本發(fā)明涉及一種牛樟芝酵素及其制備方法。
背景技術(shù)：
：牛樟芝學(xué)名為antrodiacamphorata，又名為樟芝，牛樟菇、樟菇，是中國臺灣特有的真菌。牛樟芝生長于牛樟樹干腐朽的中空內(nèi)部或倒伏樹干的潮濕表面，子實(shí)體形態(tài)多變化，有板狀、鍾狀、馬蹄狀或塔狀；初生時鮮紅色，漸長變?yōu)榘咨?、淡紅褐色、淡褐色或淡黃褐色。牛樟芝氣芳香味辛苦、平，有祛風(fēng)行氣、化淤活血、溫中消結(jié)、解毒消腫、鎮(zhèn)靜止痛、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、提升機(jī)體免疫力之效；對于治療胃腸疼痛、腹瀉嘔吐、食物中毒、糖尿病、酒精肝、脂肪肝、肝硬化、肝癌等更是有獨(dú)特功能?，F(xiàn)代分離分析技術(shù)證實(shí)，樟芝主要生理活性物質(zhì)為多糖體(β-d-葡聚糖)和三萜類化合物。樟芝所含有的三萜類成分為靈芝的數(shù)倍之多，為樟芝最重要的化學(xué)成分之一。其功效除了有抗癌的效果外，同時可以增強(qiáng)人體免疫力，提升肝臟運(yùn)作功能，對乙肝病毒等肝炎具有很好的改善效果。此外，三萜類亦有降血壓，降低中風(fēng)幾率的作用。樟芝多糖屬于雜多糖，具有提升人體免疫力，調(diào)整血壓、降血脂、抑制病毒、抗過敏及抗輻射等作用。樟芝所含次要活性物質(zhì)則包括超氧化物歧化酶(sod)、腺苷、小分子蛋白質(zhì)(含免疫蛋白)、維生素、固醇類、木質(zhì)素、不飽和長鏈脂肪酸、麥角甾醇、微量元素鍺以及凝集素、氨基酸、薄孔菌酸(antrodiaacid)等。腺苷是人體遺傳基因的主要成分之一，可以抑制血小板凝聚，改善血液循環(huán)；超氧化物歧化酶是一種血蛋白，具有移除超氧陰離子的作用等。由于樟芝在中國臺灣被視為獨(dú)特而珍貴的藥用真菌，因此具有極高的研究和商業(yè)價值，也是目前中國臺灣最昂貴的野生真菌，在港澳被稱為“神芝”，中國臺灣民間稱之為“森林中的紅寶石”。酵素指以一種或多種新鮮蔬菜、水果、菌菇、中草藥等為原料，經(jīng)多種有益菌發(fā)酵而產(chǎn)生的，含有豐富的維生素、酶、礦物質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物等營養(yǎng)成分的功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品。酵素不但保存了發(fā)酵原料中所固有的營養(yǎng)物質(zhì)，而且可以改善發(fā)酵原料原有的一些不良風(fēng)味，更重要的是在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了一些新的功能成分，對人體有效好的保健效果。然而，微生物發(fā)酵是一個復(fù)雜的過程，影響酵素產(chǎn)品質(zhì)量的因素較多，比如，發(fā)酵菌種、接種量等工藝參數(shù)對酵素質(zhì)量的影響尤為明顯，確定適宜的發(fā)酵條件，從而得到一種風(fēng)味良好且功能性成分含量較高的酵素產(chǎn)品對技術(shù)人員來說十分困難。隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活水平得到提高，但切伴隨著現(xiàn)代文明病、富貴病及人類普遍亞健康狀態(tài)的出現(xiàn)。在物質(zhì)豐裕的現(xiàn)代，人們越來越注重養(yǎng)生，“中醫(yī)不治已病治未病”的保健理念深入人心，近幾年來以具有很好的防癌、抗癌、保肝功效的樟芝真菌為原材料研發(fā)的保健食品更是受人追捧，市場對其需求量非常大。樟芝菌絲體在中國臺灣已被中國臺灣衛(wèi)生部門批準(zhǔn)為保健食品，且樟芝保健食品在中國臺灣、日本和香港都已上市多年，并外銷大陸、日本、東南亞等地。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明研發(fā)了一種牛樟芝酵素產(chǎn)品，能夠改善牛樟芝的口感，提高牛樟芝的抗氧化性能，且服用更加方便，應(yīng)用前景廣闊。本發(fā)明提供了一種牛樟芝酵素及其制備方法。本發(fā)明首先提供了牛樟芝酵素的制備方法，步驟如下：(1)取牛樟芝，加入1～4倍量水，浸泡10～30分鐘，破碎打漿，得漿液，果膠酶酶解，分離取汁，滅菌，得酶解液；(2)在步驟(1)所得酶解液中，按重量比0.05～0.15％加入酵母菌，在溫度為20～30℃的條件下發(fā)酵12～36小時，得藥液；再在藥液中，按重量比2～6％加入乳酸菌，然后在溫度為30～40℃的條件下發(fā)酵12～60小時，得原液；(3)取步驟(2)所得原液，冷凍干燥，粉碎，即可。步驟(1)中，所述牛樟芝是牛樟芝antrodiacamphorata的干燥體。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：步驟(1)中，加入4倍量的水。步驟(1)中，所述滅菌的方式是煮沸10分鐘。步驟(1)中，所述果膠酶酶解的方法是：調(diào)解漿液ph至3～4，在45～50℃條件下，按重量比加入0.2～0.5％的果膠酶，酶解2～4小時；優(yōu)選地，所述分離取汁的分離方法是過濾。步驟(2)中，所述酵母菌為葡萄酒·果酒專用酵母rw。所述葡萄酒·果酒專用酵母rw可以購自安琪酵母股份有限公司，編號：80000877。步驟(2)中，所述乳酸菌是保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、青春雙歧桿菌中一種或數(shù)種混合菌。其中，保加利亞乳桿菌可以是來自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院的編號：bncc223619的保加利亞乳桿菌；嗜熱鏈球菌可以是來自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院的編號：bncc134430的嗜熱鏈球菌；嗜酸乳桿菌可以是來自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院的編號：bncc185342的嗜酸乳桿菌；青春雙歧桿菌可以是來自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院的編號：bncc186535的青春雙歧桿菌。步驟(2)中，所述乳酸菌是保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、青春雙歧桿菌中一種或數(shù)種混合菌；或者，所述酵母菌按照重量比0.10％的比例加入；或者，所述酵母菌發(fā)酵的溫度為20～28℃，優(yōu)選28℃；或者，所述酵母菌發(fā)酵的發(fā)酵時間可以為24～36h，優(yōu)選24h。步驟(2)中，所述乳酸菌發(fā)酵的接種量為優(yōu)選3～6％，最優(yōu)選4％；或者，所述乳酸菌發(fā)酵的發(fā)酵時間是30～60h，最優(yōu)選36h；或者，所述乳酸菌發(fā)酵的發(fā)酵溫度是35～40℃，優(yōu)選35℃。步驟(3)中，所述冷凍干燥的方法是-12～-36℃低溫預(yù)冷凍12-24小時，再在真空度20-30pa、溫度20-30℃條件下干燥24-48小時。本發(fā)明還提供了前述方法制備得到的牛樟芝酵素。本發(fā)明還提供了前述牛樟芝酵素在制備抗氧化或者提高免疫力的藥品、食品或者保健食品中的用途。本發(fā)明方法制備得到的牛樟芝酵素口感優(yōu)良，具有抗氧化性能和提高機(jī)體免疫力的作用，而且效果均顯著高于牛樟芝藥材，應(yīng)用前景優(yōu)良。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。具體實(shí)施方式實(shí)施例1本發(fā)明牛樟芝酵素的制備方法一、制備方法取牛樟芝，除去雜質(zhì)，洗凈，加入4倍量煮沸滅菌后冷卻的純凈水，浸泡30分鐘，破碎打漿。調(diào)節(jié)ph至3～4，在45～50℃條件下，按重量比加入0.2～0.5％的果膠酶，酶解2～4小時，分離取汁(過濾分離)，煮沸10分鐘滅菌，冷卻至室溫；按重量比0.05～0.15％加入酵母菌(采用的酵母菌為葡萄酒·果酒專用酵母rw，物料編號：80000877，來源：安琪酵母股份有限公司)，在溫度為20～30℃的條件下發(fā)酵12～36小時，分離上清液，再在藥液中，按重量比2～5％接種乳酸菌(嗜酸乳桿菌與青春雙歧桿菌的混合菌，嗜酸乳桿菌：編號:bncc185342，來源：北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；青春雙歧桿菌：bncc186535，來源：北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)，在溫度為30～35℃的條件下發(fā)酵12～60小時，離心，取上清液，灌裝，于4℃條件下保存，即得本發(fā)明的酵素原液；取原液，在-12～-36℃低溫預(yù)冷凍12～24小時，再在真空度20～30pa、溫度20～30℃條件下干燥24～48小時，粉碎，即得酵素凍干粉。實(shí)施例2本發(fā)明牛樟芝酵素的工藝篩選實(shí)驗(yàn)一、制備方法1、酵母菌發(fā)酵工藝研究取牛樟芝，除去雜質(zhì)，洗凈，加入4倍量煮沸滅菌后冷卻的純凈水，浸泡30分鐘，破碎打漿。調(diào)節(jié)ph至3～4，在45～50℃條件下，按重量比加入0.2～0.5％的果膠酶，酶解2～4小時，分離取汁，煮沸10分鐘，滅菌，冷卻至室溫，按下法進(jìn)行酵母菌單獨(dú)發(fā)酵工藝研究。1.1發(fā)酵時間對酵母菌數(shù)量和sod活性的影響發(fā)酵時間影響著酵母菌的數(shù)量和sod的活性，在保證充分溶氧的條件下，將發(fā)酵溫度設(shè)為25℃，酵母菌的接種量為0.1％，分別研究了在0，6，12，24，36，48和72h發(fā)酵后酵母菌數(shù)量、sod活性、糖度和ph的變化，結(jié)果如表1。表1發(fā)酵時間對酵母菌數(shù)量和sod活性的影響從表1可知，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液中的sod活性和酵母菌的數(shù)量不斷增加，發(fā)酵時間達(dá)到24h時酵母菌數(shù)量最大，此時sod活性為401.7u/g，糖度為12.0，隨后發(fā)酵液中的酵母菌數(shù)量開始下降，此時sod活性增趨于穩(wěn)定，而在此過程中ph一直在緩慢減少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，本發(fā)明發(fā)酵方法中，酵母菌發(fā)酵的發(fā)酵時間可以為12～36h，優(yōu)選24～36h，最優(yōu)選24h。1.2酵母菌接種量對酵母菌發(fā)酵的影響接種量會影響發(fā)酵液中酵母菌的生長，合適的接種量可以使生產(chǎn)菌在發(fā)酵過程中迅速生長，從而減少雜菌的生長機(jī)會，但是接種量過大也可能使菌種生長過快，導(dǎo)致培養(yǎng)液黏度過大，從而使溶氧不足，影響產(chǎn)物的合成。試驗(yàn)在保證充分溶氧的條件下，將發(fā)酵溫度設(shè)為25℃，發(fā)酵時間設(shè)為24h，酵母菌的接種量分別為0.05％，0.08％，0.10％，0.12％和0.15％，研究了在不同接種量時酵母菌數(shù)量、sod活性等相關(guān)指標(biāo)的變化，結(jié)果如表2。表2酵母菌接種量對酵母菌數(shù)量和sod活性的影響由表2可知，當(dāng)接種量在0.05％～0.10％時，酵母菌數(shù)量和sod活性明顯呈上升趨勢，當(dāng)接種量在0.10％時達(dá)到最大值，此時sod活性為401.7u/g，當(dāng)接種量在0.10％～0.15％時兩者有明顯下降，在整個發(fā)酵過程中ph和糖度變化趨勢不明顯，因此酵母菌的最佳接種量為0.10％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，本發(fā)明發(fā)酵方法中，酵母菌發(fā)酵的接種量可以為0.05～0.15％，優(yōu)選0.10％。1.3發(fā)酵溫度對酵母菌發(fā)酵的影響溫度會影響微生物細(xì)胞的生長的速率和產(chǎn)物形成、產(chǎn)物合成方向，因此它對酵母菌數(shù)量和sod活性有直接的影響。在保證充分溶氧的條件下，接種0.10％的酵母菌，發(fā)酵時間設(shè)為24h，研究不同發(fā)酵溫度下20℃，25℃，28℃，30℃和33℃酵母菌數(shù)量、sod活性等相關(guān)指標(biāo)的變化，結(jié)果如表3。表3發(fā)酵溫度對酵母菌數(shù)量和sod活性的影響由表3可知，在一定溫度范圍內(nèi)隨著溫度的升高，酵母菌數(shù)量和sod活性隨之增加，28℃下達(dá)到最大，此時sod活性為351.3u/g，在28℃～33℃2種顯著下降，但在整個溫度范圍內(nèi)糖度、ph趨于穩(wěn)定，變化不明顯。此時28℃可設(shè)為最佳發(fā)酵溫度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，本發(fā)明發(fā)酵方法中，酵母菌發(fā)酵的發(fā)酵溫度可以是20～28℃，優(yōu)選28℃。2、乳酸菌發(fā)酵工藝研究取牛樟芝，除去雜質(zhì)，洗凈，加入4倍量煮沸滅菌后冷卻的純凈水，浸泡30分鐘，破碎打漿。調(diào)節(jié)ph至3～4，在45～50℃條件下，按重量比加入0.2～0.5％的果膠酶，酶解2～4小時，分離取汁，煮沸10分鐘，滅菌，冷卻至室溫，按下法進(jìn)行乳酸菌單獨(dú)發(fā)酵工藝研究。2.1發(fā)酵時間對乳酸菌數(shù)量和酸度的影響在發(fā)酵溫度為35℃，接種量為3％的條件下，采用6，12，18，24，30，36，48和60h不同的發(fā)酵時間對牛樟芝液進(jìn)行發(fā)酵，根據(jù)產(chǎn)酸量和乳酸菌數(shù)量確定最佳發(fā)酵時間，結(jié)果見表4。表4發(fā)酵時間對乳酸菌數(shù)量和酸度的影響由表4可知，在發(fā)酵前12h內(nèi)產(chǎn)酸較慢，此時植物乳桿菌生長比較緩慢，可能與植物乳桿菌接種到新的環(huán)境有關(guān)，隨著發(fā)酵時間延長，乳酸含量不斷增加，在36h時，乳酸菌數(shù)開始下降，當(dāng)發(fā)酵36h時酸度達(dá)到最大值0.58％，可能是因?yàn)闋I養(yǎng)物質(zhì)有限，細(xì)胞進(jìn)入生長后期，基本停止產(chǎn)酸。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，本發(fā)明發(fā)酵方法中，乳酸菌發(fā)酵的發(fā)酵時間可以是12～60h，優(yōu)選30～60h，最優(yōu)選36h。2.2乳酸菌接種量的確定適當(dāng)增加接種量可以縮短甚至消除遲緩期，加快產(chǎn)酸速度，在發(fā)酵溫度為35℃，發(fā)酵時間為36h的條件下，采用1％，2％，3％，4％，5％和6％不同的接種量對棗液進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果如表5。表5乳酸菌接種量對乳酸菌數(shù)量和酸度的影響由表5可知，隨著接種量的增加，發(fā)酵液中乳酸含量呈上升趨勢，接種量為1％，2％和6％時的牛樟芝液經(jīng)36h發(fā)酵后產(chǎn)酸量小于0.30％，產(chǎn)酸較慢，達(dá)不到飲料生產(chǎn)的要求。接種量為3～5％時的牛樟芝液經(jīng)發(fā)酵后酸度能達(dá)到0.50％，隨后酸度呈下降趨勢，最佳接種量為4％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，本發(fā)明發(fā)酵方法中，乳酸菌發(fā)酵的接種量可以為2～6％，優(yōu)選3～6％，最優(yōu)選4％。2.3發(fā)酵溫度對乳酸菌發(fā)酵的影響在接種量為3％，發(fā)酵時間36h的條件下，研究25℃，30℃，35℃，40℃和43℃不同的發(fā)酵溫度對棗液進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果如表6。表6發(fā)酵溫度對乳酸菌數(shù)量和酸度的影響由表6可知，在整個溫度范圍內(nèi)，發(fā)酵液中乳酸含量隨著溫度的升高呈先升高后下降的趨勢，乳酸菌發(fā)酵牛樟芝液的最適溫度為30℃～35℃左右，此時乳酸含量都超過0.40％，在35℃下酸度高達(dá)0.58％，發(fā)酵溫度低，乳酸菌產(chǎn)酸緩慢，達(dá)到要求酸度的時間比較長；發(fā)酵溫度過高會抑制植物乳桿菌的生產(chǎn)，會產(chǎn)生刺激性較強(qiáng)的酸味，綜合考慮乳酸菌發(fā)酵的最適溫度為35℃。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，本發(fā)明發(fā)酵方法中，乳酸菌發(fā)酵的發(fā)酵溫度可以是30～40℃，優(yōu)選35～40℃，最優(yōu)選35℃。3、結(jié)論根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，確定牛樟芝酵素的最佳發(fā)酵工藝為：按重量比0.1％加入酵母菌，在溫度為28℃的條件下發(fā)酵24小時，分離上清液，再在藥液中，按重量比4％接種乳酸菌，在溫度為35℃的條件下發(fā)酵36小時，離心，取上清液，灌裝，于4℃條件下保存，即得本發(fā)明的酵素原液。實(shí)施例3本發(fā)明牛樟芝酵素的制備方法一、制備方法取牛樟芝，除去雜質(zhì)，洗凈，加入4倍量煮沸滅菌后冷卻的純凈水，浸泡30分鐘，破碎打漿。調(diào)節(jié)ph至3～4，在45～50℃條件下，按重量比加入0.2～0.5％的果膠酶，酶解2～4小時，分離取汁(過濾分離)，煮沸10分鐘，滅菌，冷卻至室溫；按重量比0.1％加入酵母菌，在溫度為28℃的條件下發(fā)酵24小時，分離上清液，再在藥液中，按重量比4％接種乳酸菌，在溫度為35℃的條件下發(fā)酵36小時，離心，取上清液，灌裝，于4℃條件下保存，即得本發(fā)明的酵素原液；取原液，在-12～-36℃低溫預(yù)冷凍12～24小時，再在真空度20～30pa、溫度20～30℃條件下干燥24～48小時，粉碎，即得酵素凍干粉。二、性質(zhì)檢測表7本發(fā)明牛樟芝酵素質(zhì)量評價結(jié)果*注：％指g/100g牛樟芝藥材。測定結(jié)果表明，本發(fā)明酵素與原藥材相比，口感更好，服用更方便，總多糖、乳酸菌等有益成分顯著增加，并且增加了sod活性。以下通過實(shí)驗(yàn)例的方式來證明本發(fā)明的有益效果：實(shí)驗(yàn)例1本發(fā)明牛樟芝酵素的藥效活性1.抗氧化功能1.1材料與儀器實(shí)驗(yàn)動物清潔級icr10月齡小鼠30只，體重(45±5)g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供；牛樟芝酵素凍干粉(自制)；牛樟芝菌，批號160701，由中山安蕎生物科技有限公司提供；丙二醛(mda)、超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽過氧化物酶(gsh－px)測試盒由南京建成生物工程研究所提供。動物臺秤，常熟雙杰測試儀器廠；dzkw-s-4型電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；tu-1810dp型紫外-可見分光光度儀，北京普析通用；tdl-40b離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1供試藥物溶液的制備(1)牛樟芝酵素凍干粉溶液：取凍干粉(按照實(shí)施例3的方法制備)，加蒸餾水適量溶解，制成每1ml含1g牛樟芝的混懸液，備用。(2)牛樟芝藥材溶液：取牛樟芝藥材，粉碎成粗粉，加8倍量水煎煮2次，每次30分鐘，濾過，合并濾液，濃縮成每1ml含1g牛樟芝的混懸液，備用。1.2.2動物分組及給藥方法實(shí)驗(yàn)前，小鼠稱重后眼眶取血，分離血清，按試劑盒說明書測定血清中的mda含量。按mda水平將小鼠分為老齡對照組、牛樟芝酵素組、牛樟芝藥材組(5g/kg·bw劑量的牛樟芝液給老齡小鼠灌胃)三個組。實(shí)驗(yàn)時按所設(shè)劑量進(jìn)行灌胃給藥，連續(xù)30d。1.2.3觀察指標(biāo)及檢測方法(1)一般體征觀察。實(shí)驗(yàn)期間觀察小鼠的精神、活動和毛色。(2)血清脂質(zhì)過氧化指標(biāo)的測定。末次給藥后小鼠摘眼球取血，置于試管中，離心(4000r/min，10min)，分離血清測mda含量。mda含量測定采用硫代巴比妥酸(tba)比色法。(3)組織勻漿抗氧化酶活力的測定。末次給藥后，小鼠摘眼球取血后處死小鼠，立即取新鮮肝臟組織塊(0.2～1g)，除去血液，濾紙拭干，稱重，加入9倍重量的冷生理鹽水，用組織勻漿機(jī)制成10％勻漿液，檢測sod活力。sod活力測定采用鄰苯三酚氧化法。1.2.4實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)所測定指標(biāo)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用spss10.0軟件中的t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。1.3結(jié)果與分析1.3.1一般體征觀察結(jié)果給予牛樟芝酵素和牛樟芝提取液30d的組，小鼠反應(yīng)靈敏、行動靈活、毛色光亮；老齡對照組反應(yīng)遲滯、行動緩慢、毛色粗糙。1.3.2牛樟芝對老齡小鼠血清過氧化脂質(zhì)的影響給予牛樟芝藥材和牛樟芝酵素30d后，各組與對照組比較血清mda含量降低，差異有顯著性；牛樟芝酵素與牛樟芝藥材組比較，差異也具顯著性，見表8。表8牛樟芝提取物對老齡小鼠血清mda含量的影響注：與對照組比較，**p＜0.01；與牛樟芝藥材組比較△p＜0.051.3.3牛樟芝對老齡小鼠肝組織勻漿中超氧化物歧化酶(sod)活力的影響給予牛樟芝藥材和牛樟芝酵素30d后，各組與對照組比較，肝組織中sod活力升高差異有顯著性；牛樟芝酵素與牛樟芝藥材組比較，差異也具顯著性，見表9。表9牛樟芝提取物對老齡小鼠血清mda含量的影響劑量組動物數(shù)(只)sod活力(nu/ml)對照組1090.83±8.23牛樟芝藥材組10120.13±6.27**牛樟芝酵素組10145.76±7.52**△注：與對照組比較，**p＜0.01；與牛樟芝藥材組比較△p＜0.051.4結(jié)論本發(fā)明制得的牛樟芝酵素，能顯著增強(qiáng)衰老小鼠的抗氧化能力，延緩小鼠的衰老。效果也明顯優(yōu)于牛樟芝藥材。2.增強(qiáng)免疫力功能2.1材料與儀器實(shí)驗(yàn)動物清潔級昆明種小鼠30只，雌雄各半，體重(20±2)g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供；牛樟芝酵素凍干粉(自制)；牛樟芝菌，批號160701，由中山安蕎生物科技有限公司提供；二硝基氟苯(dnfb)，丙酮，麻油，硫化鈉，0.1％na2co3溶液，印度墨水，血清白介素－2(il－2)elisa測定試劑盒(rapidbio公司產(chǎn)品)。動物臺秤，常熟雙杰測試儀器廠；dzkw-s-4型電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；tu-1810dp型紫外-可見分光光度儀，北京普析通用；tdl-40b離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1供試藥物溶液的制備(1)牛樟芝酵素凍干粉溶液：取凍干粉，加蒸餾水適量溶解，制成每1ml含1g牛樟芝的混懸液，備用。(2)牛樟芝藥材溶液：取牛樟芝藥材，粉碎成粗粉，加8倍量水煎煮2次，每次30分鐘，濾過，合并濾液，濃縮成每1ml含1g牛樟芝的混懸液，備用。2.2.2動物分組及給藥方法實(shí)驗(yàn)前，小鼠隨機(jī)分為3組，分別為空白對照組、牛樟芝酵素組、牛樟芝藥材組，每組10只。牛樟芝酵素組、牛樟芝藥材組按5g/kg·bw劑量灌胃給藥，空白對照組給予等體積的生理鹽水。連續(xù)給藥10d。2.2.3觀察指標(biāo)及檢測方法(1)免疫器官指數(shù)：頸椎脫臼處死小鼠，取小鼠胸腺和脾臟，電子天平稱重，計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。胸腺指數(shù)＝胸腺重量/體重；脾臟指數(shù)＝脾臟重量/體重。(2)免疫功能檢測:①小鼠碳廓清試驗(yàn):按100ml/kg體重從小鼠尾靜脈注入稀釋4倍的印度墨汁，注入墨汁后2、10min分別從眼內(nèi)眥靜脈叢取血20μl，并將其加到0.1％na2co3溶液2ml中，在600nm波長處測光密度值(od)，以0.1％na2co3溶液作空白對照。按下式分別計(jì)算廓清指數(shù)(k)。k＝(lgod1－lgod2)/(t2－t1)。②遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)測定:小鼠腹部用硫化鈉脫毛，范圍約3cm×3cm，用10mg/mldnfb溶液50μl均勻涂抹致敏。5d后用10mg/mldnfb溶液10μl均勻涂抹于小鼠右耳(兩面)進(jìn)行攻擊。攻擊后24h頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼，用打孔器取下直徑8mm耳片，稱重，以左右兩耳片重量之差為遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)值。(3)血清il－2測定：眼眶取血1.5ml，靜置30min，2500r/min離心15min，取上置血清。采用elisa測定法測定血清il－2的含量，所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。2.2.4實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)所測定指標(biāo)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用spss10.0軟件中的t分析進(jìn)行檢驗(yàn)。2.3結(jié)果與分析2.3.1免疫器官指數(shù)比較與空白對照組比較，牛樟芝藥材組、牛樟芝酵素組胸腺和脾臟臟器指數(shù)均有增加(p＜0.01，p＜0.05)；與牛樟芝藥材組比較，牛樟芝酵素胸腺和脾臟臟器指數(shù)明顯增加(p＜0.05),結(jié)果見表10。表明牛樟芝酵素組作用最優(yōu)。表10各組小鼠胸腺和脾臟臟器指數(shù)比較組別動物數(shù)(只)胸腺臟器指標(biāo)(mg/g)脾臟臟器指數(shù)(mg/g)空白對照組103.27±0.357.35±0.11牛樟芝藥材組104.57±0.42**8.43±0.22**牛樟芝酵素組105.37±0.35**△9.16±0.40**△注：與對照組比較，**p＜0.01；與牛樟芝藥材組比較△p＜0.052.3.2碳廓清能力比較與空白對照組比較，牛樟芝藥材組碳廓清指數(shù)無明顯差異(p＞0.05)，而酵素組碳廓清指數(shù)則顯著提高(p＜0.05)。表明酵素組促進(jìn)小鼠碳粒廓清的能力明顯高于其它各組，即明顯提高小鼠的非特異性免疫功能，見表11。表11各組小鼠碳廓清能力比較組別動物數(shù)(只)廓清指數(shù)空白對照組105.26±1.02牛樟芝藥材組106.01±0.22牛樟芝酵素組107.8±0.43*△注：與對照組比較，*p＜0.05；與牛樟芝藥材組比較△p＜0.052.3.3遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)測定結(jié)果與空白對照組比較，牛樟芝藥材組和牛樟芝酵素組小鼠左右耳廓差重明顯縮小(p＜0.05，p＜0.01)；與牛樟芝藥材組比較，牛樟芝酵素組小鼠左右耳廓差重明顯縮小(p＜0.05)，見表12。結(jié)果顯示牛樟芝藥材及牛樟芝酵素組均能促進(jìn)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，牛樟芝酵素組效果最優(yōu)。表12左右耳廓重量之差比較組別動物數(shù)(只)耳廓增重(mg)空白對照組101.77±1.02牛樟芝藥材組101.01±0.31*牛樟芝酵素組100.61±0.25**△注：與對照組比較，*p＜0.05，*p＜0.05；與牛樟芝藥材組比較△p＜0.052.3.4血清il－2含量比較與空白對照組比較，牛樟芝藥材組、牛樟芝酵素組血清il-2含量明無明顯差異(p＞0.05；p＞0.01)；與牛樟芝藥材組比較，牛樟芝酵素組血清il-2含量明顯增加(p＜0.05)，見表13。結(jié)果顯示牛樟芝酵素組效果最優(yōu)。表13血清il-2含量比較組別動物數(shù)(只)血清il-2含量(ng/ml)空白對照組1012.34±3.75牛樟芝藥材組1015.82±0.93*牛樟芝酵素組1017.94±2.17*△注：與對照組比較，*p＜0.05；與牛樟芝藥材組比較△p＜0.052.4結(jié)論本發(fā)明制得的牛樟芝酵素，能顯著增強(qiáng)小鼠的免疫能力，效果也明顯優(yōu)于牛樟芝藥材。綜上，本發(fā)明方法制備得到了牛樟芝酵素，其口感優(yōu)良，抗氧化作用強(qiáng)，可以提高機(jī)體免疫力，且顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的牛樟芝藥材，可用于制備具有抗氧化作用和提高機(jī)體免疫力的藥品、食品或者保健食品，應(yīng)用前景優(yōu)良。當(dāng)前第1頁12