一種與抗腫瘤用藥相關(guān)的多重基因檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種與抗腫瘤用藥相關(guān)的多重基因檢測試劑盒，包括RT引物的混合物和PCR擴增引物的混合物，RT引物的混合物和PCR擴增引物的混合物中分別包括基于基因群、內(nèi)參基因和反應(yīng)內(nèi)標(biāo)的各RT引物和各PCR擴增引物，其特征在于：基因群包括PTEN、EGFR、DPYD、HER2、RRM1、ERCC1、TUBB3、TOP1、TYMS和TOP2A；內(nèi)參基因包括ACTB、GAPDH和B2M；反應(yīng)內(nèi)標(biāo)是KAN-rRNA。本發(fā)明的與抗腫瘤用藥相關(guān)的多重基因檢測試劑盒可一次性系統(tǒng)地檢測多個與抗腫瘤用藥密切相關(guān)基因的表達(dá)水平，使用簡便，準(zhǔn)確性好，檢測效率高，可以很好地用于指導(dǎo)化療用藥，選擇化療方案。
【專利說明】一種與抗腫瘤用藥相關(guān)的多重基因檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基因檢測試劑盒，尤其是一種同步檢測多種抗腫瘤用藥相關(guān)基因表達(dá)水平的試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]眾所周知，化療是當(dāng)今腫瘤治療中最常用的選擇方案，但是半數(shù)以上的患者經(jīng)過化療后常常療效不大，同樣的腫瘤藥物對于不同病人的療效往往會有很大的差異；同時化療藥物毒副作用較大，其在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，又殺傷正常組織的細(xì)胞，有時還可出現(xiàn)并發(fā)癥，許多患者因為化療的強烈毒副作用而倍受折磨，甚至死亡。大量臨床研究證實，單憑經(jīng)驗治療腫瘤，一般只有30%以下的療效，且毒副作用明顯。藥物遺傳學(xué)和藥物基因組學(xué)的研究表明，不同病人基因表達(dá)水平的差異導(dǎo)致對各種抗腫瘤藥物的療效差異。
[0003]2012年Nature雜志已有文章指出，臨床診斷已由傳統(tǒng)地依賴于病理診斷方式轉(zhuǎn)為更大程度上依據(jù)分子檢測結(jié)果，分子檢測已成為臨床診斷的必要檢測手段。高水平的分子檢測手段及產(chǎn)品已為新 時代的個體化治療鋪平道路。依賴于藥物遺傳學(xué)和藥物基因組學(xué)在抗腫瘤藥物作用機制等方面的最新研究成果，利用某些抗腫瘤藥物的作用效果與相關(guān)基因表達(dá)的顯著相關(guān)性機制，我們在進(jìn)行化療方案的選擇前若能方便、快捷且準(zhǔn)確地對病人的相關(guān)基因進(jìn)行系統(tǒng)檢測，可顯著提高藥物療效并減輕毒副作用，并有效爭取治療時間，最終使病人在療效和經(jīng)濟上獲益。
[0004]目前與抗腫瘤用藥最為密切相關(guān)的基因包括、PTEN (phosphatase and tensinhomolog,同源性憐酸酶-張力蛋白)、EGFR (epidermal growth factor receptor,表皮生長因子受體)，、DPYD (dihydropyrimide dehydrogenase, 二氫嘧唳脫氫酶)，、HER2 (human epidermal growth factor receptor-2,人類表皮生長因子受體 2),、RRMl(ribonucleotide reductase Ml,核糖核苷酸還原酶 Ml),、ERCC1 (excision repair crosscomplementation 1，切除修復(fù)交叉互補基因 I)、TUBB3 (tubulin-beta 3, beta-微管蛋白
3)、T0P1 (topoisomerase I，拓?fù)洚悩?gòu)酶 1)、TYMS (thymidylate synthetase,胸苷酸合成酶)，、T0P2A (topoisomerase DNA II alpha,拓?fù)洚悩?gòu)酶2)等,這些祀標(biāo)基因mRNA水平的高低可指導(dǎo)諸如赫賽汀、吉非替尼、氟類、抗微管類等多種化療藥物的選擇，以實施個體化治療方案，提聞療效。
[0005]目前檢測基因表達(dá)情況的常用方法有:FISH、免疫組化、熒光定量PCR (qPCR)、基因芯片等。其中，F(xiàn)ISH是使用熒光標(biāo)記的探針去檢測組織切片上的RNA表達(dá)情況；免疫組化是使用抗體去檢測組織切片上的蛋白表達(dá)情況。但是這兩種方法的缺點都是無法定量，且實驗結(jié)果必須要由有經(jīng)驗的檢測員進(jìn)行觀察并主觀判斷。另外，基因芯片技術(shù)通常可以同時檢測上千個甚至上萬個基因的轉(zhuǎn)錄水平，但常應(yīng)用于全基因表達(dá)譜的分析，用如此高通量的方法進(jìn)行某些特定基因群的表達(dá)水平分析會導(dǎo)致成本太高，很難滿足實際需求。而熒光定量PCR (qPCR)是檢測RNA表達(dá)的常規(guī)技術(shù)，也是檢測腫瘤組織基因表達(dá)情況的最常用的技術(shù)。但是如果需要檢測多個基因的表達(dá)情況，則大多需要逐一對各個基因進(jìn)行檢測，且難以設(shè)置內(nèi)參基因，通量低，成本高、便捷性差。
[0006]在一個反應(yīng)體系中應(yīng)用多對引物進(jìn)行PCR擴增以期檢測多個基因，即進(jìn)行多重基因檢測，需反復(fù)對擴增條件進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整和驗證，并需選擇和驗證合適的引物序列，若有成熟應(yīng)用的檢測產(chǎn)品將節(jié)省大量的人力和物力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種使用簡便，準(zhǔn)確性好，檢測效率高的與抗腫瘤用藥相關(guān)的多重基因檢測試劑盒，可一次性系統(tǒng)地檢測多個與抗腫瘤用藥密切相關(guān)基因的表達(dá)水平。
[0008]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提出的一種技術(shù)方案是:一種與抗腫瘤用藥相關(guān)的多重基因檢測試劑盒，包括RT引物的混合物和PCR擴增引物的混合物，所述RT引物(反轉(zhuǎn)錄引物)的混合物中包括基于基因群、內(nèi)參基因和反應(yīng)內(nèi)標(biāo)的各RT引物，所述PCR擴增引物的混合物中包括基于相應(yīng)基因群、內(nèi)參基因和反應(yīng)內(nèi)標(biāo)的各PCR擴增引物，所述基因群包括PTEN、EGFR、DPYD、HER2、RRM1、ERCC1、TUBB3、T0P1、TYMS 和 T0P2A ;所述內(nèi)參基因包括 ACTB、GAPDH和B2M ;所述反應(yīng)內(nèi)標(biāo)是KAN_r RNA。
[0009]上述各PCR擴增引物序列由特異性引物序列和5 ’端的正向通用引物序列組成，所述各RT引物序列由特異性引物序列和5’端的反向通用引物序列組成；
基于所述PTEN的PCR擴增引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.1所示，RT引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.2所示；
基于所述EGFR的PCR擴增引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.3所示，RT引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.4所示；
基于所述DPYD的PCR擴增 引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.5所示，RT引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.6所示；
基于所述HER2的PCR擴增引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.7所示，RT引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.8所示；
基于所述RRMl的PCR擴增引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.9所示，RT引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.10所示；
基于所述ERCCl的PCR擴增引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.11所示，RT引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.12所示；
基于所述TUBB3的PCR擴增引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.13所示，RT引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.14所示；
基于所述TOPl的PCR擴增引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.15所示，RT引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.16所示；
基于所述TYMS的PCR擴增引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.17所示，RT引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.18所示；
基于所述T0P2A的PCR擴增引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.19所示，RT引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.20所示；
基于所述ACTB的PCR擴增引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.21所示，RT引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.22所示；基于所述GAPDH的PCR擴增引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.23所示，RT引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.24所示；
基于所述B2M的PCR擴增引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.25所示，RT引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.26所示；
基于所述KAN-r的PCR擴增引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.27所示，RT引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.28所示。
[0010]上述技術(shù)方案的優(yōu)選是:基于所述PTEN、EGFR、DPYD, HER2、RRMU ERCCU TUBB3、TOPl、TYMS, T0P2A、ACTB, GAPDH、B2M和KAN_r基因的PCR擴增引物在反應(yīng)體系中的濃度為150nM~250nM，基于PTEN基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為IOnM~20nM ;基于EGFR基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為1800nM~2200nM ;基于DPYD、RRMl、TYMS和KAN-r基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為450nM~550nM ;基于HER2基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為50nM~70nM ;基于ERCCl和TOPl基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為200nM~300nM ;基于TUBB3和T0P2A基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為800nM~1200nM ;基于ACTB基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為20nM~40nM ;基于GAPDH和B2M基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為8nM~12nM。
[0011]上述技術(shù)方案的進(jìn)一步優(yōu)選是:基于所述PTEN、EGFR、DPYD, HER2、RRMl、ERCCl、TUBB3、TOPl、TYMS、T0P2A、ACTB、GAPDH、B2M和KAN_r基因的PCR擴增引物在反應(yīng)體系中的濃度為200nM，基于PTEN基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為15nM ;基于EGFR基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為2000nM ;基于DPYD、RRMl、TYMS和KAN_r基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為500nM ;基于HER2基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為60nM ;基于ERCCl和TOPl基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為250nM ;基于TUBB3和T0P2A基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為1000nM ;基于ACTB基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為30nM ;基于GAPDH和B2M基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為ΙΟηΜ。
[0012]上述與抗腫瘤用藥相關(guān)的多重基因檢測試劑盒，還包括正向通用引物和反向通用引物的混合物；所述正向通用引物為熒光標(biāo)記引物；所述正向通用引物序列如SEQ IDN0.29所示,所述反向通用引物序列如SEQ ID N0.30所示；所述正向通用引物和反向通用引物在反應(yīng)體系中的濃度均為1.ΟμΜ~1.5μΜ。
[0013]上述正向通用引物的熒光標(biāo)記包括Cy5、Cy3或FAM。
[0014]上述技術(shù)方案的優(yōu)選是:上述正向通用引物和反向通用引物在反應(yīng)體系中的濃度均為1.2μΜ。
[0015]上述與抗腫瘤用藥相關(guān)的多重基因檢測試劑盒還包括反轉(zhuǎn)錄酶、反轉(zhuǎn)錄緩沖液、KAN-r RNA、DNA聚合酶、PCR緩沖液、dNTP和超純水。 [0016]上述與抗腫瘤用藥相關(guān)的多重基因檢測試劑盒還包括陽性對照品，所述陽性對照品是從腫瘤細(xì)胞中提取的RNA混合物，所述陽性對照品包括所述基因群、內(nèi)參基因和反應(yīng)內(nèi)標(biāo)的mRNA。作為RT反應(yīng)后的PCR反應(yīng)的陽性對照品還可以是基于所述基因群、內(nèi)參基因和反應(yīng)內(nèi)標(biāo)的PCR擴增引物和RT引物克隆所得的DNA片段的混合物。
[0017]上述與抗腫瘤用藥相關(guān)的多重基因檢測試劑盒的應(yīng)用是指導(dǎo)化療用藥，選擇化療方案。
[0018]本發(fā)明具有積極的效果:(I)本發(fā)明的多重基因檢測試劑盒采用KAN-r作為反應(yīng)內(nèi)標(biāo)能有效監(jiān)測反應(yīng)體系的正常工作，排除初始RNA模板量差異帶來的誤差，而傳統(tǒng)方法中用載體等作為反應(yīng)內(nèi)標(biāo)，易導(dǎo)致其高效擴增從而影響目標(biāo)基因的有效擴增而導(dǎo)致結(jié)果判斷的偏差；本發(fā)明還采用三個內(nèi)參基因作為PCR反應(yīng)對照，所要檢測的10個目的基因的表達(dá)水平將會通過這兩個內(nèi)參基因進(jìn)行均一化，克服了傳統(tǒng)PCR中由于不均等擴增造成的偏差，實現(xiàn)精確定量一組目的基因的表達(dá)情況。上述內(nèi)參及內(nèi)標(biāo)的設(shè)置結(jié)合GeXP的毛細(xì)管電泳及熒光檢測技術(shù)，不同于傳統(tǒng)凝膠電泳分析模式，使PCR結(jié)果分析更直觀、簡潔、可靠，易于識別判斷，更有利于標(biāo)準(zhǔn)化操作，實現(xiàn)了超高靈敏度及最大程度降低了假陽性問題。
[0019](2)本發(fā)明的多重基因檢測試劑盒對反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，主要對各引物序列進(jìn)行了多次篩選已盡可能避免引物間的干擾問題；反復(fù)調(diào)整各個引物的合適濃度，優(yōu)化了反應(yīng)體系。本發(fā)明的多重基因檢測試劑盒利用熒光標(biāo)記通用引物結(jié)合針對與抗腫瘤用藥密切相關(guān)的十個基因的特異引物實現(xiàn)了在一個PCR體系內(nèi)同步系統(tǒng)化檢測十個目的基因位點，實現(xiàn)了檢測的快捷和便利，準(zhǔn)確性也得到了驗證。[0020](3)本發(fā)明的多重基因檢測試劑盒利用了 GenomeLab GeXP遺傳分析系統(tǒng)高通量及自動化優(yōu)勢，采用96孔上樣系統(tǒng)進(jìn)行多樣本規(guī)?；瘷z測，操作便捷，使用條件可以模式化，便于大規(guī)模推廣應(yīng)用。每個樣本的檢測成本在50元內(nèi)。實現(xiàn)了高通量，低成本，為系統(tǒng)用藥指導(dǎo)爭取了時間。
[0021](4)本發(fā)明的多重基因檢測，對與抗腫瘤用藥密切相關(guān)的10個基因進(jìn)行同步檢測的產(chǎn)品開發(fā)，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)?；膽?yīng)用推廣，具有通量高、成本低、便捷、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性好等特點，為調(diào)整所需檢測目標(biāo)基因的不同類型試劑盒的成功研制提供了借鑒。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為采用本發(fā)明試劑盒對多種腫瘤細(xì)胞提取的RNA混合物進(jìn)行RT、PCR及利用GeXP系統(tǒng)進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析后的圖譜。
【具體實施方式】
[0023]下面通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是以下實施例只用于對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)上述本
【發(fā)明內(nèi)容】
對本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。文中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著的科學(xué)出版社2002年出版的《分子克隆實驗指南》一書中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。
[0024]一、試劑盒的組成。
[0025]本發(fā)明與抗腫瘤用藥相關(guān)的多重基因檢測試劑盒包括固定在紙質(zhì)包裝盒內(nèi)的以下試管:
1)RT酶(反轉(zhuǎn)錄酶)；
2)RT緩沖液(反轉(zhuǎn)錄緩沖液)；
3)RT引物的混合物(反轉(zhuǎn)錄引物的混合物)；4)KAN-r RNA ；
5)DNA聚合酶；
6)PCR緩沖液(含氯化鎂)；
7)dNTP ；
8)PCR擴增引物的混合物；
9)正向通用引物和反向通用引物的混合物；
10)陽性對照品；
11)超純水(無RNA酶/DNA酶)。
[0026]各個PCR擴增引物5 ’端設(shè)有正向通用引物序列，各個RT引物的5 ’端設(shè)有反向通用引物序列。
[0027]正向通用引物的序列為:AGGTGACACTATAGAATA。
[0028]反向通用引物的序列為:GTACGACTCACTATAGGGA。
[0029]正向通用引物上帶有Cy5熒光標(biāo)記。
[0030]陽性對照品是從多種腫瘤細(xì)胞提取的RNA混合物，包含所述基因群、內(nèi)參基因和反應(yīng)內(nèi)標(biāo)的mRNA。
[0031]RT引物和PCR擴增 引物的序列根據(jù)與基因群中各基因的mRNA序列跨外顯子設(shè)計。每對擴增引物都可以擴增出特定長度的PCR片段。不同基因?qū)?yīng)的擴增理論片段長度如表I所示，實際片段長度可能會略有不同。
[0032]RT引物的混合物和PCR擴增引物的混合物中各RT引物和PCR擴增引物的濃度如表1所示。正向通用引物和反向通用引物濃度遠(yuǎn)高于RT引物和PCR擴增引物的濃度。優(yōu)選正向通用引物和反向通用引物的濃度均為1.2μΜ。
[0033]表1引物特征表
【權(quán)利要求】
1.一種與抗腫瘤用藥相關(guān)的多重基因檢測試劑盒，包括RT引物的混合物和PCR擴增引物的混合物，所述RT引物的混合物中包括基于基因群、內(nèi)參基因和反應(yīng)內(nèi)標(biāo)的各RT引物，所述PCR擴增引物的混合物中包括基于相應(yīng)基因群、內(nèi)參基因和反應(yīng)內(nèi)標(biāo)的各PCR擴增引物，其特征在于:所述基因群包括 PTEN、EGFR、DPYD, HER2、RRMl、ERCCl、TUBB3、TOPl、TYMS和T0P2A ;所述內(nèi)參基因包括ACTB、GAPDH和B2M ;所述反應(yīng)內(nèi)標(biāo)是KAN_r RNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種與抗腫瘤用藥相關(guān)的多重基因檢測試劑盒，其特征在于:所述各PCR擴增引物序列由特異性引物序列和5’端的正向通用引物序列組成，所述各RT引物序列由特異性引物序列和5’端的反向通用引物序列組成； 基于所述PTEN的PCR擴增引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.1所示，RT引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.2所示； 基于所述EGFR的PCR擴增引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.3所示，RT引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.4所示； 基于所述DPYD的PCR擴增引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.5所示，RT引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.6所示； 基于所述HER2的PCR擴增引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.7所示，RT引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.8所示； 基于所述RRMl的PCR擴增引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.9所示，RT引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.10所示； 基于所述ERCCl的PCR擴增引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.11所示，RT引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.12所示； 基于所述TUBB3的PCR擴增引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.13所示，RT引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.14所示； 基于所述TOPl的PCR擴增引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.15所示，RT引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.16所示； 基于所述TYMS的PCR擴增引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.17所示，RT引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.18所示； 基于所述T0P2A的PCR擴增引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.19所示，RT引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.20所示； 基于所述ACTB的PCR擴增引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.21所示，RT引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.22所示； 基于所述GAPDH的PCR擴增引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.23所示，RT引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.24所示； 基于所述B2M的PCR擴增引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.25所示，RT引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.26所示； 基于所述KAN-r的PCR擴增引 物的特異性引物序列如SEQ ID N0.27所示，RT引物的特異性引物序列如SEQ ID N0.28所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種與抗腫瘤用藥相關(guān)的多重基因檢測試劑盒，其特征在于:基于所述 PTEN、EGFR、DPYD、HER2、RRMl、ERCCl、TUBB3、TOPl、TYMS, T0P2A、ACTB、GAPDH、B2M和KAN-r基因的PCR擴增引物在反應(yīng)體系中的濃度為150nM~250nM，基于PTEN基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為IOnM~20nM ;基于EGFR基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為1800nM~2200nM ;基于DPYD、RRMl、TYMS和KAN_r基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為450nM~550nM ;基于HER2基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為50nM~70nM ；基于ERCCl和TOPl基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為200nM~300nM ;基于TUBB3和T0P2A基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為800nM~1200nM ;基于ACTB基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為20nM~40nM ;基于GAPDH和B2M基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為 8nM ~12nM。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種與抗腫瘤用藥相關(guān)的多重基因檢測試劑盒，其特征在于:基于所述 PTEN、EGFR、DPYD、HER2、RRMl、ERCCl、TUBB3、TOPl、TYMS、T0P2A、ACTB、GAPDH、B2M和KAN-r基因的PCR擴增引物在反應(yīng)體系中的濃度為200nM，基于PTEN基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為15nM ;基于EGFR基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為2000nM ;基于DPYD、RRMl、TYMS和KAN_r基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為500nM ;基于HER2基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為60nM ;基于ERCCl和TOPl基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為250nM ;基于TUBB3和T0P2A基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為1000nM ;基于ACTB基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為30nM ;基于GAPDH和B2M基因的RT引物在反應(yīng)體系中的濃度為ΙΟηΜ。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4之一所述的一種與抗腫瘤用藥相關(guān)的多重基因檢測試劑盒，其特征在于:還包括正向通用引物和反向通用引物的混合物；所述正向通用引物為熒光標(biāo)記引物；所述正向通用引物序列如SEQ ID N0.29所示，所述反向通用引物序列如SEQ IDN0.30所示；所述正向通用引物和反向通用引物在反應(yīng)體系中的濃度均為1.ΟμΜ~1.5μΜ。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種與抗腫瘤用藥相關(guān)的多重基因檢測試劑盒，其特征在于:所述正向通用引物的熒光標(biāo)記包括Cy5、Cy3或FAM。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種與抗腫瘤用藥相關(guān)的多重基因檢測試劑盒，其特征在于:所述正向通用引物和反向 通用引物在反應(yīng)體系中的濃度均為1.2μΜ。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至4之一所述的一種與抗腫瘤用藥相關(guān)的多重基因檢測試劑盒，其特征在于:還包括反轉(zhuǎn)錄酶、反轉(zhuǎn)錄緩沖液、KAN-r RNA、DNA聚合酶、PCR緩沖液、dNTP和超純水。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至4之一所述的一種與抗腫瘤用藥相關(guān)的多重基因檢測試劑盒，其特征在于:還包括陽性對照品，所述陽性對照品是從數(shù)種腫瘤細(xì)胞中提取的RNA混合物，所述陽性對照品包括所述基因群、內(nèi)參基因和反應(yīng)內(nèi)標(biāo)的mRNA。
10.一種上述權(quán)利要求1所述的與抗腫瘤用藥相關(guān)的多重基因檢測試劑盒的應(yīng)用，其特征在于:指導(dǎo)化療用藥，選擇化療方案。
【文檔編號】C12Q1/68GK103882138SQ201410135933
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年4月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月4日
【發(fā)明者】趙新泰, 王明, 王星果 申請人:上海賽安生物醫(yī)藥科技有限公司