肌纖維體外培養(yǎng)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術領域】，具體來說是一種肌纖維體外培養(yǎng)試劑盒，包括消化酶、D-Hanks液、肌細胞培養(yǎng)液A和肌細胞培養(yǎng)液B。本發(fā)明培養(yǎng)基可快速通過體外培養(yǎng)獲得骨骼肌肌纖維衛(wèi)星細胞，所培養(yǎng)的細胞形態(tài)均一，繁殖活力強，在分化誘導后具有融合成肌管得能力；利用本發(fā)明試劑盒進行體外培養(yǎng)肌衛(wèi)星細胞的方法不但操作簡便，而且大大節(jié)省了培養(yǎng)成本，具有一定的經濟意義，且可以獲得大量傳代穩(wěn)定性好的細胞。
【專利說明】肌纖維體外培養(yǎng)試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術領域】，具體來說是一種肌纖維體外培養(yǎng)試劑盒。
【背景技術】
[0002]實驗表明骨胳肌中的肌衛(wèi)星細胞有自我更新及成肌、成骨、成脂肪等能力，亦稱之為“肌肉干細胞”，這種細胞是向成肌細胞系定向的一種前體細胞；肌肉再生過程主要是由肌衛(wèi)星細胞來完成的；肌衛(wèi)星細胞位于肌纖維的肌膜與基底膜之間，一般為小梭形扁平的單核細胞；當肌肉組織受到刺激時如骨骼肌受損時，衛(wèi)星細胞就會被激活，大量分裂、增殖并相互融合形成再生肌纖維；激活的衛(wèi)星細胞與受損傷細胞融合以修復受損傷細胞，或幾個成肌細胞融合形成肌管，進而生成新的肌細胞。衛(wèi)星細胞的激活、增殖和分化也是骨骼肌細胞肥大、數目增多以及肌纖維轉化的重要機制。肌衛(wèi)星細胞體外分離培養(yǎng)成為研究肌肉分化途徑及性狀改良的分子機制的重要技術平臺，為改良家畜肌肉品質及畜牧業(yè)生產領域奠定研究基礎。
[0003]肌細胞是肌組織的前體細胞，易培養(yǎng)、可塑性強，具有骨骼肌的許多重要生物特性，對于肌衛(wèi)星細胞的研究成為生物組織工程中的一個熱門領域。不同年齡、不同肌肉類型中衛(wèi)星細胞的數目不同，因此取材對于肌衛(wèi)星細胞的原代培養(yǎng)很重要；一般來說，年幼個體的衛(wèi)星細胞含量較豐富。開發(fā)一種肌纖維體外培養(yǎng)試劑盒對肌纖維的研究具有重要意義。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的 是提供一種肌纖維體外培養(yǎng)試劑盒。
[0005]為實現上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是:一種肌纖維體外培養(yǎng)試劑盒，其特征在于:包括消化酶、D-Hanks液、肌細胞培養(yǎng)液A和肌細胞培養(yǎng)液B。
[0006]進一步的:所述消化酶包括胰酶和I型膠原酶。
[0007]進一步的:所述D-Hanks 液由 8g 的 NaCU0.6g 的 Na2HPO4.2H20、4g 的 KC1、0.6g的KH2P04、3.5g的NaHC03、5g的青鏈霉素、1.0g的兩性霉素B和1000mL三蒸水組成。
[0008]進一步的:所述細胞生長培養(yǎng)液A由70ml的DMEM高糖培養(yǎng)基、20ml的FBS、IOml的胎牛血清、Ig的青鏈霉素和Ig的兩性霉素B組成。
[0009]進一步的:所述細胞生長培養(yǎng)液B由98ml的DMEM高糖培養(yǎng)液、2m的胎牛血清組成。
[0010]進一步的:所述細胞生長培養(yǎng)液pH值為7.2。
[0011]本發(fā)明的有益技術效果是:本發(fā)明培養(yǎng)基可快速通過體外培養(yǎng)獲得骨骼肌肌纖維衛(wèi)星細胞，所培養(yǎng)的細胞形態(tài)均一，繁殖活力強，在分化誘導后具有融合成肌管得能力；利用本發(fā)明試劑盒進行體外培養(yǎng)肌衛(wèi)星細胞的方法不但操作簡便，而且大大節(jié)省了培養(yǎng)成本，具有一定的經濟意義，且可以獲得大量傳代穩(wěn)定性好的細胞。
【具體實施方式】[0012]下面將結合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0013]實施例一
肌纖維體外培養(yǎng)試劑盒，包括消化酶、D-Hanks液、肌細胞培養(yǎng)液A和肌細胞培養(yǎng)液B。
[0014]其中:消化酶包括胰酶和I型膠原酶。
[0015]其中=D-Hanks液由 8g 的 NaCl、0.6g 的 Na2HPO4.2H20、4g 的 KCl、0.6g 的 KH2PO4'
3.5g的NaHC03、5g的青鏈霉素、1.0g的兩性霉素B和1000mL三蒸水組成。
[0016]其中:細胞生長培養(yǎng)液A由70ml的DMEM高糖培養(yǎng)基、20ml的FBSUOml的胎牛血清、Ig的青鏈霉素和Ig的兩性霉素B組成，pH值為7.2。
[0017]其中:細胞生長培養(yǎng)液B由98ml的DMEM高糖培養(yǎng)液、2ml的胎牛血清組成，pH值為 7.2。
[0018]利用本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)山羊肌纖維衛(wèi)星細胞的方法步驟如下:
(1)取樣:在無菌條件下，取山羊背最長肌放入冰盒，立即帶回實驗室；
(2)消化:將肌肉樣用剪刀剪碎，加入含有0.25g胰酶和0.2g I型膠原酶的D-Hanks(D-Hanks 液由 8g 的 NaCl、0.6g 的 Na2HPO4.2H20、4g 的 KC1、0.6g 的 ΚΗ2Ρ04、3.5g 的 NaHC03、5g的青鏈霉素、1.0g的兩性霉素B和1000mL三蒸水組成)液中，37 °C條件下消化60~120min，得到細胞懸浮液；
(3)過濾:利用篩孔為400目的過濾篩過濾細胞懸液，然后離心，所得細胞沉淀用D-Hanks液重懸并離心，再用細胞生長培養(yǎng)液A (70ml的DMEM高糖培養(yǎng)基、20ml的FBS、IOml的胎牛血清、Ig的青鏈霉素和Ig的兩性霉素B組成，pH值為7.2)重懸細胞；
(4)初代培養(yǎng):將懸浮的細胞接種于以多聚賴氨酸包被的細胞培養(yǎng)瓶中，采用差速貼壁法培養(yǎng)細胞ppl至pp6，將pp6中的細胞培養(yǎng)至匯合率為95%，然后采用質量濃度為0.25%的胰酶進行傳代(I: 1)，即完成山羊肌衛(wèi)星細胞的體外分離培養(yǎng)；
(5)誘導分化
A、采用100μ I的DMEM高糖培養(yǎng)液對4 μ g的pEGFP-1RES_Myf6質粒和8 μ I的PEI轉染試劑分別進行孵育5min，然后混合并孵育15min，得PE1-質粒復合物；
B、取體外分離培養(yǎng)的山羊肌衛(wèi)星細胞并培養(yǎng)至匯合率為75%，棄掉培養(yǎng)液，用DMEM高糖培養(yǎng)液清洗山羊肌衛(wèi)星細胞兩次，然后補加1.8ml的DMEM高糖培養(yǎng)液，再將PE1-質粒復合物逐滴滴加到山羊肌衛(wèi)星細胞表面并作用4h，然后更換為細胞生長培養(yǎng)液A (70ml的DMEM高糖培養(yǎng)基、20ml的FBSUOml的胎牛血清、Ig的青鏈霉素和Ig的兩性霉素B組成，PH值為7.2)培養(yǎng)24h，再更換為細胞生長培養(yǎng)液B (DMEM高糖培養(yǎng)液、2ml的胎牛血清組成，PH值為7.2)，在溫度為37°C并裝有5%C02的培養(yǎng)箱中誘導分化48~72h，即完成山羊肌衛(wèi)星細胞的誘導分化。
[0019]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.肌纖維體外培養(yǎng)試劑盒，其特征在于:包括消化酶、D-Hanks液、肌細胞培養(yǎng)液A和肌細胞培養(yǎng)液B。
2.根據權利要求1所述肌纖維體外培養(yǎng)試劑盒，其特征在于:所述消化酶包括胰酶和I型膠原酶。
3.根據權利要求1所述肌纖維體外培養(yǎng)試劑盒，其特征在于:所述D-Hanks液由Sg的NaCU0.6g 的 Na2HPO4.2H20、4g 的 KC1、0.6g 的 KH2PO4,3.5g 的 NaHC03、5g 的青鏈霉素、1.0g的兩性霉素B和1000mL三蒸水組成。
4.根據權利要求1所述肌纖維體外培養(yǎng)試劑盒，其特征在于:所述細胞生長培養(yǎng)液A由70ml的DMEM高糖培養(yǎng)基、20ml的FBSUOml的胎牛血清、Ig的青鏈霉素和Ig的兩性霉素B組成。
5.根據權利要求1所述肌纖維體外培養(yǎng)試劑盒，其特征在于:所述細胞生長培養(yǎng)液B由98ml的DMEM高糖培養(yǎng)液、2ml的胎牛血清組成。
6.根據權利要求4或5所述肌纖維體外培養(yǎng)試劑盒，其特征在于:所述細胞生長培養(yǎng)液PH值為7.2。
【文檔編號】C12N5/071GK103667177SQ201310663442
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月10日 優(yōu)先權日:2013年12月10日
【發(fā)明者】段升華 申請人:中山奈德生物科技有限公司