中，20-35℃下培養(yǎng)3-10d后，進行1-10℃保藏，制得雞腿菇斜面菌種；b.液體搖瓶培養(yǎng)：將步驟a制得的雞腿菇斜面菌種切成3mm×3mm大小，挑取3～5塊接種到裝有液體搖瓶培養(yǎng)基的搖瓶中，20-35℃下培養(yǎng)3-10d后，制得液體搖瓶菌種；其中，每1l液體搖瓶培養(yǎng)基含有：葡萄糖10～60g，玉米粉10～50g，小麥麩皮5～20g，玉米皮5～25g，酵母浸膏5～30g，磷酸二氫鉀1-8g，硫酸鎂1～8g；c.種子罐種子培養(yǎng)：將步驟b制得的液體搖瓶菌種接種到種子罐培養(yǎng)基，在種子罐內進行培養(yǎng)，制得種子罐菌種液體；其中，每1l種子罐培養(yǎng)基含有：葡萄糖10～60g，小麥麩皮5～20g,玉米皮5～80g，酵母浸膏5～30g，磷酸二氫鉀1-8g，硫酸鎂1～8g；d.固體發(fā)酵培養(yǎng)：將種子罐菌種液體和固體發(fā)酵培養(yǎng)基混合均勻，攤在固態(tài)發(fā)酵床上，厚度6-20cm，寬度60-120cm，在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)室中培養(yǎng)3-15天后，干燥至恒重，得到雞腿菇固態(tài)轉化山藥的發(fā)酵物；步驟d中，所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基是通過將培養(yǎng)基原料進行滅菌制得，培養(yǎng)基原料按重量份計包括：100份大米，20～60份山藥，10～50份玉米皮，60～150份水。進一步，步驟c中，將液體搖瓶菌種接種到種子罐培養(yǎng)基的接種量為2-20v％。進一步，種子罐中的培養(yǎng)條件為：溫度為20-35℃，攪拌轉速為50-160r/m，通氣量為0.2-1.8:1v/v/m，培養(yǎng)18-200h。進一步，步驟d中，接種量為：每100g固體發(fā)酵培養(yǎng)基中接種1-20ml種子罐菌種液體。進一步，步驟d中，培養(yǎng)條件為：溫度20-35℃，通氣量為0.05-0.5:1v/v/m。上述雞腿菇固態(tài)轉化山藥的發(fā)酵物在降血糖和中的應用。本發(fā)明的雞腿菇固態(tài)轉化山藥的發(fā)酵物中，100克干的發(fā)酵物含有20～80毫克皂苷，10～100毫克多酚，10～50毫克甾醇，100～1000mg多糖?？蓪⒈景l(fā)明的雞腿菇固態(tài)轉化山藥的發(fā)酵物制備醇提物和水提物，用于腹腔注射途徑或口服途徑。雞腿菇固態(tài)轉化山藥的發(fā)酵物的醇提物的制備方法：以1g雞腿菇固態(tài)轉化山藥的發(fā)酵物計算，將雞腿菇固態(tài)轉化山藥的發(fā)酵物加入10～60ml20～80wt％的乙醇溶液，于85℃提取2～6h，然后離心，濾渣重復此提取過程兩次，三次提取濾液合并；然后真空濃縮至2-10ml，再加入10～20ml水，2℃沉淀；濾出濃縮沉淀物，用2℃水洗滌后烘干，得到雞腿菇固態(tài)轉化山藥發(fā)酵物的醇提物。雞腿菇固態(tài)轉化山藥的發(fā)酵物的水提物的制備方法：以1g雞腿菇固態(tài)轉化山藥的發(fā)酵物計算，將雞腿菇固態(tài)轉化山藥的發(fā)酵物加入10～60ml水，煮沸提取2～6h，然后離心，濾渣重復此提取過程兩次，三次提取濾液合并；三次提取合并濾液真空濃縮至2-10ml，再加入4～10ml乙醇，2℃沉淀；濾出濃縮沉淀物，用乙醇洗滌后烘干，得到雞腿菇固態(tài)轉化山藥發(fā)酵物的水提物。有益效果：本發(fā)明的雞腿菇固態(tài)轉化山藥的發(fā)酵物中，100克干的發(fā)酵物含有20～80毫克皂苷，10～100毫克多酚，10～50毫克甾醇；100～1000mg多糖。本發(fā)明人經反復試驗證實，雞腿菇固態(tài)轉化山藥發(fā)酵物口服途徑及其醇提物和水提物腹腔注射途徑或口服途徑給予高血糖大鼠可以顯著降低其血糖。而且本發(fā)明的發(fā)酵物是一種純天然制劑，與現有降糖藥物相比不僅見效快、效果顯著，并且服用后不會導致低血糖、有益無害。具體實施方式下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例1a.試管擴大培養(yǎng)：將雞腿菇菌種接種于馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基中，20℃下培養(yǎng)10d后，進行10℃保藏，制得雞腿菇斜面菌種；b.液體搖瓶培養(yǎng)：將步驟a制得的雞腿菇斜面菌種切成3mm×3mm大小，挑取5塊接種到裝有液體搖瓶培養(yǎng)基的搖瓶中，35℃下培養(yǎng)3d后，制得液體搖瓶菌種；其中，每1l液體搖瓶培養(yǎng)基含有：葡萄糖60g，玉米粉50g，小麥麩皮20g，玉米皮25g，酵母浸膏30g，磷酸二氫鉀8g，硫酸鎂8g；c.種子罐種子培養(yǎng)：將步驟b制得的液體搖瓶菌種按照體積比20％接種到種子罐培養(yǎng)基，在溫度為35℃，攪拌轉速為50r/m，通氣量為0.2:1v/v/m的條件下，培養(yǎng)18h，制成種子罐菌種；其中，每1l種子罐培養(yǎng)基含有：葡萄糖10g，小麥麩皮5g，玉米皮5g，酵母浸膏5g，磷酸二氫鉀1g，硫酸鎂1g；d.固體發(fā)酵培養(yǎng)：將種子罐菌種和固體發(fā)酵培養(yǎng)基混合均勻(每100g固體發(fā)酵培養(yǎng)基中接種20ml種子罐菌種液體)，攤在固態(tài)發(fā)酵床上，厚度20cm，寬度60cm，長度不限，在溫度20℃，通氣量為0.05:1固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)室中培養(yǎng)15d后，干燥至恒重，得到雞腿菇固態(tài)轉化山藥發(fā)酵物；固體發(fā)酵培養(yǎng)基通過將培養(yǎng)基原料進行滅菌制得，固體發(fā)酵培養(yǎng)基以每100kg大米添加的其他各成分的重量為：山藥20kg,玉米皮10kg,水60kg。實施例2a.試管擴大培養(yǎng)：將雞腿菇菌種接種于馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基中，25℃下培養(yǎng)6d后，進行5℃保藏，制得雞腿菇斜面菌種；b.液體搖瓶培養(yǎng)：將步驟a制得的雞腿菇斜面菌種切成3mm×3mm大小，挑取3塊接種到裝有液體搖瓶培養(yǎng)基的搖瓶中，20℃下培養(yǎng)10d后，制得液體搖瓶菌種；其中，每1l液體搖瓶培養(yǎng)基含有：葡萄糖10g，玉米粉10g，小麥麩皮5g，玉米皮5g，酵母浸膏5g，磷酸二氫鉀1g，硫酸鎂1g；c.種子罐種子培養(yǎng)：將步驟b制得的液體搖瓶菌種按照體積比2％接種到種子罐培養(yǎng)基，在溫度為20℃，攪拌轉速為160r/m，通氣量為1.8:1v/v/m的條件下，培養(yǎng)200h，制成種子罐菌種；其中，每1l種子罐培養(yǎng)基含有：葡萄糖60g，小麥麩皮20g，玉米皮80g，酵母浸膏30g，磷酸二氫鉀8g，硫酸鎂8g；d.固體發(fā)酵培養(yǎng)：將種子罐菌種和固體發(fā)酵培養(yǎng)基混合均勻(每100g固體發(fā)酵培養(yǎng)基中接種1ml種子罐菌種液體)，攤在固態(tài)發(fā)酵床上，厚度6cm，寬度60cm，長度不限，在溫度35℃，通氣量為0.05:1固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)室中培養(yǎng)10d后，干燥至恒重，得到雞腿菇固態(tài)轉化山藥發(fā)酵物；固體發(fā)酵培養(yǎng)基通過將培養(yǎng)基原料進行滅菌制得，固體發(fā)酵培養(yǎng)基以每100kg大米添加的其他各成分的重量為：山藥60kg，玉米皮50kg，水150kg。實施例3a.試管擴大培養(yǎng)：將雞腿菇菌種接種于馬鈴薯葡萄糖斜面培養(yǎng)基中，35℃下培養(yǎng)3d后，進行1℃保藏，制得雞腿菇斜面菌種；b.液體搖瓶培養(yǎng)：將步驟a制得的雞腿菇斜面菌種切成3mm×3mm大小，挑取3塊接種到裝有液體搖瓶培養(yǎng)基的搖瓶中，28℃下培養(yǎng)7d后，制得液體搖瓶菌種；其中，每1l液體搖瓶培養(yǎng)基含有：葡萄糖30g，玉米粉30g，小麥麩皮12.5g，玉米皮12.5g，酵母浸膏18g，磷酸二氫鉀5g，硫酸鎂4g；c.種子罐種子培養(yǎng)：將步驟b制得的液體搖瓶菌種按照體積比10％接種到種子罐培養(yǎng)基，在溫度為28℃，攪拌轉速為110r/m，通氣量為1:1v/v/m的條件下，培養(yǎng)100h，制成種子罐菌種；其中，每1l種子罐培養(yǎng)基含有：葡萄糖30g，小麥麩皮12.5g，玉米皮42g，酵母浸膏16g，磷酸二氫鉀5g，硫酸鎂5g；d.固體發(fā)酵培養(yǎng)：將種子罐菌種和固體發(fā)酵培養(yǎng)基混合均勻(每100g固體發(fā)酵培養(yǎng)基中接種10ml種子罐菌種液體)，攤在固態(tài)發(fā)酵床上，厚度8cm，寬度110cm，長度不限，在溫度20℃，通氣量為0.1:1固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)室中培養(yǎng)15天后，干燥至恒重，得到雞腿菇固態(tài)轉化山藥發(fā)酵物；固體發(fā)酵培養(yǎng)基通過將培養(yǎng)基原料進行滅菌制得，固體發(fā)酵培養(yǎng)基以每100kg大米添加的其他各成分的重量為：山藥40kg，玉米皮30kg，水100kg。試驗測試：1、將實施例1-3制得的雞腿菇固態(tài)轉化山藥的發(fā)酵物進行多酚、皂苷、多糖的含量測試，測試方法如下：1)多酚的含量測試(1)標準曲線制作：準確量取1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00ml0.01mg/ml沒食子酸標準溶液，分別置于10ml容量瓶中，在每個容量瓶內分別加入5.0ml10％福林酚試劑搖勻，反應8min內，加入4.0ml7.5％na2co3溶液，加水定容至刻度、搖勻。室溫下放置60min。用10mm比色皿、用蒸餾水作為空白，在765nm波長條件下測定吸光度，制作沒食子酸濃度-吸光度標準曲線。(2)多酚的提?。喝〗?0℃干燥至恒重的雞腿菇轉化山藥樣品1.0g250ml三角瓶中，加入25ml70％乙醇溶液，于70℃的水浴中進行振蕩提取，3h后過濾，濾渣用25ml二次70％乙醇二次重復提取取物。兩次濾液合并經0.45微米濾膜過濾，獲得茶多酚浸提液。(3)樣品中多酚濃度的測定：準確吸取多酚提取液1.0ml共3份，分別置10ml容量瓶，在每個容量瓶內分別加入5.0ml10％福林酚試劑搖勻，反應8min內，加入4.0ml7.5％na2co3溶液，加水定容至刻度、搖勻。室溫下放置60min。用10mm比色皿、在765nm波長條件下，以水作空白對照，測定吸光度(a)，根據標準曲線計算樣品多酚的含量。2)皂苷的含量測試(1)標準曲線制作：吸取標準液0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35和0.40ml1mg/ml用無水乙醇配置的薯蕷皂甙標準溶液，分別置于10ml具塞試管中，70℃水浴揮干溶劑，加入0.2ml的5％香草醛－冰醋酸溶液，再加入0.8ml的高氯酸，搖勻，于60℃水浴中加熱20min，立即取出用流水冷卻至室溫，加入冰醋酸5ml，搖勻，于505nm處測定其吸光值od。繪制薯蕷皂甙吸光度-濃度標準曲線。(2)樣品皂苷的提?。喝〗?0℃干燥至恒重的雞腿菇轉化山藥樣品2.5g，用乙醚經索氏提取器脫脂風干。準確稱取脫脂風干的雞腿菇山藥粉0.2g于10ml具塞試管中，準確加入4ml含1％氨水乙醇，加塞后放入超聲波儀中超聲1h，然后取出試管，置于離心機中以3000轉/分離心15min，上清液作為待測液。(3)樣品中皂苷濃度的測定：吸取上述樣品皂苷提取液各0.4ml，3個重復，分別置于10ml具塞試管中，70℃水浴揮干溶劑，加入0.2ml的5％香草醛－冰醋酸溶液，再加入0.8ml的高氯酸，搖勻，于60℃水浴中加熱20min，立即取出用流水冷卻至室溫，加入冰醋酸5ml，搖勻，于505nm處測定其吸光值od。3)多糖的含量測試a.多糖準曲線測定：準確量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和0.7ml1mg/ml的葡萄糖標準品溶液于定量刻度試管中，蒸餾水定容到2ml，分別加入1.0ml5％的苯酚溶液，快速加入5.0ml濃硫酸并搖勻，沸水浴15min，流動水冷卻至室溫，以2ml蒸餾水代替標準液，冷卻后，用水代替標準葡萄糖溶液作為空白對照。于波長490nm處測量吸光值，然后繪制標準葡萄糖濃度-吸光度曲線圖。b.多糖的提取：稱取1g樣品，放入試管，加入10ml蒸餾水，塞入試管塞，在80℃下水浴3h，轉入離心管離心，殘渣再加入30ml蒸餾水，沸水浴1h，取上清液，蒸餾水定容至10ml保存在4℃冰箱中，用于分析多糖含量。c.樣品中多糖測定：準確量取多糖提取液2ml，快速加入5.0ml濃硫酸并搖勻，沸水浴15min，流動水冷卻至室溫，以2ml蒸餾水代替標準液，冷卻后，用水代替標準葡萄糖溶液作為空白對照。于波長490nm處測量吸光值。d.樣品多糖含量分析結果：實施例1、實施例2和實施例3的多糖含量分別為102mg/100g干基質，449mg/100g干基質和998mg/干基質。測試結果見下表：實施例1實施例2實施例3多酚，mg/100g發(fā)酵物10.0299.658.7皂苷，mg/100g發(fā)酵物20.144.679.9多糖，mg/100g發(fā)酵物1024499982、降血糖功效評價試驗方法：100只小鼠以基礎飼料適應喂養(yǎng)5d后，腹腔注射180mg/kg體重的四氧嘧啶，飼喂普通小鼠飼料(12％酪蛋白，60.98％玉米淀粉，15％蔗糖，7％玉米油，1％維生素糖粉，4％礦物鹽，0.02％魚肝油)五天后，取尾血用血糖試劑盒測定血糖含量，以血糖含量高于13mmol/ml的模型鼠隨機分為6組：正常對照組、高血糖對照組、實施例1樣品組、實施例2樣品組和實施例3樣品組，所有實驗鼠都飼喂基礎飼料。各組小鼠均自由攝食和飲水，動物室溫度18～22℃。連續(xù)給藥四周后，每隔七天尾部靜脈取血，分析血糖含量，試驗結果見圖1。由圖1可以看出，在整個試驗期間，正常組和陽性對照組血糖值基本不變，而實施例1、實施例2和實施例3組血糖值顯著降低。當前第1頁12