大豆開花基因GmFT2a啟動(dòng)子的制作方法
【專利摘要】大豆開花基因GmFT2a啟動(dòng)子，它涉及大豆開花基因GmFT2a啟動(dòng)子序列。本發(fā)明的目的是提供大豆開花基因GmFT2a啟動(dòng)子。本發(fā)明的大豆開花基因GmFT2a啟動(dòng)子核苷酸序列如序列表Seq?ID?No：2所示。GmFT2a基因啟動(dòng)子起開花促進(jìn)作用，本發(fā)明通過大豆遺傳轉(zhuǎn)化驗(yàn)證，闡明GmFT2a的啟動(dòng)子在大豆開花期中起調(diào)控開花作用。本發(fā)明不但對(duì)于揭開大豆開花期和生育期的分子機(jī)理具有非常重要的意義，而且也可以利用開發(fā)的分子標(biāo)記進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種，加快育種進(jìn)程，提高育種效率。本發(fā)明應(yīng)用于大豆基因工程領(lǐng)域。
【專利說明】大豆開花基因GmFT2a啟動(dòng)子
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及大豆開花基因GmFT2a啟動(dòng)子序列，屬于植物基因工程領(lǐng)域和作物分子育種領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]大豆為人類提供重要的植物蛋白質(zhì)和油份。在世界范圍內(nèi)，北至高緯度的北歐瑞典和北美加拿大，南至巴西及阿根廷等廣泛區(qū)域內(nèi)均有大豆栽培，但單個(gè)品種或種質(zhì)資源一般適宜種植的緯度跨度較小，這種區(qū)域適應(yīng)性與大豆光周期和生育期基因或者數(shù)量性狀位點(diǎn)(Quantitative Trait Locus, QTL)密切相關(guān)。選育生態(tài)適應(yīng)性廣的優(yōu)良大豆品種是實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效大豆產(chǎn)業(yè)的根本途徑。但常規(guī)育種在廣適應(yīng)品種選育中進(jìn)展緩慢，利用分子育種手段有望定向調(diào)節(jié)大豆光周期和生育期，加快廣適應(yīng)品種的選育。模式植物擬南芥和水稻的研究結(jié)果表明，開花素(Fl0rigen，F(xiàn)T蛋白)從葉片轉(zhuǎn)運(yùn)到莖尖誘導(dǎo)花的形成(Corbesier 等，2007 ;Tamaki 等,2007)。
[0003]我們從大豆中克隆了 10個(gè)FT基因，這10個(gè)基因成對(duì)的復(fù)制在大豆連鎖群上?；虮磉_(dá)分析的結(jié)果顯示，在開花誘導(dǎo)條件即短日照條件下，有兩個(gè)FT基因(GmFT2a和GmFT5a)在花芽形成期(25~30天左右)，在三出復(fù)葉中大量表達(dá)，而其他基因表達(dá)量極低或者不表達(dá)。并且這兩個(gè)基因呈現(xiàn)生物鐘規(guī)律的基因表達(dá)類型，在光照開始4個(gè)小時(shí)表達(dá)強(qiáng)度最高之后逐漸減弱 。在非誘導(dǎo)的長(zhǎng)日照條件下，只有一個(gè)FT基因(GmFT5a)相對(duì)表達(dá)，從而導(dǎo)致了在此條件下大豆開花期較晚，生育期延長(zhǎng)。利用大豆光敏色素A基因的雙突變體(Harosoy_e3e4)研究則發(fā)現(xiàn),在長(zhǎng)日照條件下，Harosoy-e3e4的開花期與其野生型植株在短日照條件下的開花期一致。而且，在雙突變體中，在花芽形成期，GmFT2a和GmFT5a的表達(dá)被大量誘導(dǎo)而且呈現(xiàn)與短日照完全相同的生物鐘規(guī)律的基因表達(dá)。這些研究結(jié)果從分子水平上初步揭示了大豆開花期和生育期的分子機(jī)理，即(I)在誘導(dǎo)的短日照條件下，有兩個(gè)FT基因參與表達(dá)導(dǎo)致花期很短，然而在非誘導(dǎo)的長(zhǎng)日照條件下，只有一個(gè)FT基因參與表達(dá)從而導(dǎo)致開花期變長(zhǎng)；(2)大豆經(jīng)過自身進(jìn)化使光敏色素A基因失活來適應(yīng)在高緯度區(qū)域生存，而這一進(jìn)化過程又是最終通過調(diào)控兩個(gè)大豆中主要的FT基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的；(3)在長(zhǎng)日照條件下，長(zhǎng)日照植物擬南芥的光敏色素A基因誘導(dǎo)FT基因的表達(dá)，而短日照植物大豆的光敏色素A基因卻抑制FT基因的表達(dá)，說明短日照植物含有與長(zhǎng)日照植物不同的光周期反應(yīng)調(diào)控機(jī)制(Kong等2010)。此外，通過大豆遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，研究者進(jìn)一步驗(yàn)證了GmFT2a具有大豆開花促進(jìn)功能(Sun等2011)。Jiang等(2013)研究表明大豆光周期敏感性和開花時(shí)間與GmFT2a的啟動(dòng)子多態(tài)性密切相關(guān)。但是，GmFT2a基因的啟動(dòng)子如何影響著大豆生育期(開花期及成熟期)是一個(gè)非常重要的科學(xué)問題，相關(guān)研究鮮有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供大豆開花基因GmFT2a啟動(dòng)子。
[0005]本發(fā)明的大豆開花基因GmFT2a啟動(dòng)子核苷酸序列如序列表Seq ID No:2所示。[0006]本發(fā)明的有益效果:
[0007]本發(fā)明是在克隆出大豆開花基因GmFT2a (Kong等2010)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)GmFT2a基因的啟動(dòng)子序列進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究，我們已證實(shí)GmFT2a基因具有促進(jìn)大豆開花的功能，本發(fā)明對(duì)不同品種中GmFT2a基因的啟動(dòng)子序列進(jìn)行了研究，并確定了 GmFT2a的啟動(dòng)子對(duì)大豆生開花期關(guān)系密切。
[0008]通過QTL技術(shù)分析可知，從大豆品種TK780中獲得的開花基因GmFT2a的啟動(dòng)子具有序列表中Seq ID No:1的核苷酸序列，從大豆品種H4中獲得的開花基因GmFT2a的啟動(dòng)子具有序列表中的Seq ID No:2的核苷酸序列，兩者相比，除少數(shù)SNP外，如Seq ID No:1所示的序列，在GmFT2a基因上游958bp處有一個(gè)42堿基的插入，在1677bp處有一個(gè)10堿基的缺失。如Seq ID No: 2所示的序列，GmFT2a基因上游958bp有一個(gè)42堿基的缺失，在1677bp處有一個(gè)10堿基的插入。通過生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明Seq ID No:1比Seq IDNo:2多出2個(gè)順式元件，分別和雙組份信號(hào)系統(tǒng)的細(xì)胞分裂素信號(hào)途徑、花粉的成熟和萌發(fā)相關(guān)。
[0009]進(jìn)一步的大豆遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)GmFT2a基因啟動(dòng)子序列Seq ID No:2的植株比轉(zhuǎn)對(duì)照GmFT2a基因啟動(dòng)子序列Seq ID No:1的植株早開花，說明GmFT2a基因啟動(dòng)子序列Seq ID No:2起開花促進(jìn)作用。
[0010]本發(fā)明要解決開花期及成熟期長(zhǎng)的問題，提供了大豆開花基因FT啟動(dòng)子，本發(fā)明為分子手段培育廣適應(yīng)作物品種創(chuàng)造了條件，將在植物的遺傳改良中發(fā)揮重要作用，本發(fā)明通過大豆遺傳轉(zhuǎn)化驗(yàn)證，表明含開花基因GmFT2a啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照相比，其促進(jìn)開花的功能明顯增強(qiáng)，闡明GmFT2a的啟動(dòng)子在大豆開花期中起調(diào)控開花作用。
[0011]本研究不但對(duì)于揭開大豆開花期和生育期的分子機(jī)理具有非常重要的意義，而且同時(shí)也可以利用開發(fā)的分子標(biāo)記進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種，加快育種進(jìn)程，提高育種效率，本發(fā)明應(yīng)用于大豆基因工程領(lǐng)域。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為pTFlOL l-GmFT2a_P質(zhì)粒過表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖，其中FT2a_P表示GmFT2a的啟動(dòng)子；
[0013]圖2為未轉(zhuǎn)入Seq ID No:2啟動(dòng)子序列連著GmFT2a基因與轉(zhuǎn)入Seq ID No:2啟動(dòng)子序列連著GmFT2a基因的大豆開花時(shí)間圖，其中I為未轉(zhuǎn)入Seq ID No:2啟動(dòng)子序列連著GmFT2a基因的大豆，2為轉(zhuǎn)入Seq ID No:2啟動(dòng)子序列連著GmFT2a基因的大豆；
[0014]圖3為未轉(zhuǎn)入Seq ID No:2啟動(dòng)子序列連著GmFT2a基因的大豆?fàn)I養(yǎng)生殖狀態(tài)圖；
[0015]圖4為轉(zhuǎn)入Seq ID No:2啟動(dòng)子序列連著GmFT2a基因的大豆開花狀態(tài)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016]【具體實(shí)施方式】一:本實(shí)施方式的大豆開花基因GmFT2a啟動(dòng)子核苷酸序列如序列表 Seq ID No:2 所示。
[0017]本實(shí)施方式是在分子水平上首次成功地克隆、驗(yàn)證大豆開花基因GmFT2a的啟動(dòng)子的功能。
[0018]本實(shí)施方式是在克隆出大豆開花基因GmFT2a (Kong等2010)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)GmFT2a基因的啟動(dòng)子序列進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究，我們已證實(shí)GmFT2a基因具有促進(jìn)大豆開花的功能，本實(shí)施方式對(duì)不同品種中GmFT2a基因的啟動(dòng)子序列進(jìn)行了研究，并確定了GmFT2a的啟動(dòng)子對(duì)大豆生開花期關(guān)系密切。
[0019]通過QTL技術(shù)分析可知，從大豆品種TK780中獲得的開花基因GmFT2a的啟動(dòng)子具有序列表中Seq ID No:1的核苷酸序列，從大豆品種H4中獲得的開花基因GmFT2a的啟動(dòng)子具有序列表中的Seq ID No:2的核苷酸序列，兩者相比，除少數(shù)SNP外，如Seq ID No:1所示的序列，在GmFT2a基因上游958bp處有一個(gè)42堿基的插入，在1677bp處有一個(gè)10堿基的缺失。如Seq ID No: 2所示的序列，GmFT2a基因上游958bp有一個(gè)42堿基的缺失，在1677bp處有一個(gè)10堿基的插入。通過生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明Seq ID No:1比Seq IDNo:2多出2個(gè)順式元件，分別和雙組份信號(hào)系統(tǒng)的細(xì)胞分裂素信號(hào)途徑、花粉的成熟和萌發(fā)相關(guān)。
[0020]進(jìn)一步的大豆遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)GmFT2a基因啟動(dòng)子序列Seq ID No:2的植株比轉(zhuǎn)對(duì)照GmFT2a基因啟動(dòng)子序列Seq ID No:1的植株早開花，說明GmFT2a基因啟動(dòng)子序列Seq ID No:2起開花促進(jìn)作用。
[0021]本實(shí)施方式利用PCR方法從大豆中克隆出大豆開花基因GmFT2a的啟動(dòng)子。
[0022]本實(shí)施方式通過大豆遺傳轉(zhuǎn)化手段，將GmFT2a的啟動(dòng)子序列Seq ID No:2連著GmFT2a基因在一起轉(zhuǎn)入大豆品種TK780 (GmFT2a的啟動(dòng)子序列Seq ID No:1，屬功能缺失型)，能使大豆品種TK780早花10天左右。
[0023]通過以 下試驗(yàn)驗(yàn)證本發(fā)明的效果:
[0024](I)大豆開花基因GmFT2a啟動(dòng)子的獲得
[0025]利用SSR標(biāo)記構(gòu)建大豆重組自交系H4XTK780的連鎖圖譜，在以elnlRIL群體背景下，定位到了一個(gè)QTLs，位于J連鎖群的GmFT2a基因位點(diǎn)。通過對(duì)H4和TK780的重測(cè)序結(jié)果分析表明，兩者間GmFT2a基因cDNA序列沒有差異。分別以大豆品種H4和TK780的葉片為材料，采用CTAB法提取DNA，通過Fl與Rl引物擴(kuò)增GmFT2a基因的啟動(dòng)子，PCR反應(yīng)條件如下:94°C預(yù)變性5min, 94°C變性30s, 56°C退火30s, 72°C延伸lmin,共35循環(huán)，再72°C延伸90秒，將PCR產(chǎn)物在ABI3130測(cè)序儀(ABI公司)上進(jìn)行測(cè)序；
[0026]其中，引物Fl的序列為GCCGATCATGACAGTGCATG ;弓丨物Rl的序列為CTTCCACTAGGCATGGGATA。
[0027]測(cè)序結(jié)果表明大豆品種TK780中開花基因GmFT2a的啟動(dòng)子具有序列表中Seq IDNo:1的核苷酸序列，大豆品種H4中開花基因GmFT2a的啟動(dòng)子具有序列表中的Seq ID No:2的核苷酸序列。
[0028]大豆GmFT2a的啟動(dòng)子序列Seq ID No:1與GmFT2a的啟動(dòng)序列Seq ID No:2相t匕，除少數(shù)SNP外，前者在GmFT2a基因上游958bp處有一個(gè)42堿基的插入，在1677bp處有一個(gè)10堿基的缺失，從而改變GmFT2a基因的功能。
[0029](2)大豆開花基因GmFT2a啟動(dòng)子的功能驗(yàn)證
[0030]利用F2和R2為引物，以(I)中H4中開花基因GmFT2a的啟動(dòng)子為模板通過PCR進(jìn)行5’與3’擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸90秒，共35循環(huán)，再72°C延伸lOmin，獲得含有Pst1-XbaI雙酶酶切位點(diǎn)的大豆開花基因GmFT2a的啟動(dòng)子；將獲得的含有酶切位點(diǎn)的大豆開花基因GmFT2a的啟動(dòng)子克隆到pTFlOl.1-GmFT質(zhì)粒中，替換35S啟動(dòng)子，獲得pTFlOl.l-GmFT2a_P質(zhì)粒，以大豆品種TK780為材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因大豆，將含有H4型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因大豆與未轉(zhuǎn)入H4型GmFT2a的啟動(dòng)子的大豆在長(zhǎng)日照條件下種植，觀察大豆生長(zhǎng)及開花狀態(tài)。
[0031]其中，pTFlOl.1質(zhì)粒在2006年《Plant Cell Reports))中刊登的名稱為〃 Improved cotyledonary node method using an alternative explant derived frommature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation，，的文章中公開，由文章的作者惠贈(zèng)；大豆品種TK780和H4由北海道大學(xué)Abe交警惠贈(zèng)。
[0032]其中，引物F2的序列為CTGCAGGCCGATCATGACAGTGCATG ;引物R2的序列為TCTAGACTTCCACTAGGCATGGGATA。
[0033]其中pTFlOl.l-GmFT2a_P質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。
[0034]未轉(zhuǎn)入Seq ID No:2啟動(dòng)子序列連著GmFT2a基因的大豆?fàn)I養(yǎng)生殖狀態(tài)圖如圖3所示，轉(zhuǎn)入Seq ID No:2啟動(dòng)子序列連著GmFT2a基因的大豆開花狀態(tài)圖如圖4所示，由圖3和圖4可以看出，當(dāng)轉(zhuǎn)入H4型GmFT2a的啟動(dòng)子的大豆開花時(shí)，未轉(zhuǎn)入H4型GmFT2a的啟動(dòng)子的大豆還沒有開花，表明轉(zhuǎn)入H4型GmFT2a的啟動(dòng)子能互補(bǔ)TK780中GmFT2a的啟動(dòng)子功能缺失，同時(shí)也進(jìn)一步說明GmFT2a的啟動(dòng)子是此QTL的候選基因。
[0035]未轉(zhuǎn)入Seq ID No:2啟動(dòng)子序列連著GmFT2a基因與轉(zhuǎn)入Seq ID No:2啟動(dòng)子序列連著GmFT2a基因的大豆開花時(shí)間圖如圖2所示，其中I為未轉(zhuǎn)入Seq ID No:2啟動(dòng)子序列連著GmFT2a基因的大豆品種TK780，2為轉(zhuǎn)入Seq ID No:2啟動(dòng)子序列連著GmFT2a基因的大豆品種TK780，由圖2可以看出，TK780的開花時(shí)間約平均33.75天，而轉(zhuǎn)入Seq ID No:2啟動(dòng)子序列連著GmFT2a基因的大豆品種TK780的開花時(shí)間平均為23天，表明轉(zhuǎn)入Seq IDNo:2啟動(dòng)子序列連著GmFT2a`基因的大豆開花時(shí)間比未轉(zhuǎn)入Seq ID No:2啟動(dòng)子序列連著GmFT2a基因的大豆開花時(shí)間早10天，從而說明GmFT2a的啟動(dòng)子在大豆開花中起促進(jìn)功能，同時(shí)也進(jìn)一步說明GmFT2a的啟動(dòng)子是此QTL的候選基因。
【權(quán)利要求】
1.大豆開花基因GmFT2a啟動(dòng)子，其特征在于大豆開花基因GmFT2a啟動(dòng)子核苷酸序列如序列表Seq ID No:2所 示。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK103805604SQ201410031873
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月23日
【發(fā)明者】孔凡江, 劉寶輝, 李瑩, 曹東 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所