離心沉降輔助植物轉(zhuǎn)基因的方法
【專利摘要】一種離心沉降輔助植物轉(zhuǎn)基因的方法是：將植物受體材料與農(nóng)桿菌混合后在合理的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行離心沉降處理，最終獲得陽性轉(zhuǎn)化子。離心沉降不僅可以增加受體材料的創(chuàng)傷面積，而且使農(nóng)桿菌在離心力作用下深入到受體材料內(nèi)部，顯著提高了植物轉(zhuǎn)基因效率。
【專利說明】離心沉降輔助植物轉(zhuǎn)基因的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)，具體是一種離心沉降輔助植物轉(zhuǎn)基因的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為生物技術(shù)的核心在植物改良、醫(yī)藥、畜牧業(yè)和食品工業(yè)方面都具有巨大的發(fā)展?jié)摿ΑＨ欢赞r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化為主的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)目前存在轉(zhuǎn)化效率低下的問題，大部分植物的轉(zhuǎn)化率為1%左右，這個(gè)問題也成為了限制轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的主要因素。研究表明，農(nóng)桿菌浸泡受體植物材料時(shí)，只有表層的少數(shù)受創(chuàng)傷細(xì)胞有可能被轉(zhuǎn)化，而受體材料中的大部分內(nèi)部細(xì)胞沒有機(jī)會(huì)接觸到農(nóng)桿菌。針對(duì)這一問題，有人提出超聲波輔助農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)思路，這種處理可以增加受體材料表面的創(chuàng)傷程度，對(duì)于受體內(nèi)部細(xì)胞來說效果甚微。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的，就是為了解決上述問題，提供一種離心沉降輔助植物轉(zhuǎn)基因的方法。
[0004]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:一種離心沉降輔助植物轉(zhuǎn)基因的方法，包括如下步驟:
[0005]步驟一，通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)，得到無菌的植物材料；
[0006]步驟二，從獲得的無菌植物材料中切取受體部位，作為轉(zhuǎn)化受體材料；
[0007]步驟三，將包含有目的基因的農(nóng)桿菌活化到轉(zhuǎn)化狀態(tài)后，在5000-10000rpm條件下離心并重懸，得到農(nóng)桿菌重懸液；
[0008]步驟四，把植物受體材料浸泡到農(nóng)桿菌重懸液中，再次進(jìn)行離心處理；
[0009]步驟五，將步驟四中離心處理后的材料轉(zhuǎn)移到無菌玻璃器皿中靜置15-20分鐘；
[0010]步驟六，靜置時(shí)間結(jié)束后，把感染后的植物材料從玻璃器皿中取出來，用無菌濾紙吸干殘留的菌液，然后轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基中共培養(yǎng)；
[0011 ] 步驟七，共培養(yǎng)結(jié)束后，將感染過的植物受體材料在選擇壓力下進(jìn)行篩選，最終獲得陽性轉(zhuǎn)化子。
[0012]步驟三中所述的轉(zhuǎn)化狀態(tài)，是指農(nóng)桿菌液的OD值達(dá)到0.5-0.7。
[0013]步驟三中所述的重懸，是指將農(nóng)桿菌在感染之前進(jìn)行離心沉降后棄上清，然后用植物液體培養(yǎng)基把細(xì)菌重新懸浮起來。
[0014]步驟四中所述的離心處理是，在25°C下，5000-8000rpm離心5-lOmin。
[0015]本發(fā)明將植物受體材料與農(nóng)桿菌混合后在合理的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行離心沉降處理，離心沉降不僅可以增加受體材料的創(chuàng)傷面積，而且使農(nóng)桿菌在離心力作用下深入到受體材料內(nèi)部，顯著提高了植物轉(zhuǎn)基因效率。
【具體實(shí)施方式】[0016]下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明:本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
[0017]下面實(shí)施例的煙草來自本 申請(qǐng)人:的實(shí)驗(yàn)室。
[0018]本實(shí)施例包括如下步驟:
[0019]步驟一，從無菌煙草組培苗中取紉嫩葉片，切去葉緣作為受體材料；
[0020]步驟二，將包含有⑶S基因的農(nóng)桿菌TGl活化到OD值=0.6，在50000rpm條件下離心5分鐘，然后用MS液體培養(yǎng)基因重懸；
[0021]步驟三，把步驟一中的煙草受體葉片浸泡到農(nóng)桿菌重懸液中，并在5000rpm條件下離心10min ；
[0022]步驟四，把離心后的材料轉(zhuǎn)移到無菌三角瓶中靜置20分鐘；
[0023]步驟五，靜置時(shí)間結(jié)束后，把感染后的植物材料從三角瓶中取出來，用無菌濾紙吸干殘留的菌液，然后轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基中，黑暗條件下兩天；
[0024]步驟七，共培養(yǎng)結(jié)束后，將感染過的植物受體材料在添加頭孢霉素和卡那霉素的MS培養(yǎng)基中篩選；最終通過GUS染色獲得22株陽性轉(zhuǎn)化子。
[0025]本實(shí)施例發(fā)現(xiàn)，離心沉降輔助轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以使煙草轉(zhuǎn)基因效率提高一倍。
【權(quán)利要求】
1.一種離心沉降輔助植物轉(zhuǎn)基因的方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟一，通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)，得到無菌的植物材料； 步驟二，從獲得的無菌植物材料中切取受體部位，作為植物受體材料； 步驟三，將包含有目的基因的農(nóng)桿菌活化到轉(zhuǎn)化狀態(tài)后，在5000-10000rpm條件下離心并重懸，得到農(nóng)桿菌重懸液； 步驟四，把植物受體材料浸泡到農(nóng)桿菌重懸液中，再次進(jìn)行離心處理； 步驟五，將步驟四中離心處理后的材料轉(zhuǎn)移到無菌玻璃器皿中靜置15-20分鐘；步驟六，靜置時(shí)間結(jié)束后，把感染后的植物材料從玻璃器皿中取出來，用無菌濾紙吸干殘留的菌液，然后轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基中共培養(yǎng)； 步驟七，共培養(yǎng)結(jié)束后，將感染過的植物受體材料在選擇壓力下進(jìn)行篩選，最終獲得陽性轉(zhuǎn)化子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的離心沉降輔助植物轉(zhuǎn)基因的方法，其特征是:步驟四中所述的離心處理是，在 25。0下，5000-8000rpm離心5-lOmin。
【文檔編號(hào)】C12N15/84GK104017825SQ201410283216
【公開日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年6月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月23日
【發(fā)明者】王貴榮, 李斌連, 唐克軒 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)