一種右旋糖酐酶及其在制備低分子右旋糖酐中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種右旋糖酐酶的制備方法及該右旋糖酐酶在制備低分子右旋糖酐中的應用，其特征在于該右旋糖酐酶的產(chǎn)生菌是從土壤中分離得到的棘孢青霉F1008，該菌株由中國微生物菌種保藏中心保藏，保藏編號為CGMCCNo.8135。本發(fā)明成功運用棘孢青霉F1008發(fā)酵培養(yǎng)制得高酶活的右旋糖酐酶，該酶的催化溫度為25～35℃，催化pH為5.0～6.0，其平均酶活高于600U/mL，并且該右旋糖酐酶在多底物溶液中優(yōu)先選擇與高分子量的底物反應，非常適用于低分子量右旋糖酐的制備；運用棘孢青霉F1008右旋糖酐酶催化得到的低分子右旋糖酐種類包括重均分子量為10000Da、6000-8000Da及3000-5000Da的小分子右旋糖酐；該右旋糖酐酶催化反應條件溫和、底物特異性強、能耗低，可以實現(xiàn)小分子右旋糖酐生產(chǎn)的提高產(chǎn)率、低碳、低成本化生產(chǎn)目標。
【專利說明】一種右旋糖酐酶及其在制備低分子右旋糖酐中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物制藥與酶工程領域，具體地說是一種右旋糖酐酶的制備方法及其在制備低分子右旋糖酐中的應用。
【背景技術】
[0002]右旋糖酐(dextran)是一種鏈式葡聚糖，由葡萄糖單元以α-1，6_糖苷鍵連接而成，同時含有少量α-1，3-糖苷鍵組成的支鏈結構。右旋糖酐及其衍生物因具有安全、無毒等多種優(yōu)點已被廣泛應用于醫(yī)藥、工業(yè)、食品等多個領域，市場需求十分巨大(全球每年的需求近幾百億美金)。不同分子量的右旋糖酐具有不同的藥用價值與生物學功能，重均分子量為20_70kDa的中分子右旋糖酐是臨床上使用較多的藥用級右旋糖酐，主要用作血漿代用品，治療出血性休克、創(chuàng)傷性休克及燒傷性休克等；重均分子量為6-8kDa的低分子右旋糖酐是制備右旋糖酐鐵的優(yōu)良材料；重均分子量為3_5kDa的小分子右旋糖酐可進行硫酸化，得到的衍生化產(chǎn)品在醫(yī)療中可以用于抗血栓。
[0003]傳統(tǒng)工業(yè)中，右旋糖酐的生產(chǎn)主要是通過腸膜狀明串珠菌發(fā)酵結合酸解工序來進行，由于酸水解的隨機無序性，得到的產(chǎn)品分子量分布不集中從而影響產(chǎn)品的質(zhì)量；另外，由于利用鹽酸水 解需要高溫高酸等惡劣條件，能耗高，不利于環(huán)保、低碳，并且產(chǎn)品收率有待于提高。右旋糖酐酶能夠催化降解高分子右旋糖酐，生產(chǎn)出能夠適用于食品、化工、醫(yī)藥等領域的中、低分子量的多糖，酶催化反應條件溫和、能耗低，從而能實現(xiàn)低分子量多糖生產(chǎn)工藝的綠色、環(huán)保、低碳目標，尤其有利于生物多糖在醫(yī)藥領域中的應用。
[0004]申請公布號CN102676615A的專利文本中描述的是右旋糖酐蔗糖酶與右旋糖酐酶分布加入法制備藥用級右旋糖酐，右旋糖酐酶必須在右旋糖酐蔗糖酶反應結束后加入，并且需要控制低的加酶量，反應時間短，為的是使中分子量的藥用級右旋糖酐富集。本發(fā)明公開一種高酶活的右旋糖酐酶制備方法，并運用該酶在多底物溶液中優(yōu)先降解大分子右旋糖酐的特性，與市售右旋糖酐蔗糖酶同時加入蔗糖溶液中，制備出系列低分子量的右旋糖酐，為低分子量右旋糖酐的雙酶合成提供新的技術支撐。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種右旋糖酐酶的制備方法及其在制備低分子量右旋糖酐中的應用。
[0006]本發(fā)明提供一種從土壤中篩選出的高酶活右旋糖酐酶產(chǎn)生菌-棘孢青霉，該菌株保減名稱為:棘抱青霉F1008，保減單位:中國微生物囷種保減中心，保減日期:2013年09月13日，保藏號為CGMCC N0.8135 ;保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。
[0007]本發(fā)明運用棘孢青霉F1008發(fā)酵培養(yǎng)制得高活性的右旋糖酐酶，其制備步驟包括:
[0008]I)菌株活化:采用滅菌固體PDA培養(yǎng)基，將F1008菌株接種在試管斜面上，30_32°C下培養(yǎng)48-60h，然后用于菌株種子液制備；[0009]2)菌株種子發(fā)酵培養(yǎng):種子培養(yǎng)基組分為每100ml水中含有DextranlOOkDal.5g，蛋白胨 0.4g,K2HPO4.3Η200.lg,NaNO30.2g,MgSO4.7Η200.05g，KC10.05g,FeSO4.7Η200.0Olg,pH5.0~5.5，將步驟I)中的菌株接種到所述的種子培養(yǎng)基中，置于恒溫搖床上30-32°C，轉速220r/min下培養(yǎng)48-72小時作為種子液，然后將種子液用于發(fā)酵制備右旋糖酐酶；
[0010]3)發(fā)酵制備右旋糖酐酶:發(fā)酵培養(yǎng)基組分為每100ml水中含有DextranlOOkDal.5g,蛋白胨 0.4g, K2HPO4.3Η200.lg, NaNO30.2g, MgSO4.7Η200.05g,KC10.05g, FeSO4.7H200.0Olg, pH5.0~5.5，利用滅菌后發(fā)酵培養(yǎng)基，將步驟2)中的種子液按5%的比例接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于恒溫搖床上30-32°C，轉速220r/min下培養(yǎng)5天得到相應的右旋糖酐酶的發(fā)酵液，然后將發(fā)酵液用于分離純化；
[0011]4)右旋糖酐酶的分離純化:將步驟3)中得到的右旋糖酐酶的發(fā)酵液通過過濾、離心分離菌體，然后再進行硫酸銨鹽析以及瓊脂糖凝膠柱分離，得到純的右旋糖酐酶酶液，運用DNS法測定酶活力。
[0012]5)右旋糖酐酶優(yōu)先降解高分子右旋糖酐的特性:將步驟4)中得到的純酶液與兩種不同分子量右旋糖酐(底物E分子量Mw34242Da，底物F分子量Mw665?a)構成的雙底物溶液進行混合，在25°C下催化反應，運用HPLC檢測催化過程中兩種底物的分子量變化，結果見圖1，高分子量的底物E優(yōu)先被降解，分子量不斷降低，而低分子量的底物F在反應初期基本無變化，從而證實本發(fā)明公開的棘孢青霉F1008右旋糖酐酶具有優(yōu)先降解高分子右旋糖酐的特性。
[0013]本發(fā)明公開的棘孢青霉F1008能夠產(chǎn)生高酶活性的右旋糖酐酶，該右旋糖酐酶的特征在于它的最適作用溫度為25~35°C，最適催化pH為5.0~6.0，其平均酶活高于600U/mL，并且該右旋糖酐酶在多底物溶液中優(yōu)先選擇與高分子量的底物反應，非常適用于低分子量右旋糖酐的制 備。
[0014]本發(fā)明公開棘孢青霉F1008右旋糖酐酶在制備系列低分子右旋糖酐中的應用，其方法按如下步驟進行:
[0015]按1000mL的反應體系計算，首先將60_200g的蔗糖溶解于ρΗ5.00.02mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，在25°C下同時添加2000-3000U的市售右旋糖酐蔗糖酶與2500-7500U的右旋糖酐酶，恒溫攪拌反應22-26小時；然后將反應體系置于80°C下保溫I小時滅活右旋糖酐蔗糖酶，紗布濾過變性酶蛋白后再置于沸水浴中20分鐘滅活殘留的右旋糖酐酶，再經(jīng)真空過濾得到清澈透明的濾液，即為系列低分子右旋糖酐溶液；
[0016]最后將該溶液進行旋蒸濃縮70°C旋蒸濃縮去除部分水分，濃縮至原體積一半后進行分級醇沉，采用四級劃分:一級乙醇濃度為48，得到的沉淀為殘余蛋白雜質(zhì)及少量高分子糖酐；二級乙醇濃度為58，得到的沉淀為1000ODa的右旋糖酐；三級乙醇濃度為68，得到的沉淀物為6000-8000Da的右旋糖酐；四級乙醇濃度為78，得到的沉淀物為3000_5000Da的右旋糖酐；每級得到的沉淀置于80°C真空干燥箱中干燥4小時，即得到系列低分子右旋糖酐純品。
[0017]本發(fā)明的優(yōu)點在于:
[0018]棘孢青霉F1008發(fā)酵培養(yǎng)成本低，所產(chǎn)的右旋糖酐酶具有高酶活、高的底物特異性、多底物溶液中優(yōu)先與高分子量的底物反應、能耗低等優(yōu)點，在與右旋糖酐蔗糖酶組成的雙酶體系中能夠及時優(yōu)先降解右旋糖酐蔗糖酶合成出的大分子量右旋糖酐，從而累積低分子右旋糖酐的量，非常適用于工業(yè)化運用，利用該酶與市售右旋糖酐蔗糖酶聯(lián)合催化蔗糖制備系列低分子量右旋糖酐的反應條件溫和、能耗低，工序簡單；通過調(diào)節(jié)雙酶體系的工藝參數(shù)(蔗糖濃度、雙酶用量、反應時間)，可以實現(xiàn)對右旋糖酐分子量的調(diào)控；通過后期對反應液進行的濃縮處理，醇沉過程的無水乙醇用量大大減少，從而使得生產(chǎn)成本進一步降低；雙酶催化得到的右旋糖酐分子量分布集中、種類多(lOOOODa，6000-8000Da，3000-5000Da)，總收率高；本發(fā)明可以實現(xiàn)低分子右旋糖酐生產(chǎn)工藝低成本化、環(huán)保、低碳、產(chǎn)率提高的目標，為酶法生產(chǎn)右旋糖酐的工業(yè)化奠定堅實的基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0019]本發(fā)明中的系列低分子右旋糖酐及低聚糖產(chǎn)品均運用高效液相色譜及糖電泳進行檢測，現(xiàn)附上部分圖譜如下:
[0020]圖1為棘孢青霉F1008右旋糖酐酶催化多底物溶液過程中右旋糖酐的分子量變化；
[0021]圖2為實例3中雙酶法催化制備的右旋糖酐液相色譜圖(重均分子量5272Da)； [0022]圖3為實例4中雙酶法催化制備的右旋糖酐液相色譜圖(重均分子量8000Da)；
[0023]圖4為實例4中雙酶法催化制備的右旋糖酐液相色譜圖(重均分子量4412Da)；
[0024]圖5為實例5中雙酶法催化制備的右旋糖酐液相色譜圖(重均分子量6276Da)；
[0025]圖6為實例5中雙酶法催化制備的右旋糖酐液相色譜圖(重均分子量350?a)；
【具體實施方式】:
[0026]以下通過具體實例對本發(fā)明做進一步解釋說明，但并不限制本發(fā)明的內(nèi)容。實施例I
[0027]一株產(chǎn)右旋糖酐酶高酶活性菌株F1008的分離方法，其包括如下步驟:
[0028]在99ml無菌水中加入Ig 土樣(土樣分別取自安徽合肥、安徽蛘埠、四川成都)制備土壤稀釋液，在PDA培養(yǎng)基內(nèi)加入青霉素溶液(100ml加入50 μ I )，倒入培養(yǎng)皿中，靜止冷卻成平板。采用稀釋涂布法將稀釋后的土壤溶液分別涂布于平板上，然后倒置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌長出后，用接種針將菌株挑取到另一滅菌的篩選培養(yǎng)基(配方:Dextran T20001g, NaNO30.3g, K2HPO4.3Η200.4g, MgSO4.7Η200.02g, KC10.02g,FeSO4.7Η200.001g，瓊脂1.6g，水100ml, ρΗ5.0~5.5)上進行劃線分離，然后將能夠在篩選培養(yǎng)基上生長的單菌落挑取下來，轉接到發(fā)酵培養(yǎng)基(配方:Dextranl00kDal.5g,蛋白胨
0.4g, K2HPO4.3Η200.lg, NaNO30.2g, MgSO4.7Η200.05g, KC10.05g, FeSO4.7H200.0Olg,水100ml，pH5.0~5.5)上，于30°C、220r/min恒溫繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)5天。將發(fā)酵液運用平半透明圈法(右旋糖酐瓊脂平板)檢測活性，透明圈越大表明發(fā)酵液所含的右旋糖酐酶酶活力越聞。
[0029]將初篩得到的活性菌株的發(fā)酵培養(yǎng)液用DNS比色法檢測酶活力大小。在酶反應體系中加入待測液，測定酶活，右旋糖酐酶的活力測定為將4mL0.02mol/LpH5.0的醋酸鹽緩沖液配制的3%右旋糖酐70kDa溶液置于40°C保溫lOmin，再加入適當稀釋的酶液ImL保溫60min后,利用3，5 二硝基水楊酸(DNS)法測定生成的還原糖，以在上述條件下每小時產(chǎn)生Img還原糖(葡萄糖當量)所需要的酶量為一個酶活力單位(U)，通過初篩及復篩分離純化得到單菌落純培養(yǎng)棘孢青霉F1008。
[0030]實施例2
[0031]運用棘孢青霉F1008生產(chǎn)右旋糖酐酶的技術方案:
[0032]I)菌株活化:采用滅菌固體PDA培養(yǎng)基，將F1008菌株接種在試管斜面培養(yǎng)基上，28-30°C下培養(yǎng)48-60h，然后用于菌株種子液制備；
[0033]2)菌株種子發(fā)酵培養(yǎng):種子培養(yǎng)基組分為每100ml水中含有DextranlOOkDaL 5g，蛋白胨 0.4g,K2HPO4.3Η200.lg,NaNO30.2g,MgSO4.7Η200.05g，KC10.05g,FeSO4.7Η200.0Olg,pH5.0~5.5，將步驟I)中的菌株接種到所述的種子培養(yǎng)基中，置于恒溫搖床上30-32°C°C，轉速220r/min下培養(yǎng)48-72小時作為種子液，然后將種子液用于發(fā)酵制備右旋糖酐酶；
[0034]3)發(fā)酵制備右旋糖酐酶:發(fā)酵培養(yǎng)基組分為每100ml水中含有DextranlOOkDal.5g,蛋白胨 0.4g, K2HPO4.3Η200.lg, NaNO30.2g, MgSO4.7Η200.05g,KC10.05g, FeSO4.7H200.0Olg, pH5.0~5.5，利用滅菌后發(fā)酵培養(yǎng)基，將步驟2)中的種子液按5%的比例接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于恒溫搖床上30-32°C，轉速220r/min下培養(yǎng)6天得到相應的右旋糖酐酶的發(fā)酵液，然后將發(fā)酵液用于分離純化；
[0035]4)右旋糖酐酶的分離純化:將步驟3)中得到的右旋糖酐酶的發(fā)酵液通過過濾、離心分離菌體，然后再進行硫酸銨鹽析以及瓊脂糖凝膠柱分離，得到純的右旋糖酐酶酶液，經(jīng)上述DNS法測得酶活為650U/mL ；
[0036]5)右旋糖酐酶優(yōu)先降解高分子右旋糖酐的特性:將步驟4)中得到的純酶液與兩種不同分子量右旋糖酐(底物E分子量Mw34242Da，底物F分子量Mw665?a)構成的雙底物溶液進行混合，在25°C下催化反應，運用HPLC檢測催化過程中兩種底物的分子量變化，結果見圖1，高分子量的底物E優(yōu)先被降解，分子量不斷降低，而低分子量的底物F在反應初期基本無變化，從而證實本發(fā)明公開的棘孢青霉F1008右旋糖酐酶具有優(yōu)先降解高分子右旋糖酐的特性。
[0037]實施例3
[0038]棘孢青霉F1008在制備低分子右旋糖酐中的應用:
[0039]在電動機械攪拌裝置和水浴控溫的燒杯中加入240g蔗糖與2000mL的緩沖溶液，攪拌充分溶解后，控制水浴溫度在30°C，同時加入4000U的右旋糖酐蔗糖酶與5000U的右旋糖酐酶，攪拌反應22-24小時，然后將水浴溫度升至80°C保溫I小時滅活右旋糖酐蔗糖酶，紗布過濾變性酶蛋白后再置于沸水浴中20分鐘滅活殘留的右旋糖酐酶，再經(jīng)真空過濾得到清澈透明的濾液，即為低分子右旋糖酐溶液。
[0040]該溶液經(jīng)70°C旋蒸濃縮去除部分水分，濃縮至原體積一半后進行分級醇沉，得到總收率為71%的三種分子量的右旋糖酐，分別為13.7%11258Da，35.5%8510Da,
21.8%5272Da，三種產(chǎn)品的分子量分布寬度指數(shù)分別為1.39，1.26，1.14。實施例4:
[0041]棘孢青霉 F1008在制備低分子右旋糖酐中的應用:
[0042]在電動機械攪拌裝置和水浴控溫的燒杯中加入120g蔗糖與2000mL的緩沖溶液，攪拌充分溶解后，控制水浴溫度在30°C，同時加入4000U的右旋糖酐蔗糖酶與5000U的右旋糖酐酶，攪拌反應22-24小時，然后將水浴溫度升至80°C保溫I小時滅活右旋糖酐蔗糖酶，紗布過濾變性酶蛋白后再置于沸水浴中20分鐘滅活殘留的右旋糖酐酶，再經(jīng)真空過濾得到清澈透明的濾液，即為低分子右旋糖酐溶液。[0043]該溶液經(jīng)70°C旋蒸濃縮去除部分水分，濃縮至原體積一半后進行分級醇沉，得到總收率為68.7%的兩種分子量的右旋糖酐，分別為23.5%8000Da，45.2%4412Da，產(chǎn)品的分子量分布寬度指數(shù)分別為1.22，1.11。
[0044]實施例5:
[0045]棘孢青霉F1008在制備低分子右旋糖酐中的應用:
[0046]在電動機械攪拌裝置和水浴控溫的燒杯中加入600g蔗糖與2000mL的緩沖溶液，攪拌充分溶解后，控制水浴溫度在30°C，同時加入6000U的右旋糖酐蔗糖酶與6000U的右旋糖酐酶，攪拌反應26小時，然后將水浴溫度升至80°C保溫I小時滅活右旋糖酐蔗糖酶，紗布濾過變性酶蛋白后再置于沸水浴中20分鐘滅活殘留的右旋糖酐酶，再經(jīng)真空過濾得到清澈透明的濾液，即為低分子右旋糖酐溶液。
[0047]該溶液經(jīng)70°C旋蒸濃縮去除部分水分，濃縮至原體積一半后進行分級醇沉，得到總收率為69.5%的三種分子量的右旋糖酐，分別為15.l%9831Da，36.6%6276Da，
17.8%350?a，三種產(chǎn) 品的分子量分布寬度指數(shù)分別為1.14，1.10，1.10。
【權利要求】
1.一種從土壤當中篩選分離得到的棘孢青霉F1008，該菌株由中國微生物菌種保藏中心保藏，保藏編號為CGMCC N0.8135。
2.權利要求1所述的棘孢青霉F1008在制備高酶活的右旋糖酐酶中的應用。
3.利用權利要求1所述的棘孢青霉F1008制備右旋糖酐酶的方法，其特征在于該方法按如下步驟進行: 1)菌株活化:采用滅菌固體PDA培養(yǎng)基，將F1008菌株接種在試管斜面上，28-30°C下培養(yǎng)48-60h,然后用于菌株種子液制備； 2)菌株種子發(fā)酵培養(yǎng):種子培養(yǎng)基組分為每100ml水中含有DextranlOOkDal.5g,蛋白胨 0.4g, K2HPO4.3Η200.lg, NaNO30.2g, MgSO4.7Η200.05g, KC10.05g, FeSO4.7Η200.0Olg,pH5.0~5.5，將步驟I)中的菌株接種到所述的種子培養(yǎng)基中，置于恒溫搖床上30-32°C，轉速220r/min下培養(yǎng)48-72小時作為種子液，然后將種子液用于發(fā)酵制備右旋糖酐酶； 3)發(fā)酵制備右旋糖酐酶:發(fā)酵培養(yǎng)基組分為每100ml水中含有DextranlOOkDal.5g，蛋白胨 0.4g, K2HPO4.3Η200.lg, NaNO30.2g, MgSO4.7Η200.05g, KC10.05g, FeSO4.7Η200.0Olg,pH5.0~5.5，利用滅菌后發(fā)酵培養(yǎng)基，將步驟2)中的種子液按5%的比例接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于恒溫搖床上30-32°C，轉速220r/min下培養(yǎng)5天得到相應的右旋糖酐酶的發(fā)酵液，然后將發(fā)酵液用于分離純化，得到純的右旋糖酐酶。
4.利用權利要求1所述的棘孢青霉F1008菌株發(fā)酵制得的右旋糖酐酶制備低分子右旋糖酐的方法，其特征在于:采用市售右旋糖酐蔗糖酶與棘孢青霉F1008右旋糖酐酶聯(lián)合作用于蔗糖溶液制備系列低分子量的右旋糖酐，其制備方法包括以下步驟: 將蔗糖溶于PH5.0濃度0.02mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，在25°C下同時添加市售右旋糖酐蔗糖酶與棘孢青霉F1008右旋糖酐酶，恒溫攪拌反應22-26小時，再將反應體系置于80°C下保溫I小時滅活右旋糖酐蔗糖酶，過濾變性酶蛋白后再置于沸水浴中20分鐘滅活殘留的右旋糖酐酶，再經(jīng)過濾得到清澈透明的濾液，即為低分子右旋糖酐溶液，將所述低分子右旋糖酐溶液進行70°C旋蒸濃縮、無水乙醇分級醇沉以及真空干燥，最后得到系列低分子量右旋糖酐產(chǎn)品； 所述的低分子右旋糖酐指的是重均分子量為10000Da、6000-8000Da、3000-5000Da的低聚右旋糖酐； 所述的蔗糖:乙酸-乙酸鈉緩沖溶液:右旋糖酐蔗糖酶:右旋糖酐酶的比例為60-200g:1OOOmL:2000-3000U:2500_7500U。
【文檔編號】C12N1/14GK103834574SQ201410003338
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年1月3日 優(yōu)先權日:2014年1月3日
【發(fā)明者】張洪斌, 甘微葦, 張宇琪, 胡雪芹 申請人:合肥工業(yè)大學