一種提高尼莫克汀發(fā)酵產(chǎn)量的方法
【專利摘要】一種提高尼莫克汀發(fā)酵產(chǎn)量的方法，包括以下步驟：A、選取出發(fā)菌株；B、菌株斜面培養(yǎng)；C、菌株種瓶培養(yǎng)；D、種子罐培養(yǎng)；E、發(fā)酵罐培養(yǎng)。本發(fā)明的一種提高尼莫克汀發(fā)酵產(chǎn)量的方法，通過在發(fā)酵中后期單次或多次補(bǔ)加乙酸鈉，實(shí)現(xiàn)了尼莫克汀產(chǎn)量的大幅度提升。
CGMCC No.6217
20120614
【專利說明】一種提高尼莫克訂發(fā)酵產(chǎn)量的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及尼莫克汀的發(fā)酵生產(chǎn)，具體涉及一種提高尼莫克汀發(fā)酵產(chǎn)量的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]尼莫克汀是由產(chǎn)色鏈霉菌或者藍(lán)灰鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的一種十六元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，它主要用于合成親脂性更強(qiáng)的莫西克汀。尼莫克汀主要用于合成活性更強(qiáng)的農(nóng)藥獸藥莫西克汀(Moxidectin)。莫西克汀20世紀(jì)80年代中期以來開始作為獸用驅(qū)蟲藥使用，能夠高效的殺滅線蟲和體表寄生蟲，同時(shí)對(duì)動(dòng)物有很好的安全性，是目前被廣泛用于獸醫(yī)臨床的廣譜、高效、新型大環(huán)內(nèi)酯類驅(qū)蟲抗生素。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中尼莫克汀的產(chǎn)量低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足工業(yè)需求?，F(xiàn)有技術(shù)中提高尼莫克汀的方法有選取高產(chǎn)的菌株、補(bǔ)糖、添加氨基酸或其它營(yíng)養(yǎng)成分等等，例如，申請(qǐng)?zhí)枮?01110242857.0的專利《一種發(fā)酵生產(chǎn)尼莫克汀的方法》中公開了 “在發(fā)酵生產(chǎn)尼莫克汀的過程中，當(dāng)發(fā)酵液中的總糖濃度低于30g/L時(shí)，通過向發(fā)酵液間歇或連續(xù)補(bǔ)加糖類物質(zhì)，使發(fā)酵液中的總糖濃度控制在10_40g/L進(jìn)行發(fā)酵”，通過間隙或連續(xù)補(bǔ)糖來提高尼莫克汀的產(chǎn)量，但是其效果依然不理想，在發(fā)酵過程中存在葡萄糖代謝阻遏效應(yīng)，而葡萄糖對(duì)尼莫克汀的產(chǎn)量有著關(guān)鍵性的影響，因而，雖然可通過補(bǔ)糖來提高尼莫克汀產(chǎn)量，但是具有一定的局限性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中尼莫克汀的產(chǎn)量低、發(fā)酵結(jié)束時(shí)的產(chǎn)量有待提高的技術(shù)問題，提供利用一種可以提高尼莫克汀發(fā)酵產(chǎn)量的方法。
[0005]本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)其目的采用的技術(shù)方案是:
[0006]一種提高尼莫克汀發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0007]A、選取出發(fā)菌株:選取一株乙酸鈉抗性產(chǎn)色鏈霉菌突變株，所述的一株乙酸鈉抗性產(chǎn)色鏈霉菌突變株的分類名稱為產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces cyanneorisens)DC18_01，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)，保藏編號(hào)為CGMCC N0.6217，保藏日期為2012年6月14日；
[0008]B、菌株斜面培養(yǎng):將產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces cyanneorisens)DC18-01接種于斜面培養(yǎng)基，于26-30°C、30% -60%濕度條件下培養(yǎng)96_144h，得到斜面菌種；
[0009]C、菌株種瓶培養(yǎng):挖取2-5cm2步驟B制備的斜面菌種接種于種瓶培養(yǎng)基中，于26-30 0C，220-240rpm震蕩培養(yǎng)24_30h，得到成熟種液；
[0010]D、種子罐培養(yǎng):將步驟C得到的成熟種液以體積比0.05%接種量接種至種子罐培養(yǎng)基中，控制培養(yǎng)溫度為27.5-28.5°C，罐壓為0.03-0.05MPa，培養(yǎng)過程中的溶氧控制在25%以上，得到種瓶培養(yǎng)液；
[0011]E、發(fā)酵罐培養(yǎng):將步驟D得到的種瓶培養(yǎng)液以體積比10%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制發(fā)酵罐溫度為27.5-28.5°C，罐壓為0.03-0.05MPa，發(fā)酵液中的溶氧控制在60%以上，葡萄糖濃度控制在0.5-2.0g/mL，在發(fā)酵150h之后至少一次向發(fā)酵液中補(bǔ)加濃度為10-20mg/L的乙酸鈉溶液，共補(bǔ)加1-2%體積比的乙酸鈉，在發(fā)酵260_280h停止補(bǔ)糖，當(dāng)葡萄糖濃度低于0.2g/mL時(shí)停止發(fā)酵，制得含有尼莫克汀的發(fā)酵液。
[0012]所述的步驟E發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中在發(fā)酵開始后168h補(bǔ)入乙酸鈉溶液。
[0013]所述的步驟E發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中在發(fā)酵開始后168h、216h補(bǔ)入乙酸鈉溶液。
[0014]所述的步驟E發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中在發(fā)酵開始后156h、192h和228h補(bǔ)入乙酸鈉溶液。
[0015]步驟B所述的斜面培養(yǎng)基成分及用量(g/100mL)為:葡萄糖0.3_0.5、麥芽糖0.1-0.15、酵母膏或酵母粉0.3-0.5、淀粉0.4-0.6、黃豆餅粉0.4-0.6、糊精0.4-0.6、磷酸氫二鉀 0.01-0.03、瓊脂 1-2。
[0016]步驟C所述的種瓶培養(yǎng)基成分及用量(g/100mL)為:葡萄糖0.5_2、糊精1_3、黃豆餅粉1-2、酵母膏或酵母粉1-2、硫酸鎂0.05-0.2、磷酸氫二鉀0.05-0.2。
[0017]步驟D所述的種子罐培養(yǎng)基成分及用量(g/100mL)為:葡萄糖2_3、黃豆餅粉1_2、酵母膏或酵母粉1-2、硫酸鎂0.05-0.2、磷酸氫二鉀0.05-0.2。
[0018]步驟E所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及用量(g/100mL)為:葡萄糖4_6，黃豆餅粉2.5-3.5，酵母粉 0.3-0.5，硫酸鎂 0.8-1.2，碳酸鈣 0.2-0.4。
[0019]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的一種提高尼莫克汀發(fā)酵產(chǎn)量的方法，通過在發(fā)酵中后期單次或多次補(bǔ)加乙酸鈉，實(shí)現(xiàn)了尼莫克汀產(chǎn)量的大幅度提升。在研宄的過程中，面對(duì)如何克服發(fā)酵液中乙酸鈉含量高而對(duì)尼莫克汀的合成酶系產(chǎn)生抑制作用的困難時(shí)，其中的困惑是難以想象的，我們經(jīng)過了長(zhǎng)期的創(chuàng)造性研宄，克服種種困難，這個(gè)過程是艱難的但是其成功性的研宄對(duì)尼莫克汀的發(fā)展具有重大意義的。
[0020]從尼莫克汀的合成原理上講，乙酸鈉作為尼莫克汀的一種前體物質(zhì)，其添加量對(duì)尼莫克汀的產(chǎn)量起到關(guān)鍵性的作用，乙酸鈉被菌絲體利用后產(chǎn)生NaOH，使發(fā)酵液pH值升高，而發(fā)酵液PH值過高不僅不利于菌體的生長(zhǎng)，而且抑制尼莫克汀的合成，從圖1現(xiàn)有技術(shù)乙酸鈉對(duì)尼莫克汀產(chǎn)量影響規(guī)律的研宄中表明乙酸鈉添加量從0-0.2%時(shí)，尼莫克汀產(chǎn)量持續(xù)上升，當(dāng)乙酸鈉添加量超過0.2%時(shí)，菌體濃度下降，尼莫克汀的產(chǎn)量也急劇下降，原因在于發(fā)酵液中乙酸鈉濃度升高對(duì)尼莫克汀的合成酶系產(chǎn)生抑制作用。而我們通過長(zhǎng)期的研宄，打破常規(guī)，增加乙酸鈉的添加量，本以為會(huì)因?yàn)楦咛砑恿康囊宜徕c對(duì)尼莫克汀的合成酶系產(chǎn)生抑制作用，出乎意料的，尼莫克汀的產(chǎn)量不僅沒有下降，反而有了大幅度的提升，克服了現(xiàn)有技術(shù)乙酸鈉添加量超過0.2%尼莫克汀的產(chǎn)量急劇下降的技術(shù)偏見。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是乙酸鈉對(duì)尼莫克汀產(chǎn)量的影響規(guī)律

【具體實(shí)施方式】
[0022]本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中尼莫克汀的產(chǎn)量低、發(fā)酵結(jié)束時(shí)的產(chǎn)量有待提高的技術(shù)問題，提供利用一種可以提高尼莫克汀發(fā)酵產(chǎn)量的方法。下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0023]實(shí)施例1.1.5T發(fā)酵罐發(fā)酵過程中不補(bǔ)加乙酸鈉
[0024]A、選取出發(fā)菌株:選取一株乙酸鈉抗性產(chǎn)色鏈霉菌突變株，所述的一株乙酸鈉抗性產(chǎn)色鏈霉菌突變株的分類名稱為產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces cyanneorisens)DC18-01，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)，保藏編號(hào)為CGMCC N0.6217，保藏日期為2012年6月14日；
[0025]B、菌株斜面培養(yǎng):將產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces cyanneorisens)DC18-01接種于斜面培養(yǎng)基，于26-30°C、30% -60%濕度條件下培養(yǎng)96_144h，得到斜面菌種；
[0026]C、菌株種瓶培養(yǎng):挖取2-5cm2步驟B制備的斜面菌種接種于種瓶培養(yǎng)基中，于26-30 0C，220-240rpm震蕩培養(yǎng)24_30h，得到成熟種液；
[0027]D、種子罐培養(yǎng):將步驟C得到的成熟種液以體積比0.05%接種量接種至種子罐培養(yǎng)基中，控制培養(yǎng)溫度為27.5-28.5°C，罐壓為0.03-0.05MPa，培養(yǎng)過程中的溶氧控制在25%以上，得到種瓶培養(yǎng)液；
[0028]E、發(fā)酵罐培養(yǎng):在1.5T發(fā)酵罐中配置0.9T發(fā)酵培養(yǎng)基，120°C滅菌20min后冷卻至27.5-28.5°C，將步驟D得到的種瓶培養(yǎng)液以體積比10%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制發(fā)酵罐溫度為27.5-28.5°C，罐壓為0.03-0.05MPa，發(fā)酵過程中溶氧控制在60%以上，葡萄糖濃度控制在0.5-2.0g/mL，在發(fā)酵260h停止補(bǔ)糖，當(dāng)葡萄糖濃度低于0.2g/mL時(shí)停止發(fā)酵，制得含有尼莫克汀的發(fā)酵液，測(cè)定最后發(fā)酵產(chǎn)量為2560mg/L。
[0029]實(shí)施例2.1.5T發(fā)酵罐發(fā)酵過程中發(fā)酵開始后168h補(bǔ)加乙酸鈉
[0030]A、選取出發(fā)菌株:選取一株乙酸鈉抗性產(chǎn)色鏈霉菌突變株，所述的一株乙酸鈉抗性產(chǎn)色鏈霉菌突變株的分類名稱為產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces cyanneorisens)DC18-01，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)，保藏編號(hào)為CGMCC N0.6217，保藏日期為2012年6月14日；
[0031]B、菌株斜面培養(yǎng):將產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces cyanneorisens)DC18-01接種于斜面培養(yǎng)基，于26-30°C、30% -60%濕度條件下培養(yǎng)96_144h，得到斜面菌種；
[0032]C、菌株種瓶培養(yǎng):挖取2-5cm2步驟B制備的斜面菌種接種于種瓶培養(yǎng)基中，于26-30 0C，220-240rpm震蕩培養(yǎng)24_30h，得到成熟種液；
[0033]D、種子罐培養(yǎng):將步驟C得到的成熟種液以體積比0.05%接種量接種至種子罐培養(yǎng)基中，控制培養(yǎng)溫度為27.5-28.5°C，罐壓為0.03-0.05MPa，培養(yǎng)過程中的溶氧控制在25%以上，得到種瓶培養(yǎng)液；
[0034]E、發(fā)酵罐培養(yǎng):在1.5T發(fā)酵罐中配置0.9T發(fā)酵培養(yǎng)基，120°C滅菌20min后冷卻至27.5-28.5°C，將步驟D得到的種瓶培養(yǎng)液以體積比10%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制發(fā)酵罐溫度為27.5-28.5°C，罐壓為0.03-0.05MPa，發(fā)酵過程中溶氧控制在60%以上，葡萄糖濃度控制在0.5-2.0g/mL，在發(fā)酵開始后168h補(bǔ)入10L濃度為10mg/L的乙酸鈉溶液，在發(fā)酵260h停止補(bǔ)糖，當(dāng)葡萄糖濃度低于0.2g/mL時(shí)停止發(fā)酵，制得含有尼莫克汀的發(fā)酵液，測(cè)定最后發(fā)酵產(chǎn)量為2980mg/L。
[0035]實(shí)施例3.12T發(fā)酵罐發(fā)酵過程中發(fā)酵開始后168h、216h補(bǔ)加乙酸鈉A、選取出發(fā)菌株:選取一株乙酸鈉抗性產(chǎn)色鏈霉菌突變株，所述的一株乙酸鈉抗性產(chǎn)色鏈霉菌突變株的分類名稱為產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces cyanneorisens)DC18-01，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)，保藏編號(hào)為CGMCC N0.6217，保藏日期為2012年6月14日；
[0036]B、菌株斜面培養(yǎng):將產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces cyanneorisens)DC18-01接種于斜面培養(yǎng)基，于26-30°C、30% -60%濕度條件下培養(yǎng)96_144h，得到斜面菌種；
[0037]C、菌株種瓶培養(yǎng):挖取2-5cm2步驟B制備的斜面菌種接種于種瓶培養(yǎng)基中，于26-30 0C，220-240rpm震蕩培養(yǎng)24_30h，得到成熟種液；
[0038]D、種子罐培養(yǎng):將步驟C得到的成熟種液以體積比0.05%接種量接種至種子罐培養(yǎng)基中，控制培養(yǎng)溫度為27.5-28.5°C，罐壓為0.03-0.05MPa，培養(yǎng)過程中的溶氧控制在25%以上，得到種瓶培養(yǎng)液；
[0039]E、發(fā)酵罐培養(yǎng):在12T發(fā)酵罐中配置7.5T發(fā)酵培養(yǎng)基，120°C滅菌20min后冷卻至27.5-28.5°C，將步驟D得到的種瓶培養(yǎng)液以體積比10%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制發(fā)酵罐溫度為27.5-28.5°C，罐壓為0.03-0.05MPa，發(fā)酵過程中溶氧控制在60%以上，葡萄糖濃度控制在0.5-2.0g/mL,在發(fā)酵開始后168h和216h時(shí)分別補(bǔ)入50L和70L濃度為15mg/L的乙酸鈉溶液，在發(fā)酵276h停止補(bǔ)糖，當(dāng)葡萄糖濃度低于0.2g/mL時(shí)停止發(fā)酵，制得含有尼莫克汀的發(fā)酵液，測(cè)定最后發(fā)酵產(chǎn)量為3343mg/L。
[0040]實(shí)施例4.12T發(fā)酵罐發(fā)酵過程中發(fā)酵開始后156h、192h和228h補(bǔ)加乙酸鈉
[0041]A、選取出發(fā)菌株:選取一株乙酸鈉抗性產(chǎn)色鏈霉菌突變株，所述的一株乙酸鈉抗性產(chǎn)色鏈霉菌突變株的分類名稱為產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces cyanneorisens)DC18-01，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)，保藏編號(hào)為CGMCC N0.6217，保藏日期為2012年6月14日；
[0042]B、菌株斜面培養(yǎng):將產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces cyanneorisens)DC18-01接種于斜面培養(yǎng)基，于26-30°C、30% -60%濕度條件下培養(yǎng)96_144h，得到斜面菌種；
[0043]C、菌株種瓶培養(yǎng):挖取2-5cm2步驟B制備的斜面菌種接種于種瓶培養(yǎng)基中，于26-30 0C，220-240rpm震蕩培養(yǎng)24_30h，得到成熟種液；
[0044]D、種子罐培養(yǎng):將步驟C得到的成熟種液以體積比0.05%接種量接種至種子罐培養(yǎng)基中，控制培養(yǎng)溫度為27.5-28.5°C，罐壓為0.03-0.05MPa，培養(yǎng)過程中的溶氧控制在25%以上，得到種瓶培養(yǎng)液；
[0045]E、發(fā)酵罐培養(yǎng):在12T發(fā)酵罐中配置7.5T發(fā)酵培養(yǎng)基，120°C滅菌20min后冷卻至27.5-28.5°C，將步驟D得到的種瓶培養(yǎng)液以體積比10%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制發(fā)酵罐溫度為27.5-28.5°C，罐壓為0.03-0.05MPa，發(fā)酵過程中溶氧控制在60%以上，葡萄糖濃度控制在0.5-2.0g/mL，在發(fā)酵開始后156h、192h和228h時(shí)分別補(bǔ)入60L、40L和60L濃度為20mg/L的乙酸鈉溶液，在發(fā)酵264h停止補(bǔ)糖，當(dāng)葡萄糖濃度低于0.2g/mL時(shí)停止發(fā)酵，制得含有尼莫克汀的發(fā)酵液，測(cè)定最后發(fā)酵產(chǎn)量為3690mg/L。
【權(quán)利要求】
1.一種提高尼莫克汀發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于，包括以下步驟: A、選取出發(fā)菌株:選取一株乙酸鈉抗性產(chǎn)色鏈霉菌突變株，所述的一株乙酸鈉抗性產(chǎn)色鏈霉菌突變株的分類名稱為產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces cyanneorisens)DC18_01，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)，保藏編號(hào)為CGMCC N0.6217，保藏日期為2012年6月14曰； B、菌株斜面培養(yǎng):將產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycescyanneorisens)DC18-01接種于斜面培養(yǎng)基，于26-30°C、30% -60%濕度條件下培養(yǎng)96_144h，得到斜面菌種； C、菌株種瓶培養(yǎng):挖取2-5cm2步驟B制備的斜面菌種接種于種瓶培養(yǎng)基中，于26-30 0C，220-240rpm震蕩培養(yǎng)24_30h，得到成熟種液； D、種子罐培養(yǎng):將步驟C得到的成熟種液以體積比0.05%接種量接種至種子罐培養(yǎng)基中，控制培養(yǎng)溫度為27.5-28.5°C，罐壓為0.03-0.05MPa，培養(yǎng)過程中的溶氧控制在25%以上，得到種瓶培養(yǎng)液； E、發(fā)酵罐培養(yǎng):將步驟D得到的種瓶培養(yǎng)液以體積比10%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制發(fā)酵罐溫度為27.5-28.5°C，罐壓為0.03-0.05MPa，發(fā)酵液中的溶氧控制在60%以上，葡萄糖濃度控制在0.5-2.0g/mL，在發(fā)酵150h之后至少一次向發(fā)酵液中補(bǔ)加濃度為10-20mg/L的乙酸鈉溶液，共補(bǔ)加1-2%體積比的乙酸鈉，在發(fā)酵260_280h停止補(bǔ)糖，當(dāng)葡萄糖濃度低于0.2g/mL時(shí)停止發(fā)酵，制得含有尼莫克汀的發(fā)酵液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高尼莫克汀發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于:所述的步驟E發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中在發(fā)酵開始后168h補(bǔ)入乙酸鈉溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高尼莫克汀發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于:所述的步驟E發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中在發(fā)酵開始后168h、216h補(bǔ)入乙酸鈉溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高尼莫克汀發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于:所述的步驟E發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中在發(fā)酵開始后156h、192h和228h補(bǔ)入乙酸鈉溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高尼莫克汀發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于:步驟B所述的斜面培養(yǎng)基成分及用量(g/100mL)為:葡萄糖0.3-0.5、麥芽糖0.1-0.15、酵母膏或酵母粉0.3-0.5、淀粉0.4-0.6、黃豆餅粉0.4-0.6、糊精0.4-0.6、磷酸氫二鉀0.01-0.03、瓊脂1-2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高尼莫克汀發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于:步驟C所述的種瓶培養(yǎng)基成分及用量(g/100mL)為:葡萄糖0.5-2、糊精1-3、黃豆餅粉1_2、酵母膏或酵母粉1-2、硫酸鎂0.05-0.2、磷酸氫二鉀0.05-0.2。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高尼莫克汀發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于:步驟D所述的種子罐培養(yǎng)基成分及用量(g/100mL)為:葡萄糖2-3、黃豆餅粉1_2、酵母膏或酵母粉1-2、硫酸鎂 0.05-0.2、磷酸氫二鉀 0.05-0.2。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高尼莫克汀發(fā)酵產(chǎn)量的方法，其特征在于:步驟E所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及用量(g/100mL)為:葡萄糖4-6，黃豆餅粉2.5-3.5，酵母粉.0.3-0.5，硫酸鎂 0.8-1.2，碳酸鈣 0.2-0.4。
【文檔編號(hào)】C12R1/465GK104450823SQ201410787858
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月18日
【發(fā)明者】李明, 楊麗鋒 申請(qǐng)人:河北圣雪大成制藥有限責(zé)任公司