一種小規(guī)模木霉菌固態(tài)發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種固態(tài)發(fā)酵方法。
【背景技術(shù)】
[0002]木霉(Trichoderma)屬于半知菌亞門，絲孢目，木霉屬真菌。兼具“木霉生物菌肥”，“木霉生物農(nóng)藥”，“木霉植物生長調(diào)節(jié)劑”三大特性。世界各國紛紛將木霉菌應(yīng)用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。木霉菌生長迅速，產(chǎn)孢需要大量的氧氣和營養(yǎng)。小規(guī)模發(fā)酵，條件控制不好，常常導(dǎo)致發(fā)酵失敗。一是產(chǎn)孢量達(dá)不到需要，二是發(fā)酵后期自溶現(xiàn)象經(jīng)常發(fā)生，這些嚴(yán)重影響了后期田間試驗菌肥效果的發(fā)揮。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明目的是為了解決現(xiàn)有小規(guī)模發(fā)酵木霉菌存在產(chǎn)孢量少，發(fā)酵后期出現(xiàn)自溶現(xiàn)象的問題，而提供了一種小規(guī)模木霉菌固態(tài)發(fā)酵方法。
[0004]一種小規(guī)模木霉菌固態(tài)發(fā)酵方法，按以下步驟進(jìn)行:
[0005]—、制備PDA斜面培養(yǎng)基并接種木霉菌，室溫培養(yǎng)4?6天，然后用滅菌水洗下PDA斜面培養(yǎng)基上的木霉分生孢子，制備成濃度為10s?10 個孢子/mL的菌液；
[0006]二、按重量百分比稱取80%的稻殼、18%的麥麩、1 %的玉米面和1%的黃顯粉，加入自來水至濕度為180%，攪勻后裝入聚丙烯滅菌袋，然后于121°C滅菌2.5h，獲得滅菌后的發(fā)酵料；
[0007]三、無菌托盤中裝入150?160g滅菌后的發(fā)酵料，加入lmL步驟一中的菌液并拌勻，然后用保鮮膜封口，室溫，自然光下培養(yǎng)至木霉菌菌絲體布滿發(fā)酵料，然后用鑷子在保鮮膜表面扎孔，托盤的4個角，每個角扎兩個孔，待發(fā)酵料上布滿木霉分生孢子后，將孔擴(kuò)大2倍，繼續(xù)發(fā)酵至孢子全部散出，即完成小規(guī)模木霉菌固態(tài)發(fā)酵。
[0008]本發(fā)明中小規(guī)模木霉菌固態(tài)發(fā)酵方法，無需嚴(yán)格控制生產(chǎn)條件，操作簡單，且無需大型設(shè)備，無需設(shè)立單獨(dú)的生產(chǎn)空間，適合于在實(shí)驗室進(jìn)行小規(guī)模生產(chǎn)；同時木霉菌產(chǎn)孢量少，發(fā)酵周期短，僅用10天左右即可完成，并且發(fā)酵后期不會出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。
[0009]本發(fā)明中小規(guī)模木霉菌固態(tài)發(fā)酵方法，采用的發(fā)酵料配比合理，營養(yǎng)均衡，能夠滿足多數(shù)木霉菌的大量生長繁殖，且成本低。采用托盤裝料后發(fā)酵，累疊擺放高至屋頂，充分利用室內(nèi)空間，占地面積小，通風(fēng)良好，托盤可反復(fù)使用，且不用購買培養(yǎng)架，節(jié)約成本。
【附圖說明】
[0010]圖1為實(shí)施例中托盤采用長、寬的朝向互換上下累疊擺放的圖；
[0011]圖2為實(shí)施例中發(fā)酵10天后孢子全部散出的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0012]本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實(shí)施方式】，還包括各【具體實(shí)施方式】間的任意組合。
[0013]【具體實(shí)施方式】一:本實(shí)施方式小規(guī)模木霉菌固態(tài)發(fā)酵方法，按以下步驟進(jìn)行:
[0014]一、制備PDA斜面培養(yǎng)基并接種木霉菌，室溫培養(yǎng)4?6天，然后用滅菌水洗下PDA斜面培養(yǎng)基上的木霉分生孢子，制備成濃度為10s?10 個孢子/mL的菌液；
[0015]二、按重量百分比稱取80%的稻殼、18%的麥麩、1%的玉米面和1%的黃豆粉，加入自來水至濕度為180%，攪勻后裝入聚丙烯滅菌袋，然后于121°C滅菌2.5h，獲得滅菌后的發(fā)酵料；
[0016]三、無菌托盤中裝入150?160g滅菌后的發(fā)酵料，加入lmL步驟一中的菌液并拌勻，然后用保鮮膜封口，室溫，自然光下培養(yǎng)至木霉菌菌絲體布滿發(fā)酵料，然后用鑷子在保鮮膜表面扎孔，托盤的4個角，每個角扎兩個孔，待發(fā)酵料上布滿木霉分生孢子后，將孔擴(kuò)大2倍，繼續(xù)發(fā)酵至孢子全部散出，即完成小規(guī)模木霉菌固態(tài)發(fā)酵。
[0017]本實(shí)施方式步驟二中發(fā)酵料裝入聚丙烯滅菌袋，裝料要緊實(shí)，保證放入高壓鍋時，能直立，滅菌袋與滅菌袋之間形成縫隙，保證在高壓鍋中的高壓熱空氣能夠均勻分布，滅菌均勻徹底。
[0018]本實(shí)施方式步驟二中配制好的發(fā)酵料必須馬上滅菌，避免雜菌生長，使發(fā)酵料的營養(yǎng)改變；滅菌后的發(fā)酵料在1?2天之內(nèi)務(wù)必接菌，放置時間長，易污染。
[0019]本實(shí)施方式步驟二中滅菌后的發(fā)酵料若散發(fā)臭味或酸味，則是受到細(xì)菌或酵母菌污染，滅菌失敗。
[0020]本實(shí)施方式步驟三中無菌托盤:托盤用洗潔精刷洗一遍，流水徹底沖洗，托盤倒扣摞在一起，避免室內(nèi)雜菌落入，污染托盤，同時，托盤壁上的水珠容易流出，很快晾干。
[0021]本實(shí)施方式步驟三中的操作環(huán)境要求清潔，徹底擦凈操作臺，并將室內(nèi)地面拖擦干凈；戴上無菌一次性PE手套，將菌液與發(fā)酵料拌勻。
[0022]本實(shí)施方式步驟三中無菌托盤中裝入150?160g滅菌后的發(fā)酵料，原因是發(fā)酵料太薄容易失水變干，太厚菌絲體長滿之后透氣性差，不容易產(chǎn)孢。
[0023]本實(shí)施方式步驟三中保鮮膜封口后，可以標(biāo)記接菌時間及菌種的編號，便于后期觀察。
[0024]本實(shí)施方式步驟三中接菌后的托盤采用長、寬的朝向互換上下累疊擺放。
[0025]本實(shí)施方式步驟三中扎孔目的是保證快速產(chǎn)孢需要的氧氣，促使分生孢子迅速萌發(fā)，扎孔后即保證木霉生長環(huán)境的透氣性，又不會產(chǎn)生雜菌污染；孔擴(kuò)大目的是使發(fā)酵產(chǎn)物盡快干燥，避免自溶現(xiàn)象發(fā)生。
[0026]本實(shí)施方式步驟三中完成小規(guī)模木霉菌固態(tài)發(fā)酵的發(fā)酵周期:春夏8?10天，秋冬為11?13天；發(fā)酵完成后利用血球計數(shù)板測定孢子產(chǎn)量約16億個活孢子/克發(fā)酵產(chǎn)物；無雜菌污染。
[0027]【具體實(shí)施方式】二:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是，步驟一中PDA斜面培養(yǎng)基的配制:200g馬鈴薯、20g葡萄糖、15g瓊脂和1000mL水，裝入聚丙烯大試管中，每管20mL，115°C滅菌30min后擺斜面。其它步驟及參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0028]【具體實(shí)施方式】三:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一或二不同的是，步驟一中木霉菌為棘抱木霉(Trichoderma asperellum)ACCC30536、加納木霉(Trichoderma ghanense)ACCC30153、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)ACCC30588、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)ACCC30371、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)ACCC31959、綠木霉(Trichoderma virens)ACCC32490 或棘抱木霉(Trichoderma asperellum)CFCC88162。其它步驟及參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一或二相同。
[0029]本實(shí)施方式中棘抱木霉(Trichoderma asperellum)ACCC30536,購買自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；加納木霉(Trichoderma ghanense)ACCC30153，購買自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；哈茨木霉(Trichoderma harzianum)ACCC30588，購買自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；哈茨木霉(Trichoderma harzianum) ACCC30371，購買自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；哈茨木霉(Trichoderma harzianum)ACCC31959，購買自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；綠木霉(Trichoderma virens) ACCC32490，購買自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；棘抱木霉(Trichoderma asperellum)CFCC88162，購買自中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心。
[0030]【具體實(shí)施方式】四:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至三之一不同的是，步驟一中聚丙烯大試管的規(guī)格:3cm 口徑X24cm長。其它步驟及參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一至三之一相同。
[0031]【具體實(shí)施方式】五:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至四之一不同的是，步驟一中制備PDA斜面培養(yǎng)基并接種木霉菌，室溫培養(yǎng)5天。其它步驟及參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一至四之一相同。
[0032]【具體實(shí)施方式】六:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至五之一不同的是，步驟一中制備成濃度為109個孢子/mL的菌液。其它步驟及參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一至五之一相同。
[0033]【具體實(shí)施方式】七:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至六之一不同的是，步驟二中聚丙烯滅菌袋的規(guī)格:15CmX40Cm。其它步驟及參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一至六之一相同。
[0034]【具體實(shí)施方式】八:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至七之一不同的是，步驟三中無菌托盤中裝入155g滅菌后的發(fā)酵料。其它步驟及參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一至七之一相同。
[0035]【具體實(shí)施方式】九:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至八之一不同的是，步驟三中托盤的規(guī)格:口部外徑:長X寬X高=42cmX29.5cmX6.5cm，底部內(nèi)徑:長*寬=36cmX23.5cm ;托盤的材質(zhì):厚度為1.5mm的透明亞克力。其它步驟及參數(shù)與【具體實(shí)施方式】一至八之一相同。
[0036]采用以下實(shí)施例驗證本發(fā)明的有益效果:
[0037]實(shí)施例:
[0038]小規(guī)模木霉菌固態(tài)發(fā)酵方法，按以下步驟進(jìn)行:
[0039]—、制備PDA斜面培養(yǎng)基并接種木霉菌，室溫培養(yǎng)5天，然后用滅菌水