利用滾環(huán)擴增放大和光散射技術的核酸檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用滾環(huán)擴增放大和光散射技術的核酸檢測方法，根據待測核酸鏈的序列設計成環(huán)DNA的序列，在酶的作用下，成環(huán)DNA連接成封閉環(huán)狀DNA，加入擴增酶及其他擴增混合物后，在一定條件下，核酸鏈會以環(huán)狀DNA為擴增模板進行滾環(huán)擴增，擴增所得產物為長單鏈DNA，溶液中核酸鏈的濃度將決定產物長單鏈DNA的濃度，以及產物溶液的光散射強度?？衫铆傊请娪疽约霸恿︼@微鏡對產物長單鏈DNA進行表征和觀察，此技術可實現(xiàn)均相溶液中目標鏈及單堿基錯配的目標鏈的一步檢測，可用于分子生物學和醫(yī)學診斷的相關分析領域。
【專利說明】利用滾環(huán)擴增放大和光散射技術的核酸檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學和醫(yī)學診斷領域，涉及一種利用滾環(huán)擴增放大和光散射技術的核酸檢測方法，此技術可實現(xiàn)均相溶液中目標鏈及單堿基錯配的目標鏈的一步檢測。
【背景技術】
[0002]隨著許多遺傳病相關基因逐漸被闡明，對其在基因水平上的認識愈加深入?，F(xiàn)知人類的疾病都與基因有直接或間接的關系，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展往往也涉及許多基因異常。另外近來不斷有研究顯示人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與DNA甲基化的異常有關，甲基化可以作為腫瘤等早期診斷的生物標記物和預后評估指標，對腫瘤的篩查和風險評估、早期診斷、分期分型、預后判斷及治療監(jiān)測都具有重要的意義。核酸的檢測和分析在遺傳性疾病、腫瘤和傳染病等領域的應用日益廣泛，由此帶來疾病診斷模式和治療策略的更新，并可揭示了與基因結構或表達異常相關的疾病的發(fā)病機制。醫(yī)學實驗室所要檢測和分析的核酸既包括人體本身的基因(DNA)以及反映基因轉錄水平的mRNA，也包括侵入人體的致病微生物等所攜帶的外源性基因(DNA或RNA)。伴隨基因檢測技術的進步，核酸雜交、PCR、序列分析等逐漸成為診斷遺傳病的常規(guī)手段，但不可否認的是，上述諸多技術仍存在一些問題如檢測靈敏度較低、操作復雜等問題。
[0003]滾環(huán)擴增技術是模仿生物體內復制的一種信號放大機制:它以DNA寡核苷酸為引物，以單鏈環(huán)狀 DNA為模板,在DNA聚合酶(phi29 polymerase)的作用下實現(xiàn)DNA在體外的線性或指數型擴增，并生成包含若干重復序列(IO3~101°)的DNA長鏈，其對DNA的檢測靈敏度最高可達10個拷貝數。因其溫和的擴增條件和高效擴增的特點將與熒光、電化學、電化學發(fā)光等生物檢測技術可以實現(xiàn)高靈敏的生物分子檢測。滾環(huán)擴增技術在DNA、痕量蛋白、及生物小分子等生物分子診斷領域具有潛在的應用價值。通過滾環(huán)擴增技術可使與環(huán)狀DNA擴增模雜交的核酸DNA得到高效延伸，擴增所得長單鏈DNA，在均相溶液中，長單鏈DNA因其本身的柔性特性而相互纏繞而形成具備一定體積和狀態(tài)的交聯(lián)聚集體，通過光散射技術表征，可發(fā)現(xiàn)溶液的光散射強度會隨著聚集體的增大和濃度增高增強；且溶液的光散射強度用普通的熒光光度計通過激發(fā)光和發(fā)射光的同步掃描即可記錄下來；在室溫下，光散射強度在10分鐘之內即可達到最大值。與其他檢測分析方法相比，靈敏度更高、速度更快，操作也更簡單。同時也避免了其他方法中的多步反應和多步洗滌，從而避免了多步操作中所引入的誤差。

【發(fā)明內容】

[0004]為克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供一種利用滾環(huán)擴增技術將待測核酸序列擴增所得長單鏈DNA，因單鏈DNA的柔性特性，會聚集成團，再利用光散射技術檢測溶液中光散射強度從而檢測待測核酸的濃度的方法；
本發(fā)明的目的之二是利用滾環(huán)擴增技術將含有突變堿基的核酸序列擴增所得長單鏈DNA,然后結合光散射技術檢測溶液的光散射強度從而檢測待測核酸突變堿基的方法。[0005]一種利用滾環(huán)擴增和光散射技術進行核酸檢測的方法，其特征在于，根據待測核酸鏈的序列設計成環(huán)DNA的序列，在酶的作用下，成環(huán)DNA連接成封閉環(huán)狀DNA，加入擴增酶及其他擴增混合物后，在一定條件下，核酸鏈會以環(huán)狀DNA為擴增模板進行滾環(huán)擴增，擴增所得產物為長單鏈DNA，溶液中核酸鏈的濃度將決定產物長單鏈DNA的濃度，以及產物溶液的光散射強度，從而可利用產物的光散射強度變化檢測溶液中待測核酸鏈的濃度；利用瓊脂糖電泳以及原子力顯微鏡對產物長單鏈DNA進行表征和觀察，實現(xiàn)均相溶液中目標鏈及單喊基錯配的目標鏈的一步檢測；
所述的待測核酸為堿基數為10-20bp的DNA、RNA、mRNA、aptamer序列；所述的成環(huán)DNA序列為堿基數為60-210個堿基、5’端磷酸化修飾的一段DNA序列。
[0006]所述的封閉環(huán)狀DNA，其制備方法如下:
(1)成環(huán)DNA序列與待測核酸鏈混合均與后，高溫處理后，緩慢降至室溫，退火；
(2)加入連接酶進行連接；
(3)連接酶高溫變性；
(4)離心洗滌去除溶液中的酶；
步驟(1)所述的高溫處理為90°C高溫變性I分鐘。
[0007]步驟(2)所述的連接酶為T4 DNA連接酶，或E.coliDNA連接酶；連接條件為25°C，16小時，生成磷酸二酯鍵。
[0008]步驟(3)所述高溫變性為連接酶在65°C，10分鐘變性處理。
[0009]步驟(4)所述離心洗滌，超濾管規(guī)格為30KDa，離心條件為4°C，10000rpm/min，5分鐘。
[0010]所述的滾環(huán)擴增過程，具體為:
(1)環(huán)狀DNA模板與核酸鏈復合物溶液中加入滾環(huán)擴增混合物，混合均勻；
(2)置于水浴中擴增；
(3)phi29聚合酶變性.步驟(1)所述的擴增混合物為含有:dNTP，或bio-dNTP、或FITC-dNTP、或Cy3-dNTP、或放射性標記dNTP，10U/--L，終濃度為1U/--L的phi29聚合酶，和10Xphi29擴增緩沖液，擴增緩沖液終濃度為IX ;
步驟(2)所述的擴增條件為30°C水浴30分鐘-2小時；步驟(3)所述的phi29聚合酶變性條件為85°C，10-30分鐘。
[0011]所述的光散射強度，使用普通的熒光分光光度計即可通過激發(fā)光與發(fā)射光的同步掃描記錄產物長單鏈DNA溶液的光散射強度。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為掃描范圍為5微米的引物DNA擴增后的原子力顯微鏡成像圖片；
圖2為掃描范圍為200納米的引物DNA擴增后的原子力顯微鏡成像圖片。
【具體實施方式】
[0013]實施例1:
5 μ L 100 μ M預成環(huán)DNA與10 μ L 100 μ M待測核酸序列加入到0.5mL離心管中混合均勻，90°C下lmin，當管中溶液自然冷卻到室溫時，加入3μ LT4連接酶及2 μ LT4連接酶緩沖液，25°C環(huán)境下連接16小時以上，結束后，65°C條件下酶變性lOmin，酶作用完全后，用30KD的超濾管超濾(lOOOOrpm/min，5min),收集底部溶液，為環(huán)狀DNA-待測核酸的復合物溶液。
[0014]SyLmilliQ加入以下溶液:環(huán)狀DNA-待測核酸的復合物溶液(6yL)，dNTPs (2μ L, 10 mM), RCA buffer (2 μ L, 10 X), phi29 polymerase (2 μ L, 10 U/ μ L),混合溶液終體積為20 μ L。然后30°C水浴中擴增30 min。后90°C條件下酶變性lOmin，取10 μ L上樣，1%瓊脂糖電泳，電壓120V，30min。另10 μ L稀釋到90 μ LMill1-Q水中，取5 μ L滴到平整清潔云母表面,吸附3min后，Mill1-Q滴流沖洗,原子力顯微鏡Tapping-mode成像。
[0015]實施例2:
5 μ L 100 μ M預成環(huán)DNA與10 μ L 10 μ M待測核酸序列加入到0.5mL離心管中混合均勻，90°C下lmin，當管中溶液自然冷卻到室溫時，加入3μ LT4連接酶及2 μ LT4連接酶緩沖液，25°C環(huán)境下連接16小時以上，結束后，65°C條件下酶變性lOmin，酶作用完全后，用30KD的超濾管超濾(10000rpm/min, 5min),收集底部溶液，為環(huán)狀DNA-待測核酸的復合物溶液。
[0016]SyLmilliQ加入以下溶液:環(huán)狀DNA-待測核酸的復合物溶液(6yL)，dNTPs (2μ L, 10 mM), RCA buffer (2 μ L, 10 X), phi29 polymerase (2 μ L, 10 U/ μ L),混合溶液終體積為20 μ L。然后30°C水浴中擴增30 min。后90°C條件下酶變性lOmin，取10 μ L上樣，1%瓊脂糖電泳，電壓120V，30min。另10 μ L稀釋到90 μ LMill1-Q水中，取5 μ L滴到平整清潔云母表面,吸附3min后，Mill1-Q滴流沖洗,原子力顯微鏡Tapping-mode成像。 [0017]實施例3;
5 μ L 100 μ M預成環(huán)DNA與10 μ L I μ M待測核酸序列加入到0.5mL離心管中混合均勻，90°C下lmin，當管中溶液自然冷卻到室溫時，加入3 μ LT4連接酶及2 μ LT4連接酶緩沖液，25°C環(huán)境下連接16小時以上，結束后，65°C條件下酶變性lOmin，酶作用完全后，用30KD的超濾管超濾(10000rpm/min, 5min),收集底部溶液，為環(huán)狀DNA-待測核酸的復合物溶液。
[0018]SyLmilliQ加入以下溶液:環(huán)狀DNA-待測核酸的復合物溶液(6yL)，dNTPs (2μ L, 10 mM), RCA buffer (2 μ L, 10 X), phi29 polymerase (2 μ L, 10 U/ μ L),混合溶液終體積為20 μ L。然后30°C水浴中擴增30 min。后90°C條件下酶變性lOmin，取10 μ L上樣，1%瓊脂糖電泳，電壓120V，30min。另10 μ L稀釋到90 μ LMill1-Q水中，取5 μ L滴到平整清潔云母表面,吸附3min后，Mill1-Q滴流沖洗,原子力顯微鏡Tapping-mode成像。
[0019]實施例4:
5 μ L 100 μ M預成環(huán)DNA與10 μ L 0.1 μ M待測核酸序列加入到0.5mL離心管中混合均勻，90°C下lmin，當管中溶液自然冷卻到室溫時，加入3μ LT4連接酶及2 μ LT4連接酶緩沖液，25°C環(huán)境下連接16小時以上，結束后，65°C條件下酶變性lOmin，酶作用完全后，用30KD的超濾管超濾(10000rpm/min, 5min),收集底部溶液，為環(huán)狀DNA-待測核酸的復合物溶液。
[0020]SyLmilliQ加入以下溶液:環(huán)狀DNA-待測核酸的復合物溶液(6yL)，dNTPs (2μ L, 10 mM), RCA buffer (2 μ L, 10 X), phi29 polymerase (2 μ L, 10 U/ μ L),混合溶液終體積為20 μ L。然后30°C水浴中擴增30 min。后90°C條件下酶變性lOmin，取10 μ L上樣，1%瓊脂糖電泳，電壓120V，30min。另10 μ L稀釋到90 μ LMill1-Q水中，取5 μ L滴到平整清潔云母表面,吸附3min后，Mill1-Q滴流沖洗,原子力顯微鏡Tapping-mode成像。
[0021]實施例5:5 μ L 100 μ M預成環(huán)DNA與10 μ L 0.01 μ M待測核酸序列加入到0.5mL離心管中混合均勻，90°C下lmin，當管中溶液自然冷卻到室溫時，加入3μ LT4連接酶及2 μ LT4連接酶緩沖液，25°C環(huán)境下連接16小時以上，結束后，65°C條件下酶變性lOmin，酶作用完全后，用30KD的超濾管超濾(10000rpm/min, 5min),收集底部溶液，為環(huán)狀DNA-待測核酸的復合物溶液。
[0022]SyLmilliQ加入以下溶液:環(huán)狀DNA-待測核酸的復合物溶液(6yL)，dNTPs (2μ L, 10 mM), RCA buffer (2 μ L, 10 X), phi29 polymerase (2 μ L, 10 U/ μ L),混合溶液終體積為20 μ L。然后30°C水浴中擴增30 min。后90°C條件下酶變性lOmin，取10 μ L上樣，1%瓊脂糖電泳，電壓120V，30min。另10 μ L稀釋到90 μ LMill1-Q水中，取5 μ L滴到平整清潔云母表面,吸附3min后，Mill1-Q滴流沖洗,原子力顯微鏡Tapping-mode成像。
[0023]實施例6:
5yL 100μΜ預成環(huán)DNA與IOyLO,0.01,0.1、1、10、100 μ M共6組待測核酸序列分別加入到0.5mL離心管中混合均勻，90°C下lmin，當管中溶液自然冷卻到室溫時，加入3 μ LT4連接酶及2yLT4連接酶緩沖液，25°C環(huán)境下連接16小時以上，結束后，65°C條件下酶變性lOmin，酶作用完全后，用30KD的超濾管超濾(10000rpm/min，5min)，收集底部溶液，得到6組不同濃度的環(huán)狀DNA-待測核酸的復合物溶液。
[0024]8μ L milliQ加入以下溶液:不同濃度的6組環(huán)狀DNA-待測核酸的復合物溶液(6μ L), dNTPs (2 μ L, 10 mM)，RCA buffer (2 μ L, 10X), phi29 polymerase (2 μ L, 10 U/μ L)，混合溶液終體積為20 μ L0然后30°C水浴中擴增30 min。后90°C條件下酶變性lOmin，取10 μ L稀釋到 990 μ LMill1-Q水中，熒光分光度計上測試6組均相溶液的光散射濃度，統(tǒng)計數據并分析。
[0025]實施例7:
5μ L 100 μ M預成環(huán)DNA與10 μ L 100 μ M含一個錯配堿基的核酸序列加入到0.5mL離心管中混合均勻，90°C下lmin，當管中溶液自然冷卻到室溫時，加入3 μ LT4連接酶及2ULT4連接酶緩沖液，25°C環(huán)境下連接16小時以上，結束后，65°C條件下酶變性lOmin，酶作用完全后，用30KD的超濾管超濾(10000rpm/min, 5min),收集底部溶液，得到環(huán)狀DNA-待測核酸的復合物溶液。
[0026]SyLmilliQ加入以下溶液:環(huán)狀DNA-待測核酸的復合物溶液(6yL)，dNTPs (2μ L, 10 mM), RCA buffer (2 μ L, 10 X), phi29 polymerase (2 μ L, 10 U/ μ L),混合溶液終體積為20 μ L。然后30°C水浴中擴增30 min。后90°C條件下酶變性lOmin，取10 μ L稀釋到990 μ LMill1-Q水中，熒光分光度計上測試6組均相溶液的光散射濃度，統(tǒng)計數據并分析。
[0027]實施例8:
5μ L 100 μ M預成環(huán)DNA與10 μ L 100 μ M含兩個錯配堿基的核酸序列加入到0.5mL離心管中混合均勻，90°C下lmin，當管中溶液自然冷卻到室溫時，加入3 μ LT4連接酶及2ULT4連接酶緩沖液，25°C環(huán)境下連接16小時以上，結束后，65°C條件下酶變性lOmin，酶作用完全后，用30KD的超濾管超濾(10000rpm/min, 5min),收集底部溶液，得到環(huán)狀DNA-待測核酸的復合物溶液。
[0028]SyLmilliQ加入以下溶液:環(huán)狀DNA-待測核酸的復合物溶液(6yL)，dNTPs (2μ L, 10 mM), RCA buffer (2 μ L, 10 X), phi29 polymerase (2 μ L, 10 U/ μ L),混合溶液終體積為20 μ L。然后30°C水浴中擴增30 min。后90°C條件下酶變性lOmin，取10 μ L稀釋到990 μ LMill1-Q水中，熒光分光度計上測試6組均相溶液的光散射濃度，統(tǒng)計數據并分析。
[0029]實施例9:
5μ L 100 μ M預成環(huán)DNA與10 μ L 100 μ M含三個錯配堿基的核酸序列加入到0.5mL離心管中混合均勻，90°C下lmin，當管中溶液自然冷卻到室溫時，加入3 μ LT4連接酶及2 μ LT4連接酶緩沖液，25° C環(huán)境下連接16小時以上，結束后，65°C條件下酶變性lOmin，酶作用完全后，用30KD的超濾管超濾(10000rpm/min，5min)，收集底部溶液，得到環(huán)狀DNA-待測核酸的復合物溶液。
[0030]SyLmilliQ加入以下溶液:環(huán)狀DNA-待測核酸的復合物溶液(6yL)，dNTPs (2μ L, 10 mM), RCA buffer (2 μ L, 10 X), phi29 polymerase (2 μ L, 10 U/ μ L),混合溶液終體積為20 μ L。然后30°C水浴中擴增30 min。后90°C條件下酶變性lOmin，取10 μ L稀釋到990 μ LMill1-Q水中，熒光分光度計上測試6組均相溶液的光散射濃度，統(tǒng)計數據并分析。
[0031]實施例10:
5 μ L 100 μ M預成環(huán)DNA與10 μ L 100 μ M完全不相配對核酸序列加入到0.5mL離心管中混合均勻，90°C下lmin，當管中溶液自然冷卻到室溫時，加入3 μ LT4連接酶及2 μ LT4連接酶緩沖液，25°C環(huán)境下連接16小時以上，結束后，65°C條件下酶變性lOmin，酶作用完全后，用30KD的超濾管超濾(10000rpm/min, 5min),收集底部溶液，得到環(huán)狀DNA-待測核酸的復合物溶液。
[0032]SyLmilliQ加入以下溶液:環(huán)狀DNA-待測核酸的復合物溶液(6yL)，dNTPs (2μ L, 10 mM), RCA buffer ( 2 μ L, 10 X), phi29 polymerase (2 μ L, 10 U/ μ L),混合溶液終體積為20 μ L。然后30°C水浴中擴增30 min。后90°C條件下酶變性lOmin，取10 μ L稀釋到990 μ LMill1-Q水中，熒光分光度計上測試6組均相溶液的光散射濃度，統(tǒng)計數據并分析。
[0033]實施例11:
5 μ L 100 μ M預成環(huán)DNA與10 μ L 100 μ M完全配對堿基核酸序列、O μ M完全配對堿基核酸序列、100 μ M含一個錯配堿基的核酸序列、100 μ M完全不相配對堿基核酸序列4組待測核酸序列分別加入到0.5mL離心管中混合均勻，90°C下lmin，當管中溶液自然冷卻到室溫時，加入3 μ LT4連接酶及2 μ LT4連接酶緩沖液，25°C環(huán)境下連接16小時以上，結束后，65°C條件下酶變性IOmin,酶作用完全后,用30KD的超濾管超濾(10000rpm/min, 5min),收集底部溶液，得到4組不同濃度的環(huán)狀DNA-待測核酸的復合物溶液。
[0034]8 μ L mi 11 iQ加入以下溶液:不同濃度的4組環(huán)狀DNA-待測核酸的復合物溶液(6μ L), dNTPs (2 μ L, 10 mM)，RCA buffer (2 μ L, 10X), phi29 polymerase (2 μ L, 10 U/μ L)，混合溶液終體積為20 μ L0然后30°C水浴中擴增30 min。后90°C條件下酶變性lOmin，取10 μ L稀釋到990 μ LMill1-Q水中，熒光分光度計上測試6組均相溶液的光散射濃度，統(tǒng)計數據并分析。
【權利要求】
1.一種利用滾環(huán)擴增和光散射技術進行核酸檢測的方法，其特征在于，根據待測核酸鏈的序列設計成環(huán)DNA的序列，在酶的作用下，成環(huán)DNA連接成封閉環(huán)狀DNA，加入擴增酶及其他擴增混合物后，在一定條件下，核酸鏈會以環(huán)狀DNA為擴增模板進行滾環(huán)擴增，擴增所得產物為長單鏈DNA，溶液中核酸鏈的濃度將決定產物長單鏈DNA的濃度，以及產物溶液的光散射強度，從而可利用產物的光散射強度變化檢測溶液中待測核酸鏈的濃度；利用瓊脂糖電泳以及原子力顯微鏡對產物長單鏈DNA進行表征和觀察，實現(xiàn)均相溶液中目標鏈及單喊基錯配的目標鏈的一步檢測； 所述的待測核酸為堿基數為10-20bp的DNA、RNA、mRNA、aptamer序列；所述的成環(huán)DNA序列為堿基數為60-210個堿基、5’端磷酸化修飾的一段DNA序列。
2.根據權利要求1所述利用滾環(huán)擴增和光散射技術進行核酸檢測的方法，其特征在于，所述的封閉環(huán)狀DNA，其制備方法如下: (1)成環(huán)DNA序列與待測核酸鏈混合均與后，高溫處理后，緩慢降至室溫，退火； (2)加入連接酶進行連接； (3)連接酶高溫變性； (4)離心洗滌去除溶液中的酶。
3.根據權利要求2所述利用滾環(huán)擴增和光散射技術進行核酸檢測的方法，其特征在于，步驟(1)所述的高溫處理為90°C高溫變性I分鐘。
4.根據權利要求2 所述利用滾環(huán)擴增和光散射技術進行核酸檢測的方法，其特征在于，步驟(2)所述的連接酶為T4 DNA連接酶，或E.coliDNA連接酶；連接條件為25°C，16小時，生成憐Ife二酷鍵。
5.根據權利要求2所述利用滾環(huán)擴增和光散射技術進行核酸檢測的方法，其特征在于，步驟(3)所述高溫變性為連接酶在65°C，10分鐘變性處理。
6.根據權利要求2所述利用滾環(huán)擴增和光散射技術進行核酸檢測的方法，其特征在于，步驟(4)所述離心洗滌，超濾管規(guī)格為30KDa，離心條件為4°C，10000rpm/min，5分鐘。
7.根據權利要求1所述利用滾環(huán)擴增和光散射技術進行核酸檢測的方法，其特征在于，所述的滾環(huán)擴增過程，具體為: (1)環(huán)狀DNA模板與核酸鏈復合物溶液中加入滾環(huán)擴增混合物，混合均勻； (2)置于水浴中擴增； (3)phi29聚合酶變性。
8.根據權利要求7所述利用滾環(huán)擴增和光散射技術進行核酸檢測的方法，其特征在于，步驟(1)所述的擴增混合物為含有:dNTP，或bio-dNTP、或FITC-dNTP、或Cy3_dNTP、或放射性標記dNTP，10U/--L，終濃度為1U/--L的phi29聚合酶，和10Xphi29擴增緩沖液，擴增緩沖液終濃度為IX。
9.根據權利要求7所述利用滾環(huán)擴增和光散射技術進行核酸檢測的方法，其特征在于，步驟(2)所述的擴增條件為30°C水浴30分鐘-2小時；步驟(3)所述的phi29聚合酶變性條件為85 °C，10-30分鐘。
10.根據權利要求1所述利用滾環(huán)擴增和光散射技術進行核酸檢測的方法，其特征在于，所述的光散射強度，使用普通的熒光分光光度計即可通過激發(fā)光與發(fā)射光的同步掃描記錄產物長單鏈DNA溶液的光散射強度。
【文檔編號】C12Q1/68GK104017869SQ201410230468
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年5月28日 優(yōu)先權日:2014年5月28日
【發(fā)明者】何丹農, 顏娟, 胡沖婭 申請人:上海納米技術及應用國家工程研究中心有限公司