一種基于活性功能分子標(biāo)記蔗糖酶信號(hào)系統(tǒng)及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及生物化學(xué)物質(zhì)的檢測(cè)和分析領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種基于活性功能分子標(biāo)記蔗糖酶信號(hào)系統(tǒng)及其應(yīng)用。信號(hào)系統(tǒng)為結(jié)合有特異性的功能分子的蔗糖酶。所述信號(hào)系統(tǒng)作為信號(hào)探針用于生物分析領(lǐng)域中對(duì)生物分子進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明利用活性功能分子標(biāo)記蔗糖酶生物分子，用其檢測(cè)檢測(cè)控制生物分子濃度的變化，能夠快速檢測(cè)對(duì)微生物和細(xì)胞。相對(duì)于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫反應(yīng)吸附的測(cè)量，利用便攜式血糖儀分析系統(tǒng)來(lái)快速檢測(cè)和分析生物分子具有顯著的特異性，同時(shí)準(zhǔn)確性高。利用活性功能小分子標(biāo)記半導(dǎo)體聚合物信號(hào)系統(tǒng)來(lái)快速檢測(cè)和分析生物分子，具有穩(wěn)定性好、靈敏度高，不容易失活，價(jià)格便宜等優(yōu)勢(shì)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】 一種基于活性功能分子標(biāo)記蔗糖酶信號(hào)系統(tǒng)及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物化學(xué)物質(zhì)的檢測(cè)和分析領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種基于活性功能分子標(biāo)記蔗糖酶信號(hào)系統(tǒng)及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]在環(huán)境安全檢測(cè)和人體健康的監(jiān)控中，許多生物靶點(diǎn)分子的含量非常低。很多生物信號(hào)分子、有害微生物或腫瘤細(xì)胞在初期濃度非常低，需要對(duì)靶點(diǎn)物質(zhì)進(jìn)行信號(hào)放大才可以檢測(cè)分析。目前，研究者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了集中幾種信號(hào)放大的技術(shù)來(lái)檢測(cè)低豐度靶點(diǎn)，包括銀增加強(qiáng)反應(yīng)、酪氨酸信號(hào)放大、酶金屬礦化和滾環(huán)放大報(bào)告系統(tǒng)。銀增強(qiáng)反應(yīng)基于納米金催化沉淀銀，從而來(lái)檢測(cè)核酸、蛋白質(zhì)和微生物等有害物質(zhì)(Wan, Y.,Wang, Y.,ffu, J., Zhang, D., 201 lb.Analytical Chemistry83 (3), 648-653 ；Taton, T.A., Mirkin, C.A.，Letsinger, R.L.，2000.Science289 (5485)，1757-1760.)。相對(duì)銀增強(qiáng)的技術(shù)來(lái)說(shuō)，替代的方案用過(guò)氧化物酶來(lái)催化銀的沉淀，這種方法叫酶礦化技術(shù)(Mdl ler, R.，Powell, R.D.，Hainfeld, J.F.，F(xiàn)ritzsche, W.，2005.Nano Letters5 (7)，1475-1482)。最近出現(xiàn)一種超靈敏的技術(shù)，結(jié)合氫化酶標(biāo)記的酶聯(lián)免疫反應(yīng)來(lái)控制納米金生成過(guò)程，產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的信號(hào)(de la Rica, R., Stevens, Μ.Μ., 2012.Nature Nanotechnology do1:10.1038/nnan0.2012.186)，來(lái)分析生物靶點(diǎn)物質(zhì)。酪氨酸信號(hào)放大系統(tǒng)結(jié)合生物沉淀和熒光標(biāo)記來(lái)增強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)免疫反應(yīng)的靈敏度(Clutter, M.R., Heffner, G.C., Krutzik, P.0., Sachen, K.L., Nolan, G.P., 2010.Cytometry Part A77A(11)，1020-1031)。滾環(huán)放大技術(shù)是一種恒溫核酸擴(kuò)增方法，在RCA反應(yīng)中，DNA目標(biāo)鏈可沿環(huán)形探針頂替擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)高靈敏度的檢測(cè)；同時(shí)環(huán)形探針的鏈接成環(huán)對(duì)DNA單堿基錯(cuò)配有很高的特異性，適合單核苷酸突變的分析檢測(cè)。
[0003]聚合物信號(hào)標(biāo)記也得到了廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。比如，Chan等報(bào)道一種聚合物與半導(dǎo)體量子點(diǎn)雜合的信號(hào)標(biāo)記物，再用親和素修飾得到相應(yīng)的標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記腫瘤細(xì)胞(Chan, Y.-H.；Ye, F.；Gallina, Μ.Ε.；Zhang, X.； Jin, Y.；ffu, 1.C.；Chiu, D.T., HybridSemiconducting Polymer Dot-Quantum Dot with Narrow-Band Emiss1n, Near-1nfraredFluorescence,and High Brightness.Journal of the American ChemicalSociety2012, 134，7309-7312.)。
[0004]酶標(biāo)的分析檢測(cè)一直以來(lái)都得到生化學(xué)家的關(guān)注和親睞。比如辣根過(guò)氧化物用于酶聯(lián)免疫反應(yīng)、堿性磷酸酶用于生物化學(xué)組織染色，最近的氫化酶也用于超靈敏的分析和檢測(cè)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的在于提供一種基于活性功能分子標(biāo)記蔗糖酶信號(hào)系統(tǒng)及其應(yīng)用。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為:
[0007]—種基于活性功能分子標(biāo)記蔗糖酶信號(hào)系統(tǒng)，信號(hào)系統(tǒng)為結(jié)合有特異性的功能分子的蔗糖酶。
[0008]所述特異性的功能分子為凝集素、微生物抗體、微生物適配體、抗生素、寡糖、適配體或D-型氨基酸。
[0009]所述凝集素為麥胚素、刀豆素、花生凝集素或大豆凝集素。
[0010]所述微生物抗體為大腸桿菌抗體、金黃色葡萄球菌抗體、愛(ài)德華遲緩細(xì)菌抗體、銅綠假單胞菌抗體或費(fèi)氏弧菌抗體。
[0011]所述抗生素為萬(wàn)古霉素、多粘菌素、達(dá)托霉素或枯草桿菌肽。
[0012]所述寡糖為括棉籽糖、水蘇糖、麥芽寡糖或大豆寡糖。
[0013]所述D-型氨基酸為D-丙氨酸或D-谷氨酸。
[0014]一種基于活性功能分子標(biāo)記蔗糖酶信號(hào)系統(tǒng)的應(yīng)用，所述信號(hào)系統(tǒng)作為信號(hào)探針用于生物分析領(lǐng)域中對(duì)生物分子進(jìn)行檢測(cè)。
[0015]所述所述信號(hào)系統(tǒng)作為信號(hào)探針定量和/定性的對(duì)微生物和細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。
[0016]所述所述信號(hào)系統(tǒng)作為血糖儀分析系統(tǒng)中的信號(hào)探針定量和/定性的對(duì)微生物和細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。
[0017]本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn):
[0018]本發(fā)明利用活性分子(微生物抗體、凝集素、微生物適配體、抗生素、寡糖)標(biāo)記的蔗糖酶系統(tǒng)來(lái)快速檢測(cè)和分析微生物細(xì)胞，用其檢測(cè)檢測(cè)控制生物分子濃度的變化，能夠快速檢測(cè)對(duì)微生物和細(xì)胞。同時(shí)將本發(fā)明信號(hào)系統(tǒng)應(yīng)用于便攜式血糖儀系統(tǒng)中，能夠?qū)ξ⑸锟焖贆z測(cè)。其相對(duì)于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫反應(yīng)吸附的測(cè)量，利用信號(hào)標(biāo)記系統(tǒng)來(lái)快速檢測(cè)和分析生物分子具有顯著的特異性，同時(shí)準(zhǔn)確性高。利用活性功能小分子標(biāo)記信號(hào)系統(tǒng)來(lái)快速檢測(cè)和分析生物分子，具有穩(wěn)定性好、靈敏度高，不容易失活，價(jià)格便宜等優(yōu)勢(shì)。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的基于適配體標(biāo)記蔗糖酶快速便攜式血糖儀診斷示意圖(a)，比較不同模式下檢測(cè)信號(hào)(b):單獨(dú)微生物存在(I)，微生物加蔗糖(2)，微生物-蔗糖標(biāo)記適配體與蔗糖培育PH7.4 (3)和微生物-蔗糖標(biāo)記適配體與蔗糖培育pH4.5 (4)。
[0020]圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的微生物-適配體蔗糖酶復(fù)合物在不同PH條件培育信號(hào)變化(a)、微生物-適配體蔗糖酶復(fù)合物在不同溫度條件培育信號(hào)變化(b)、微生物與適配體蔗糖酶復(fù)合物培育不同時(shí)間變化的信號(hào)變化(C)和微生物與適配體蔗糖酶復(fù)合物和蔗糖培育不同時(shí)間的信號(hào)變化(d)。
[0021]圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的便攜式血糖儀系統(tǒng)對(duì)金黃色葡萄球菌和遲緩愛(ài)德華菌檢測(cè)的線性關(guān)系(a)，快速分析八種微生物的信號(hào)特異性(b)和細(xì)菌混合的信號(hào)變化影響(C)。

【具體實(shí)施方式】
[0022]下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0023]實(shí)施例1:
[0024]萬(wàn)古霉素功能化的蔗糖酶對(duì)微生物的檢測(cè)功能:
[0025]萬(wàn)古霉素-蔗糖酶復(fù)合物的制備:0.1ml聚乙二醇(5% )和0.1ml HEPES緩沖液(lmol L—1)分別加入到5ml蔗糖酶溶液中。而后再將0.5ml萬(wàn)古霉素(5mg mL—1)接著加入，攪拌混合體系30min。然后，再將新鮮配置的0.1mll-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽EDC(5mg ml/1)加入混合液中攪拌2小時(shí)。反應(yīng)的混合物在透析袋(截留分子量300)中透析2天，移除未交聯(lián)的分子。再加入50 μ L Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)(2.0wt% );即得到萬(wàn)古霉素-蔗糖酶復(fù)合物。
[0026]微生物標(biāo)記檢測(cè):金黃色葡萄球用PBS緩沖液清洗兩次。再與萬(wàn)古霉素-蔗糖酶復(fù)合物(5μ g mL—1)室溫下培育0.5小時(shí)。過(guò)量未結(jié)合的萬(wàn)古霉素-蔗糖酶復(fù)合物用PBS清洗兩次，再加入0.5mol L-1蔗糖(ρΗ4.5)，培育0.5h，取40 μ L混合液，用1.1 μ L的NaOH(IM)調(diào)節(jié)P H到中性。得到的溶液取5yL用羅氏血糖儀檢測(cè)(參見(jiàn)圖la)。這種方法首先在蔗糖酶最優(yōu)化的P H(4.5)條件下催化蔗糖分解，然后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)到中性，用便攜式血糖儀來(lái)檢測(cè)微生物。大腸桿菌的檢測(cè)線為4.5X 13Cfu ml—1，線性范圍為4.5X 104cfu ml—1—4.5 X 19Cfu Iiir1O
[0027]實(shí)施例2:
[0028]金黃色葡萄球菌適配體功能化的蔗糖酶對(duì)微生物的檢測(cè)功能:
[0029]50 μ L氨基修飾金黃色葡萄球菌適配體(ImM)與25 μ L硼酸緩沖液(ρΗ9.2)。然后加入25mg PPD,在室溫下反應(yīng)2h。然后加入5mL水a(chǎn)nd5mL正丁醇反應(yīng)15min,有機(jī)溶液被移除。用超濾離心管(Amicon Ultra-ΙΟΚ)純化活化的適配體。再加入8mg蔗糖酶，使其在室溫下反應(yīng)2天，用超濾離心管(Amicon Ultra-ΙΟΟΚ)純化，獲得適配體標(biāo)記蔗糖酶。
[0030]微生物標(biāo)記檢測(cè):金黃色葡萄球菌用PBS緩沖液清洗兩次。再與金黃色葡萄球菌適配體-蔗糖酶復(fù)合物(5 μ g mL—1)室溫下培育0.5小時(shí)。過(guò)量未結(jié)合的金黃色葡萄球菌適配體-蔗糖酶復(fù)合物用PBS清洗兩次，再加入0.5mol L—1蔗糖(pH4.5)，培育0.5h，取40 μ L混合液，用1.1 μ L的NaOH(IM)調(diào)節(jié)ρ H到中性。得到的溶液取5 μ L用羅氏血糖儀檢測(cè)(參見(jiàn)圖la)。這種方法首先在蔗糖酶最優(yōu)化的ρ H (4.5)條件下催化蔗糖分解，然后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)到中性，用便攜式血糖儀來(lái)檢測(cè)微生物。檢測(cè)線為3.0X 13Cfu ml-1,線性范圍為 3.0XlO4Cfuml-1 — 3.0XlO9Cfu ml'
[0031]實(shí)施例3:
[0032]微生物抗體功能化的蔗糖酶對(duì)微生物的檢測(cè)功能:
[0033]50 μ L大腸桿菌抗體(ImM)。然后加入5mg馬來(lái)酸和琥拍酸功能化的乙二醇交聯(lián)劑，在室溫下反應(yīng)2h。用超濾離心管(Amicon Ultra-ΙΟΚ)純化活化的抗體。再加入8mg鹿糖酶，使其在室溫下反應(yīng)2天,用超濾離心管(Amicon Ultra-ΙΟΟΚ)純化,獲得抗體標(biāo)記鹿糖酶。
[0034]微生物標(biāo)記檢測(cè):大腸桿菌用PBS緩沖液清洗兩次。再與大腸桿菌抗體-蔗糖酶復(fù)合物(5 yg mL—1)室溫下培育0.5小時(shí)。過(guò)量未結(jié)合的大腸桿菌抗體-蔗糖酶復(fù)合物用PBS清洗兩次，再加入0.5mol L-1蔗糖(ρΗ4.5)，培育0.5h，取40 μ L混合液，用1.1 μ L的NaOH(IM)調(diào)節(jié)ρ H到中性。得到的溶液取5 μ L用羅氏血糖儀檢測(cè)(參見(jiàn)圖1a)。這種方法首先在蔗糖酶最優(yōu)化的P H(4.5)條件下催化蔗糖分解，然后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)到中性，用便攜式血糖儀來(lái)檢測(cè)微生物。大腸桿菌的檢測(cè)線為2.7X 13Cfu ml-1,線性范圍為2.7X 14Cfuml 1—2.7 X 109cfu ml、
[0035]實(shí)施例4:
[0036]微生物凝集素功能化的蔗糖酶對(duì)微生物的檢測(cè)功能:
[0037]50 μ L凝集素(ImM)。然后加入5mg馬來(lái)酸和琥珀酸功能化的乙二醇交聯(lián)劑，在室溫下反應(yīng)2h。用超濾離心管(Amicon Ultra-ΙΟΚ)純化活化的抗體。再加入8mg鹿糖酶,使其在室溫下反應(yīng)2天，用超濾離心管(Amicon Ultra-100Κ)純化，獲得凝集素標(biāo)記蔗糖酶。
[0038]微生物標(biāo)記檢測(cè):大腸桿菌用PBS緩沖液清洗兩次。再與凝集素-蔗糖酶復(fù)合物(5 μ g mL—1)室溫下培育0.5小時(shí)。過(guò)量未結(jié)合的凝集素-蔗糖酶復(fù)合物用PBS清洗兩次，再加入0.5mol L-1蔗糖(ρΗ4.5)，培育0.5h，取40 μ L混合液，用1.1 μ L的NaOH(IM)調(diào)節(jié)ρH到中性。得到的溶液取5μ L用羅氏血糖儀檢測(cè)(參見(jiàn)圖la)。這種方法首先在蔗糖酶最優(yōu)化的P H(4.5)條件下催化蔗糖分解，然后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)到中性，用便攜式血糖儀來(lái)檢測(cè)微生物。檢測(cè)線為 3.6X 13Cfu ml-1,線性范圍為 3.6X 14Cfu ml-1—3.6X 109cfu ml'
[0039]實(shí)施例5:
[0040]微生物抗體功能化的蔗糖酶對(duì)微生物的檢測(cè)功能:
[0041]50 μ L金黃色葡萄球菌抗體(ImM)。然后加入5mg馬來(lái)酸和琥珀酸功能化的乙二醇交聯(lián)劑，在室溫下反應(yīng)2h。用超濾離心管(Amicon Ultra-ΙΟΚ)純化活化的抗體。再加入8mg鹿糖酶,使其在室溫下反應(yīng)2天,用超濾離心管(Amicon Ultra-100Κ)純化,獲得金黃色葡萄球菌抗體標(biāo)記蔗糖酶。
[0042]微生物標(biāo)記檢測(cè):金黃色葡萄球菌用PBS緩沖液清洗兩次。再與金黃色葡萄球菌抗體-蔗糖酶復(fù)合物(5 μ g mL—1)室溫下培育0.5小時(shí)。過(guò)量未結(jié)合的金黃色葡萄球菌抗體-蔗糖酶復(fù)合物用PBS清洗兩次，再加入0.5mol L-1蔗糖(ρΗ4.5)，培育0.5h，取40 μ L混合液，用1.1yL的NaOH(IM)調(diào)節(jié)ρ H到中性。得到的溶液取5 μ L用羅氏血糖儀檢測(cè)(參見(jiàn)圖1a)。這種方法首先在蔗糖酶最優(yōu)化的P H(4.5)條件下催化蔗糖分解，然后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)到中性，用便攜式血糖儀來(lái)檢測(cè)微生物。檢測(cè)線為1.5Χ 13Cfu ml-1,線性范圍為 1.5 X 14Cfu ml-1 — Ι.5 X 19Cfu ml'
[0043]實(shí)施例6:
[0044]微生物抗體功能化的蔗糖酶對(duì)微生物的檢測(cè)功能:
[0045]50 μ L愛(ài)德華遲緩細(xì)菌抗體(ImM)。然后加入5mg馬來(lái)酸和琥珀酸功能化的乙二醇交聯(lián)劑，在室溫下反應(yīng)2h。用超濾離心管(Amicon Ultra-ΙΟΚ)純化活化的抗體。再加入8mg鹿糖酶,使其在室溫下反應(yīng)2天,用超濾離心管(Amicon Ultra-ΙΟΟΚ)純化,獲得愛(ài)德華遲緩細(xì)菌抗體標(biāo)記鹿糖酶。
[0046]微生物標(biāo)記檢測(cè):愛(ài)德華遲緩細(xì)菌用PBS緩沖液清洗兩次。再與愛(ài)德華遲緩細(xì)菌抗體-蔗糖酶復(fù)合物(5yg ml-1)室溫下培育0.5小時(shí)。過(guò)量未結(jié)合的愛(ài)德華遲緩細(xì)菌抗體-蔗糖酶復(fù)合物用PBS清洗兩次，再加入0.5mol L-1蔗糖(ρΗ4.5)，培育0.5h，取40 μ L混合液，用1.1yL的NaOH(IM)調(diào)節(jié)ρ H到中性。得到的溶液取5 μ L用羅氏血糖儀檢測(cè)(參見(jiàn)圖la)。這種方法首先在蔗糖酶最優(yōu)化的ρ H (4.5)條件下催化蔗糖分解，然后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)到中性，用便攜式血糖儀來(lái)檢測(cè)微生物。檢測(cè)線為2.0X 13Cfu ml-1,線性范圍為 2.0XlO4Cfu ml-1—2.0X 18Cfu ml'
[0047]實(shí)施例7:
[0048]微生物抗體功能化的蔗糖酶對(duì)微生物的檢測(cè)功能:
[0049]50 μ L銅綠假單胞菌細(xì)菌抗體(ImM)。然后加入5mg馬來(lái)酸和琥珀酸功能化的乙二醇交聯(lián)劑，在室溫下反應(yīng)2h。用超濾離心管(Amicon Ultra-ΙΟΚ)純化活化的抗體。再加入8mg鹿糖酶,使其在室溫下反應(yīng)2天,用超濾離心管(Amicon Ultra-ΙΟΟΚ)純化,獲得銅綠假單胞菌抗體標(biāo)記鹿糖酶。
[0050]微生物標(biāo)記檢測(cè):銅綠假單胞菌用PBS緩沖液清洗兩次。再與銅綠假單胞菌細(xì)菌抗體-蔗糖酶復(fù)合物(5yg mL—1)室溫下培育0.5小時(shí)。過(guò)量未結(jié)合的銅綠假單胞菌細(xì)菌抗體-蔗糖酶復(fù)合物用PBS清洗兩次，再加入0.5mol L—1蔗糖(pH4.5)，培育0.5h，取40 μ L混合液，用1.1 μ L的NaOH(IM)調(diào)節(jié)ρ H到中性。得到的溶液取5 μ L用羅氏血糖儀檢測(cè)(參見(jiàn)圖la)。這種方法首先在蔗糖酶最優(yōu)化的ρ H (4.5)條件下催化蔗糖分解，然后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)到中性，用便攜式血糖儀來(lái)檢測(cè)微生物。檢測(cè)線為5.5X 13Cfu ml-1,線性范圍為 5.5 X 15Cfu ml-1—5.5 XlO9Cfu ml-1.
[0051]實(shí)施例8:
[0052]微生物抗體功能化的蔗糖酶對(duì)微生物的檢測(cè)功能:
[0053]50 μ L費(fèi)氏弧菌細(xì)菌抗體(ImM)。然后加入5mg馬來(lái)酸和琥珀酸功能化的乙二醇交聯(lián)劑，在室溫下反應(yīng)2h。用超濾離心管(Amicon Ultra-ΙΟΚ)純化活化的抗體。再加入8mg鹿糖酶,使其在室溫下反應(yīng)2天，用超濾離心管(Amicon Ultra-ΙΟΟΚ)純化,獲得費(fèi)氏弧菌抗體標(biāo)記蔗糖酶。
[0054]微生物標(biāo)記檢測(cè):費(fèi)氏弧菌用PBS緩沖液清洗兩次。再與費(fèi)氏弧菌細(xì)菌抗體-蔗糖酶復(fù)合物(5 μ g mL—1)室溫下培育0.5小時(shí)。過(guò)量未結(jié)合的費(fèi)氏弧菌細(xì)菌抗體-蔗糖酶復(fù)合物用PBS清洗兩次，再加入0.5mol L—1蔗糖(pH4.5)，培育0.5h，取40 μ L混合液，用
1.1 μ L的NaOH(IM)調(diào)節(jié)ρ H到中性。得到的溶液取5 μ L用羅氏血糖儀檢測(cè)(參見(jiàn)圖la)。這種方法首先在蔗糖酶最優(yōu)化的P H(4.5)條件下催化蔗糖分解，然后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)到中性，用便攜式血糖儀來(lái)檢測(cè)微生物。檢測(cè)線為6.5X 13Cfu ml—1，線性范圍為6.5X 104cfuml- 1—6.5 X 109cfu ml、
[0055]實(shí)施例9:
[0056]大腸桿菌適配體功能化的蔗糖酶對(duì)微生物的檢測(cè)功能:
[0057] 50 μ L氨基修飾大腸桿菌適配體(ImM)與25 μ L硼酸緩沖液(ρΗ9.2)。然后加入25mg PPD，在室溫下反應(yīng)2h。然后加入5mL水a(chǎn)nd5mL正丁醇反應(yīng)15min，有機(jī)溶液被移除。用超濾離心管(Amicon Ultra-ΙΟΚ)純化活化的適配體。再加入8mg鹿糖酶,使其在室溫下反應(yīng)2天,用超濾離心管(Amicon Ultra-ΙΟΟΚ)純化,獲得適配體標(biāo)記鹿糖酶。
[0058]微生物標(biāo)記檢測(cè):大腸桿菌用PBS緩沖液清洗兩次。再與大腸桿菌適配體-蔗糖酶復(fù)合物(5 μ g mL—1)室溫下培育0.5小時(shí)。過(guò)量未結(jié)合的大腸桿菌適配體-蔗糖酶復(fù)合物用PBS清洗兩次，再加入0.5mol L-1蔗糖(ρΗ4.5)，培育0.5h，取40 μ L混合液，用1.1 μ L的NaOH(IM)調(diào)節(jié)ρ H到中性。得到的溶液取5 μ L用羅氏血糖儀檢測(cè)(參見(jiàn)圖1a)。這種方法首先在蔗糖酶最優(yōu)化的P H(4.5)條件下催化蔗糖分解，然后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)到中性，用便攜式血糖儀來(lái)檢測(cè)微生物。檢測(cè)線為7.2X 12Cfu ml—1，線性范圍為7.2X 104cfu ml—1—
7.2 X 17Cfu ml-1.,
[0059]實(shí)施例10:
[0060]愛(ài)德華遲緩細(xì)菌適配體功能化的蔗糖酶對(duì)微生物的檢測(cè)功能:
[0061]50 μ L氨基修飾愛(ài)德華遲緩細(xì)菌適配體(ImM)與25 μ L硼酸緩沖液(ρΗ9.2)。然后加入25mg PPD,在室溫下反應(yīng)2h。然后加入5mL水a(chǎn)nd5mL正丁醇反應(yīng)15min,有機(jī)溶液被移除。用超濾離心管(Amicon Ultra-ΙΟΚ)純化活化的適配體。再加入8mg蔗糖酶，使其在室溫下反應(yīng)2天，用超濾離心管(Amicon Ultra-ΙΟΟΚ)純化，獲得適配體標(biāo)記蔗糖酶。
[0062]微生物標(biāo)記檢測(cè):愛(ài)德華遲緩細(xì)菌用PBS緩沖液清洗兩次。再與愛(ài)德華遲緩細(xì)菌適配體-蔗糖酶復(fù)合物(5 μ g mL—1)室溫下培育0.5小時(shí)。過(guò)量未結(jié)合的愛(ài)德華遲緩細(xì)菌適配體-蔗糖酶復(fù)合物用PBS清洗兩次，再加入0.5mol L—1蔗糖(pH4.5)，培育0.5h，取40 μ L混合液，用1.1 μ L的NaOH(IM)調(diào)節(jié)ρ H到中性。得到的溶液取5 μ L用羅氏血糖儀檢測(cè)(參見(jiàn)圖la)。這種方法首先在蔗糖酶最優(yōu)化的ρ H (4.5)條件下催化蔗糖分解，然后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)到中性，用便攜式血糖儀來(lái)檢測(cè)微生物。檢測(cè)線為6.5X 13Cfu ml-1,線性范圍為 6.5 X 14Cfu ml-1 — 6.5 X 17Cfu ml'
【權(quán)利要求】
1.一種基于活性功能分子標(biāo)記蔗糖酶信號(hào)系統(tǒng)，其特征在于:信號(hào)系統(tǒng)為結(jié)合有特異性的功能分子的蔗糖酶。
2.按權(quán)利要求1所述的基于活性功能分子標(biāo)記蔗糖酶信號(hào)系統(tǒng)，其特征在于:所述特異性的功能分子為凝集素、微生物抗體、微生物適配體、抗生素、寡糖、適配體或D-型氨基酸。
3.按權(quán)利要求2所述的基于活性功能分子標(biāo)記蔗糖酶信號(hào)系統(tǒng)，其特征在于:所述凝集素為麥胚素、刀豆素、花生凝集素或大豆凝集素。
4.按權(quán)利要求2所述的基于活性功能分子標(biāo)記蔗糖酶信號(hào)系統(tǒng)，其特征在于:所述微生物抗體為大腸桿菌抗體、金黃色葡萄球菌抗體、愛(ài)德華遲緩細(xì)菌抗體、銅綠假單胞菌抗體或費(fèi)氏弧菌抗體。
5.按權(quán)利要求2所述的基于活性功能分子標(biāo)記蔗糖酶信號(hào)系統(tǒng)，其特征在于:所述抗生素為萬(wàn)古霉素、多粘菌素、達(dá)托霉素或枯草桿菌肽。
6.按權(quán)利要求2所述的基于活性功能分子標(biāo)記蔗糖酶信號(hào)系統(tǒng)，其特征在于:所述寡糖為括棉籽糖、水蘇糖、麥芽寡糖或大豆寡糖。
7.按權(quán)利要求2所述的基于活性功能分子標(biāo)記蔗糖酶信號(hào)系統(tǒng)，其特征在于:所述D-型氨基酸為D-丙氨酸或D-谷氨酸。
8.—種權(quán)利要求1所述的基于活性功能分子標(biāo)記蔗糖酶信號(hào)系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在于:所述信號(hào)系統(tǒng)作為信號(hào)探針用于生物分析領(lǐng)域中對(duì)生物分子進(jìn)行檢測(cè)。
9.按權(quán)利要求8所述的基于活性功能分子標(biāo)記蔗糖酶信號(hào)系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在于:所述信號(hào)系統(tǒng)作為信號(hào)探針定量和/定性的對(duì)微生物和細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。
10.按權(quán)利要求8所述的基于活性功能分子標(biāo)記蔗糖酶信號(hào)系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在于:所述信號(hào)系統(tǒng)作為血糖儀分析系統(tǒng)中的信號(hào)探針定量和/定性的對(duì)微生物和細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/34GK104076153SQ201410203085
【公開(kāi)日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2014年5月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月14日
【發(fā)明者】萬(wàn)逸, 張盾 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所