一種油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法，具體包括以下步驟：(1)SRB富集培養(yǎng)基的制備；(2)SRB分離培養(yǎng)基的制備；(3)SRB的富集培養(yǎng)；(4)SRB的分離培養(yǎng)；(5)SRB的純化培養(yǎng)，本發(fā)明具有分離純化的速度快，從SRB富集和分離培養(yǎng)基的制備到純化培養(yǎng)物只需要3d～5d，分離純化的成功率高，一次分離純化既可得到純化培養(yǎng)物，操作簡單、對操作人員要求較低，針對性強(qiáng)，本方法只適合進(jìn)行SRB菌種分離純化，因此，可廣泛地應(yīng)用于油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化中。
【專利說明】—種油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法
一、【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于石油微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法。

二、【背景技術(shù)】
[0002]硫酸鹽還原菌(SRB)是利用油田產(chǎn)出液中的硫酸鹽或者其它氧化態(tài)硫化物作為電子受體來異化有機(jī)物質(zhì)的微生物，它將S042_還原成H2S,進(jìn)而改變油田水質(zhì)的pH值和金屬的腐蝕狀態(tài)，是金屬腐蝕速率顯著增加的重要因素，對油田管網(wǎng)帶來腐蝕、堵塞等諸多有害作用。
[0003]分離和純化SRB獲得純種的SRB單菌株，可以為油田環(huán)境的菌落結(jié)構(gòu)分析以及腐蝕現(xiàn)狀和水質(zhì)情況的評價(jià)提供重要的理論依據(jù)。
[0004]現(xiàn)有的SRB分離純化方法有以下三種:稀釋搖管法、疊皿夾層法和Hungate滾管法，但目前的方法存在著以下問題:(1)稀釋搖管法觀察和挑取菌落比較困難，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力效率低；(2)疊皿夾層法適用范圍小，分離純化的成功率低，往往需要3次?6次重復(fù)的分離純化才能得到相對純化培養(yǎng)物；(3)Hungate滾管對設(shè)備操作人員要求較高，操作復(fù)雜，分離純化效果低；(4)三種方法分離方法時(shí)間均需要1d以上。

三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法。該方法具有工藝簡單、操作方便、材料易得、針對性強(qiáng)，對操作人員及設(shè)備要求較低、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、分離純化速度快和成功率高的優(yōu)點(diǎn)。
[0006]一種油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法，其特征在于，具體包括以下步驟:
[0007]1、SRB富集培養(yǎng)基的制備
[0008]將富集培養(yǎng)基溶于蒸餾水中，厭氧分裝到容積為25ml的厭氧管中，每管分裝9ml，121°C高壓蒸汽滅菌30min。
[0009]其中，富集培養(yǎng)基配方為乳酸鈉質(zhì)量濃度0.4%?0.6%、硫酸亞鐵銨質(zhì)量濃度0.05%?0.2%、酵母浸粉質(zhì)量濃度0.05%?0.1 %、氯化鈉質(zhì)量濃度0.5%?2.0 %、氯化鎂質(zhì)量濃度0.01%?0.03%。
[0010]2、SRB分離培養(yǎng)基的制備
[0011]將分離培養(yǎng)基溶于蒸餾水中，加熱至充分溶解，然后厭氧分裝到容積為25ml的厭氧管中，每管15ml，121°C高壓蒸汽滅菌30min，滅菌完后自然降溫至50°C?55°C備用。
[0012]其中，分離培養(yǎng)基配方為蛋白胨質(zhì)量濃度0.8%?1.2%、肉浸粉質(zhì)量濃度0.9 %?1.1 %、乳酸鈉質(zhì)量濃度0.4%?0.6 %、硫酸亞鐵銨質(zhì)量濃度0.05 %?0.2 %、酵母浸粉質(zhì)量濃度0.05%?0.1 %、氯化鈉質(zhì)量濃度0.5%?2.0 %、氯化鎂質(zhì)量濃度0.01%?0.03%、瓊脂粉質(zhì)量濃度0.8%?1.5%。
[0013]3、SRB的富集培養(yǎng)
[0014]取油田污水Iml注入上述制備好的富集培養(yǎng)基中，30°C?60°C恒溫培養(yǎng)至培養(yǎng)液變黑為止，得到富集培養(yǎng)物。
[0015]4、SRB的分離培養(yǎng)
[0016]取Iml上述富集培養(yǎng)物用制備好的富集培養(yǎng)基按照10倍系列稀釋法稀釋至10_4，將10_3和10_4梯度的稀釋液用Iml無菌注射器取0.1ml，分別緩慢注入至上述50°C?55°C備用的分離培養(yǎng)基中，混合均勻，垂直靜置放置0.5h?Ih得到透明的半固體培養(yǎng)基，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30°C?60°C，培養(yǎng)至培養(yǎng)基中出現(xiàn)黑點(diǎn)為止，得到分離培養(yǎng)物。
[0017]5、SRB的純化培養(yǎng)
[0018]取I管上述富集培養(yǎng)基，用Iml無菌注射器抽取0.2ml富集培養(yǎng)基，接著用該注射器吸入分離培養(yǎng)物中輪廓清晰的黑點(diǎn)，然后注入該管富集培養(yǎng)基中，放置在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30°C?60°C，培養(yǎng)Id?3d直到培養(yǎng)液變黑，得到純化培養(yǎng)物。
[0019]其中，所述步驟2中的滅菌完后自然降溫，為確保降溫均勻，降溫過程中緩慢滾動(dòng)厭氧管。
[0020]所述步驟3中的油田污水，其現(xiàn)場采集后進(jìn)行密封處理在4°C下保藏不超過7d。
[0021]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0022](I)操作簡單、對操作人員要求較低；
[0023](2)針對性強(qiáng)，本方法只適合進(jìn)行SRB菌種分離純化；
[0024](3)分離純化的速度快，從SRB富集和分離培養(yǎng)基的制備到純化培養(yǎng)物只需要3d ?5d ;
[0025](4)分離純化的成功率高，一次分離純化既可得到純化培養(yǎng)物。
[0026]四、說明書附圖
[0027]附圖1為區(qū)塊A硫酸鹽還原菌的分離培養(yǎng)物；
[0028]附圖2為區(qū)塊A硫酸鹽純化培養(yǎng)物顯微照片；
[0029]附圖3為區(qū)塊B硫酸鹽還原菌的分離培養(yǎng)物；
[0030]附圖4為區(qū)塊B硫酸鹽純化培養(yǎng)物顯微照片；
[0031]附圖5為區(qū)塊C硫酸鹽純化培養(yǎng)物顯微照片。

五、【具體實(shí)施方式】
:
[0032]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0033]實(shí)施例1
[0034]利用本發(fā)明的方法對勝利油田某區(qū)塊A產(chǎn)出水中的SRB進(jìn)行分離純化，區(qū)塊A產(chǎn)出水的溫度為30°C，具體步驟如下:
[0035]1、SRB富集培養(yǎng)基的制備
[0036]將富集培養(yǎng)基溶于蒸餾水中，厭氧分裝到容積為25ml的厭氧管中，每管分裝9ml，121°C高壓蒸汽滅菌30min。
[0037]其中，富集培養(yǎng)基配方為乳酸鈉質(zhì)量濃度0.4%、硫酸亞鐵銨質(zhì)量濃度0.05%、酵母浸粉質(zhì)量濃度0.07 %、氯化鈉質(zhì)量濃度1.0 %、氯化鎂質(zhì)量濃度0.03%。
[0038]2、SRB分離培養(yǎng)基的制備
[0039]將分離培養(yǎng)基溶于蒸餾水中，加熱至充分溶解，然后厭氧分裝到容積為25ml的厭氧管中，每管15ml，121°C高壓蒸汽滅菌20min，滅菌完后自然降溫至50°C備用，為確保降溫均勻，降溫過程中緩慢滾動(dòng)厭氧管。
[0040]其中，分離培養(yǎng)基配方為蛋白胨質(zhì)量濃度0.8%、肉浸粉質(zhì)量濃度0.9%、乳酸鈉質(zhì)量濃度0.5%、硫酸亞鐵銨質(zhì)量濃度0.1 %、酵母浸粉質(zhì)量濃度0.1 %、氯化鈉質(zhì)量濃度2.0%,氯化鎂質(zhì)量濃度0.02%、瓊脂粉質(zhì)量濃度1.2%。
[0041]3、SRB的富集培養(yǎng)
[0042]現(xiàn)場采集區(qū)塊A油田污水樣品后進(jìn)行密封處理，并在4°C下保藏2d，取油田污水Iml注入上述制備好的富集培養(yǎng)基中，30°C恒溫培養(yǎng)至培養(yǎng)液變黑為止，得到富集培養(yǎng)物。
[0043]4、SRB的分離培養(yǎng)
[0044]取Iml上述富集培養(yǎng)物用制備好的富集培養(yǎng)基按照10倍系列稀釋法稀釋至10_4，將10_3和10_4梯度的稀釋液用Iml無菌注射器取0.1ml，分別緩慢注入至上述50°C備用的分離培養(yǎng)基中，混合均勻，垂直靜置放置0.5h得到透明的半固體培養(yǎng)基，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)至培養(yǎng)基中出現(xiàn)黑點(diǎn)為止，得到分離培養(yǎng)物，見附圖1。
[0045]5、SRB的純化培養(yǎng)
[0046]取I管上述富集培養(yǎng)基，用Iml無菌注射器抽取0.2ml富集培養(yǎng)基，接著用該注射器吸入分離培養(yǎng)物中輪廓清晰的黑點(diǎn)，然后注入該管富集培養(yǎng)基中，放置在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)Id直到培養(yǎng)液變黑，得到純化培養(yǎng)物，純化培養(yǎng)物的顯微照片見附圖2。
[0047]實(shí)施例2
[0048]利用本發(fā)明的方法對勝利油田某區(qū)塊B產(chǎn)出水中的SRB進(jìn)行分離純化，區(qū)塊B產(chǎn)出水的溫度為48°C，具體步驟如下:
[0049]1、SRB富集培養(yǎng)基的制備
[0050]將富集培養(yǎng)基溶于蒸餾水中，厭氧分裝到容積為25ml的厭氧管中，每管分裝9ml，121°C高壓蒸汽滅菌20min。
[0051]其中，富集培養(yǎng)基配方為乳酸鈉質(zhì)量濃度0.5%、硫酸亞鐵銨質(zhì)量濃度0.2%、酵母浸粉質(zhì)量濃度0.1 %、氯化鈉質(zhì)量濃度0.5%、氯化鎂質(zhì)量濃度0.01 %。
[0052]2、SRB分離培養(yǎng)基的制備
[0053]將分離培養(yǎng)基溶于蒸餾水中，加熱至充分溶解，然后厭氧分裝到容積為25ml的厭氧管中，每管15ml，121°C高壓蒸汽滅菌25min，滅菌完后自然降溫至52°C備用，為確保降溫均勻，降溫過程中緩慢滾動(dòng)厭氧管。
[0054]其中，分離培養(yǎng)基配方為蛋白胨質(zhì)量濃度1.0%、肉浸粉質(zhì)量濃度1.0%、乳酸鈉質(zhì)量濃度0.4%、硫酸亞鐵銨質(zhì)量濃度0.2%、酵母浸粉質(zhì)量濃度0.05%、氯化鈉質(zhì)量濃度
1.0%、氯化鎂質(zhì)量濃度0.03%、瓊脂粉質(zhì)量濃度0.8%。
[0055]3、SRB的富集培養(yǎng)
[0056]現(xiàn)場采集區(qū)塊B油田污水后進(jìn)行密封處理，并在4°C下保藏5d，取油田污水Iml注入上述制備好的富集培養(yǎng)基中，48°C恒溫培養(yǎng)至培養(yǎng)液變黑為止，得到富集培養(yǎng)物。
[0057]4、SRB的分離培養(yǎng)
[0058]取Iml上述富集培養(yǎng)物用制備好的富集培養(yǎng)基按照10倍系列稀釋法稀釋至10_4，將10_3和10_4梯度的稀釋液用Iml無菌注射器取0.1ml，分別緩慢注入至上述52°C備用的分離培養(yǎng)基中，混合均勻，垂直靜置放置0.7h得到透明的半固體培養(yǎng)基，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為48°C，培養(yǎng)至培養(yǎng)基中出現(xiàn)黑點(diǎn)為止，得到分離培養(yǎng)物，見附圖3。
[0059]5、SRB的純化培養(yǎng)
[0060]取I管上述富集培養(yǎng)基，用Iml無菌注射器抽取0.2ml富集培養(yǎng)基，接著用該注射器吸入分離培養(yǎng)物中輪廓清晰的黑點(diǎn)，然后注入該管富集培養(yǎng)基中，放置在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度48°C，培養(yǎng)2d直到培養(yǎng)液變黑，得到純化培養(yǎng)物，純化培養(yǎng)物的顯微照片見附圖4。
[0061]實(shí)施例3
[0062]利用本發(fā)明的方法對勝利油田某區(qū)塊C產(chǎn)出水中的SRB進(jìn)行分離純化，區(qū)塊C產(chǎn)出水的溫度為60°C,具體步驟如下:
[0063]1、SRB富集培養(yǎng)基的制備
[0064]將富集培養(yǎng)基溶于蒸餾水中，厭氧分裝到容積為25ml的厭氧管中，每管分裝9ml，121°C高壓蒸汽滅菌25min。
[0065]其中，富集培養(yǎng)基配方為乳酸鈉質(zhì)量濃度0.6%、硫酸亞鐵銨質(zhì)量濃度0.1 %、酵母浸粉質(zhì)量濃度0.05%、氯化鈉質(zhì)量濃度0.08%、氯化鎂質(zhì)量濃度0.02%。
[0066]2、SRB分離培養(yǎng)基的制備
[0067]將分離培養(yǎng)基溶于蒸餾水中，加熱至充分溶解，然后厭氧分裝到容積為25ml的厭氧管中，每管15ml，121°C高壓蒸汽滅菌30min，滅菌完后自然降溫至55°C備用，為確保降溫均勻，降溫過程中緩慢滾動(dòng)厭氧管。
[0068]其中，分離培養(yǎng)基配方為蛋白胨質(zhì)量濃度1.2%、肉浸粉質(zhì)量濃度1.1%、乳酸鈉質(zhì)量濃度0.6%、硫酸亞鐵銨質(zhì)量濃度0.05%、酵母浸粉質(zhì)量濃度0.08%、氯化鈉質(zhì)量濃度0.5%,氯化鎂質(zhì)量濃度0.01%、瓊脂粉質(zhì)量濃度1.5%。
[0069]3、SRB的富集培養(yǎng)
[0070]現(xiàn)場采集區(qū)塊區(qū)塊C油田污水樣品后進(jìn)行密封處理，在4°C下保藏ld，取油田污水Iml注入上述制備好的富集培養(yǎng)基中，60°C恒溫培養(yǎng)至培養(yǎng)液變黑為止，得到富集培養(yǎng)物。
[0071]4、SRB的分離培養(yǎng)
[0072]取Iml上述富集培養(yǎng)物用制備好的富集培養(yǎng)基按照10倍系列稀釋法稀釋至10_4，將10_3和10_4梯度的稀釋液用Iml無菌注射器取0.1ml，分別緩慢注入至上述55°C備用的分離培養(yǎng)基中，混合均勻，垂直靜置放置Ih得到透明的半固體培養(yǎng)基，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為60°C，培養(yǎng)至培養(yǎng)基中出現(xiàn)黑點(diǎn)為止，得到分離培養(yǎng)物。
[0073]5、SRB的純化培養(yǎng)
[0074]取I管上述富集培養(yǎng)基，用Iml無菌注射器抽取0.2ml富集培養(yǎng)基，接著用該注射器吸入分離培養(yǎng)物中輪廓清晰的黑點(diǎn)，然后注入該管富集培養(yǎng)基中，放置在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度60°C，培養(yǎng)3d直到培養(yǎng)液變黑，得到純化培養(yǎng)物，純化培養(yǎng)物的顯微照片見附圖5。
【權(quán)利要求】
1.一種油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法，其特征在于，該方法具體包括以下步驟: (1)SRB富集培養(yǎng)基的制備 將富集培養(yǎng)基溶于蒸懼水中，厭氧分裝到容積為7.8ml的厭氧瓶中，每瓶分裝7ml,121 °C高壓蒸汽滅菌，其中，富集培養(yǎng)基配方為乳酸鈉質(zhì)量濃度0.4%?0.6%、硫酸亞鐵銨質(zhì)量濃度0.05 %?0.2 %、酵母浸粉質(zhì)量濃度0.05 %?0.1 %、氯化鈉質(zhì)量濃度0.5 %?2.0 %、氯化鎂質(zhì)量濃度0.01%?0.03% ; (2)SRB分離培養(yǎng)基的制備 將分離培養(yǎng)基溶于蒸餾水中，加熱至充分溶解，然后厭氧分裝到容積為7.8ml的厭氧瓶中，每管7ml，121°C高壓蒸汽滅菌，滅菌完后自然降溫至50°C?55°C備用，其中，分離培養(yǎng)基配方為蛋白胨質(zhì)量濃度0.8%?1.2%、肉浸粉質(zhì)量濃度0.9%?1.1%、乳酸鈉質(zhì)量濃度0.4%?0.6 %、硫酸亞鐵銨質(zhì)量濃度0.05 %?0.2 %、酵母浸粉質(zhì)量濃度0.05 %?0.1%、氯化鈉質(zhì)量濃度0.5 %?2.0 %、氯化鎂質(zhì)量濃度0.0I %?0.03 %、瓊脂粉質(zhì)量濃度0.8%?1.5% ； (3)SRB的富集培養(yǎng) 取油田污水0.2ml注入上述制備好的富集培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)至培養(yǎng)液變黑為止，得到富集培養(yǎng)物； (4)SRB的分離培養(yǎng) 取0.77ml上述富集培養(yǎng)物用制備好的富集培養(yǎng)基按照10倍系列稀釋法稀釋至10_4，將10_3和10_4梯度的稀釋液用Iml無菌注射器取0.1ml，分別緩慢注入至上述50°C?55°C備用的分離培養(yǎng)基中，混合均勻，垂直靜置放置0.5h?Ih得到透明的半固體培養(yǎng)基，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至培養(yǎng)基中出現(xiàn)黑點(diǎn)為止，得到分離培養(yǎng)物； (5)SRB的純化培養(yǎng) 取I管上述富集培養(yǎng)基，用Iml無菌注射器抽取0.2ml富集培養(yǎng)基，接著用該注射器吸入分離培養(yǎng)物中輪廓清晰的黑點(diǎn)，然后注入該管富集培養(yǎng)基中，放置在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到培養(yǎng)液變黑，得到純化培養(yǎng)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法，其特征在于，所述的121°C高壓蒸汽滅菌，滅菌時(shí)間為20min?30min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法，其特征在于，所述的滅菌完后自然降溫，為確保降溫均勻，降溫過程中緩慢滾動(dòng)厭氧管。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法，其特征在于，所述取油田污水現(xiàn)場采集后進(jìn)行密封處理在4°C下保藏不超過7d。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法，其特征在于，所述的恒溫培養(yǎng)至培養(yǎng)液變黑為止，得到富集培養(yǎng)物，恒溫培養(yǎng)溫度為30°C?60V。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法，其特征在于，所述的置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至培養(yǎng)基中出現(xiàn)黑點(diǎn)為止，得到分離培養(yǎng)物，恒溫培養(yǎng)溫度為30°C?60°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法，其特征在于，所述的放置在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到培養(yǎng)液變黑，得到純化培養(yǎng)物，恒溫培養(yǎng)溫度為30。。?60。。。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法，其特征在于，所述的放置在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到培養(yǎng)液變黑，得到純化培養(yǎng)物，培養(yǎng)時(shí)間為Id?3d。
【文檔編號】C12N1/20GK104312962SQ201410584993
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月27日
【發(fā)明者】潘永強(qiáng), 徐鵬, 袁長忠, 王剛, 徐闖, 李彩風(fēng), 杜春安, 王靜, 宋欣, 張守獻(xiàn), 曹嫣鑌 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司勝利油田分公司采油工藝研究院