一種等離子納米金二聚體用于細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的方法
【專利摘要】一種等離子納米金二聚體用于細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的方法，屬于材料化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明包括金納米粒子修飾穿膜肽，金納米粒子與調(diào)控序列的偶聯(lián)，雙功能納米金二聚體組裝，納米金二聚體對細(xì)胞內(nèi)基因的調(diào)控，細(xì)胞內(nèi)基因調(diào)控的表征。本發(fā)明選擇金納米粒子作為激元，將具有能調(diào)控survivin基因的反義核苷酸修飾在單一的金納米粒子上，再將其與連接有穿膜肽的粒子進(jìn)行組裝，使其能夠高效快速的發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)基因調(diào)控的作用。本發(fā)明提供了具有細(xì)胞內(nèi)基因調(diào)控作用的納米金二聚體組裝方法，得到了結(jié)構(gòu)均一，性能優(yōu)越的納米金二聚體結(jié)構(gòu)。
【專利說明】—種等離子納米金二聚體用于細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種等離子納米金二聚體用于細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的方法，屬于材料化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]基因表達(dá)普遍存在于細(xì)胞的各個生命過程中，是細(xì)胞把遺傳物質(zhì)中的信息轉(zhuǎn)化為具有一定功能的蛋白質(zhì)的過程?；虮磉_(dá)調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄、翻譯以及mRNA加工水平上利用相關(guān)的DNA調(diào)節(jié)序列、酶以及調(diào)節(jié)蛋白對生命活動規(guī)律進(jìn)行有序調(diào)控。利用人工合成的反義核苷酸，通過堿基互補(bǔ)原則將其結(jié)合到特異性的靶基因上，能夠有效調(diào)控靶基因的表達(dá)。另一方面，金納米材料因其具有良好的生物相容性，被廣泛應(yīng)用于生物載藥，疾病治療等納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。通過自組裝的方式將兩種具有不同功能的粒子組裝成二聚體結(jié)構(gòu)，從而使二聚體結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出高效的細(xì)胞內(nèi)基因調(diào)控的作用。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種等離子納米金二聚體用于細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的方法。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案:一種等離子納米金二聚體用于細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的方法，步驟如下:
(1)金納米粒子修飾穿膜肽:將檸檬酸還原法合成的金納米粒子與巰基聚乙二醇PEG5000、穿膜肽TAT和DNAl混勻，24h后得到表面修飾有穿膜肽的Au-TAT-DNAI復(fù)合體；
(2)金納米粒子與調(diào)控序列的偶聯(lián):將金納米粒子與survivin基因的反義核苷酸ant1-DNA和DNA2偶聯(lián)，得到表面修飾有調(diào)控序列的Au_ant1-DNA_DNA2復(fù)合體；
(3)雙功能納米金二聚體組裝:將步驟(1)得到的Au-TAT-DNAI復(fù)合體和步驟(2)得到的Au-ant1-DNA-DNA2復(fù)合體混勻,得到雙功能納米金二聚體組裝結(jié)構(gòu)；
(4)納米金二聚體對細(xì)胞內(nèi)基因的調(diào)控:將步驟(3)中得到的雙功能納米金二聚體組裝結(jié)構(gòu)與細(xì)胞共同孵育3h后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，得到納米金二聚體調(diào)控后的細(xì)胞懸液；
(5)細(xì)胞內(nèi)基因調(diào)控的表征:將步驟(4)獲得的細(xì)胞懸液中的總RNA提取出來，再將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用熒光定量PCR檢測survivin基因在體內(nèi)的表達(dá)量，并與內(nèi)參基因β -actin相比較,計(jì)算其相對表達(dá)量,相對表達(dá)量=survivin基因表達(dá)量/ β -actin基因表達(dá)量。
[0005]所述等離子納米金二聚體用于細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的方法，具體步驟為:
(I)金納米粒子修飾穿膜肽:取100mL、2nmol/L、20nm的金納米粒子以8000rpm的速度離心10min，并重懸在IOmL 0.01M pH7.4的磷酸鹽緩沖液PBS中得金溶膠；按金納米粒子:PEG: TAT: DNAl為1: 1000: 100: 5的摩爾濃度比同時向5mL金溶膠中加入PEG、TAT,DNAI ;室溫震蕩24h后，8000rpm離心10min，去除上清液，沉淀重懸于純水中，反復(fù)離心重懸3次，得到Au-TAT-DNAI復(fù)合體；
(2)金納米粒子與調(diào)控序列的偶聯(lián):另取5mL上述金溶膠，并按金納米粒子:ant1-DNA: DNA2為1: 100: 5摩爾濃度比，向5mL金溶膠中加入ant1-DNA和DNA2 ;室溫震蕩12h后，向溶液中加入NaCl至終濃度為80mM，繼續(xù)震蕩24h后，離心重懸于純水中，得到 Au-ant1-DNA_DNA2 復(fù)合體；
(3)雙功能納米金二聚體組裝:將步驟(1)和(2)得到的Au-TAT-DNAI和Au-ant1-DNA-DNA2復(fù)合體，按體積比1:1混勻，60°C孵育20min后立即冷卻至4°C，靜置24h后，即可得到雙功能納米金二聚體；
(4)納米金二聚體對細(xì)胞內(nèi)基因的調(diào)控:將步驟(3)得到的納米金二聚體8000rpm離心lOmin，沉淀重懸于細(xì)胞培養(yǎng)液中，使納米金二聚體的終濃度為5nM ;將細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，使每孔中的細(xì)胞數(shù)量約為IO4個，培養(yǎng)24h后去掉培養(yǎng)液，取7個孔分別加入上述含有納米金二聚體的細(xì)胞培養(yǎng)液各300 μ L ;每個孔分別轉(zhuǎn)染0h、lh、2h、3h、4h、5h、10h后，去除培養(yǎng)液，用PBS反復(fù)洗滌各個孔中細(xì)胞5次，再向細(xì)胞中加入不含納米金二聚體的新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞，得到不同轉(zhuǎn)染時間處理的細(xì)胞懸液；
(5)細(xì)胞內(nèi)基因調(diào)控的表征:用RNA提取試劑盒提取出步驟(4)各個細(xì)胞懸液中的總RNA,然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別把提取出的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA ；以此作為模板DNA用熒光定量PCR法測定不同轉(zhuǎn)染時間后細(xì)胞內(nèi)survivin基因的表達(dá)量，同時與細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)參基因β-actin進(jìn)行比較,計(jì)算出其相對的表達(dá)量；相對表達(dá)量=Survivin基因表達(dá)量/ β -actin基因表達(dá)量。
[0006](6)電鏡表征:采用生物透射電鏡對步驟(4)得到的細(xì)胞懸液進(jìn)行表征。
[0007]所述DNAl 序列如 SEQ ID N0.1 所示，DNA2 序列如 SEQ ID N0.2 所示，Ant1-DNA 序列如SEQ ID N0.3所示，TAT多肽序列如SEQ ID N0.4所示。
[0008]表1DNA及多肽的編號、序列及長度
【權(quán)利要求】
1.一種等離子納米金二聚體用于細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的方法，其特征在于步驟如下: (1)金納米粒子修飾穿膜肽:將檸檬酸還原法合成的金納米粒子與巰基聚乙二醇PEG5000、穿膜肽TAT和DNAl混勻，24h后得到表面修飾有穿膜肽的Au-TAT-DNAI復(fù)合體； (2)金納米粒子與調(diào)控序列的偶聯(lián):將金納米粒子與survivin基因的反義核苷酸ant1-DNA和DNA2偶聯(lián)，得到表面修飾有調(diào)控序列的Au_ant1-DNA_DNA2復(fù)合體； (3)雙功能納米金二聚體組裝:將步驟(1)得到的Au-TAT-DNAI復(fù)合體和步驟(2)得到的Au-ant1-DNA-DNA2復(fù)合體混勻,得到雙功能納米金二聚體組裝結(jié)構(gòu)； (4)納米金二聚體對細(xì)胞內(nèi)基因的調(diào)控:將步驟(3)中得到的雙功能納米金二聚體組裝結(jié)構(gòu)與細(xì)胞共同孵育3h后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，得到納米金二聚體調(diào)控后的細(xì)胞懸液； (5)細(xì)胞內(nèi)基因調(diào)控的表征:將步驟(4)獲得的細(xì)胞懸液中的總RNA提取出來，再將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用熒光定量PCR檢測survivin基因在體內(nèi)的表達(dá)量，并與內(nèi)參基因β -actin相比較,計(jì)算其相對表達(dá)量,相對表達(dá)量=survivin基因表達(dá)量/ β -actin基因表達(dá)量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述等離子納米金二聚體用于細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的方法，其特征在于具體步驟為: (1)金納米粒子修飾穿膜肽:取100mL、2nmol/L、20nm的金納米粒子以8000rpm的速度離心10min，并重懸在IOmL 0.01M pH7.4的磷酸鹽緩沖液PBS中得金溶膠；按金納米粒子:PEG: TAT: DNAl為1: 1000: 100: 5的摩爾濃度比同時向5mL金溶膠中加入PEG、TAT,DNAI ;室溫震蕩24h后，8000rpm離心10min，去除上清液，沉淀重懸于純水中，反復(fù)離心重懸3次，得到Au-TAT-DNAI復(fù)合體； (2)金納米粒子與調(diào)控序列的偶聯(lián):另取5mL上述金溶膠，并按金納米粒子:ant1-DNA: DNA2為1: 100: 5摩爾濃度比，向5mL金溶膠中加入ant1-DNA和DNA2 ;室溫震蕩12h后，向溶液中加入NaCl至終濃度為80mM，繼續(xù)震蕩24h后，離心重懸于純水中，得到 Au-ant1-DNA_DNA2 復(fù)合體； (3)雙功能納米金二聚體組裝:將步驟(1)和(2)得到的Au-TAT-DNAI和Au-ant1-DNA-DNA2復(fù)合體，按體積比1:1混勻，60°C孵育20min后立即冷卻至4°C，靜置24h后，即得到雙功能納米金二聚體； (4)納米金二聚體對細(xì)胞內(nèi)基因的調(diào)控:將步驟(3)得到的納米金二聚體8000rpm離心lOmin，沉淀重懸于細(xì)胞培養(yǎng)液中，使納米金二聚體的終濃度為5nM ;將細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，使每孔中的細(xì)胞數(shù)量為IO4個，培養(yǎng)24h后去掉培養(yǎng)液，取7個孔分別加入上述含有納米金二聚體的細(xì)胞培養(yǎng)液各3001^;每個孔分別轉(zhuǎn)染011、111、211、311、411、511、1011后，去除培養(yǎng)液，用PBS反復(fù)洗滌各個孔中細(xì)胞5次，再向細(xì)胞中加入不含納米金二聚體的新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞，得到不同轉(zhuǎn)染時間處理的細(xì)胞懸液； (5)細(xì)胞內(nèi)基因調(diào)控的表征:用RNA提取試劑盒提取出步驟(4)各個細(xì)胞懸液中的總RNA,然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別把提取出 的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA ；以此作為模板DNA用熒光定量PCR法測定不同轉(zhuǎn)染時間后細(xì)胞內(nèi)survivin基因的表達(dá)量，同時與細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)參基因β-actin進(jìn)行比較,計(jì)算出其相對的表達(dá)量；相對表達(dá)量=Survivin基因表達(dá)量/ β -actin基因表達(dá)量；(6)電鏡表征:采用生物透射電鏡對步驟(4)得到的細(xì)胞懸液進(jìn)行表征。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述等離子納米金二聚體用于細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的方法，其特征在于:所述DNAl序列如SEQ ID N0.1所示，DNA2序列如SEQ ID N0.2所示，Ant1-DNA序列如SEQ ID N0.3所示，TAT多肽序列如SEQ ID N0.4所示。
【文檔編號】C12N15/87GK103952444SQ201410202383
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月14日
【發(fā)明者】胥傳來, 孫茂忠, 匡華, 徐麗廣, 馬偉, 劉麗強(qiáng), 宋珊珊, 吳曉玲 申請人:江南大學(xué)