兩相體系中酶促合成異槲皮苷的分段流微反應(yīng)工藝的制作方法
【專利摘要】?jī)上囿w系中酶促合成異槲皮苷的分段流微反應(yīng)工藝，將蘆丁溶于甘氨酸-氫氧化鈉或磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，加入離子液體[Bmim][BF4]和橙皮苷酶構(gòu)成蘆丁反應(yīng)液，分別將蘆丁反應(yīng)液和萃取液三乙酸甘油酯通過微量注射泵輸入到微反應(yīng)器的微管道中，進(jìn)行酶促水解蘆丁制備異槲皮苷。該工藝有效地實(shí)現(xiàn)了反應(yīng)與分離的耦合，降低了反應(yīng)后期的純化成本，所選用的萃取劑三乙酸甘油酯價(jià)格低廉且安全無毒。利用微反應(yīng)器能夠大大加快反應(yīng)速率，縮短時(shí)間，減少耗能。本發(fā)明中的微反應(yīng)器裝置簡(jiǎn)單，操作容易，只需將數(shù)目放大即可等比例的擴(kuò)大生產(chǎn)能力，具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。
【專利說明】?jī)上囿w系中酶促合成異槲皮苷的分段流微反應(yīng)工藝
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生化 制藥領(lǐng)域，具體涉及兩相體系中酶促合成異槲皮苷的分段流微反應(yīng)工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]異槲皮苷是一種具有抗腫瘤、抗氧化和降血糖等多種優(yōu)良藥理活性的天然黃酮類化合物(Jo μ rnal of Ethnopharmacology, 2011, 134, 363-372),但其在天然產(chǎn)物中含量極低，化學(xué)合成復(fù)雜且成本高，因此獲得困難導(dǎo)致價(jià)格昂貴，遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足市場(chǎng)需求(CN102827220A)。近年來，以價(jià)格低廉的蘆丁為底物，經(jīng)酶法選擇性水解獲得異槲皮苷，為異槲皮苷的生產(chǎn)提供了新的思路。
[0003]專利CN101985639A公開了一種利用a -L-鼠李糖苷酶定向水解蘆丁合成異槲皮苷的方法，反應(yīng)48h后得率為86%。然而反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，底物濃度過低，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。本課題組在離子液體共溶劑體系中，用橙皮苷酶水解蘆丁產(chǎn)異槲皮苷，反應(yīng)IOh轉(zhuǎn)化率就可達(dá)93.4%，離子液體共溶劑體系這種新型的反應(yīng)體系不僅大大的提高了水解速率，同時(shí)也提高了底物濃度 10 倍(Bioreso μ rce.Technology, 2013, 128, 156-163);但是該體系仍然存在著反應(yīng)時(shí)間偏長(zhǎng)、產(chǎn)物對(duì)底物有抑制、后期生物分離純化成本高等缺點(diǎn)。因此，急需尋找一種新的反應(yīng)體系及技術(shù)來更加高效、低廉的制備高純度的異槲皮苷。
[0004]目前，兩相催化體系為解決均相體系中的存在的問題，如產(chǎn)物對(duì)酶的抑制、反應(yīng)速率低、催化劑與產(chǎn)物難分離等，提供了一條新的有效途徑。通常，使用的兩相體系是水相/有機(jī)相，酶和底物都溶解在水相中并在其中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)生成的產(chǎn)物被實(shí)時(shí)轉(zhuǎn)移到有機(jī)相中，可以實(shí)現(xiàn)反應(yīng)與分離耦合一體化過程。Wang等報(bào)道了在“水/環(huán)己醇”兩相體系中酶促合成環(huán)己糖苷，在反應(yīng)的同時(shí)，產(chǎn)物同時(shí)轉(zhuǎn)移到萃取相中，消除了底物的抑制作用，提高了產(chǎn)物的得率(Jo μ rnal of Molec μ Iar Catalysis B:Enzymatic, 2009, 56, 131-135)；Braun等報(bào)道了在“水/油酸乙酯”兩相體系中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化類固醇，與單純的水相相比，提高了催化劑的穩(wěn)定性和產(chǎn)物的得率(Microbial cell factories, 2012, 11，106-118)。然而，目前尚未見到利用兩相體系來酶促水解蘆丁合成異槲皮苷的報(bào)道。
[0005]近年來，微反應(yīng)器由于其優(yōu)異的傳質(zhì)特性加速反應(yīng)過程而在生物催化中受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注(Chemical Engineering Jo μ rnal, 2013, 223, 497-506)。在微反應(yīng)器中進(jìn)行兩相反應(yīng)建立分段流體系，其優(yōu)點(diǎn)是兩種互不相溶的液體之間的界面面積增大，界面液滴的中心的擴(kuò)散距離縮短。此外，在液滴內(nèi)部存在內(nèi)部循環(huán)，近一步增加了界面質(zhì)量和熱量的傳遞，促進(jìn)了酶促反應(yīng)的發(fā)生。T μ s Y ek等在Y型微反應(yīng)器中建立了 “水-正己烷”兩相體系來酶促催化己醇氧化，反應(yīng)速率比傳統(tǒng)的間歇式反應(yīng)器提高了 33倍(Engineering inLife Sciences，2012，12,49-56)。然而，目前尚未見到利用分段流微反應(yīng)器來酶促水解蘆丁合成異槲皮苷的報(bào)道。
[0006]本專利利用“緩沖溶液-離子液體共溶劑/三乙酸甘油酯”兩相體系來酶促合成異槲皮苷的工藝及微反應(yīng)器技術(shù)。該方法操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)效率高，易于大量制備高純度異槲皮苷，為推動(dòng)其在醫(yī)藥工業(yè)中的廣泛應(yīng)用具有十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]技術(shù)問題:
[0008]為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，本發(fā)明的目的提供了一種兩相體系中酶促合成異槲皮苷的分段流微反應(yīng)工藝，以解決反應(yīng)中底物對(duì)酶的抑制作用，縮短時(shí)間，提高酶促反應(yīng)效率，降低生產(chǎn)成本。
[0009]技術(shù)方案:兩相體系中酶促合成異槲皮苷的分段流微反應(yīng)工藝，將蘆丁溶于pH3~10的甘氨酸-氫氧化鈉或磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，分別加入上述溶液體積10%的離子液體[Bmim] [BF4]和橙皮苷酶構(gòu)成蘆丁反應(yīng)液，分別將蘆丁反應(yīng)液和萃取液三乙酸甘油酯通過微量注射泵輸入到微反應(yīng)器的微管道中，蘆丁反應(yīng)液中的蘆丁濃度范圍為0.0036g/L-3.6g/L，反應(yīng)液中橙皮苷酶濃度范圍為0.09g/L_l.8g/L，反應(yīng)溫度范圍為20~60°C，蘆丁反應(yīng)液流速范圍為2 μ L/min~20 μ L/min,萃取液流速范圍為2 μ L/min~80 μ L/min，進(jìn)行酶促水解蘆丁制備異槲皮苷。
[0010]替代方案之一，用間歇式反應(yīng)器替換微反應(yīng)器。所述的間歇式反應(yīng)器為IOmL的離心管，放入搖床中進(jìn)行反應(yīng)。
[0011]在間歇式反應(yīng)器中，蘆丁反應(yīng)液中的蘆丁濃度范圍為0.0036g/L-3.6g/L，反應(yīng)液中酶液濃度范圍為0.09g/L-l.8g/L，反應(yīng)溫度范圍為20~60°C，pH為3~10，反應(yīng)液與萃取液兩相體積比為3:1~1:6,反應(yīng)時(shí)間為I~20h。
[0012]所述微反應(yīng)器 設(shè)有依次連接的進(jìn)樣口、微管道和出樣口，反應(yīng)器的進(jìn)樣口端有兩個(gè)，分別與微量注射泵連接，反應(yīng)器的出樣口端與收集器連接，微管道為蛇形通道，通過熱注塑法或是蝕刻法刻出，通道的尺寸內(nèi)徑為長(zhǎng)0.25m-2m,寬100-500 μ m,深50 μ m。
[0013]所述微反應(yīng)器材質(zhì)為玻璃、PDMS(polydimethylsiloxane)或 PMMA(Poly (methylmethacrylate))。
[0014]有益效果:采用兩相體系酶促合成異槲皮苷能夠消除產(chǎn)物對(duì)酶的抑制，有效地實(shí)現(xiàn)反應(yīng)與分離的耦合，降低反應(yīng)后期的純化成本。所選用的萃取劑三乙酸甘油酯價(jià)格低廉，安全無毒。利用微反應(yīng)器能夠大大加快反應(yīng)速率，縮短時(shí)間，減少耗能。本發(fā)明中的微反應(yīng)器裝置簡(jiǎn)單，操作容易，只需將數(shù)目放大即可等比例的擴(kuò)大生產(chǎn)能力，具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為本發(fā)明中所使用的分段流微反應(yīng)器裝置示意圖。圖中I微量注射泵，2微管道，3收集器。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。[0017]本發(fā)明實(shí)施例中使用HPLC法同時(shí)檢測(cè)蘆丁和異槲皮苷，色譜條件:Alltima C18(250X4.6mm, 5 μ m),流動(dòng)相:0.02% 磷酸-乙腈(80:20，V/V);檢測(cè)波長(zhǎng):360nm;流速:
1.0mL/min ;進(jìn)樣量:20 μ L。
[0018]其中，異槲皮苷摩爾得率的計(jì)算方法如下:
[0019]
【權(quán)利要求】
1.兩相體系中酶促合成異槲皮苷的分段流微反應(yīng)工藝，其特征在于，將蘆丁溶于pH3~10的甘氨酸-氫氧化鈉或磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，分別加入上述溶液體積10%的離子液體[Bmim] [BF4]和橙皮苷酶構(gòu)成蘆丁反應(yīng)液，分別將蘆丁反應(yīng)液和萃取液三乙酸甘油酯通過微量注射泵輸入到微反應(yīng)器的微管道中，蘆丁反應(yīng)液中的蘆丁濃度范圍為0.0036g/L-3.6g/L，反應(yīng)液中橙皮苷酶濃度范圍為0.09g/L_l.8g/L，反應(yīng)溫度范圍為20~60°C，蘆丁反應(yīng)液流速范圍為2 μ L/min~20 μ L/min,萃取液流速范圍為2 μ L/min~80 μ L/min，進(jìn)行酶促水解蘆丁制備異槲皮苷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的兩相體系中酶促合成異槲皮苷的分段流微反應(yīng)工藝，其特征在于，用間歇式反應(yīng)器替換微反應(yīng)器。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的兩相體系中酶促合成異槲皮苷的分段流微反應(yīng)工藝，其特征在于所述的間歇式反應(yīng)器為IOmL的離心管，放入搖床中進(jìn)行反應(yīng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的兩相體系中酶促合成異槲皮苷的分段流微反應(yīng)工藝，其特征在于，在間歇式反應(yīng)器中，蘆丁反應(yīng)液中的蘆丁濃度范圍為0.0036g/L-3.6g/L，反應(yīng)液中酶液濃度范圍為0.09g/L-l.8g/L，反應(yīng)溫度范圍為20~60°C，pH為3~10，反應(yīng)液與萃取液兩相體積比為3:1~1:6，反應(yīng)時(shí)間為I~20h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的兩相體系中酶促合成異槲皮苷的分段流微反應(yīng)工藝，其特征在于，所述微反應(yīng)器設(shè)有依次連接的進(jìn)樣口、微管道(2 )和出樣口，反應(yīng)器的進(jìn)樣口端有兩個(gè)，分別與微量注射泵(I)連接，反應(yīng)器的出樣口端與收集器(3)連接，微管道為蛇形通道，通過熱注塑法或是蝕刻法刻出，通道的尺寸內(nèi)徑為長(zhǎng)0.25m-2m,寬100-500 μ m,深50 μ m。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的兩相體系中酶促合成異槲皮苷的分段流微反應(yīng)工藝，其特征在于，所述微反應(yīng)器材質(zhì)為玻璃、PDMS(polydimethylsiloxane)或PMMA(Poly (methylmethacrylate))。
【文檔編號(hào)】C12P19/60GK103667403SQ201310694293
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月17日
【發(fā)明者】王俊, 顧雙雙, 崔紅生, 吳福安 申請(qǐng)人:江蘇科技大學(xué)