基于免疫沉淀法的從水稻中提取多聚核糖體的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為一種基于免疫沉淀法的從水稻中提取多聚核糖體的方法。本發(fā)明以免疫法為主，使用親和層析的方法富集Flag標(biāo)簽標(biāo)記的核糖體-mRNA復(fù)合物，選用EGTA螯合組織勻漿液中的其它金屬離子，并加入氯霉素和放線菌酮抑制核糖體和mRNA的解離，其中改進(jìn)抽提溶液和洗脫溶液配方、材料勻漿和濃縮方式，使用終濃度為0.1M的EDTA洗脫核糖體-mRNA復(fù)合物。本發(fā)明預(yù)期將分離2-4個重要的參與低溫脅迫的新功能基因，為低溫脅迫下的植物生長正常進(jìn)行以及繁衍提供保障，最終在產(chǎn)量建成上發(fā)揮重要作用。
【專利說明】基于免疫沉淀法的從水稻中提取多聚核糖體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種從水稻中提取多聚核糖體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]多聚核糖體是指合成蛋白質(zhì)時,多個甚至幾十個核糖體串聯(lián)附著在一條mRNA分子上，形成的似念珠狀結(jié)構(gòu)。在合成多蛋白質(zhì)時，核糖體并不是單獨工作的，常以多聚核糖體的形式存在。在mRNA的起始密碼子部位，核糖體亞基裝配成完整的起始復(fù)合物，然后向mRNA的3’端移動，直到到達(dá)終止密碼子處。當(dāng)?shù)谝粋€核糖體離開起始密碼子后，空出的起始密碼子的位置足夠與另一個核糖體結(jié)合時，第二個核糖體的小亞基就會結(jié)合上來，并裝配成完整的起始復(fù)合物，開始蛋白質(zhì)的合成。同樣，第三個核糖體、第四個核糖體，依次結(jié)合到mRNA上形成多聚核糖體。在生物體將mRNA中的遺傳信息翻譯成有功能的蛋白質(zhì)的過程里，該復(fù)合物起到了關(guān)鍵的作用。不同于轉(zhuǎn)錄組所體現(xiàn)的全部轉(zhuǎn)錄的總RNA包含了全部的翻譯與非翻譯的RNA，多聚核糖體中所結(jié)合的RNA全部都是會被最終翻譯成蛋白質(zhì)的mRNA，其分析結(jié)果將在轉(zhuǎn)錄組與蛋白組之間架起橋梁。
[0003]1963年，Warner等發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)的多聚核糖體的結(jié)構(gòu)。2003年，Arava等利用多聚核糖體芯片技術(shù)研究了酵母全基因組范圍內(nèi)的mRNA翻譯譜。隨著二代測序技術(shù)的深入發(fā)展，Ingolia等基于核糖體保護(hù)的mRNA不被核糖核酸酶所降解而保留下來，而裸露的mRNA被消化的原理，獲得基因組范圍內(nèi)核糖體覆蓋的mRNA片段，并對這些片段進(jìn)行深度測序，從而提出了全基因組范圍內(nèi)分析核糖體的分布情況，同時可以進(jìn)一步在單核苷酸水平上分析蛋白質(zhì)翻譯事件的核糖體譜技術(shù)?？梢姸嗑酆颂求w技術(shù)的產(chǎn)生和不斷發(fā)展為蛋白質(zhì)翻譯事件、蛋白質(zhì)組學(xué)、microRNA的作用原理以及分子機(jī)理研究提供了另一個維度上重要并且精確的手段。而精確高效地提取生物組織中的多聚核糖體是開展上述研究和分析的重要基礎(chǔ)。
[0004]1998年有文獻(xiàn)報道用鎂離子沉淀多聚核糖體，只提取細(xì)胞質(zhì)RNA。這樣既減少了提取的總RNA中的其它成分，特別是核前體RNA和細(xì)胞器RNA的干擾，同時也濃縮了細(xì)胞中的mRNA。但本方法適合細(xì)胞來源較少時提取多聚核糖體。
[0005]目前使用較廣泛的提取多聚核糖體的方法主要分為蔗糖密度梯度離心法和免疫沉淀法。蔗糖密度梯度離心法主要在對細(xì)胞進(jìn)行破碎、過濾之后，將勻漿液加入蔗糖密度梯度溶液中，并使用超速離心儀進(jìn)行離心分離。該方法雖然收率較高，但有著設(shè)備要求高，操作復(fù)雜的缺點。有文獻(xiàn)報道使用垂直轉(zhuǎn)頭密度梯度超速離心法，快速分級分離多聚核糖體，但對儀器設(shè)備要求同樣較高。
[0006] 現(xiàn)有的免疫沉淀法在植物中的擬南芥中有應(yīng)用，但該方法由于提取液配方的原因?qū)е率章瘦^低，不適合做后續(xù)的深入研究。而且有關(guān)從水稻組織中提取多聚核糖體的報道并不多，方法也不成熟，因此需要對提取水稻組織中提取多聚核糖體的方法進(jìn)行改良。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提出了一種基于免疫沉淀法的從水稻中提取多聚核糖體的方法，以解決以往提取多聚核糖體時對實驗設(shè)備要求高，操作過程復(fù)雜，并且產(chǎn)物收率較低的問題。
[0008]本發(fā)明提出的基于免疫沉淀法的從水稻中提取多聚核糖體的方法，涉及一種過表達(dá)融合了 Flag標(biāo)簽的核糖體蛋白RPL18的水稻植株，在此轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)得到Flag標(biāo)簽標(biāo)記的核糖體-mRNA復(fù)合物，從而可以使用親和層析的方法將此復(fù)合物富集起來。
[0009]具體步驟如下:
(一)首先，確定需要過表達(dá)的基因和水稻宿主。
[0010]所述的融合Flag標(biāo)簽的核糖體蛋白RPL18在水稻中有6個基因編碼，其中3 個屬 RPL18A，另外三個屬 RPL18B，選取 0sRPL18Bl (0s03g0341100) (SEQ.1D.N0.1)、0sRPL18B2 (0s05g0155100) (SEQ.1D.N0.2)兩個基因添加標(biāo)簽。[0011]所述的水稻宿主為日本晴。
[0012]其次，構(gòu)建植物表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化水稻。
[0013]所述的過表達(dá)植株通過構(gòu)建融合Flag標(biāo)簽的0sRPL18Bl (0s03g0341100)、0sRPL18B2(0s05g0155100)植物表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)入水稻日本晴中，以使融合蛋白在35S啟動子及Ω-HF增強(qiáng)子的啟動下實現(xiàn)過表達(dá)。
[0014]然后，鑒定過表達(dá)植物中的核糖體-mRNA復(fù)合物。
[0015]所述的Flag標(biāo)簽標(biāo)記的核糖體-mRNA復(fù)合物通過對獲得的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行⑶S染色及western blot鑒定。
[0016](二)以免疫法為主，使用親和層析的方法富集Flag標(biāo)簽標(biāo)記的核糖體-mRNA復(fù)合物，即選用EGTA螯合組織勻漿液中的其它金屬離子，并加入氯霉素和放線菌酮抑制核糖體和mRNA的解離。其中，改進(jìn)抽提溶液和洗脫溶液配方、材料勻漿和濃縮方式，使用終濃度為
0.1M的EDTA洗脫核糖體-mRNA復(fù)合物。具體步驟為:
首先，進(jìn)行植物組織的破碎。所有實驗器具均需保證沒有RNA酶污染，并盡量保持冰上或4°C下操作。所述的材料勻漿要求加入材料二倍體積的PEB于液氮研磨的材料粉末之中，并在液氣中共研。
[0017]所述的EGTA螯合劑保持溶液中高濃度的鎂離子狀態(tài)，配制母液0.5M EGTA，用NaOH 調(diào)至 ρΗ8.0。
[0018]所述的氯霉素和放線菌酮能夠有效抑制核糖體和mRNA的解離,配制母液50mg/mL放線菌酮(Cycloheximide),乙醇溶解；50mg/mL氯霉素(Chloramphenicol),乙醇溶解。
[0019]其次，使用親和層析的方法富集多聚核糖體，所述的勻漿、濃縮要求后續(xù)體系中沒有DTT和低去垢劑含量，使用超濾的方法將抽提溶液逐步置換為Wash溶液。同時，超濾也去除了一部分低分子量的成分，減少了雜質(zhì)。
[0020]原來抽提溶液體系內(nèi)含有大量的內(nèi)源RNase卻沒有任何抑制RNase的成分，因此對操作要求高，本發(fā)明進(jìn)行了改進(jìn)，加入終濃度20U/ml的RNAsin，可減少RNA的降解。
[0021]所述的Wash溶液也是體系與Flag beads結(jié)合時的溶液,而Flag beads在有DTT存在的體系中易被還原破壞，因此在本發(fā)明配方中除去DTT成分，僅靠PMSF來防止蛋白質(zhì)降解。[0022]最后，將富集的多聚核糖體上的mRNA洗脫下來，在高濃度EDTA的存在下，由于鎂離子被結(jié)合，核糖體-RNA復(fù)合物會發(fā)生解離。因此可以用該方法低成本地得到RNA。從洗脫液中提取mRNA并鑒定洗脫效率和收率。
[0023]所述的洗脫液為終濃度0.1M EDTA,配制母液0.5M EDTA,用NaOH調(diào)至pH8.0。
[0024]本發(fā)明預(yù)期將分離2-4個重要的參與低溫脅迫的新功能基因，為低溫脅迫下的植物生長正常進(jìn)行以及繁衍提供保障，最終在產(chǎn)量建成上發(fā)揮重要作用。
[0025]本發(fā)明研究內(nèi)容獲國家有關(guān)部門的資助，項目名稱:
基因克隆新技術(shù)和新方法研究基于多聚核糖體技術(shù)克隆響應(yīng)非生物脅迫的植物生殖發(fā)育的新功能基因研究編號:2013ZX08009-001-008。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為本發(fā)明的水稻及擬南芥中RPL18蛋白的聚類分析示意圖。
[0027]圖2為本發(fā)明的0sRPL18Bl及0sRPL18B2載體結(jié)構(gòu)示意圖。
[0028]圖3為本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因株系⑶S染色鑒定示意圖。
[0029]圖4為本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因株系western blot驗證示意圖。
[0030]圖5為本發(fā)明的最終提取的RNA對Actin基因的定量PCR，不同洗脫效率對比示意圖。
【具體實施方式】
[0031]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的方法做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍，不限于下述的實施例。
[0032]在普通免疫法中，通過過表達(dá)融合了 Flag標(biāo)簽的核糖體蛋白RPL18，可以在植物體內(nèi)得到Flag標(biāo)簽標(biāo)記的核糖體-mRNA復(fù)合物，從而可以使用親和層析的方法將此復(fù)合物富集起來。
[0033]實施例1
融合 Flag 標(biāo)簽的 0sRPL18Bl(0s03g0341100)、0sRPL18B2 (0s05g0155100)植物表達(dá)載體的構(gòu)建，水稻中編碼RPL18蛋白的基因有6個，其中3個屬RPL18A，另外3個屬RPL18B，本發(fā)明選取了 0sRPL18Bl(0s03g0341100)、0sRPL18B2 (0s05g0155100)兩個基因添加標(biāo)簽，
進(jìn)行進(jìn)一步的實驗(圖1)。
[0034]我們構(gòu)建了融合Flag 標(biāo)簽的 0sRPL18Bl(0s03g0341100)、0sRPL18B2(0s05g0155100)的植物表達(dá)載體，并分別轉(zhuǎn)入水稻日本晴中，以使融合蛋白在35S啟動子及Ω-HF增強(qiáng)子的啟動下進(jìn)行過表達(dá)(圖2)。
[0035]實施例2轉(zhuǎn)基因株系的分子鑒定
由于我們需要盡可能多地在轉(zhuǎn)基因株系中獲得具有標(biāo)簽的核糖體-mRNA復(fù)合物，因此對獲得的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行了⑶S染色及western blot鑒定并挑選融合蛋白表達(dá)量較高的株系進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
[0036]通過⑶S染色(圖3)和western blot (圖4)鑒定，我們選取了 Bl-13、B1-29、B2-26、B2-38四個株系進(jìn)行接下來的實驗。
[0037]實施例3多聚核糖體的提取核糖體在高鎂離子的存在下能夠保持與mRNA的結(jié)合狀態(tài)，因此選用EGTA螯合組織勻漿液中的其它金屬離子；加入氯霉素和放線菌酮也能夠抑制核糖體和mRNA的解離。
[0038]所有實驗器具均需保證沒有RNA酶污染，可根據(jù)材質(zhì)不同使用160°C 4h干滅，
0.1%DEPC或10%過氧化氫浸泡并高壓滅菌的方法去除RNA酶。非醇類溶解的溶液需用RNasefree的milliQ水配制。在實驗中，盡量保持冰上或4°C下操作。
[0039]I)植物組織的破碎
以下實驗中，每半小時在當(dāng)時體系中添加1%體積的0.1M PMSF ；
加入二倍體積之PEB于液氮研磨的材料粉末之中與液氮共研(至少2ml樣品)。將原有文獻(xiàn)報道中的玻璃勻漿器混勻，改進(jìn)為在液氮中共研；
冰上凍融；
4°C, 16000g 離心 15min ；
取上清至新管，用miracloth濾盡殘洛；
200 μ I用作抽提總RNA對照及測量0D260。
[0040]2)親和層析富集多聚核糖體
(1)懸浮aFLAG beads,吸40 μ I于新1.5ml管子中；
(2)加Iml Wash溶液重懸；
(3)8200g離心Imin,棄上清；
(4)重復(fù)上述2-3步驟，共3次；
以下實驗中，每半小時在當(dāng)時體系中添加1%體積的0.1M PMSF。由于后續(xù)體系中要求沒有DTT和低去垢劑含量，因此增加了勻漿液濃縮這一步驟。使用超濾的方法將抽提溶液逐步置換為Wash溶液。同時，超濾也去除了一部分低分子量的成分，減少了雜質(zhì)，這些為本發(fā)明改進(jìn)之一；
(5)將抽提液加入30kDa的超濾透析管中，加入等體積的Wash溶液，5000g離心5min ；
(6)棄去濾液，在管中再次加入Wash溶液，并于5000g離心5min；
(7)重復(fù)步驟6，2次(可5000g離心濃縮體系至2ml左右)；
(8)取抽提液于新15ml離心管中，加入洗好的aFLag beads ；
(9)在旋轉(zhuǎn)混勻儀上4°C孵育2h；
(10)8200g 離心 lmin,4°C ；
(11)上清為未結(jié)合部分，可移至新管備用；
(12)沉淀中加入6mlWash溶液，慢搖，4°C5min ；
(13)8200g 離心 lmin, 4°C ；
(14)棄上清,加入6mlWash溶液，慢搖4°C 5min ；
(15)重復(fù)步驟13-14兩次；
(16)8200g離心lmin, 4°C,棄上清,沉淀轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管。
[0041]3)配制母液和工作液 母液:
2M Tris-HCl, pH9.0 (12.41g Tris; 840 μ I 濃 HCl;定容至 50ml)；
2M KCl ；0.5M EGTA,用 NaOH 調(diào)至 ρΗ8.0 (3.8g EGTA; 1.05g NaOH ;定容至 20ml)；
0.5M EDTA,用 NaOH 調(diào)至 ρΗ8.0 ；
IM MgCl2 ；
20% PTE ；
10% DOC ；
20% 去垢混合液:20% Brij-35; 20% Triton X-100; 20% NP-40; 20% Tween 20 ；
以上需高壓滅菌，常溫保存；
0.5g/mL 肝素；
0.5g/ml DTT (3.24M)；
50mg/mL放線菌酮Cycloheximide,乙醇溶解；
50mg/mL 氣霉素 Chloramphenicol,乙醇溶解；
0.1M PMSF，異丙醇溶解(不少于5ml)；
以上過濾除菌，_20°C保存；
8M鹽酸胍，DEPC水配制。
[0042]工作液:
PEB抽提溶液
抽提溶液在使用中，體系內(nèi)含有大量的內(nèi)源RNase卻沒有任何抑制RNase的成分，因此對操作要求高，本實驗進(jìn)行了改進(jìn)，加入一定的RNAsin,減少RNA的降解。
【權(quán)利要求】
1.一種基于免疫沉淀法的從水稻中提取多聚核糖體的方法，其特征在于具體步驟為: (1)首先，構(gòu)建融合Flag標(biāo)簽的核糖體蛋白RPL18的過表達(dá)水稻植株，在此轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)得到Flag標(biāo)簽標(biāo)記的核糖體-mRNA復(fù)合物； 其中，所述的融合Flag標(biāo)簽的核糖體蛋白RPL18在水稻中有6個基因編碼，其中3個屬 RPL18A，另外 3 個屬 RPL18B，選取 OsRPL18Bl (0s03g0341100)、0sRPL18B2 (0s05g0155100)兩個基因添加標(biāo)簽； 所述的過表達(dá)植株通過構(gòu)建融合Flag標(biāo)簽的OsRPL18Bl (0s03g0341100)、.0sRPL18B2(0s05g0155100)植物表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)入水稻日本晴中，以使融合蛋白在35S啟動子及Ω-HF增強(qiáng)子的啟動下實現(xiàn)過表達(dá)； (2)其次，使用親和層析方法，將此Flag標(biāo)簽標(biāo)記的核糖體-mRNA復(fù)合物富集起來，具體是選用EGTA螯合組織勻漿液中的其它金屬離子，并加入氯霉素和放線菌酮抑制核糖體和mRNA的解離；其中，改進(jìn)抽提溶液和洗脫溶液配方、材料勻漿和濃縮方式，使用終濃度為.0.1M的EDTA洗脫核糖體-mRNA復(fù)合物；具體步驟為: 首先，進(jìn)行植物組織的破碎，所用的材料勻漿要求加入材料二倍體積的PEB于液氮研磨的材料粉末之中，并在液氮中共研； 所述的EGTA螯合劑保持溶液中高濃度的鎂離子狀態(tài)，配制母液0.5M EGTA，用NaOH調(diào)至 pH8.0 ； 所述的氯霉素和放線菌酮能夠有效抑制核糖體和mRNA的解離,配制母液50mg/mL放線菌酮，乙醇溶解；50mg/mL氯霉素，乙醇溶解； 其次，用親和層析的方法富集多聚核糖體，使用超濾的方法將抽提溶液逐步置換為Wash溶液；同時，超濾也去除一部分低分子量的成分，減少了雜質(zhì)； 在抽提溶液體系中，加入終濃度為20U/ml的RNAsin ； 所述的Wash溶液也是體系與Flag beads結(jié)合時的溶液，配方中除去DTT成分，僅靠PMSF來防止蛋白質(zhì)降解； 最后，將富集的多聚核糖體上的mRNA洗脫下來，在高濃度EDTA的存在下，由于鎂離子被結(jié)合，核糖體-RNA復(fù)合物會發(fā)生解離；
洗脫用的洗脫液為終濃度0.1M EDTA,配制母液0.5M EDTA,用NaOH調(diào)至pH8.0。
【文檔編號】C12N15/10GK103911368SQ201410122208
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年3月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月30日
【發(fā)明者】明鳳, 王堯峰, 奚丹丹, 羅莉瓊, 沈佳斌 申請人:復(fù)旦大學(xué)