牦牛胴體性狀候選基因檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及動(dòng)物生物【技術(shù)領(lǐng)域】中的牦牛分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)，具體涉及到牦牛胴體性狀候選基因檢測(cè)試劑盒及其測(cè)試方法。一種牦牛胴體性狀候選基因PCR-SSCP檢測(cè)試劑盒，包括有PCR反應(yīng)液，ANK1*B的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣；去離子水，10%過(guò)硫酸銨，上樣變性緩沖液，TEMED，12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠Arc:Bis=37.5:1；所述的上樣變性緩沖液，包括98%去離子甲酰胺，0.025%溴酚藍(lán)，0.025%二甲苯青，10mmol/L?EDTA?pH8.0。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)靈敏、特異性強(qiáng)、易操作，適用于各級(jí)畜牧獸醫(yī)教學(xué)科研單位，獸用生物制品廠以及各大、中型牦牛養(yǎng)殖企業(yè)的生產(chǎn)性能的改良。
【專(zhuān)利說(shuō)明】牦牛胴體性狀候選基因檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及動(dòng)物生物【技術(shù)領(lǐng)域】中的牦牛分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)，具體涉及到牦牛胴體性狀候選基因檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]ANKl (Ankyrinl)基因?qū)馘^蛋白基因家族(Ankyrins)，編碼的AnkR蛋白存在于肌肉中的肌原纖維之間和肌原纖維與肌膜之間，ANKl基因在人類(lèi)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究較多，人類(lèi)ANKl基因啟動(dòng)子區(qū)的堿基缺失與遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥相關(guān)，在ANKl啟動(dòng)子區(qū)域的堿基突變與日本人患2型糖尿病的易感度相關(guān)。ANKl基因與肌內(nèi)脂肪關(guān)系的研究在豬和牛上有所報(bào)道，安格斯牛、夏洛來(lái)牛和利木辛牛ANKl基因1.1lkb的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了 7個(gè)多肽位點(diǎn)，其中5個(gè)SNPs與肌肉嫩度和大理石花紋相關(guān)，兩個(gè)單倍型與肌肉嫩度相關(guān)；1個(gè)單倍型明顯與肌內(nèi)脂肪和肉的多汁性相關(guān)。皮特蘭豬、杜洛克豬和大白豬ANKl基因啟動(dòng)子761bp區(qū)域發(fā)現(xiàn)了 12個(gè)SNP，其中2個(gè)SNPs與肉質(zhì)性狀顯著相關(guān)。I個(gè)SNP和I個(gè)單倍型與肌肉滴水損失相關(guān)而另一個(gè)SNP與肌內(nèi)脂肪性狀相關(guān)，在大白豬中I個(gè)單倍型與肌內(nèi)脂肪相關(guān)，單倍型3在皮特蘭中發(fā)現(xiàn)與失水率有關(guān)。單倍型5是與大白豬的肌內(nèi)脂肪和肉質(zhì)的滴水損失成正相關(guān)。豬ANKl基因3' UTR的一個(gè)SNP與肌肉剪切力、肌內(nèi)脂肪及肌肉持水性相關(guān)。
[0003]ANKl基因已經(jīng)成為肉質(zhì)改良中最為主要的肉質(zhì)候選基因之一。牛的ANKl基因圖譜已經(jīng)繪制完成，此基因在牛的第27號(hào)染色體上，與肉質(zhì)脂肪和大理石紋等數(shù)量性狀位點(diǎn)相鄰。豬的ANKl基因在17號(hào)染色體上，其緊鄰體重、背膘厚度和肌間脂肪等數(shù)量性狀位點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于避免現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種牦牛胴體性狀候選基因PCR-SSCP檢測(cè)試劑盒。以解決快速、敏感性高、成本低，用于牦牛胴體性狀候選基因分子選種技術(shù)。
[0005]本發(fā)明的又一目的在于一種牦牛胴體性狀候選基因PCR-SSCP檢測(cè)方法。
[0006]通過(guò)PCR-SSCP對(duì)不同年齡和性別的牦牛個(gè)體ANKl基因第I外顯子-第I內(nèi)含子區(qū)進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析，并測(cè)序群體內(nèi)變異產(chǎn)生的各等位基因序列，結(jié)合胴體性狀相關(guān)的生產(chǎn)數(shù)據(jù)，確定對(duì)胴體性狀影響顯著的等位基因，為改善牦牛生產(chǎn)性能提供指導(dǎo)。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:一種牦牛胴體性狀候選基因PCR-SSCP檢測(cè)引物， 其主要特點(diǎn)在于:
[0008]ANK1-F:5’-TATTCACTTGGGGAACTCGTC-3’ ；
[0009]ANK1-R:5，-TAATGGTCCCAGAGGTCAGTCA-3，。
[0010]一種牦牛胴體性狀候選基因PCR-SSCP檢測(cè)試劑盒，其主要特點(diǎn)在于包括有PCR反應(yīng)液，ANKl^B的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣；去離子水，10%過(guò)硫酸銨，上樣變性緩沖液，TEMED, 12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠Arc:Bis=37.5:1；[0011]所述的上樣變性緩沖液，包括98%去離子甲酰胺，0.025%溴酚藍(lán)，0.025% 二甲苯青，10mmol /T, EDTA pH8.0 ；(補(bǔ)充數(shù)量)
[0012]所述的PCR反應(yīng)液的反應(yīng)液:總體積20 μ L，其中IOXbuffer緩沖液為2.0 μ L，Mg2+濃度為2.5mM, dNTPs的終濃度為100 μ M，引物ANK1-F:
[0013]5’ -TATTCACTTGGGGAACTCGTC-3’ 和 ANK1-R:
[0014]5’ -TAATGGTCCCAGAGGTCAGTCA-3’ 各 0.1 μ M，Taq 聚合酶 0.5U, l.0yL, ddH20 補(bǔ)充體積至20 μ L ;[0015]一種牦牛胴體性狀候選基因PCR-SSCP檢測(cè)方法，其主要特點(diǎn)在于，檢測(cè)步驟如下:
[0016](I)樣品采集:牦牛頸靜脈采血10ml，ACD抗凝，_20°C凍存；
[0017](2)基因組DNA的提取:用常規(guī)的酚-氯仿抽提法從凍存血樣中提取基因組DNA ；
[0018](3)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng):
[0019]PCR反應(yīng)體系:總體積20yL，其中IOXbuffer緩沖液為2.0 μ L，Mg2+濃度為2.5mM, dNTPs 的終濃度為 100 μ M，引物 ANKl-F 和 ANKl-R 各 0.1 μ M，Taq 聚合酶 0.5U,模板DNA50ng，ddH20補(bǔ)充體積至20 μ L ;反應(yīng)條件:預(yù)變性94°C 5min，變性94°C 30s，退火59°C 30s,延伸72°C 30s，共35個(gè)循環(huán)，最后延伸72°C 7min ；
[0020]引物序列為:
[0021 ] ANKl-F: 5，-TATTCACTTGGGGAACTCGTC-3’
[0022]ANKl-R: 5，-TAATGGTCCCAGAGGTCAGTCA-3’
[0023](4 ) PCR 產(chǎn)物的 SSCP 檢測(cè):
[0024]取2 μ I的PCR產(chǎn)物加入8 μ I的上樣變性緩沖液，包括98%去離子甲酰胺、0.025%溴酚藍(lán)、0.025% 二甲苯青、10mmol/L EDTA ρΗ8.0，98°C變性 lOmin，立即冰浴 IOmin ；12% 的非變性聚丙烯酰胺凝膠，350V電壓條件下，4°C電泳22h，銀染法顯色后拍照；
[0025](5)結(jié)果判斷:
[0026]對(duì)牦牛ANKl基因第I外顯子-第I內(nèi)含子的PCR-SSCP檢測(cè)，有5個(gè)等位基因，對(duì)牦牛胴體性狀具有影響的等位基因?yàn)锳NK1*B;(對(duì)牦牛胴體性狀無(wú)影響的等位基因?yàn)锳NK1*A。
[0027]控制牦牛胴體性狀的等位基因?yàn)锳NK1*B的核苷酸序列ccttcacttggggaactcgtcccctctggacgcctcctccaggcagcacccctggctctgcaggactccagcacccaaactcagcagcaagcgcttggagtggccccccaccctactcacagcccaagggacccaaggagtggggccaggcttcccggctgagagcgggagagggcaccccagcaatctgtaggccccaggcaggcgcctcccctctgcttggctcctgggcccgatagcgcctgtgctgctgataaagcctcaaagggcctcgcagaggtgcggtggctccggcagcccgagacgtacccacagaccacggtgactgacctctgggacctgga ；
[0028]對(duì)牦牛肉嫩度無(wú)影響的ANK1*A核苷酸序列為:
[0029]cagagtctccaggacactcacacaccccactcagcaagacaaaagccctgtttctagcaggacccaccttccttagagggcttcccttgtgactcagtggttaagagtttgcctgccagtgcaggagatgggagtttgatccctgggtcaggaagagtccctggagaaggaaacggctacccactccaacgttcttgcctggtaaaatcccatggacagaggagcctggcaggctaagtccatggggtcacgaggagtcagacatgacttagagactaaacaacaaccttccttagaaggcagctctgaaattgtgo
[0030]所述的牦牛胴體性狀候選基因PCR-SSCP檢測(cè)試劑盒的使用方法，其步驟為:[0031](A)待檢牦?；蚪MDNAl μ L/50ng與試劑盒中PCR擴(kuò)增液混合，反應(yīng)條件:預(yù)變性940C 5min，變性 94°C 30s，退火 59°C 30s，延伸 72°C 30s，共 35 個(gè)循環(huán)，最后延伸 72°C 7min ；
[0032](B)用步驟(A)中擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物和ANK1*B的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣與試劑盒中SSCP檢測(cè)試劑各組分混合進(jìn)行SSCP檢測(cè)；
[0033](C)步驟(B)中檢測(cè)到的帶型與ANK1*B標(biāo)準(zhǔn)樣帶型一致的樣品為攜帶控制牦牛胴體性狀等位基因的個(gè)體。
[0034]本發(fā)明的有益效果:反應(yīng)靈敏、特異性強(qiáng)、易操作，適用于各級(jí)畜牧獸醫(yī)教學(xué)科研單位，獸用生物制品廠以及各大、中型牦牛養(yǎng)殖企業(yè)的生產(chǎn)性能的改良。
[0035]本發(fā)明利用PCR-SSCP對(duì)不同年齡和性別的牦牛個(gè)體ANKl基因第I外顯子-第I內(nèi)含子區(qū)進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析，并測(cè)序群體內(nèi)變異產(chǎn)生的各等位基因序列，結(jié)合胴體性狀相關(guān)的生產(chǎn)數(shù)據(jù)，確定胴體生產(chǎn)性狀的等位基因，為改善牦牛生產(chǎn)性能提供指導(dǎo)。本發(fā)明通過(guò)對(duì)試驗(yàn)牦牛ANKl基因第I外顯子-第I內(nèi)含子區(qū)的SSCP分析，發(fā)現(xiàn)了 5個(gè)(A、B、C、D和E)等位基因。其中，A、C、D和E等位基因?qū)﹃笈ｋ伢w性狀影響不顯著。
[0036]本發(fā)明對(duì)牦牛胴體性狀的分子標(biāo)記選種具有快速、敏感性高、成本低等特點(diǎn)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
[0037]圖1是牦牛ANKl基因第I外顯子-第I內(nèi)含子區(qū)的PCR-SSCP檢測(cè)凝膠圖。【具體實(shí)施方式】
[0038]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下面以甘南牦牛胴體性狀分子選種技術(shù)的建立為例，對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。
[0039]實(shí)施例1:一種牦牛胴體性狀候選基因PCR-SSCP檢測(cè)引物，其主要特點(diǎn)在于:
[0040]ANK1-F:5，-TATTCACTTGGGGAACTCGTC-3’ ；
[0041 ] ANKl-R: 5，-TAATGGTCCCAGAGGTCAGTCA-3’。
[0042]實(shí)施例2:—種牦牛胴體性狀候選基因PCR-SSCP檢測(cè)試劑盒，包括有PCR反應(yīng)液，ANK1*B的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣；去離子水，10%過(guò)硫酸銨，上樣變性緩沖液，TEMED, 12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠Arc:Bis=37.5:1；
[0043]所述的上樣變性緩沖液，包括98%去離子甲酰胺，0.025%溴酚藍(lán)，0.025% 二甲苯青，10mmol /T, EDTA pH8.0 ；
[0044]所述的PCR反應(yīng)液的反應(yīng)液:總體積20 μ L，其中IOXbuffer緩沖液為2.0 μ L，Mg2+濃度為2.5mM, dNTPs的終濃度為100 μ M，引物ANK1-F:
[0045]5， -TATTCACTTGGGGAACTCGTC-3’ 和 ANK1-R:
[0046]5’ -TAATGGTCCCAGAGGTCAGTCA-3’ 各 0.1 μ M，Taq 聚合酶 0.5U, l.0yL, ddH20 補(bǔ)充體積至20 μ L ;
[0047]所述的ΑΝΚ1*Β的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣的核苷酸序列為:
[0048]
【權(quán)利要求】
1.一種牦牛胴體性狀候選基因PCR-SSCP檢測(cè)引物，其特征在于:
ANK1-F:5’ -TATTCACTTGGGGAACTCGTC-3’ ；
ANK1-R:5， -TAATGGTCCCAGAGGTCAGTCA-3，。
2.一種牦牛胴體性狀候選基因PCR-SSCP檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括有PCR反應(yīng)液，ANK1*B的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣；去離子水，10%過(guò)硫酸銨，上樣變性緩沖液，TEMED, 12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠Arc:Bis=37.5:1； 所述的上樣變性緩沖液，包括98%去離子甲酰胺，0.025%溴酚藍(lán)，0.025% 二甲苯青，IOmmoI/L EDTA pH8.0 ； 所述的PCR反應(yīng)液的反應(yīng)液:總體積20 μ L，其中IOXbuffer緩沖液為2.0 μ L，Mg2+濃度為2.5mM, dNTPs的終濃度為100 μ M，引物ANK1-F:
5’ -TATTCACTTGGGGAACTCGTC-3’ 和 ANKl-R:
5’-TAATGGTCCCAGAGGTCAGTCA-3’ 各 0.1 μ M，Taq 聚合酶 0.5U, ddH20 補(bǔ)充體積至 20 μ L。
3.一種牦牛胴體性狀候選基因PCR-SSCP檢測(cè)方法，其特征在于，檢測(cè)步驟如下: (1)樣品采集:牦牛頸靜脈采血10ml，A⑶抗凝，-20°c凍存； (2)基因組DNA的提取:用常規(guī)的酚-氯仿抽提法從凍存血樣中提取基因組DNA； (3)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng):` PCR反應(yīng)體系:總體積20 μ L，其中IOXbuffer緩沖液為2.0 μ L, Mg2+濃度為2.5mM,dNTPs的終濃度為100 μΜ,引物ANKl-F和ANKl-R各0.1 μ M，Taq聚合酶0.5U,模板DNA50ng, ddH20補(bǔ)充體積至20 μ L ;反應(yīng)條件:預(yù)變性94 V 5min，變性94 °C 30s，退火59°C 30s，延伸72 °C 30s，共35個(gè)循環(huán)，最后延伸72°C 7min ； 引物序列為:
ANK1-F:5’ -TATTCACTTGGGGAACTCGTC-3’ ；
ANK1-R:5， -TAATGGTCCCAGAGGTCAGTCA-3，； (4)PCR產(chǎn)物的SSCP檢測(cè): 取2 μ I的PCR產(chǎn)物加入8 μ I的上樣變性緩沖液，包括98%去離子甲酰胺、0.025%溴酚藍(lán)、0.025% 二甲苯青、10mmol/L EDTA ρΗ8.0，98°C變性 lOmin，立即冰浴 IOmin ；12% 的非變性聚丙烯酰胺凝膠，350V電壓條件下，4°C電泳22h，銀染法顯色后拍照； (5)結(jié)果判斷: 對(duì)牦牛ANKl基因第2內(nèi)含子的PCR-SSCP檢測(cè)，有5個(gè)等位基因，控制牦牛胴體性狀的等位基因?yàn)锳NKl*B; 對(duì)牦牛胴體性狀無(wú)影響的等位基因?yàn)锳NK1*A。
4.如權(quán)利要求2所述的牦牛胴體性狀候選基因PCR-SSCP檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于步驟為: (A)待檢牦?；蚪MDNAlμ L/50ng與試劑盒中PCR擴(kuò)增液混合，反應(yīng)條件:預(yù)變性940C 5min,變性 94°C 30s，退火 59°C 30s,延伸 72°C 30s，共 35 個(gè)循環(huán)，最后延伸 72°C 7min ； (B)用步驟(A)中擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物和ANK1*B的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣與試劑盒中SSCP檢測(cè)試劑各組分混合進(jìn)行SSCP檢測(cè)； (C)步驟(B)中檢測(cè)到的帶型與ANK1*B標(biāo)準(zhǔn)樣帶型一致的樣品為攜帶控制牦牛胴體性狀等位基因的個(gè)體。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103866001SQ201410023938
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月17日
【發(fā)明者】胡江, 羅玉柱, 劉秀, 李少斌, 潘紅梅 申請(qǐng)人:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)