花生維生素C合成相關(guān)基因AhPMM及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了花生維生素C合成相關(guān)基因 AhPMM 及其應(yīng)用，將該基因在花生中超量表達(dá)后，得到總維生素C和還原態(tài)維生素C（AsA）含量顯著提高的轉(zhuǎn)基因植株。實(shí)驗(yàn)證明，將本發(fā)明的 AhPMM 基因超量表達(dá)可顯著提高花生葉片的維生素C含量，且對花生的正常生長沒有明顯的影響。本發(fā)明的蛋白及其編碼基因?qū)τ谥参锞S生素C合成機(jī)制的研究，以及提高植物的維生素C含量的改良和抗逆性具有重要的理論及實(shí)際意義，應(yīng)用前景廣闊。
【專利說明】花生維生素C合成相關(guān)基因及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及花生維生素C合成相關(guān)基因AWW及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]維生素C即抗壞血酸，在生物體的氧化還原代謝反應(yīng)中起調(diào)節(jié)作用，人類缺乏它可引起壞血病。除此之外，它還具有其他的作用。例如，缺乏維生素C膽固醇就不能羥基化變成膽酸排出體外；它的氧化酶會影響某些氨基酸(一般是芳香族)的代謝；還有解毒作用等。一般，在動物體內(nèi)和植物體內(nèi)，維生素C都可以自己合成，但是，在人體卻無法合成抗壞血酸。這是由于，在人體內(nèi)缺乏古洛內(nèi)酯氧化酶。植物體自身所合成的維生素C，不僅可以為人類所用，對植物體本身生理功能也具有重要作用。一般來說，抗壞血酸與植物的抗逆性是呈正相關(guān)的，隨著植物細(xì)胞內(nèi)的抗壞血酸的含量增加，其本身及其代謝相關(guān)酶類在清除活性氧方面的作用也增強(qiáng)，使得抗壞血酸在植物耐炎熱、寒冷和鹽堿環(huán)境等逆境的機(jī)制中起到了重要的作用。而且抗壞血酸還與植物細(xì)胞的分裂、伸長和植株生長有關(guān)。
[0003]迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在植物中可能存在4種維生素C合成途徑:半乳糖途徑、糖醛酸途徑、古洛糖途徑以及肌醇途徑。其中在維生素C的主要的生物合成途徑當(dāng)中，磷酸甘露糖變位酶(PMM)可以促進(jìn)D-6-磷酸甘露糖轉(zhuǎn)化為D-1-磷酸甘露糖，從而進(jìn)一步合成維生素C0
[0004]目前在擬南芥、煙草、大豆、水稻、番茄、小麥等已經(jīng)被克隆了/W基因，但在花生中還沒有克隆的報(bào)道，該基因在花生中的功能性研究和轉(zhuǎn)基因調(diào)控的報(bào)道尚存空白。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了花生維生素C合成相關(guān)基因AWW及其應(yīng)用，本發(fā)明通過將AWW基因轉(zhuǎn)入花生中，可以顯著提高花生轉(zhuǎn)基因植株的維生素C含量和花生種子的耐鹽性。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
花生維生素C合成相關(guān)基因AhPMM,其序列表如SEQ ID No:1所示。
[0007]所述基因AWW有11個(gè)外顯子。
[0008]所述11個(gè)外顯子對應(yīng)的堿基分別為第3-71，1246-1290，1410-1476，1784-1860，2076-2111，2207-2262，2349-2448，2549-2644，2732-2821，3204-3255，3417-3472 位。
[0009]克隆所述基因AWW的引物名稱與序列如下:
Pl (5，- AAATGGCTGCCCGGAAACCTGG -3，)；
P2 (5，- TGGTGGTTCTCAATGGAAACATTGCT -3’)，
上述引物序列分別與基因AWW第1-22堿基、第3482-3507堿基對應(yīng)。
[0010]本發(fā)明還提供了所述的花生維生素C合成相關(guān)基因AWW編碼產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列表如SEQ ID No:2所示。
[0011]本發(fā)明還提供了所述的基因AWW在提高維生素C含量的應(yīng)用。
[0012]轉(zhuǎn)AWW基因花生葉片總維生素C含量達(dá)8.64 umol g_S還原態(tài)維生素C含量達(dá)5.38 umol g、
[0013]本發(fā)明還提供了所述的基因AWW在提高耐鹽性中的應(yīng)用。
[0014]將花生AWW基因在花生中超量表達(dá)，花生轉(zhuǎn)基因種子在1% NaCl溶液中發(fā)芽率最高達(dá)到50%。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:
1、本發(fā)明從花生中克隆了/W基因(必/W)，測序結(jié)果表明該基因有11個(gè)外顯子，分別對應(yīng)的堿基為 3-71，1246-1290，1410-1476，1784-1860，2076-2111，2207-2262，2349-2448，2549-2644，2732-2821，3204-3255，3417-3472。
[0016]2、將所述必/W基因轉(zhuǎn)入花生植株中，轉(zhuǎn)必/W基因花生植株形態(tài)發(fā)育正常，轉(zhuǎn)基因花生葉片總維生素C含量可達(dá)到8.64 umol g—1 (FW)，為對照(5.31 umol 81的1.6倍；還原態(tài)維生素C含量可達(dá)到5.38 umol g—1 (FW)，為對照(2.83 umol g—1)的1.9倍。所以本發(fā)明將AWW基因在花生過量表達(dá)可顯著提高葉片維生素C含量。
[0017]3、本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證明AWW基因受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，24 h時(shí)可達(dá)到對照的4.96倍。
[0018]4、轉(zhuǎn)AWW基因花生種子在1% NaCl的發(fā)芽率最高可達(dá)到50%，而非轉(zhuǎn)基因種子的發(fā)芽率只有20% ;本發(fā)明將AWW基因在花生過量表達(dá)可顯著提高種子的耐鹽性。
[0019]本發(fā)明以花生這一重要的油料作物為實(shí)驗(yàn)材料，克隆了抗壞血酸生物合成途徑中的重要基因并對其進(jìn)行分析?？梢詾橐院笸ㄟ^基因工程調(diào)控花生的維生素C含量和提高花生植株的抗逆能力奠定基礎(chǔ)。
[0020]結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】后，本發(fā)明的其他特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將變得更加清
λ.Μ
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【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1表明本發(fā)明中花生的遺傳轉(zhuǎn)化，a:在SM培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3d的子葉外植體；b:在SM+cef培養(yǎng)基上培養(yǎng)2w的子葉外植體；c:添加100 mg /L卡那霉素的SEM+cef培養(yǎng)基上篩選的抗性芽(培養(yǎng)4w);d: 150 mg /L卡那霉素的SEM+cef培養(yǎng)基上篩選的抗性苗(培養(yǎng)6w) ；e:在SEM+cef恢復(fù)培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)兩周的抗性苗(培養(yǎng)8 w) ；f:抗性苗嫁接圖；g:嫁接苗移栽到大田后的收獲圖。
[0022]圖2是本發(fā)明中200 mM NaCl脅迫處理花生幼苗后必/W基因在不同時(shí)間段的相對表達(dá)量。
[0023]圖3是本發(fā)明中對照莒南小紅種和T2代轉(zhuǎn)基因花生種子在1%的NaCl溶液中的發(fā)芽情況；a:莒南小紅種；b-c: T2代轉(zhuǎn)基因花生種子。
[0024]圖4是本發(fā)明中用高效液相色譜測定對照莒南小紅種和T2代轉(zhuǎn)基因植株葉片的維生素C含量。a:維生素C含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線；b:莒南小紅種葉片的維生素C含量的測定結(jié)果；c: T2代轉(zhuǎn)基因植株葉片的維生素C含量的測定結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0026]實(shí)施例1:花生維生素C合成相關(guān)基因AWW及其在提高維生素C含量和耐鹽性中的應(yīng)用
一、實(shí)驗(yàn)材料
1.基因、菌種與花生品種
本發(fā)明克隆了花生/W基因C^/邏/)，大腸桿菌DH5a、根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳研究室實(shí)驗(yàn)室保存，也可以采用生物公司商業(yè)化的工程菌株。轉(zhuǎn)基因的受體材料為花生品種“莒南小紅種”(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳研究室實(shí)驗(yàn)室提供)。
[0027]所述克隆的花生AWW基因序列表如SEQ ID No:1所示，編碼產(chǎn)生的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
[0028]克隆所述花生AWW基因的引物名稱與序列如下:
Pl (5，- AAATGGCTGCCCGGAAACCTGG -3，)(SEQ ID No:4)；
P2 (5，- TGGTGGTTCTCAATGGAAACATTGCT -3，) (SEQ ID No:5)。
[0029]SEQ ID No:1 序列如下: AAATGGCTGCCCGGAAACCTGGTTTGATTGCATTGTTTGATGTTGATGGG ACTCTTACAG CCCCAAG
GAAGGTACTTCTTTCTTCTTGAGCCAATGGCATTACTATAACAAAATAATATATTAATGGAGC AATTTGATGTGTTCTGAGTC AGATTTATTG TCTACAGGTA GTTTAAGGTT
ACTAATTAGGGTTTGGATTCGGTAGCCTCTCCAAAGAAAGCTACTAGTAGCCTCTTCAAATTCAATTATAAAATATACCCCATGCATATCTTTTAATATTTGAAAGTATTCCTTCTTTATTTTTATTTTATTTCTTTTTTAACACGCATCATCCCAAACTTGAGATACAACGCAGCTTCATTTCTGCCTTCACTATTGCAACTTCCATGAACATTCTTCAGTAGTTTCATTTGTTTGGCTTGGAATTGTGTGAATAATTTTTAGCTCCATGAGAAGTCCATAAAAGTAAGTTCTATATTCCAACTGTGCCCACTCTCAACCAAGAAAAAGAAAAACATTCTCACTTCCAACAGCCACAAATGCTGCATAAACTAATTAAAATGAGCTGAATGTGCTGTGGAATTGGGTCATCAATGTTGAATTTGACTGTGGCAATCTTTATGAAACTAGATAATCTTTAACAAATTAATGAGTTGATTGAATAACCTGGGTTATTCAAAATGTGAAGAGCATACTCATATGAATAAAGACACCAATAATTATCATATATTTCAATAATTAAAGAGCAACGAGAAGGAATAATAATGACAAAAGAGAAACAAGAGGAAGAGGAAGAAGTGAGCCCATGTTGCTCAATCAGCACTCCACAGATTGTTCACCAAGATCATCCATCAATCACCACCATTGTCAATGTTTATATTGGACATGATGGAGGTGGATCAAAATTTATTAATGGTGTTGCAGTTCTTAGAAAGGATAAGGCAGCAATGAGATGTGGCAGTACTTCCTTTTCCTCTTATTTGAACAGTGAATAGCTGAAAAGAAATAAAAAAACAAAGCATGAGTACTTTTTAAATATGAGAAAAAGTATGCATTGGGTTATTTTATAATTAAGTATGAAGAGGCTACCAATAGCCTCTCTTTGGAGAAGGCTACTGAATCCAAAGCCTACTAATTATAGCATGCTATAACATCATAATGCTGAAGAAAACTAGAAAATTTTGATTTATTATGATTGTTTAGTCTTGCATCACCTTTATTTATTGTTTCGTACTCGAATTCAAGGTGGTGACTCCAGAGATGTTGGCATTCATGCAAGATCTAAGGAAGGTAAATGAGCCAGATTTTATTTTTGGAAAAAAAAAAGTTTACATGCATTTGTTTTCTTAATCCATACCTGACAATTCATAGAACCTGCTTTAAAAGTCCTTTCCTTTTTCCTGGTACAGGTTGTAACAGTTGGAGTTGTGGGTGGTTCTGACCTTGTAAAGATATCTGAGCAACTGGGCAGCACAGGTTAGCTACAAGCATCTCTCTGATTTCTGATGCTATAATTTCGTTATGTGAAACCACTTGGAGAAAATTGATTGTAGTGTTCCGTCTCATTGCTTAATGCTAATTAATTCTATTATGTGGTTTCTTTTTCATGT TTGTTTTGTTTCTTCTTTGCTATTGGCTGA AGTTGGGAAT TATGTTTGCT GATATAAGCT GAGAATTCAATTTTTACTTTTCTCTACTTTTGTCAAATCA TGCATCTTTG ATAAGCTATT AGAATGAAATCAAAAGGATC TATCTTTTTGAATATACCCC TTATTTGTTG CAGTTACCAA TGACTATGGTTATGTATTTT CTGAGAATGGTCTTGTGGCTCATAAGGAAGGAAACCTCATTGGAACCCAGGTACACCTCATAAACCTCAATCCTTGATAGAATCAAATTACAACGATCAGATGTAAGTTGAAAAAGTTGTGATGATCCTTTTGTTATCGAAAGAACAAAACTAGTACCATCATGGTGTCGCTTGTAAAACACCTCCCGGCGGGCCTTCTGTTAATGTAGCAATGTAAAATTTTGATCTAATAC
ACCATGA caagttgtaatttccctgtttacagagcttgaaatcattc cttggtgatgaaaagctcaa G
GTAAGCCCCGAATTTCCATTCGAGCCATATTGTTTGAGG CTGAGGCAACCATGCTGATT ACCTCCTAACTGCATTTAGA GATAATTTTG TTGTAGGAAT TTATTAATTTCACACTTCAT TACATTGCTG ACTTGGATATCCCTATTAAG AGGTCAGCCA TATTCAGAGGTTAATCATAT ACTGTTCATT TTTATTGCAG AAAACTTATAAATCCTGTTT TTGACATAATCTTTTCAGGG GAACATTCATAGAGTTCCGTAGTGGAATGCTGAATGTGTCGCCAATTGGGCGAAACTGTA GCCAAGAAGAAAGAGATGAATTTGAGAAGTATGACAAGGTGAGACATCTTGGTCATGTGAATATTAATTAGAATTTTCTG TCTCTATAAT TTGATAGGTC CTATATTTCTTTTAAAAGTT TGCAACACATGTTCTCAGATTCAGAACATTCGTCCAAAAATGGTTGAGGTGCTTCGTGAAAAGTTTGCTCATTTTAATCTGACATTTTCCATTGGAGGGCAGATAAGCTTTGATGTAAGT GATGATCTTCATCCCGATGTGGCGAATTTC TTGATGGCCA AGTTATAAGTGAGCATGTCT TAATTTGAATCTTCTCTTCA GGTTTTCCCCCAAGGTTGGG ATAAAACATACTGCCTTAGA TACCTTGAAGATTTTAATGAAATTCACTTC TTTGGTGACAAAACTTACAAGGTTAGTCCT TTAGAGTATC AAACAAATAT CTGTAACTCT GTACCATTATAGATTTTTGAATTCTATAAC GCCAGTTGCT ACCGGATCCT TTTGATTTAT CAATGTGACACATTTTTATGAAAAATCCTT AAAGTGAGTTGGGGCAAACAATTTCTGTAACAAGCAAATAATTGTCTGTTTTATGGAGACTGCATGAACCTTTTTTCTCCATTTTGAAACTTGTTTCAAA TATTCACCAAAATGATCATG CTTTTAGAAATGATATGTTG CAACAGTATA TCAGTCCCAA AATTGAAGCTATATGCCTAC TTTAGGTGTT ATCAAAGGATGAAGATTGAT TAATTTCCTA CAATAACTTTATTTTGTAAT TTTCTTTGAGCAGGGTGGAAATGACCATGAAATCTATGAATCAGAAAGGACTATTGGTCACACAGGTTAGTTGCTTCCTAACTTTAAATCATAATATGTGAAAAAAATGACTCAGTTTTGGTTACAATGGCATGCTGAAACAATTCCATTTTAAATTAAGACCGAATTATCCAAGGTAAATAATTGTTGCTGCAGTGCTTATAATTTGTA TTCATTCCTT TTTCAGTTACAAGCCCTGM GATACCATGAAGCAGTGCACAGCTCTCTTCCTTAAAAATTGAATTTGCTGAAGCAATGTT TCCATTGAGA ACCACCA。
[0030]SEQ ID No:2 序列如下: MAARKPGLIALFDVDGTLTAPRKVVTPEMLAFMQDLRKVVTVGVVGGSDL VKISEQLGST VTNDYGYVFS ENGLVAHKEG NLIGTQSLKS FLGDEKLKEF INFTLHYIAD LDIPIKRGTF IEFRSGMLNV SPIGRNCSQE ERDEFEKYDK IQNIRPKMVE VLREKFAHFN LTFSIGGQIS FDVFPQGffDKTYCLRYLEDF NEIHFFGDKT YKGGNDHEIY ESERTIGHTV TSPEDTMKQC TALFLKN。
[0031]2.植物培養(yǎng)基花生轉(zhuǎn)化中采用的培養(yǎng)基有:
基本培養(yǎng)基:為MS無機(jī)鹽+B5有機(jī)成分(簡稱MSB5)，添加3%蔗糖、0.8%瓊脂，pH=5.8，在121°C、105Kpa條件下滅菌20min ；
SM 誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MSB5+5 mg/L BAP +1.5 mg/L 2，4_D ；
SEM芽伸長培養(yǎng)基:MSB5+5 mg/L BAP ； cef:頭孢霉素。
[0032]二、實(shí)驗(yàn)方法
本發(fā)明包括以下具體實(shí)驗(yàn)步驟:
1、AhPMM基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建 (I)擴(kuò)增AWW基因花生品種“莒南小紅種”由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳研究室實(shí)驗(yàn)室提供，通過RT-PCR擴(kuò)增了AWW基因的編碼區(qū)(其序列表如SEQ ID No:3所示)，引物如下:
P3 (5，-GGTACCAAATGGCTGCCCGGAAACCTGG-3，) (Kanl) ；(SEQ ID No:6)
P4 (5，- GAGCTCTCAATTTTTAAGGAAGAGAGC-3’)(Sacl) (SEQ ID No:7)。
[0033]上述引物序列除去酶切接頭(下劃線對應(yīng)的堿基)外分別與AWW基因的第1-22堿基、第3452-3472堿基對應(yīng)。
[0034]SEQ ID No:3 序列如下: AAATGGCTGCCCGGAAACCTGGTTTGATTGCATTGTTTGATGTTGATGGGACTCTTACAG CCCCAAGGAAGGTGGTGACTCCAGAGATGTTGGCATTCATGCAAGATCTAAGGAAGGTTGTAACAGTTGGAG
TTGTGGGTGGTTCTGACCTTGTAAAGATATCTGAGCAACTGGGCAGCACAGTTACCAATGACTATGGTTATGTATTTTCTGAGAATGGTCTTGTGGCTCATAAGGAAGGAAACCTCATTGGAACCCAGAGCTTGAAATCATTCCTTGGTGATGAAAAGCTCAAGGAATTTATTAATTTCACACTTCATTACATTGCTGACTTGGATATCCCTATTAAGAGGGGAACATTCATAGAGTTCCGTAGTGGAATGCTGAATGTGTCGCCAATTGGGCGAAACTGTAGCCAAGAAGAAAGAGATGAATTTGAGAAGTATGACAAGATTCAGAACATTCGTCCAAAAATGGTTGAGGTGCTTCGTGAAAAGTTTGCTCATTTTAATCTGACATTTTCCATTGGAGGGCAGATAAGCTTTGATGTTTTCCCCCAAGGTTGGGATAAAACATACTGCCTTAGATACCTTGAAGATTTTAATGAAATTCACTTCTTTGGTGACAAAACTTACAAGGGTGGAAATGACCATGAAATCTATGAATCAGAAAGGACTATTGGTCACACAGTTACAAGCCCTGAAGATACCATGAAGCAGTGCACAGCTCT CTTCCTTAAAAATTGA。
[0035](2) AWW基因與克隆載體pUC18及植物表達(dá)載體pBI121的連接。
[0036]回收PCR產(chǎn)物，并在T4 DNA連接酶作用下與克隆載體pUC18 (購買于TaKaRa)進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci獲得了抗氨芐青霉素的菌落。提取重組質(zhì)粒，用治ml和feci進(jìn)行雙酶切，回收含AWW基因的酶切片段，并克隆到植物表達(dá)載體pBI121的對應(yīng)酶切位點(diǎn)中，獲得該基因的植物表達(dá)載體pBI 121-AWW。
[0037]3、將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化花生，包括以下步驟:
a、農(nóng)桿菌重組菌株的制備、活化及菌液制備:將PBI121-AWW重組質(zhì)粒利用液氮凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株EHA105感受態(tài)細(xì)胞，篩選出含有重組質(zhì)粒的重組菌株。挑取重組菌株單菌落，接種到Y(jié)EB (利福平50mg/L，卡那霉素50mg/L)液體培養(yǎng)基中，28°C、180rpm培養(yǎng)至OD600=0.5?0.8時(shí)，取2mL菌液轉(zhuǎn)移到50mL YEB (利福平50mg/L，卡那霉素50mg/L)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到OD6qq=0.6^0.8。將菌液于5000rpm離心15min后，用相同體積的液體MSB5懸浮備用。
[0038]b、花生子葉外植體的分離:選取飽滿的花生種子，在70%酒精中浸泡lmin，0.1%升汞浸泡20min，無菌水沖洗4-6次。去種皮和胚軸，將每片子葉縱向切成2半。
[0039]C、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化:切好的外植體浸于已備好的農(nóng)桿菌菌液中，28°C、90rpm溫和震蕩侵染lOmin，用無菌濾紙將殘留菌液吸干，接入SM誘導(dǎo)培養(yǎng)基上在暗中共培養(yǎng)3d。轉(zhuǎn)移到添加250 mg/L頭孢霉素的SIM誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將外植體切口端嵌入培養(yǎng)基，培養(yǎng)2w左右，誘導(dǎo)叢生芽，培養(yǎng)條件:光強(qiáng)為1500-20001x、光照12h、溫度為26°C ±1°C。
[0040]將形成叢生芽的外植體轉(zhuǎn)移外到250 mg/L頭孢霉素、100 mg/L卡那霉素的SEM培養(yǎng)基上篩選抗性芽，培養(yǎng)2w，培養(yǎng)條件:光強(qiáng)為1500-20001x、光照12h、溫度為26°C ±1°C。
[0041]培養(yǎng)2w后，切下不定芽部分轉(zhuǎn)移到250 mg/L頭孢霉素、150 mg/L卡那霉素的SEM培養(yǎng)基上，進(jìn)行抗性芽的篩選及誘導(dǎo)芽伸長，培養(yǎng)4w左右，期間繼代培養(yǎng)2-3次。
[0042]以2w左右的“花育23”實(shí)生苗為砧木，切除距子葉節(jié)約2cm以上的主莖部分，用手術(shù)刀將砧木上端垂直劈開，切口深約0.5?lcm。當(dāng)轉(zhuǎn)基因植株長到約2?3cm時(shí)，從芽叢基部切下再生小苗做接穗，下端切成長約0.5?lcm的V形傷口。將接穗插入砧木中，使砧木和接穗的形成層緊密接觸，然后用封口膜纏繞接口，松緊適度。將嫁接苗置于MS-B5培養(yǎng)基中無菌培養(yǎng)3?4天；然后移栽于滅菌的育苗基質(zhì)中進(jìn)行馴化3w，之后移栽到田間，直至轉(zhuǎn)基因植株結(jié)實(shí)(花生的遺傳轉(zhuǎn)化如圖1所示)。
[0043]4、轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測
提取再生植株的基因組DNA，利用上述載體序列和AWW基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95°C、5min ;95°C、30 s，56°C、35s，72°C、40 s，35個(gè)循環(huán)；72°C、lOmin。轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR陽性率達(dá)到42.3%。
[0044]將花生AhPMM基因在花生中過量表達(dá)，對花生轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測的引物為:
P5 (5，-GCTCCTACAAATGCCATCA -3，)(SEQ ID No:8)；
P6 (5’_ GATAGTGGGATTGTGCGTCA -3’) (SEQ ID No:9)。
[0045]5、熒光定量PCR，包括以下步驟:
a、用200 mM NaCl處理生長3w的‘莒南小紅種’幼苗，在不同時(shí)間段取幼苗葉片，立即在液氮中冷凍處理后備用。分別取不同時(shí)間段脅迫處理的花生幼葉0.05 g，液氮速凍并研磨成粉末狀，用RNA提取試劑盒提取RNA。抽提后的總RNA用DNase I處理，并進(jìn)行純化。
[0046]b、樣品在ABI 7500 FAST型熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。20 PL反應(yīng)體系包括:10 M-L 2 X SybrGreen qPCR Master Mix, 20 Mmol/L 正反向引物各 0.25 M-L, 20 ng 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。擴(kuò)增程序?yàn)?先95°C預(yù)變性2 min ;接著進(jìn)入40個(gè)循環(huán)反應(yīng)，每個(gè)循環(huán)中95°C變性10 s，60°C延伸33 s ;循環(huán)結(jié)束后，緩慢升至95°C，制備熔解曲線。每個(gè)反應(yīng)設(shè)2個(gè)復(fù)孔。
[0047]c、/W基因定量PCR 的正向引物序列為 5’ - CATGCAAGATCTAAGGAAGGTTGT -3’ (SEQID No: 10);反向引物序列為 5’- GGAATGATTTCAAGCTCTGGGT -3’ (SEQ ID No: 11)。
[0048]以花生Jcii/?基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)，擴(kuò)增正向引物序列為5’ - GTGGCCGTACAACTGGTATCGT-3’ (SEQ ID No: 12);反向引物序列為 5’- ATGGATGGCTGGAAGAGAACT -3’ (SEQ ID No: 13)。
[0049]如圖2所示，200 mM NaCl脅迫處理后花生幼苗后，AWW基因表達(dá)量先略微下降，后迅速上升，在24 h時(shí)達(dá)到對照的4.96倍，48 h時(shí)又迅速降低，只有對照的1.22倍。
[0050]6、T2代轉(zhuǎn)基因種子的耐鹽性鑒定
以T2代種子轉(zhuǎn)基因花生種子和莒南小紅種種子(對照)為材料，挑選飽滿種子，力口l%NaCl充分浸泡4 h,倒掉多余NaCl溶液至適量,于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件設(shè)置為25°C、暗培養(yǎng)24h，處理期間每I d更換一次NaCl溶液。5 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，胚根長度>種子長度為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)。每個(gè)處理設(shè)兩個(gè)重復(fù)。
[0051]如圖3所示，花生轉(zhuǎn)基因植株的花生種子在1% NaCl的發(fā)芽率最高可達(dá)到50%，而對照只有20%。
[0052]7、T2代轉(zhuǎn)基因植株維生素C含量的測定
AsA的測定:取T2代轉(zhuǎn)基因植株葉片0.5 g用液氮研磨，加0.1%草酸適量轉(zhuǎn)移至棕色容量瓶中，避光浸泡I h，混勻，超聲處理25 min，冷卻后定容10 mL。12,000 rmp離心10min,取上清,0.22 μ m濾膜過濾,進(jìn)樣分析。
[0053]AsA+DHA (總維生素測定):取上述離心后上清液1ml，分別加入25 μ L DTT (25mmolI/1)和 25 μ L K2HPO4 (160 mmol Γ1)，室溫下避光靜置 15 min 將 DHA 完全還原成 AsA，12，000rpm離心15 min,取上清,經(jīng)0.22 μ m濾膜過濾后進(jìn)樣分析。
[0054]如圖4所示，用高效液相色譜測定對照莒南小紅種和T2代轉(zhuǎn)基因植株葉片的維生素C含量，轉(zhuǎn)基因花生葉片總維生素C含量最高可達(dá)到8.64 umol g—1 (FW)，為對照(5.31umol g4)的1.6倍；還原態(tài)維生素C含量最高可達(dá)到5.38 umol g—1 (FW)，為對照(2.83umol g—1)的 1.9 倍。
[0055]通過上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說明，本發(fā)明通過將AWW基因轉(zhuǎn)入花生中，可以顯著提高花生轉(zhuǎn)基因植株的維生素C含量和花生種子的耐鹽性。
[0056]以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其進(jìn)行限制；盡管參照前述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，依然可以對前述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護(hù)的技術(shù)方案的精神和范圍。
【權(quán)利要求】
1.花生維生素C合成相關(guān)基因其序列表如SEQID No:1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因其特征在于所述基因AWW有11個(gè)外顯子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因其特征在于所述11個(gè)外顯子對應(yīng)的堿基分別為第 3-71，1246-1290，1410-1476，1784-1860，2076-2111，2207-2262，2349-2448，2549-2644，2732-2821，3204-3255，3417-3472 位。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因其特征在于克隆所述基因AWW的引物名稱與序列如下:
Pl (5，- AAATGGCTGCCCGGAAACCTGG -3，)；
P2 (5，- TGGTGGTTCTCAATGGAAACATTGCT -3’)， 上述引物序列分別與基因AWW第1-22堿基、第3482-3507堿基對應(yīng)。
5.權(quán)利要求1所述的花生維生素C合成相關(guān)基因AWW編碼產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列表如SEQ ID No:2所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因AWW在提高維生素C含量的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基因AWW在提高維生素C含量的應(yīng)用，其特征在于轉(zhuǎn)AWW基因花生葉片總維生素C含量達(dá)8.64 umol g'還原態(tài)維生素C含量達(dá)5.38 umol g'
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因AWW在提高耐鹽性中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的基因AWW在提高耐鹽性中的應(yīng)用，其特征在于將花生AWW基因在花生中超量表達(dá)，花生轉(zhuǎn)基因種子在1% NaCl溶液中發(fā)芽率最高達(dá)到50%。
【文檔編號】C12N9/90GK104372015SQ201410604319
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月3日
【發(fā)明者】隋炯明, 鄭春花, 王亞, 趙春梅, 孔祥遠(yuǎn), 王晶珊, 喬利仙 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)