肺炎支原體耐藥診斷試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種肺炎支原體耐藥診斷試劑盒。該試劑盒包括上游引物序列P1：5'TCCAGGTACGGGTGAAGACA'3；下游引物序列P2：5'GTCCTGATCAATATTAAGCTACAGTAAAGCT'3；探針序列T1：5'ACGGAAAGACCCC'3，VIC標(biāo)記；探針序列T2：5'CGGGAAGACCCC'3，F(xiàn)AM標(biāo)記。本發(fā)明提供的肺炎支原體耐藥診斷試劑盒通過(guò)建立熒光定量PCR等位基因鑒別方法，對(duì)MP2063位點(diǎn)的基因型進(jìn)行鑒定，在快速診斷的同時(shí)判斷其耐藥性，檢測(cè)靈敏度較好。
【專利說(shuō)明】肺炎支原體耐藥診斷試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種PCR檢測(cè)試劑盒，更具體地說(shuō)，涉及一種實(shí)時(shí)定量的肺炎支原體耐藥診斷試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae,簡(jiǎn)稱為MP)是兒童、青少年及成人上、下呼吸道感染的常見(jiàn)病原體。23%~50%的學(xué)齡前兒童和青少年社區(qū)獲得性肺炎是由MP感染導(dǎo)致的，流行周期為3~7年。肺炎支原體肺炎易復(fù)發(fā)或遷延不愈，重癥患者常合并肺外癥狀，對(duì)健康危害嚴(yán)重。
[0003]MP無(wú)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，臨床上只能選擇抑制或影響其蛋白質(zhì)和核酸合成的藥物，如大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、四環(huán)素類抗生素、喹諾酮類抗生素等。但由于其他抗生素的不良反應(yīng)，治療兒童MP感染首選大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。自2001年發(fā)現(xiàn)對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的MP以來(lái)，MP耐藥率逐年升高且流行范圍逐漸擴(kuò)大，已有多個(gè)國(guó)家或地區(qū)分離到MP耐藥株。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，日本2007年MP耐藥率已高達(dá)40%以上，韓國(guó)兒童住院患者M(jìn)P耐藥率為61.3%，意大利為26%，法國(guó)為9.8%，德國(guó)為3%。中國(guó)MP耐藥形勢(shì)則更為嚴(yán)峻，MP臨床分離株中92%以上大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥。MP的耐藥機(jī)制主要是核糖體大亞基23S rRNA的基因突變和核糖體蛋白L4、L22基因突變，其中23S rRNA結(jié)構(gòu)域V區(qū)的2063位點(diǎn)和2064位點(diǎn)的點(diǎn)突變占主導(dǎo)地位。我國(guó)發(fā)現(xiàn)的耐藥MP中2063A-G突變占97%以上。
[0004]目前，臨床上常用的MP診斷方法為MP培養(yǎng)、血清學(xué)檢測(cè)和PCR。MP培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)，陽(yáng)性率低，耐藥性的監(jiān)測(cè)通常需要體外培養(yǎng)并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，測(cè)定最小抑菌濃度(MIC)。血清學(xué)檢測(cè)方法簡(jiǎn)便易行，但需要患者恢復(fù)期血清做對(duì)照，急性期診斷效果不佳。常規(guī)PCR方法具有快速、陽(yáng)性率高的優(yōu)點(diǎn)，但存在假陽(yáng)性的問(wèn)題。熒光定量PCR以特異性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)而得到迅速發(fā)展，但其并不能判斷病原體耐藥性，對(duì)臨床治療的指導(dǎo)意義有限。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種肺炎支原體耐藥診斷試劑盒。該試劑盒可以通過(guò)建立熒光定量PCR等位基因鑒別方法，對(duì)MP2063位點(diǎn)的基因型進(jìn)行鑒定，在診斷的同時(shí)判斷其耐藥性。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述的發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述的技術(shù)方案:
[0007]—種肺炎支原體耐藥診斷試劑盒,包括:
[0008]上游引物序列Pl:5’ TCCAGGTACGGGTGAAGACA’ 3 ；
[0009]下游引物序列P2:5’ GTCCTGATCAATATTAAGCTACAGTAAAGCT’ 3 ；
[0010]探針序列Tl:5’ ACGGAAAGACCCC’ 3，VIC 標(biāo)記；
[0011]探針序列T2:5’ CGGGAAGACCCC’ 3，F(xiàn)AM 標(biāo)記。
[0012]本發(fā)明提供的肺炎支原體耐藥診斷 試劑盒通過(guò)建立熒光定量PCR等位基因鑒別方法，對(duì)MP2063位點(diǎn)的基因型進(jìn)行鑒定，在快速診斷的同時(shí)判斷其耐藥性，從而指導(dǎo)臨床實(shí)踐。該診斷試劑盒的檢測(cè)靈敏度較好，臨床應(yīng)用前景巨大。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1為MP標(biāo)準(zhǔn)株ra、耐藥株307及構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒PCR結(jié)果。其中，I為MP標(biāo)準(zhǔn)株FH，2為耐藥株307，3為敏感2063A質(zhì)粒，4為耐藥2063G質(zhì)粒，N為陰性對(duì)照，P為陽(yáng)性對(duì)照⑷為 IOObp DNA Ladder。
[0014]圖2為實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0015]圖3顯示了實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定2063等位基因的診斷價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0017]肺炎支原體(MP)是引起兒童肺炎和肺外并發(fā)癥的一種常見(jiàn)病原體。目前兒童MP感染的主要治療藥物為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。近年來(lái)國(guó)內(nèi)、國(guó)際臨床上越來(lái)越多分離到耐大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的MP株，主要耐藥機(jī)制是核糖體大亞基的23S rRNA的編碼基因突變。在我國(guó)，目前報(bào)道97%以上的耐藥株為2063A —G突變。自2000年第一次報(bào)道實(shí)時(shí)定量PCR診斷MP以來(lái)，已有大量的針對(duì)不同擴(kuò)增序列的實(shí)時(shí)定量PCR診斷方法研究出現(xiàn)，也出現(xiàn)很多市售試劑盒。但這些方法只能給出陽(yáng)性或陰性結(jié)果，不能獲得耐藥信息。因此，本發(fā)明針對(duì)導(dǎo)致MP耐藥2063位A — G的點(diǎn)突變，設(shè)計(jì)引物和探針，建立MP耐藥診斷一步法的試劑盒。下面對(duì)此展開(kāi)詳細(xì)具體的說(shuō)明。
[0018]I材料與方法
[0019]1.1 標(biāo)本
[0020]1.1.1MP 標(biāo)準(zhǔn)株
[0021]MP標(biāo)準(zhǔn)株ra (ATCC15531)、人型支原體(ATCC27813)為首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院熱帶醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存；梨形支原體、穿通支原體、生殖支原體由東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院王蓓教授饋贈(zèng)。
[0022]1.1.2MP臨床分離株
[0023]MP臨床分離株分離自2010年2月~2011年2月就診于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院兒科(住院部和門診)、首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院兒科(住院部)的43例疑似肺炎支原體肺炎患兒的呼吸道咽拭子標(biāo)本。鼻咽拭子標(biāo)本12份采集自2012年12月就診于北京大學(xué)第三醫(yī)院兒科疑似MPP的病例。
[0024]1.1.3比對(duì)菌株
[0025]綠膿桿菌( ATCC27853)、大腸埃希菌(ATCC25922)、陰溝腸桿菌(ATCC700323)、金黃色葡萄球菌(ATCC25922)、肺炎克雷伯臨床分離株(1705)由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院檢驗(yàn)科饋贈(zèng)。
[0026]1.2 試劑[0027]小牛血清、酵母提取物、葡萄糖、氨芐青霉素、IPTG、X-Gal、瓊脂糖、胰蛋白胨均購(gòu)自北京環(huán)亞泰克生物有限公司；2XTap plus PCR Green Mix購(gòu)自Takara公司；pGEM?_-T Easy Vector Systems II 購(gòu)自 Promega 公司；QIAamp DNA minikit DNA 提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；PCR產(chǎn)物回收試劑盒及質(zhì)粒純化試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；突光定量PCR Genotyping mix購(gòu)自美國(guó)ABI公司。
[0028]1.3熒光定量PCR
[0029]1.3.1DNA 模板提取
[0030]取20(^1^對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的培養(yǎng)1^，2000(^，離心201^11;20(^1^ PBS沉淀重懸；QIAamp DNA minikit提取DNA模板。接種環(huán)無(wú)菌挑取菌落至200 μ L PBS中，QIAampDNAminikit提取DNA模板。對(duì)提取咽拭子標(biāo)本的滅菌棉簽用MP培養(yǎng)液浸泡，經(jīng)反復(fù)涮洗擠壓后棄掉棉簽,將浸泡液以20000g，離心lOmin，棄去上清液后加標(biāo)本處理液50 μ L,并充分混勻，置100°C沸水中水浴lOmin，此溶液作為DNA模板備用。
[0031]1.3.2引物序列與探針序列
[0032]根據(jù)MP標(biāo)準(zhǔn)株Ml29序列(NC_000912.1) 23S RNA突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)上下游引物及探針;上游引物序列 Pl:5’TCCAGGTACGGGTGAAGACA’3( SEQ ID N0.1)，下游引物序列 P2:5，GTCCTGATCAATATTAAGCTACAGTAAAGCT’3 (SEQ IDN0.2)，探針序列 Tl:5’ACGGAAAGACCCC’3 (SEQID N0.3)，VIC 標(biāo)記；T2:5’CGGGAAGACCCC’3 (SEQ ID N0.4)，F(xiàn)AM 標(biāo)記。引物序列和探針序列均由英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。
[0033]1.3.3PCR
[0034]反應(yīng)體系:2X緩沖液 10`.0yL, 10 μ mol/L 的引物 P31.0 μ L，10 μ mol/L 引物P41.0 μ L，模板 DNA1.0yL, ddH207.0 μ L。
[0035]反應(yīng)條件:93°C變性2min ；95°C lmin, 50°C lmin, 72°C lmin, 35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min。
[0036]熒光定量PCR產(chǎn)物采用膠回收試劑盒回收，采用T Easy載體連接體系克隆，4°C連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選。隨機(jī)挑取6個(gè)白色菌落，以裂解液為模板，以原有熒光定量PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組子挑選2個(gè)陽(yáng)性克隆送英濰捷基貿(mào)易有限公司測(cè)序；采用Blast功能進(jìn)行序列分析。挑選測(cè)序結(jié)果一致的克隆提取質(zhì)粒備用。
[0037]1.3.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR
[0038]反應(yīng)體系:2X緩沖液 10.0 μ L，40XAssay Mix (含 P1，P2，T1，T2) 0.5 μ L，DNA 模板(野生型2063A或突變型2063G標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒)l.0yL, ddH207.0 μ L，總體積20 μ L。
[0039]反應(yīng)條件:95°C lmin ；92°C 15s，60°C lmin,40個(gè)循環(huán)；分別收集擴(kuò)增前、擴(kuò)增時(shí)、擴(kuò)增后熒光信號(hào)，采用ABI公司熒光定量PCR儀7500的SDS軟件獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。陽(yáng)性質(zhì)粒從600000到6進(jìn)行10倍倍比稀釋。采用不同菌株DNA作為模板進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系中引物和探針的專一性。43株MP臨床分離株2063位點(diǎn)基因型和鼻咽拭子標(biāo)本2063位點(diǎn)基因型的鑒定均在本反應(yīng)體系下完成。
[0040]1.3.523S rRNA巢式PCR23S rRNA巢式PCR引物為外套上游:5' GGTCCTAAGGTAGCGAAATT3' (SEQ ID N0.5);外套下游:5' CAGTTACCAATTAGAACAGC3'(SEQ ID N0.6);內(nèi)套上游 P3:5' CCTAGTCGGGTAAATTCCGT3' (SEQ ID N0.7);內(nèi)套下游 P4:5' CCAAGGGTAGTATTCCACCT3; (SEQ ID N0.8)(參見(jiàn)李靖、崔菲菲、辛德莉的論文《兒童呼吸道肺炎支原體感染耐藥現(xiàn)狀》，刊載于《實(shí)用兒科臨床雜志》2009，24 (22):1717~1719.)，二輪產(chǎn)物送英濰捷基貿(mào)易有限公司測(cè)序。以23S rRNA巢式PCR測(cè)序結(jié)果為對(duì)照，計(jì)算實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定2063位點(diǎn)基因型的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值等。
[0041]2 結(jié)果
[0042]2.1構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒
[0043]以MP標(biāo)準(zhǔn)株!7H (敏感株，2063A)和臨床分離株317 (耐藥株，2063G)為DNA模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段位于250bp左右位置，與設(shè)計(jì)的目的片段244bp大小一致(見(jiàn)圖1 )。將上述PCR產(chǎn)物連接至T-EASY后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，涂板含有ITPG、Χ-gal和氨芐青霉素選擇性平板，選擇白色的菌落進(jìn)行PCR鑒定，得到的片段大小與預(yù)期一致(見(jiàn)圖1)。質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示，敏感2063A質(zhì)粒2063位點(diǎn)與MP標(biāo)準(zhǔn)株均為A，耐藥2063G質(zhì)粒2063位點(diǎn)為G，與MP標(biāo)準(zhǔn)株!7H不一致。
[0044]2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0045]敏感2063A質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2為0.9979，斜率為一3.4893，擴(kuò)增效率為93% ;耐藥2063G質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2為0.9979，斜率為一3.7262，擴(kuò)增效率為86%。在相同拷貝數(shù)下，敏感2063A質(zhì)粒和耐藥2063G質(zhì)粒對(duì)應(yīng)的Ct值很接近，重現(xiàn)性較好(見(jiàn)圖2)。敏感2063A質(zhì)粒和耐藥2063G質(zhì)粒的檢測(cè)下限分別為和6和60，敏感2063A質(zhì)?？截悢?shù)為6~6X 106，基因型為2063A ;耐藥2063G質(zhì)?？截悢?shù)為60~6X 106，基因型為2063G。
[0046]2.3特異性實(shí)驗(yàn)
[0047]MP臨床分離株中耐藥株的Ct值為24.69，基因型為2063G ；MP標(biāo)準(zhǔn)株的Ct值為26.05，基因型為2063A。 除生殖支原體外，人型支原體、梨形支原體、穿通支原體及綠膿桿菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯桿菌臨床分離株均未出現(xiàn)擴(kuò)增，生殖支原體的Ct值為26.15，基因型為2063A。
[0048]2.443株臨床分離株2063位點(diǎn)基因型
[0049]43株臨床分離株進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR均出現(xiàn)擴(kuò)增，Ct值為26.82~34.25，拷貝數(shù)為2.05 X IO4~2.95 X IO6 ;其中6株2063位點(diǎn)為A，為敏感株，37株2063位點(diǎn)為G，為耐藥株，MP耐藥率為86.05%。與23S rRNA巢式PCR測(cè)序結(jié)果相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定2063等位基因的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值均為100% (見(jiàn)圖3)。
[0050]2.5鼻咽拭子標(biāo)本2063位點(diǎn)基因型
[0051]12份鼻咽拭子標(biāo)本中2份進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR均未出現(xiàn)擴(kuò)增，其余10份標(biāo)本中6份2063位點(diǎn)為A，為敏感株，3株2063位點(diǎn)為G，為耐藥株，1份標(biāo)本同時(shí)發(fā)現(xiàn)2063A和2063G位點(diǎn)。鼻咽拭子標(biāo)本MP陽(yáng)性率為83.33% (10/12)，耐藥率為33.33% (4/12)。
[0052]本發(fā)明采用MP標(biāo)準(zhǔn)株FH，以耐藥譜明確的臨床分離株307作為模板，構(gòu)建敏感型2063A質(zhì)粒，將耐藥型2063G質(zhì)粒作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。兩型最低檢出分別為6和60拷貝數(shù)。耐藥型標(biāo)準(zhǔn)品較敏感型低一個(gè)數(shù)量級(jí)，考慮原因可能為2063位G氫鍵斷裂需要較高的能量。所以在相同退火溫度時(shí)，含G開(kāi)鏈效率較A低，因此檢出效果較A差。所以根據(jù)不同基因型構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線再進(jìn)行核酸定量是必要的。特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示生殖支原體MG有擴(kuò)增，基因型為2063A。MG為一種定植于泌尿生殖道的具有致病性的性傳播病原體，首選治療藥物為大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮和四環(huán)素類抗生素。對(duì)MG進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)2063A位附近MG序列與標(biāo)準(zhǔn)株M129 —致性達(dá)到99%。因檢測(cè)位點(diǎn)區(qū)域、熒光定量PCR引物和探針實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的限制，該交叉不可避免。但可以通過(guò)血清學(xué)或16s RNA PCR區(qū)分。
[0053]應(yīng)用該試劑盒檢測(cè)43株臨床分離株，6株為敏感株，37株是耐藥株。將43株臨床分離株經(jīng)傳統(tǒng)23S rRNA巢式PCR后測(cè)序顯示結(jié)果與本發(fā)明完全一致。由此可以看出，對(duì)于臨床分離株，利用該試劑盒可以快速準(zhǔn)確鑒定2063位基因型，區(qū)分耐藥和敏感株，從而簡(jiǎn)化操作流程，降低勞動(dòng)強(qiáng)度。
[0054]該試劑盒應(yīng)用于臨床標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)MP陽(yáng)性檢出率為88.33%。同批標(biāo)本23S rRNA巢式PCR均檢出陽(yáng)性。發(fā)明人經(jīng)過(guò)分析，認(rèn)為可能是咽拭子標(biāo)本DNA提取液混有大量雜質(zhì)，簡(jiǎn)單煮沸法并不能完全清除PCR抑制物，導(dǎo)致實(shí)時(shí)定量PCR效率下降，檢出率降低；或者由于個(gè)別患者載量較低所致，可以考慮優(yōu)化DNA標(biāo)本提取方法或者使用成熟的DNA提取試劑盒。
[0055]本發(fā)明第一次在同一標(biāo)本中檢測(cè)出2063A和2063G雜合基因型,說(shuō)明在同一患者可能同時(shí)存在敏感和耐藥株。而普通巢氏PCR測(cè)序會(huì)導(dǎo)致優(yōu)勢(shì)菌株基因大量被擴(kuò)增，測(cè)序結(jié)果通常僅說(shuō)明優(yōu)勢(shì)菌群基因型，不能如實(shí)反應(yīng)病人實(shí)際感染MP的表型。本發(fā)明的研究成果顯示MP在體外大環(huán)內(nèi)酯類抗生素壓力下會(huì)產(chǎn)耐藥性，或者也可能為環(huán)境中MP即存在2063A — G的低水平突變，只是抗生素使用殺死敏感株時(shí)，耐藥株才成為優(yōu)勢(shì)菌群。
[0056]綜上所述，本發(fā)明初步建立了一種快速診斷MP感染及判斷耐藥表型的肺炎支原體耐藥診斷試劑盒。該試劑盒檢測(cè)靈敏度較好，但2063A和2063G基因型檢測(cè)下限不同，2063G較2063A低一個(gè)數(shù)量級(jí)，僅與生殖支原體有交叉。應(yīng)繼續(xù)優(yōu)化反應(yīng)體系并在擴(kuò)大臨床應(yīng)用，對(duì)效果進(jìn)行評(píng)估。本發(fā)明與傳統(tǒng)23S rRNA巢氏PCR測(cè)序方法相比，敏感性和特異性均較好，臨床應(yīng)用前景巨大。
[0057]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。`
【權(quán)利要求】
1.一種肺炎支原體耐藥診斷試劑盒，其特征在于包括: 上游引物序列 Pl:5’ TCCAGGTACGGGTGAAGACA’ 3 ； 下游引物序列 P2:5’ GTCCTGATCAATATTAAGCTACAGTAAAGCT’ 3 ； 探針序列 Tl:5’ ACGGAAAGACCCC’ 3，VIC 標(biāo)記； 探針序列 T2:5’ CGGGAAGACCCC’ 3，F(xiàn)AM 標(biāo)記。
2.如權(quán)利要求1所述的肺炎支原體耐藥診斷試劑盒，其特征在于: 采用肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株，以耐藥譜明確的臨床分離株作為模板，構(gòu)建敏感型2063A質(zhì)粒，將耐藥型2063G質(zhì)粒作為`陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103820557SQ201410073883
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月30日
【發(fā)明者】辛德莉, 李靜宜, 孫嵐, 郭東星, 姜越 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院