一種利用鎖式探針滾環(huán)擴增的snp分型檢測方法
【專利說明】一種利用鎖式探針滾環(huán)擴増的SNP分型檢測方法 【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物領域的一種檢測方法，具體涉及一種利用鎖式探針滾環(huán)擴增的 SNP分型檢測方法。 【【背景技術】】
[0002]作為第三代DNA遺傳標記，單核苷酸多態(tài)性(SNP)具有分布廣、數量大、易于檢測和 在基因組中相對穩(wěn)定的特點，其不同基因型與個人及群體對很多重要生理現(xiàn)象及其發(fā)展進 程有很大相關性。對SNP的基因型進行檢測是現(xiàn)代分子生物學重點發(fā)展方向，也是現(xiàn)代分子 病理學的研究方向之一，已成為相關研究領域中的熱點。
[0003]目前常用的對SNP檢測方法多采用先提取相關基因組，然后以PCR技術為基礎進行 基因擴增，再聯(lián)合其他檢測方法如DNA測序，內切酶酶切等進行。這些方法雖然能夠獲取相 關SNP基因型信息，但是操作繁瑣、成本高，而SNP的分子生物學特征又決定了只有獲取大量 SNP位點信息時才能對重要生理和病理活動進行分子生物學和分子病理學意義上的研究和 預測;在大樣本情況下，對血液樣品進行基因組提取，不僅進一步增加了操作的繁瑣程度、 耗時費力，而且又增加了樣品間交叉污染的可能性，同時也增加了操作人員的感染風險。因 此，目前有關SNP的相關性研究多在相關實驗室進行，這極大地限制了SNP在分子生物學中 的研究，而針對SNP的研究要進一步發(fā)展，最終要在醫(yī)療領域起到作用，則需要開發(fā)一種快 速、簡易、準確、經濟的SNP檢測方法以推進基因檢測和分型的研究與發(fā)展。
[0004]鎖式探針-滾環(huán)擴增(RCA)技術利用鎖式探針特異地與待測基因組靶基因序列結 合，在DNA連接酶的作用下成環(huán)，然后再以成環(huán)產物為模板進行滾環(huán)擴增，最后檢測是否有 滾環(huán)擴增產物，從而研究待測基因組的特征。鎖式探針-RCA技術具有準確性好、靈敏度高、 操作方便等特點，在分子生物學領域如植物病毒分型檢測、基因多態(tài)性或突變中已經得到 了應用，目前也有人嘗試在SNP檢測中進行應用，但還未見相關文獻報道。
[0005]外周血成分復雜，各種酶類、蛋白質、血紅素等的影響，造成基因組的暴露不完全 或成環(huán)反應被抑制，擴增效率不好等，特別是鎖式探針-RCA技術體系，都是以提純的基因組 為模板，因此當前基于滾環(huán)擴增的檢測不僅操作繁瑣、工作量大、成本高、易造成樣本間交 叉污染，還會增加操作者感染幾率；因此，目前還沒有鎖式探針-滾環(huán)擴增體系直接針對外 周血樣品進行檢測的研究報道。 【
【發(fā)明內容】
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[0006]本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種利用鎖式探針滾環(huán)擴增的SNP分型檢測 方法。
[0007]本發(fā)明是通過以下技術方案解決上述技術問題的：一種利用鎖式探針滾環(huán)擴增的 SNP分型檢測方法，包括如下具體操作步驟：
[0008] (1)鎖式探針與擴增引物的設計：從g e n e b a n k數據庫獲取E R A P1的S N P位點 (rs27044)的所有參考基因型，并獲取每個位點上下游各500bp的基因序列，用primer 5.0 軟件設計出兩等位基因特異性鎖式探針與兩擴增引物；
[0009] (2)鎖式探針磷酸化:對設計所得的等位基因特異性鎖式探針的5'端進行磷酸化 反應，具體地，分別取0.lymol等位基因特異性鎖式探針加入到10yLT4磷酸化激酶反應緩 沖液中：往反應體系中加入ImMdATP、2.0U的T4多核苷酸激酶，37°C孵育30分鐘;得磷酸化 后的鎖式探針；
[0010] (3)鎖式探針成環(huán)反應:取ΙΟμΜ待檢測樣品即外周血樣或者預提純得到基因組樣 品lyL，加入濃度為ΙΟμΜ的上述磷酸化后的鎖式探針0.5yL，并加入lyL10XTaqDNA連接酶 緩沖液、〇. 2mg/ml的BSA、13 %甘油、調整Mg2+濃度為10Mm，PH值為9.3，再加入6.5yL的無菌 雙蒸水，接著加入l〇yL的礦物油封閉，95°C5min，室溫10min;然后加入40U/yL的TaqDNA連 接酶0.5以1^，95°〇511^11，45°〇4小時成環(huán)反應;最后95°(3滅活151^11 ;
[0011] (4)酶切反應:在上述成環(huán)反應液中加入l.lyLΙΟΧΕχοIII緩沖液，然后再加入 0.4yLlOU/yL的核酸外切酶I和0.2yLlOOU/yL的核酸外切酶III;于37°C孵育lh，85°C孵育 30min滅活核酸外切酶；
[0012] (5)滾環(huán)擴增反應:取上述酶切后的成環(huán)反應產物3yL，加入兩擴增引物各0.5yL， 接著加入1此1〇XThermoPolReactionBuffer、3.9yL的無菌雙蒸水，之后加入10yL的礦物 油封閉，95°C5min，室溫 10min，然后于反應液中加入20xBSAlyL、10mMdNTPs0.8yL、8U/yL BstDNA聚合酶0.3yL，并于65°C反應2h;
[0013](6)SNP分型檢定:取上述滾環(huán)擴增反應所得的反應物并進行1%瓊脂糖凝膠電泳 檢測，通過電泳檢測結果即可判定SNP的基因型。
[0014]進一步地，所述lOXTaq DNA連接酶緩沖液的組分為：200mM Tris-HCl、250mM KAc、100mM Mg(Ac)2、100mM DTT、10mM NAD、0.1%Triton X-100、pH7.6。
[0015]進一步地，所述lOXExoIII緩沖液，緩沖液由500mMpH為8.0的Tris-HCl，50mM MgCl2，100mM疏基乙醇組成，
[0016]進一步地，所述lOXThermoPol Reaction Buffer的組分為：200mM pH為8.8的 Tris-HCl、100mM KCl、100mM(NH4)2S〇4、20mM MgS〇4、0.1%Triton X-100。
[0017]進一步地，所述T4磷酸化激酶反應緩沖液的組分為：70mMpH為7.6的Tris-HCl、 10mMMgCl2、5mMDTT。
[0018]本發(fā)明的有益效果在于:建立了一種利用鎖式探針滾環(huán)擴增的SNP分型檢測方法， 其能夠直接針對外周血等生物樣品進行SNP分型檢測，省去了基因組的提取過程，不僅大大 縮短了操作步驟和檢測時間，節(jié)省了成本、降低了操作人員交叉感染的風險，具有很大的推 廣前景，而且檢測結果準確、靈敏。 【【附圖說明】】
[0019]下面參照附圖結合實施例對本發(fā)明作進一步的描述。
[0020] 圖1是本發(fā)明SNP分型檢測方法的原理圖；
[0021]圖2是本發(fā)明中實施例2樣品I提純組DNA的SNP位點（rs27044)基因型時檢測時的 1 %瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0022]圖3是本發(fā)明中實施例2樣品Π提純組DNA的SNP位點（rs27044)基因型時檢測時 的1 %瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0023]圖4是本發(fā)明中實施例3外周血樣品I和Π檢測時的1 %瓊脂糖凝膠電泳圖，其中G1、C1泳道為樣品I檢測結果，G2、C2為樣品2檢測結果。 【【具體實施方式】】
[0024]請參閱圖1，本發(fā)明一種利用鎖式探針滾環(huán)擴增的SNP分型檢測方法的具體操作請 詳細參照如下實施例1。
[0025] 實施例1
[0026] 一、鎖式探針與擴增引物的設計
[0027] 從genebank數據庫獲取ERAP1基因上SNP位點（rs27044)所有參考基因型，并獲取 此單核苷酸多態(tài)性位點上下游各500bp的基因序列，用primer5.0軟件設計出兩等位基因 特異性鎖式探針(為了簡化描述，后續(xù)直接簡稱為鎖式探針)與兩擴增引物。其中：
[0028] 檢測rs27044位點：兩鎖式探針（如SEQIDN0: 1、2所示）：卩^-15'-TGAGGCGTCGTAAGCCATAAGTAGGATAGGACAGGAAAGAAACGCTCCTCATCATCAAG-3 '，Pro-25 '-TGAGGCGTCGTAAGCCATAAGTAGGATAGGACAGGAAAGAAACGCTCCTCATCATCAAC-3 '；兩擴增引物(如 SEQIDN0:3、4所示）：第一引物5'-CTTTCCTGTCCTATCCTACTTATG-3'，第二引物5'-CTCCTCATCATCAACTG-3'；
[0029] 二、鎖式探針磷酸化
[0030] 對設計所得的等位基因特異性鎖式探針的5'端進行磷酸化反應，具體地，分別取 0.Ιμπιο?等位基因特異性鎖式探針加入到10yLT4磷酸化激酶反應緩沖液中：往反應體系中 加入ImMdATP、2.0U的T4多核苷酸激酶，37°C孵育30分鐘;得磷酸化后的鎖式探針。
[0031] 三、鎖式探針成環(huán)反應
[0032] 取ΙΟμΜ待檢測樣品即外周血樣lyL，加入濃度為ΙΟμΜ的上述磷酸化后的