染色體分子標(biāo)記及用途
【專利摘要】本發(fā)明屬于作物分子遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及希爾斯山羊草2Ss染色體分子標(biāo)記的建立，12個新標(biāo)記的序列如序列表中序列1-24所示。還涉及這些分子標(biāo)記在跟蹤檢測小麥背景中希爾斯山羊草染色體方面的應(yīng)用。分子標(biāo)記篩選與鑒定雜交后代的結(jié)果與基因組原位雜交結(jié)果一致性為100%，因此，本發(fā)明獲得的特異分子標(biāo)記不僅可用于雜交群體的篩選與鑒定，還可以用于輔助選育籽粒微量元素高且抗小麥白粉病的小麥新品系/品種。
【專利說明】基于小麥和水稻EST序列的希爾斯山羊草2SS染色體分子 標(biāo)記及用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于作物分子遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及利用小麥和水稻EST序列來建立 的希爾斯山羊草2^染色體分子標(biāo)記的內(nèi)容，還涉及這些分子標(biāo)記在跟蹤檢測小麥背景中 希爾斯山羊草染色體方面的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 六倍體小麥（friiicw? aesiira? L.，2n=42,基因組AABBDD)是世界最主要的糧 食作物之一。提高小麥產(chǎn)量和改良其品質(zhì)是小麥育種的重要內(nèi)容，然而，二者均受到生物或 非生物脅迫的影響。小麥遠源物種中含有豐富的可以應(yīng)用于小麥育種的優(yōu)異農(nóng)藝性狀基 因。遠緣雜交可以將來自小麥外源物種的優(yōu)異基因?qū)胄←湥鄳?yīng)基因的導(dǎo)入可以大大改 良小麥對生物或非生物脅迫的抗性。小麥的遠源物種黑麥（fecah cereal 2n=14,基因組 RR)是在小麥育種中應(yīng)用最為成功的范例之一。導(dǎo)入栽培小麥的小麥-黑麥IRS. IBL易位 系因為含有抗小麥條銹病基因久抗葉銹病基因 ΖΠ 、抗桿銹病基因和抗白粉病基 因 /--大大提高了我國小麥產(chǎn)量和抗性，因此，受到了育種家們的普遍青睞。據(jù)報道，我國 約有70%的小麥品種含有該易位系。由于長期的品種間雜交選育導(dǎo)致我國小麥品種抗源日 趨單一化和遺傳變異范圍縮小，從而使小麥群體遺傳多樣性喪失并且使得各種病害加重。 此外，由于強毒性致病生理小種及其變種的產(chǎn)生與流行，使得包括/^9、7r7-7r< 7r久 辟P 在內(nèi)的白粉病、條銹病和桿銹病等抗性基因的抗性喪失。2014年， 我國約有1. 3億畝小麥感染紋枯病，I. 0億畝小麥感染小麥白粉病，3000萬畝小麥感染條銹 病，導(dǎo)致小麥大面積減產(chǎn)造成直接經(jīng)濟損失達上百億元人民幣。所以，加強對不同小麥遠源 物種中抗性基因的挖掘并應(yīng)用小麥育種工作中進行可持續(xù)抗源多樣化育種工作對我國糧 食安全具有重要意義。
[0003] 希爾斯山羊草（2n=14，基因組SsSs),是小麥的遠源物種，高抗小麥葉銹病和白粉 病、高抗小麥桿銹病和禾谷類二叉蚜、對干旱和鹽脅迫也有較好的抗性。因此，該種質(zhì)中 的優(yōu)異基因值得進一步向小麥轉(zhuǎn)移。Friebe等（Friebe B, Tuleen NA, and Gill BS. Standard karyotype of Triticum searsii and its relationship with other S-genome species and common wheat. Theor Appl Genet, 1995，91(2) :248-254.)鑒定了一整 套中國春-希爾斯山羊草附加系，為定位優(yōu)異基因在染色體上的位置提供了研究材料。 以這套附加系為工具，Garg 等（Garg M，Tanaka H，Ishikawa N，Takata K，Yanaka Mj Tsujimoto H. A novel pair of HMW glutenin subunits from Aegilops searsii improves quality of hexaploid wheat. Cereal Chemistry，2009，86:26-321.)將顯 著提高小麥品質(zhì)的相關(guān)基因定位在希爾斯山羊草ISs染色體上；Buloichik等（Buloichik AA j Borzyak VSj Voluevich EA. Influence of alien chromosomes on the resistance of soft wheat to biotrophic fungal pathogens. Cytol Genet， 2008， 42:9-15.)將 抗小麥白粉病基因定位在2SS染色體上；Wang等（Wang SW，Yin LN，Tanaka H，Tanaka K, Tsujimoto Η. Vheat-Aegilops chromosome addition lines showing high iron and zinc contents in grains. Breeding Sci, 2011, 61: 189-195.)將顯著提高小麥桿粒 鐵和鋅元素的基因定位在ISs和253染色體上；Liu等（Liu WX, JinY, Rouse M, Friebe B, Gill BS, and Pumphrey MO. Development and characterization of wheat - Ae. searsii Robertsonian translocations and a recombinant chromosome conferring resistance to stem rust. Theor Appl Genet, 2011, 122:1537-1545.)將抗小麥桿鎊病 基因定位在3SS染色體上。
[0004] 小麥-外源物種附加系中除了含有小麥育種需要的優(yōu)異基因外，還含有一些控 制不利農(nóng)藝性狀的基因，因此，需要利用染色體工程方法將其誘導(dǎo)后才能應(yīng)用于小麥育種 工作。到目前為止，中國春-希爾斯山羊草3S S附加系已經(jīng)被成功改造 （Liu WX，Jin Y， Rouse M, Friebe B, Gill BS, and Pumphrey MO. Development and characterization of wheat - Ae. searsii Robertsonian translocations and a recombinant chromosome conferring resistance to stem rust. Theor Appl Genet, 2011, 122:1537-1545.), 而2SS附加系尚未被利用染色體工程方法誘導(dǎo)?；诖?，我們開展該項工作。誘導(dǎo)群體的 篩選與鑒定需要分子標(biāo)記的輔助進行，因此，希爾斯山羊草2S S染色體特異標(biāo)記的建立對 該工作的順利開展起著重要作用。到目前為止，Sun等（Sun X，Hu SL，Liu X，Qian WQ， Hao ST, Zhang AM, Wang Dff. Characterization of the HMW glutenin subunits from Aegilops searsii and identification of a novel variant HMW glutenin subunit. Theor Appl Genet, 2006，113:631-641.)和 Garg 等（Garg M, Tanaka H, Ishikawa N， Takata K, Yanaka M, Tsujimoto H. A novel pair of HMW glutenin subunits from Aegilops searsii improves quality of hexaploid wheat. Cereal Chemistry, 2009, 86:26-321.)均建立了希爾斯山羊草ISs的種子蛋白標(biāo)記。Liu等（Liu WX, Jin Y, Rouse M, Friebe B, Gill BS, and Pumphrey MO. Development and characterization of wheat - Ae. searsii Robertsonian translocations and a recombinant chromosome conferring resistance to stem rust. Theor Appl Genet, 2011, 122:1537-1545.)建 立了希爾斯山羊草3SS染色體的EST-STS標(biāo)記，用這些標(biāo)記鑒定了小麥-希爾斯山羊草易 位系并定位了來自希爾斯山羊草上的抗小麥桿銹病基因。然而，能用于快速簡便實用的檢 測小麥背景中希爾斯山羊草2S S的PCR標(biāo)記未見報道。
[0005] 目前，尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)希爾斯山羊草基因組序列信息的報道，而小麥、水稻和包括希 爾斯山羊草在內(nèi)的小麥遠源物種的基因具有較好的共線性，并且不同物種基因的內(nèi)含子區(qū) 域含有豐富的序列變異，因此，可以利用現(xiàn)有的小麥和水稻EST序列來設(shè)計引物，進而對希 爾斯山羊草和小麥基因組DNA進行擴增并對其擴增產(chǎn)物進行酶切，以此來建立希爾斯山羊 草染色體特異分子標(biāo)記。希爾斯山羊草2S S染色體導(dǎo)入小麥能顯著提高小麥籽粒鐵鋅含 量，并且可以改良小麥白粉病抗性，因此，利用小麥和水稻EST序列來建立小麥背景中希爾 斯山羊草2S S染色體分子標(biāo)記，對快速選育抗小麥白粉病、高鐵和鋅含量的小麥品種，具有 很重要的實際意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)中沒有希爾斯山羊草2^染色體的PCR標(biāo)記的問題，本發(fā) 明提供了一種能夠快捷、有效、簡便地鑒定待測樣本中是否含有希爾斯山羊草2^染色體的 方法。本發(fā)明的目的是建立希爾斯山羊草2SS染色體特異分子標(biāo)記，并將建立的分子標(biāo)記 應(yīng)用于小麥-希爾斯山羊草雜交后代的篩選工作。
[0007] 本發(fā)明還提供了所述希爾斯山羊草2SS染色體分子標(biāo)記在雜交種質(zhì)篩選與鑒定中 的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明是通過以下措施得到的： 本發(fā)明所建立的希爾斯山羊草2SS染色體分子標(biāo)記是MAG3253-EST-SSR、 MAG3930-EST-SSR、BE444521-EST-STS、TNACl 137-PLUG、TNACl 139-PLUG、TNAC1210-PLUG、 MAG4271-EST-SSR、MAG3512-EST-SSR、MAG3798-EST-SSR、C0S40、C0S65 和 C0S70,其序列和 擴增特異片段長度如表3所示。本發(fā)明所提供的檢測小麥背景中希爾斯山羊草2SS染色體 的新方法，是以待測希爾斯山羊草、小麥-希爾斯山羊草附加系及小麥對照(表1)基因組總 DNA為模板，對EST-STS、EST-STS、COS和PLUG引物進行篩選，篩選出能在希爾斯山羊草和 小麥-希爾斯山羊草2S S附加系中擴增出特異DNA條帶的引物，引物篩選的統(tǒng)計結(jié)果見表 2。再用篩選出的引物對小麥-希爾斯山羊草ISISs附加系進行擴增，確證相應(yīng)特異DNA條 帶僅小麥-希爾斯山羊草加系能擴增出而其他6個附加系（IS s、3Ss-7Ss)和小麥對照 (表1)不能擴增出，確證相應(yīng)DNA條帶為希爾斯山羊草2SS染色體特有。進而，利用這些引 物再對2S sS和2SSL端體附加系進行PCR擴增，將這些DNA片段定位在2SsS或2S SL染色體 臂上。各引物檢測特異擴增產(chǎn)物長度如表3所示。
[0009] 一種基于小麥和水稻EST序列的希爾斯山羊草2SS染色體分子標(biāo)記， 短臂引物對堿基序列如下： MAG3253-EST-SSR ： F :5' - CTGCTGCTTGGGATCATTCT-3'，（見序列表中序列 1) R: :5' - GCTGGTGAGAGTTGGAAACC-3'，（見序列表中序列 2) MAG3930-EST-SSR ： F :5' - CCTCCAAAGAGAAGCCATGA-3'，（見序列表中序列 3) R: :5' - ATGCCCTTGAGGACGAACT-3'，（見序列表中序列 4) 長臂引物對堿基序列如下： BE44452I-EST-STS ： F :5' -CCAATGACTGGCATGTGAAG-3'，（見序列表中序列 5) R :5' -CTTCGGATCGAGACACTTCC-3'，（見序列表中序列 6) TNACl137-PLUG ： F :5' -GCTGAATCACTCAACCATTCC-3'，（見序列表中序列 7) R :5' -TGCTCGCGCTCTACTTCAC-3'，（見序列表中序列 8) TNACl139-PLUG ： F :5' -ATGTTGTCCATGCCTCCACTT-3'，（見序列表中序列 9) R :5' -:CTGGAATTCTCCGTCTGCTTA-3'，（見序列表中序列 10) TNACl210-PLUG ： F :5' -TTGTGACTGACAGCAACATCC-3'，（見序列表中序列 11) R :5' -AGAGCTTGGCCTTCTCTTCC-3'，（見序列表中序列 12) MAG4271-EST-SSR ： F :5' - CTGCTGTTAAGGCAAGCACA-3'，（見序列表中序列 13) R :5' -TACCTCCCCCAATACGTGTC-3'，（見序列表中序列 14) MAG3512-EST-SSR ： F :5' -ACGCAAAGCCCAAATACATC-3'，（見序列表中序列 15) R :5' -CAGGCTCCTCCTCTACGTCA-3'，（見序列表中序列 16) MAG3798-EST-SSR ： F :5' -ATTGCGAGACGGATAACGAA-3'，（見序列表中序列 17) R :5' -GCTTACGAGCGAACATCAGG-3'，（見序列表中序列 18) C0S40 ： F :5' -GTGCTGCTGCCATTACTTTAG-3'，（見序列表中序列 19) R :5' -AGCAGCAGCCAATTGAAG-3'，（見序列表中序列 20) COS65 ： F :5' -GTGAGGATTCCTGATTGTGG-3'，（見序列表中序列 21) R :5' -ACGGTTAACACGAAGAATCG-3'，（見序列表中序列 22) C0S70 ： F :5' -AACCTTCTGTTTTGGAGGTTC-3'，（見序列表中序列 23) R :5' -TGGTAAAAAGCCCAGCTTC-3'，（見序列表中序列 24) 希爾斯山羊草2^染色體分子標(biāo)記為上述12對引物中的一對以上的組合或者一對以 上的短臂引物對與一對以上的長臂引物對的組合。
[0010] 所述的希爾斯山羊草2^染色體分子標(biāo)記的應(yīng)用，使用所述的希爾斯山羊草253染 色體分子標(biāo)記進行PCR擴增，對小麥背景中是否含有希爾斯山羊草2SS染色體進行檢測或 輔助檢測。
[0011] 所述的應(yīng)用，優(yōu)選檢測或輔助檢測步驟如下： (1) 以待測的可能含有希爾斯山羊草2^染色體或染色體片段的小麥背景系的基因組 總DNA為模板，用權(quán)利要求1所述的希爾斯山羊草2S S染色體特異分子標(biāo)記分別對模板和 對照進行PCR擴增，擴增結(jié)果使用凝膠電泳進行檢測； (2) 如果待測模板DNA凝膠電泳檢測圖譜中含有特異DNA條帶，則說明待測小麥背景系 的基因組中含有希爾斯山羊草2^染色體；如果待測模板DNA凝膠電泳檢測圖譜中不含有 特異DNA條帶，則說明待測小麥背景系的基因組中不含有希爾斯山羊草2^染色體。
[0012] 所述的應(yīng)用，優(yōu)選步驟（1)中使用希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山羊草2SS附加 系為陽性對照，以中國春小麥和/或其他不同小麥品種/品系為陰性對照。
[0013] 其中，EST-STS、COS和PLUG引物擴增反應(yīng)體系為15 μ L，包括25 ng/μ L的模 板 DNA 1 μ L，5 U/μ L Ti^DNA polymerase (申能博彩公司）0.15 μ L，200 yi^AdNTPs (博奧公司），含Mg2+的IOX PCRbuffer 1.5 yL (申能博彩公司），10 μ M的上、下游引物 各I UL，用無菌雙蒸餾水補充反應(yīng)體系至ISyL15PCR反應(yīng)在BIO-RAD PCR擴增儀上進行， 擴增程序為：94 °C預(yù)變性3 min，隨后35個循環(huán)：94 °C變性45 S，57 °C退火45 S，72 °C 延伸2 min，最后72 °C延伸10 min，4 °C保存。而EST-SSR引物擴增體系和上述擴增體系 一致，僅需要把退火溫度調(diào)整為52 °C。
[0014] EST-SSR和COS引物擴增產(chǎn)物用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳緩沖液 為1XTBE。取15yL擴增產(chǎn)物，加入3yL指示劑(含0· 1%溴酚藍和0· 1%二甲苯青)，混 勻，上樣量3 μ L，180V恒定電壓電泳約55min。經(jīng)硝酸銀染色30 min后觀察照相。PLUG 和EST-STS引物的擴增產(chǎn)物進行2%的瓊脂凝膠上電泳，電泳緩沖液為1XTAE。擴增產(chǎn)物 IOul在150V恒壓下電泳約25min，然后用lug/mL的溴化乙錠溶液進行染色30min，最后在 ⑶S-Gel Dol 2000紫外凝膠成像系統(tǒng)下掃描照像。
[0015] 本發(fā)明的有益效果： (1) 本發(fā)明利用小麥和水稻EST序列建立了希爾斯山羊草2SS染色體的新標(biāo)記，拓寬了 小麥和水稻EST序列的使用范圍，提供了檢測小麥背景中希爾斯山羊草2S S染色體的新方 法； (2) 本發(fā)明的希爾斯山羊草2^染色體特異標(biāo)記引物序列位于小麥和水稻各FL (Fragment Length)區(qū)段，根據(jù)比較基因組學(xué)原理，這些標(biāo)記也位于2SS染色體各FL區(qū)段， 因此可以綜合利用這些標(biāo)記鑒定涉及2S S染色體易位斷點的材料； (3) 本發(fā)明的特異性分子標(biāo)記，對小麥背景中是否含有希爾斯山羊草2SS染色體進行檢 測或輔助檢測，特異性強，檢測準(zhǔn)確率高，提高篩選效率，對輔助選育籽粒微量元素（Fe和 Zn)高且抗小麥白粉病的小麥新品系/品種具有積極的產(chǎn)業(yè)化價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1.引物MAG3253擴增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果，箭頭所示為多態(tài)性帶，其中A圖為 引物MAG3253對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山羊草2S S附加系、一粒小麥、圓錐小麥、綿 陽11、綿陽15和中國春的擴增結(jié)果，B圖為引物MAG3253對中國春-希爾斯山羊草1S S-7SS 附加系和中國春的擴增結(jié)果，C圖為引物MAG3253對中國春-希爾斯山羊草2SS附加系、中 國春-希爾斯山羊草2S S短臂和2S s長臂端體附加系以及中國春的擴增結(jié)果； 圖2.引物MAG3930擴增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果，箭頭所示為多態(tài)性帶，其中A圖為引物 MAG3930對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山羊草2SS附加系、一粒小麥、圓錐小麥、綿陽11、 綿陽15和中國春的擴增結(jié)果，B圖為引物MAG3930對中國春-希爾斯山羊草1S S-7SS附加 系和中國春的擴增結(jié)果，C圖為引物MAG3930對中國春-希爾斯山羊草2S S附加系、中國 春-希爾斯山羊草2SS短臂和2S s長臂端體附加系以及中國春的擴增結(jié)果； 圖3.引物BE444521擴增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果，箭頭所示為多態(tài)性帶，其中A圖為引物 BE444521對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山羊草2SS附加系、一粒小麥、圓錐小麥、綿陽 11、綿陽15和中國春的擴增結(jié)果，B圖為引物BE444521對中國春-希爾斯山羊草1SS-7SS 附加系和中國春的擴增結(jié)果，C圖為引物BE444521對中國春-希爾斯山羊草2SS附加系、 中國春-希爾斯山羊草2S S短臂和2S s長臂端體附加系以及中國春的擴增結(jié)果； 圖4.引物TNACl 137擴增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果，箭頭所示為多態(tài)性帶，其中A圖為引物 TNAC1137對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山羊草2SS附加系、一粒小麥、圓錐小麥、綿陽 11、綿陽15和中國春的擴增結(jié)果，B圖為引物TNAC1137對中國春-希爾斯山羊草1SS-7SS 附加系和中國春的擴增結(jié)果，C圖為引物TNAC1137對中國春-希爾斯山羊草2SS附加系、 中國春-希爾斯山羊草2S S短臂和2S s長臂端體附加系以及中國春的擴增結(jié)果； 圖5.引物TNAC1139擴增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果，箭頭所示為多態(tài)性帶，其中A圖為引物 TNAC1139對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山羊草2SS附加系、一粒小麥、圓錐小麥、綿陽 11、綿陽15和中國春的擴增結(jié)果，B圖為引物TNAC1139對中國春-希爾斯山羊草1SS-7SS 附加系和中國春的擴增結(jié)果，C圖為引物TNAC1139對中國春-希爾斯山羊草2SS附加系、 中國春-希爾斯山羊草2S S短臂和2S s長臂端體附加系以及中國春的擴增結(jié)果； 圖6.引物TNAC1210擴增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果，箭頭所示為多態(tài)性帶，其中A圖為引物 TNAC1210對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山羊草2SS附加系、一粒小麥、圓錐小麥、綿陽 11、綿陽15和中國春的擴增結(jié)果，B圖為引物TNAC1210對中國春-希爾斯山羊草1S S-7SS 附加系和中國春的擴增結(jié)果，C圖為引物TNAC1210對中國春-希爾斯山羊草2SS附加系、 中國春-希爾斯山羊草2S S短臂和2S s長臂端體附加系以及中國春的擴增結(jié)果； 圖7.引物MAG4271擴增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果，箭頭所示為多態(tài)性帶，其中A圖為引物 MAG4271對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山羊草2SS附加系、一粒小麥、圓錐小麥、綿陽11、 綿陽15和中國春的擴增結(jié)果，B圖為引物MAG4271對中國春-希爾斯山羊草1S S-7SS附加 系和中國春的擴增結(jié)果，C圖為引物MAG4271對中國春-希爾斯山羊草2S S附加系、中國 春-希爾斯山羊草2SS短臂和2S s長臂端體附加系以及中國春的擴增結(jié)果； 圖8.引物MAG3512擴增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果，箭頭所示為多態(tài)性帶，其中A圖為引物 MAG3512對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山羊草2SS附加系、一粒小麥、圓錐小麥、綿陽11、 綿陽15和中國春的擴增結(jié)果，B圖為引物MAG3512對中國春-希爾斯山羊草1S S-7SS附加 系和中國春的擴增結(jié)果，C圖為引物MAG3512對中國春-希爾斯山羊草2S S附加系、中國 春-希爾斯山羊草2SS短臂和2S s長臂端體附加系以及中國春的擴增結(jié)果； 圖9.引物MAG3798擴增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果，箭頭所示為多態(tài)性帶，其中A圖為引物 MAG3798對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山羊草2SS附加系、一粒小麥、圓錐小麥、綿陽11、 綿陽15和中國春的擴增結(jié)果，B圖為引物MAG3798對中國春-希爾斯山羊草1S S-7SS附加 系和中國春的擴增結(jié)果，C圖為引物MAG3798對中國春-希爾斯山羊草2S S附加系、中國 春-希爾斯山羊草2SS短臂和2S s長臂端體附加系以及中國春的擴增結(jié)果； 圖10.引物C0S40擴增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果，箭頭所示為多態(tài)性帶，其中A圖為引物 C0S40對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山羊草2SS附加系、一粒小麥、圓錐小麥、綿陽11、 綿陽15和中國春的擴增結(jié)果，B圖為引物C0S40對中國春-希爾斯山羊草1S S-7SS附加系 和中國春的擴增結(jié)果，C圖為引物C0S40對中國春-希爾斯山羊草2S S附加系、中國春-希 爾斯山羊草2SS短臂和2S s長臂端體附加系以及中國春的擴增結(jié)果； 圖11.引物COS65擴增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果，箭頭所示為多態(tài)性帶，其中A圖為引物 COS65對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山羊草2SS附加系、一粒小麥、圓錐小麥、綿陽11、 綿陽15和中國春的擴增結(jié)果，B圖為引物COS65對中國春-希爾斯山羊草1S S-7SS附加系 和中國春的擴增結(jié)果，C圖為引物COS65對中國春-希爾斯山羊草2S S附加系、中國春-希 爾斯山羊草2SS短臂和2S s長臂端體附加系以及中國春的擴增結(jié)果； 圖12.引物C0S70擴增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果，箭頭所示為多態(tài)性帶，其中A圖為引物 C0S70對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山羊草2SS附加系、一粒小麥、圓錐小麥、綿陽11、 綿陽15和中國春的擴增結(jié)果，B圖為引物C0S70對中國春-希爾斯山羊草1S S-7SS附加系 和中國春的擴增結(jié)果，C圖為引物C0S70對中國春-希爾斯山羊草2S S附加系、中國春-希 爾斯山羊草2SS短臂和2S s長臂端體附加系以及中國春的擴增結(jié)果； 圖13為引物MAG3253對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山羊草2SS附加系、中國春、中 國春2B缺體/中國春-希爾斯山羊草2SS附加系雜交F2群體的擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖； 圖14.引物MAG3930對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山羊草2SS附加系、中國春、中 國春2B缺體/中國春-希爾斯山羊草2SS附加系雜交F2群體的擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖； 圖15.引物BE444521對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山羊草2SS附加系、中國春、中 國春2B缺體/中國春-希爾斯山羊草2SS附加系雜交F2群體的擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖； 圖16.引物TNAC1137對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山羊草2SS附加系、中國春、中 國春2B缺體/中國春-希爾斯山羊草2SS附加系雜交F2群體的擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖； 圖17.引物TNAC1139對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山羊草2SS附加系、中國春、中 國春2B缺體/中國春-希爾斯山羊草2SS附加系雜交F2群體的擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖； 圖18.引物TNAC1210對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山羊草2SS附加系、中國春、中 國春2B缺體/中國春-希爾斯山羊草2SS附加系雜交F2群體的擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖； 圖19.引物MAG4271對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山羊草2SS附加系、中國春、中 國春2B缺體/中國春-希爾斯山羊草2SS附加系雜交F2群體的擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖； 圖20.引物MAG3512對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山羊草2SS附加系、中國春、中 國春2B缺體/中國春-希爾斯山羊草2SS附加系雜交F2群體的擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖； 圖21.引物MAG3798對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山羊草2SS附加系、中國春、中 國春2B缺體/中國春-希爾斯山羊草2SS附加系雜交F2群體的擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖； 圖22.引物C0S40對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山羊草2SS附加系、中國春、中國 春2B缺體/中國春-希爾斯山羊草2SS附加系雜交F2群體的擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖； 圖23.引物COS65對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山羊草2SS附加系、中國春、中國 春2B缺體/中國春-希爾斯山羊草2SS附加系雜交F2群體的擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖； 圖24.引物C0S70對希爾斯山羊草、中國春-希爾斯山羊草2SS附加系、中國春、中國 春2B缺體/中國春-希爾斯山羊草2SS附加系雜交F2群體的擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖； 圖25.基因組原位雜交鑒定分子標(biāo)記鑒定出的部分中國春2B缺體和中國春-希爾斯 山羊草2SS附加系的部分雜交F 2分離群體的雜交圖譜，其中，圖A、B、C分別為雜交后代植 株AS-17、AS-96和AS-185的基因組原位雜交結(jié)果。

【具體實施方式】
[0017] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。
[0018] 下述實施例中，如無特殊說明，所用PCR體系方法與
【發(fā)明內(nèi)容】
部分的描述的PCR體 系及方法相同，所有引物合成均由成都瑞信生物公司完成。所用TA編號的實驗材料(表1) 全部由美國堪薩斯州立大學(xué)小麥基因組學(xué)與遺傳資源中心Gill BS教授惠贈，公眾可從美 國堪薩斯州立大學(xué)小麥基因組學(xué)與遺傳資源中心（http://www. k-state. edu/wgrc/)有償 獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。
[0019] 下述實施例中的綿陽11小麥（MYll)和中國春（CS) (Liu C，Yang ZJ，Li GR， Zeng ZXj Zhang Yj Zhou JPj Liu ZHj Ren ZL 2008. Isolation of a new repetitive DNA sequence from Secale africanum enables targeting of Secale chromatin in wheat background. Euphytica，159(1-2): 249-258·);綿陽 15 (MY15) (Zhou JP， Zhang HY，Yang ZJ，Li GR，Hu LJ，Lei MP，Liu C，Zhang Y，Zhang Y，Ren ZL 2012. Characterization of a new T2DS. 2DL-?R translocation triticale ZH-I with multiple resistances to diseases. Genet Resour Crop Evol，59(6):1161-1168.)由 電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院楊足君教授提供，公眾可從山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所 獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。AeSe-I- AeSe-192為中國春2B缺體/中國春-希爾斯山羊草2SS附加系雜交F 2群體。
[0020] 表1.供試材料

【權(quán)利要求】
1. 一種基于小麥和水稻EST序列的希爾斯山羊草2S 3染色體分子標(biāo)記，其特征在于 短臂引物對堿基序列如下： MAG3253-EST-SSR ： F :5' - CTGCTGCTTGGGATCATTCT-3'， R: :5, - GCTGGTGAGAGTTGGAAACC-3，， MAG3930-EST-SSR ： F :5, - CCTCCAAAGAGAAGCCATGA-3，， R: :5' - ATGCCCTTGAGGACGAACT-3'， 長臂引物對堿基序列如下： BE444521-EST-STS ： F :5' -CCAATGACTGGCATGTGAAG-3'， R :5' -CTTCGGATCGAGACACTTCC-3'， TNAC1137-PLUG ： F :5, -GCTGAATCACTCAACCATTCC-3，， R :5' -TGCTCGCGCTCTACTTCAC-3'， TNAC1139-PLUG ： F :5' -ATGTTGTCCATGCCTCCACTT-3'， R :5' -:CTGGAATTCTCCGTCTGCTTA-3'， TNAC1210-PLUG ： F :5' -TTGTGACTGACAGCAACATCC-3'， R :5' -AGAGCTTGGCCTTCTCTTCC-3'， MAG4271-EST-SSR ： F :5, - CTGCTGTTAAGGCAAGCACA-3，， R :5' -TACCTCCCCCAATACGTGTC-3'， MAG3512-EST-SSR ： F :5' -ACGCAAAGCCCAAATACATC-3'， R :5' -CAGGCTCCTCCTCTACGTCA-3'， MAG3798-EST-SSR ： F :5, -ATTGCGAGACGGATAACGAA-3，， R :5, -GCTTACGAGCGAACATCAGG-3，， C0S40 ： F :5' -GTGCTGCTGCCATTACTTTAG-3'， R :5, -AGCAGCAGCCAATTGAAG-3，， C0S65 ： F :5' -GTGAGGATTCCTGATTGTGG-3'， R :5, -ACGGTTAACACGAAGAATCG-3，， C0S70 ： F :5' -AACCTTCTGTTTTGGAGGTTC-3'， R :5, -TGGTAAAAAGCCCAGCTTC-3，， 希爾斯山羊草2^染色體分子標(biāo)記為上述12對引物中的一對以上的組合或者一對以 上的短臂引物對與一對以上的長臂引物對的組合。
2. -種權(quán)利要求1所述的希爾斯山羊草2S 3染色體分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于使用 權(quán)利要求1所述的希爾斯山羊草2SS染色體分子標(biāo)記進行PCR擴增，對小麥背景中是否含 有希爾斯山羊草2^染色體進行檢測或輔助檢測。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于檢測或輔助檢測步驟如下： (1) 以待測的可能含有希爾斯山羊草2^染色體或染色體片段的小麥背景系的基因組 總DNA為模板，用權(quán)利要求1所述的希爾斯山羊草2SS染色體特異分子標(biāo)記分別對模板和 對照進行PCR擴增，擴增結(jié)果使用凝膠電泳進行檢測； (2) 如果待測模板DNA凝膠電泳檢測圖譜中含有特異DNA條帶，則說明待測小麥背景系 的基因組中含有希爾斯山羊草2^染色體；如果待測模板DNA凝膠電泳檢測圖譜中不含有 特異DNA條帶，則說明待測小麥背景系的基因組中不含有希爾斯山羊草2^染色體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于步驟（1)中使用希爾斯山羊草、中國春-希 爾斯山羊草2SS附加系為陽性對照，以中國春小麥和/或其他不同小麥品種/品系為陰性 對照。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于引物BE444521-EST-STS、TNAC1137-PLUG、 TNAC1139-PLUG、TNAC1210-PLUG、C0S40、C0S65 和 C0S70 擴增 15 ii L PCR 反應(yīng)體系為： 25 ng/u L 的模板 DNA 1 u L, 5 U/ u L Ta^DNA polymerase 0. 15iiL,200 u M 的 dNTPs，含Mg2+的10X PCRbuffer 1.5 iiL，10iiM的上、下游引物各1 iiL，用無菌雙蒸餾 水補充反應(yīng)體系至15 yL; PCR反應(yīng)擴增程序為：94 °C預(yù)變性3 min，隨后35個循環(huán)：94 °C變性45 S，57 °C退火 45 S，72 °C延伸 2 min，最后 72 °C延伸 10 min，4 °C保存。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于MAG3253-EST-SSR、MAG3930-EST-SSR、 MAG4271-EST-SSR、MAG3512-EST-SSR 和 MAG3798-EST-SSR 擴增 15 ii L PCR 反應(yīng)體系為： 25 ng/u L 的模板 DNA 1 u L, 5 U/ u L Ta^DNA polymerase 0. 15iiL,200 u M 的 dNTPs，含Mg2+的10X PCRbuffer 1.5 iiL，10iiM的上、下游引物各1 iiL，用無菌雙蒸餾 水補充反應(yīng)體系至15 yL; PCR反應(yīng)擴增程序為：94 °C預(yù)變性3 min，隨后35個循環(huán)：94 °C變性45 S，52°C退火 45 S，72 °C延伸 2 min，最后 72 °C延伸 10 min，4 °C保存。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于MAG3253-EST-SSR、MAG3930-EST-SSR、 MAG4271-EST-SSR、MAG3512-EST-SSR、MAG3798-EST-SSR、C0S40、C0S65 和 C0S70 引物 擴增產(chǎn)物進行8 %的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后銀染顯色；BE444521-EST-STS、 TNAC1137-PLUG、TNAC1139-PLUG和TNAC1210-PLUG引物的擴增產(chǎn)物進行2%的瓊脂讓凝膠 電泳，然后用lug/mL的溴化乙錠溶液進行染色。
【文檔編號】C12Q1/68GK104498483SQ201410716282
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月2日
【發(fā)明者】劉成, 宮文英, 劉建軍, 李根英, 宋健民, 李豪圣, 劉愛峰, 曹新有, 程敦公, 王燦國, 趙振東 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所