一種高毒性、高增值能力的人d-cik細(xì)胞的制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于細(xì)胞免疫學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說(shuō)是一種高毒性、高增值能力的人D-CIK細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟：1)采集外周靜脈血，獲得單個(gè)核細(xì)胞；2)進(jìn)一步分離獲得單核細(xì)胞和懸浮細(xì)胞；3)單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟的DC；4)CD3+CD8+CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)；5)D-CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到一種新的異質(zhì)性細(xì)胞群，即D-CIK細(xì)胞。通過(guò)本發(fā)明所制備的D-CIK細(xì)胞與CIK細(xì)胞比較，增值活性和細(xì)胞毒活性更強(qiáng)，同時(shí)具有制備工藝簡(jiǎn)單、成本低廉、易于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)勢(shì)。通過(guò)本發(fā)明所制備的D-CIK細(xì)胞，其應(yīng)用主要為癌癥病人的治療或者癌癥高危人群的預(yù)防。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種高毒性、高增值能力的人D-CIK細(xì)胞的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞免疫學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說(shuō)是一種高毒性、高增值能力的人D-CIK細(xì)胞的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokineinduced killer cell, CIK)是 Schmidt 等于1986年報(bào)道的從外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中誘導(dǎo)出的一群異質(zhì)性細(xì)胞。其主要效應(yīng)細(xì)胞因同時(shí)表達(dá)CD3+和CD56+兩種膜蛋白分子，因此又被稱(chēng)為NK細(xì)胞樣T淋巴細(xì)胞(NKT細(xì)胞)。體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)研究表明，CIK細(xì)胞具有殺瘤活性高、增值速度快、抗凋亡及殺瘤效應(yīng)不受癌細(xì)胞多重耐藥的影響等優(yōu)勢(shì)。
[0003]樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)是目前所知功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presenting cell, APC),表面具有豐富的有助于抗原呈遞的分子,如主要組織相容性復(fù)合體 1、II (major histocompatibility complex I/I I, MHC I/II)、CD80/86、CD40、ICAM-1等共刺激分子，能有效的激活初始型T細(xì)胞(naiVe T cell)使其活化和增值，啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，發(fā)揮有效的抗腫瘤效應(yīng)。
[0004]樹(shù)突狀細(xì)胞調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(dendritic cell activated andcytokine induced killer cell, D-CIK)是指將成熟的DC與同源的CIK細(xì)胞同培養(yǎng)而形成的一群異質(zhì)性細(xì)胞群。共培養(yǎng)既可以促進(jìn)DC分泌IL-12，又可以促進(jìn)CIK細(xì)胞的增值，并加強(qiáng)其抗腫瘤活性。Marten A等研究發(fā)現(xiàn)，IL-12攝取阻斷會(huì)減弱CIK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。因此,D-CIK細(xì)胞應(yīng)用于惡性腫瘤患者的治療，有助于解除腫瘤患者體內(nèi)T細(xì)胞的免疫無(wú)能，從而提高抗腫瘤活性。
[0005]現(xiàn)有CIK細(xì)胞制備技術(shù)中存在:(1)CIK細(xì)胞中絕大部分群體為⑶3+⑶8+T淋巴細(xì)胞，大約占CIK細(xì)胞的60%左右，然而其殺瘤活性卻受到極大的限制；這與目前的CD3+0)8+T淋巴細(xì)胞,也即細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)是抗腫瘤的主要免疫效應(yīng)細(xì)胞的認(rèn)識(shí)存在差異。(2)雖然主要效應(yīng)細(xì)胞一NKT細(xì)胞，擴(kuò)增1000倍左右，但整體細(xì)胞群體擴(kuò)增能力較為有限，大約80~100倍左右。DC制備技術(shù)中存在，成熟DC分泌IL-12因子的水平偏低。二者共培養(yǎng)后，增值能力和細(xì)胞毒活性提高不顯著等問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，通過(guò)選擇優(yōu)化的CIK細(xì)胞和DC培養(yǎng)方案的基礎(chǔ)上，對(duì)CIK細(xì)胞和DC共培養(yǎng)方案進(jìn)一步改進(jìn)，提供了一種新的人D-CIK細(xì)胞的制備方法及其應(yīng)用，解決了現(xiàn)有技術(shù)CIK細(xì)胞與DC共培養(yǎng)后，異質(zhì)性細(xì)胞群體增值能力和細(xì)胞毒活性提高不顯著等問(wèn)題。
[0007]本發(fā)明所提供的人D-CIK細(xì)胞，是指以CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞為主效應(yīng)細(xì)胞，在人D-CIK細(xì)胞異質(zhì)性群體中約95%，與K562細(xì)胞共培養(yǎng)8小時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷活性可達(dá)93%左右。CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞其表面標(biāo)記為:人白細(xì)胞分化抗原CD3、人白細(xì)胞分化抗原CD8和人a PTCR受體。
[0008]本文中的“⑶3+⑶8+CIK細(xì)胞”表示CD3和⑶8均為陽(yáng)性的CIK細(xì)胞。
[0009]為實(shí)現(xiàn)上述目的，設(shè)計(jì)一種高毒性、高增值能力的人D-CIK細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟:
[0010]I)采集外周靜脈血，獲得單個(gè)核細(xì)胞；
[0011]2)進(jìn)一步分離獲得單核細(xì)胞和懸浮細(xì)胞；
[0012]3)單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟的DC;
[0013]4)CD3+CD8+CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)；[0014]5) D-CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0015]作為優(yōu)選，所述步驟I)為將外周靜脈血經(jīng)聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心獲得單個(gè)核細(xì)胞；所述步驟2)為通過(guò)貼壁法將上述單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)一步分離獲得單核細(xì)胞和懸浮細(xì)胞。
[0016]進(jìn)一步地，所述步驟I)具體為采用聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心法分離收集，并用生理鹽水洗滌2次，低速離心后獲得PBMCs。
[0017]所述步驟2)具體為將獲取的PBMCs重懸于PAA?培養(yǎng)基、GT-T551?培養(yǎng)基、OPt1-MEM?培養(yǎng)基中的任意一種，然后于37°C，5% C02和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)靜止2h，吸取其中懸浮細(xì)胞另行CD3+CD8+CIK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)，貼壁細(xì)胞則為單核細(xì)胞。
[0018]作為優(yōu)選，所述步驟3)具體包括:將含有8-10%白體血漿、800_1000IU/mlGM-CSF、800-1000IU/ml IL-4的X-VIV0-15?培養(yǎng)基或者AM-V?培養(yǎng)基加入獲取的單核細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)2-3天后，更換新鮮培養(yǎng)基，并在新鮮培養(yǎng)基中加入I~20 μ g/ml的腫瘤抗原，繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)1-2天后，加入IL-Ιβ、IL-6、TNF-a，或者IL-1 β、IL_6、TNF_ a與Mtb-HAg及IFN- Y中的一種或者兩種的組合；繼續(xù)培養(yǎng)1-2天，進(jìn)行DC成熟度和IL-12含量檢測(cè)。
[0019]作為優(yōu)選，所述步驟3)中加入的IL-Ιβ終濃度為8-15ng/mL，IL_6終濃度為50-150ng/mL, TNF- a 終濃度為 8_15ng/mL，Mtb-Hag 終濃度為 5 ~10 μ g/ml, IFN- Y 終濃度為 100 ~1000IU/ml ;GM_CSF 濃度為 800IU/ml、IL-4 濃度為 1000IU/ml ;所述的 DC 成熟度的檢測(cè)方法為流式細(xì)胞術(shù)，IL-12含量檢測(cè)方法為ELISA。
[0020]進(jìn)一步地，所述步驟3)中加入的IL-1 β終濃度為10ng/mL，IL-6終濃度為IOOng/mL, TNF- α 終濃度為 10ng/mL，Mtb-Hag 終濃度為 8 μ g/ml, IFN- Y 終濃度為 1000IU/ml。
[0021]作為優(yōu)選，所述步驟4)具體包括:將步驟2)中收集的懸浮細(xì)胞重懸于含8-10%自體滅活血漿的PAA?或者GT-T551?等商品化無(wú)血清培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度(1_2) X IO6/ml左右，并加入IFN-Y至終濃度500-1500IU/ml，最后轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)20-28小時(shí)后加入抗⑶3單抗、抗⑶28單抗、IL-1 α、IL-2,40-50小時(shí)后加入卡介苗(bacillus Callmette-Guerin,BCG)連續(xù)培養(yǎng)6~7天,其中每2~3天補(bǔ)加含有IL-2的新鮮培養(yǎng)基，使補(bǔ)加培養(yǎng)基后的細(xì)胞密度控制在(1-2) X106/ml。
[0022]作為優(yōu)選，所述步驟4)中所加入的抗⑶3單抗?jié)舛葹?0~500ng/ml，抗⑶28單抗的濃度為50~500ng/ml，IL-1 α的濃度為0.5~5ng/ml，IL-2的濃度為50~1000IU/ml ;加入卡介苗的濃度為5~20 μ g/ml。
[0023]進(jìn)一步地，所述步驟4)中IFN- Y的濃度為1000IU/ml，培養(yǎng)20_28小時(shí)候加入抗CD3單抗?jié)舛葹?00ng/ml，抗CD28單抗的濃度為200ng/ml，IL-1 α的濃度為lng/ml，IL-2的濃度為1000IU/ml，40-50小時(shí)后加入BCG的濃度為10 μ g/ml。
[0024]作為優(yōu)選，所述步驟5)具體包括:將步驟3)及步驟4)中培養(yǎng)的DC和CD3+CD8+CIK 收集并重懸于含有 5 ~20 μ g/ml 的 BCG、50 ~1000IU/ml 的 IL-2 的 GT-T551?培養(yǎng)基中在進(jìn)行培養(yǎng)14~21天，每2~3天進(jìn)行補(bǔ)加含有50~1000IU/ml的IL-2的GT-T551?培養(yǎng)基。
[0025]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述BCG濃度為10 μ g/ml，所述IL-2終濃度為1000IU/ml。
[0026]本發(fā)明所制備的人D-CIK細(xì)胞主要應(yīng)用于癌癥病人的治療或者癌癥高危人群的預(yù)防。
[0027]所屬腫瘤抗原包含并不限于下述抗原:CD19、CD20、WT-1、MUCl、LMP2、HPV E6E7、EGFRvII1、HER-2/neu、Idiotype, MAGE A3、p53、NY-ESO-l、PSMA、⑶2、CEA, MelanA/MARTl、Ras mutant、gp100、p53mutant、Proteinase3、bcr-ab1、Tyrosinase、Survivin、PSA、hTERT、Sarcoma、EphA2、PAP、ML-1AP、AFP、EpCAM、ERG、NAl7、PAX3、ALK、Androgen receptor、CycI inB1、Polysialic acid、MYCN、RhoC、TRP-2、⑶3、Fucosyl GMl、Mesothelin、PSCA、MAGE Al、sLe (animal)、CYPlBl、PLACl、GM3、BORIS、Tn。所述 IL-1 β (lOng/mL)，IL-6 (lOOng/mL)，TNF- a (lOng/mL)，Mtb-HAg 的終濃度為 8 μ g/ml, IFN- y 的終濃度為 1000IU/ml。
[0028]所述腫瘤包含并不限于B淋巴細(xì)胞腫瘤細(xì)胞、白血病細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、結(jié)直腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、食管癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞等。
[0029]本發(fā)明所用的原料和試劑除有特殊說(shuō)明外，均市售可得。
[0030]本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比:本發(fā)明所制備的D-CIK細(xì)胞，細(xì)胞擴(kuò)增效率高，總細(xì)胞擴(kuò)增效率在21天是現(xiàn)有CIK細(xì)胞擴(kuò)增效率的3倍左右；對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷活性強(qiáng)，其細(xì)胞毒活性從現(xiàn)有CIK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞殺傷活性的50 %提高到90 %左右。同時(shí)具有制備工藝簡(jiǎn)單、成本低廉、易于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)勢(shì)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0031]:圖1:成熟DC形態(tài)。培養(yǎng)第7天，成熟DC在倒置顯微鏡下的形態(tài)，放大倍率為40 X ；
[0032]圖2:培養(yǎng)第7天流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行DC成熟度檢測(cè)；
[0033]圖3:不同培養(yǎng)方式培養(yǎng)的外周血來(lái)源PBMCs生長(zhǎng)曲線(n=8);外周血來(lái)源的PBMCs通過(guò)不同方式培養(yǎng)，在第0、5、7、10、12、14、17、19、21天分別用細(xì)胞計(jì)數(shù)板和細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，將當(dāng)前細(xì)胞總數(shù)除以開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)(第O天)的細(xì)胞總數(shù)，所得數(shù)值即為細(xì)胞增殖倍數(shù)。CIK組:指采用斯坦福大學(xué)應(yīng)用的培養(yǎng)法培養(yǎng)的CIK細(xì)胞<D3⑶8CIK組:指本發(fā)明中所采用的優(yōu)化的CIK培養(yǎng)方式培養(yǎng)的細(xì)胞CD3+CD8+CIK細(xì)胞；D_CIK組:指本發(fā)明所采用的培養(yǎng)方式；
[0034]圖4:采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行免疫表型檢測(cè)(n=8)。外周血來(lái)源的PBMCs，通過(guò)不同方式培養(yǎng)，在第14天取細(xì)胞進(jìn)行流式熒光抗體:抗CD3-FITC、CD4-PE、CD8-PECY5.5、CD56_APC進(jìn)行表面染色并檢測(cè)。CIK組:指采用斯坦福大學(xué)應(yīng)用的培養(yǎng)法培養(yǎng)的CIK細(xì)胞；CD3CD8CIK組:指本發(fā)明中所采用的優(yōu)化的CIK培養(yǎng)方式培養(yǎng)的⑶3+⑶8+CIK細(xì)胞；D-CIK組:指本發(fā)明所采用的培養(yǎng)方式:；[0035]圖5:采用CCK-8細(xì)胞毒活性檢測(cè)試劑盒對(duì)不同培養(yǎng)方式培養(yǎng)的外周血來(lái)源PBMCs進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)(n=8)。通過(guò)不同方式培養(yǎng)，在第14天取細(xì)胞通過(guò)CCK-8試劑盒進(jìn)行細(xì)胞毒活性檢測(cè)。CIK組:指采用斯坦福大學(xué)應(yīng)用的培養(yǎng)法培養(yǎng)的CIK細(xì)胞KD3⑶8CIK組:指本發(fā)明中所采用的優(yōu)化的CIK培養(yǎng)方式培養(yǎng)的CD3+CD8+CIK細(xì)胞；D_CIK組:指本發(fā)明所采用的培養(yǎng)方式。橫坐標(biāo):表示效靶細(xì)胞比值，E: T=IO: I表示效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比值為10: 1,E: T=20: I表示效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比值為20: Ι,Ε: Τ=40: I表示效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比值為40: I。
【具體實(shí)施方式】
[0036]下面用實(shí)例來(lái)具體說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下面實(shí)例中凡未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，均為遵照常規(guī)方法和廠家提供的操作說(shuō)明執(zhí)行。
[0037]實(shí)施例1
[0038]本實(shí)施例1是分離獲得的PBMCs并進(jìn)行D-CIK細(xì)胞的培養(yǎng)。包括以下步驟:
[0039]1.采集患者外周靜脈血30~50ml，經(jīng)聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心獲得單個(gè)核細(xì)胞。具體步驟為:1500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，吸取上層血漿層，56°C滅活30分鐘后離心備用，用生理鹽水對(duì)倍稀釋沉淀的血細(xì)胞，人淋巴細(xì)胞分離液與稀釋血液按1: 2的比例加入離心管中，2000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，小心吸取白膜層，用生理鹽水洗滌2次，轉(zhuǎn)速分別為1600轉(zhuǎn)/分，1300轉(zhuǎn)/分，均離心7分鐘，即得到PBMCs。
[0040]2.通過(guò)貼壁法將上述PBMCs進(jìn)一步分離獲得單核細(xì)胞和懸浮細(xì)胞。具體步驟為:將上述分離的PBMCs重懸于PAA?培養(yǎng)基、GT-T551?培養(yǎng)基、Opt1-MEM?培養(yǎng)基的任意一種培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度為(5~10) X 106/ml，總體積為IOml加入T75ml的細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，于37°C、5%C02和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)貼壁2h ;輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使未貼壁細(xì)胞重新懸??；然后收集懸浮的未貼壁細(xì)胞，則留下的貼壁細(xì)胞即為單核細(xì)胞。
[0041]3.單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟的DC。具體步驟為:將20ml含有10%自體血漿、800IU/mlGM-CSF、1000IU/ml IL-4 的 X-VIV0-15? 培養(yǎng)基或者 AM-V? 培養(yǎng)基加入上述 T75的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，然后置于37°C、5% C02和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。第三天(72h)吸棄IOml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基，并補(bǔ)加IOml新鮮的含有10%自體血漿、800IU/ml GM-CSF、1000IU/mlIL-4、I~20 μ g/ml的腫瘤抗原的X-VIV0-15?培養(yǎng)基或者AIM-V?培養(yǎng)基，其中腫瘤抗原優(yōu)選的濃度為10yg/ml。在細(xì)胞培養(yǎng)的第五天,加入IL-1 β (10ng/mL), IL-6 (100ng/mL),TNF-t a (lOng/mL)，Mtb-HAg 終濃度為 8 μ g/ml, IFN- y 終濃度為 1000IU/ml。細(xì)胞培養(yǎng)的第6~7天，分別通過(guò)倒置顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行DC形態(tài)(見(jiàn)圖1)和成熟度(見(jiàn)圖2)檢測(cè)。
[0042]4.⑶3+⑶8+CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)。具體步驟為:將實(shí)施例1步驟2中收集的懸浮細(xì)胞重懸于含10%自體滅活血漿的PAA?或者GT-T551?等商品化無(wú)血清培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度2 X 106/ml左右，并加入IFN-Y至終濃度1000IU/ml，最后轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)后加入抗⑶3單抗、抗⑶28單抗、IL-1 a、IL-2,48小時(shí)后加入卡介苗(bacillus Callmette-Guerin, BCG)連續(xù)培養(yǎng)6~7天,其中每2~3天補(bǔ)加含有IL_2的新鮮培養(yǎng)基，使補(bǔ)加培養(yǎng)基后的細(xì)胞密度控制在(I~2)X106/ml。其中，抗CD3單抗?jié)舛葹?00ng/ml，抗CD28單抗的濃度為200ng/ml，IL-1 α的濃度為lng/ml，IL-2的濃度為1000IU/ml ；48小時(shí)后加入BCG的濃度為10 μ g/ml。
[0043]5.D-CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)。具體步驟為:將實(shí)施例1步驟3、4中培養(yǎng)6~7天的DC 和 CD3+CD8+CIK 收集并重懸于含有 10 μ g/ml 的 BCG、1000IU/ml 的 IL-2 的 GT-T551? 培養(yǎng)基中在進(jìn)行培養(yǎng)14~21天(PBMCs分離為第O天計(jì)算)，以后每2~3天進(jìn)行補(bǔ)加含有1000IU/ml 的 IL-2 的 GT-T551? 培養(yǎng)基。
[0044]實(shí)施例2
[0045]本實(shí)施例2是對(duì)D-CIK細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)和增值能力檢測(cè)。包括以下步驟:
[0046]1.DC和⑶3+⑶8+CIK共培養(yǎng)24小時(shí)即可見(jiàn)細(xì)胞沉于培養(yǎng)瓶的底部，有大量的大小不一的集落和不規(guī)則的單個(gè)核細(xì)胞。對(duì)培養(yǎng)12~14天的細(xì)胞進(jìn)行瑞姬氏染色，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞體積增大，呈橢圓形或不規(guī)則形，細(xì)胞核大多為橢圓形或圓形，核染色疏松，核膜不規(guī)則，有突起，每個(gè)細(xì)胞可見(jiàn)I個(gè)小核仁，呈深藍(lán)色；胞質(zhì)豐富，染成灰藍(lán)色，形態(tài)不規(guī)貝U，有偽足，近核處有淡染現(xiàn)象，也有呈不規(guī)則形。取培養(yǎng)12~14天的細(xì)胞100 μ 1，加入100 μ 10.4%臺(tái)盼藍(lán)染色液，活細(xì)胞不染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色，顯微鏡下計(jì)數(shù)。本發(fā)明制備的細(xì)胞活力大于95%。
[0047]2.在第0、5、7、10、12、14、17、19、21天分別用細(xì)胞計(jì)數(shù)板和細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，
將當(dāng)前細(xì)胞總數(shù)除以開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞總數(shù)，所得數(shù)值即為細(xì)胞增殖倍數(shù)，以此進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞增殖情況并作為細(xì)胞補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基時(shí)的參考，細(xì)胞增殖倍數(shù)見(jiàn)圖3、表1。
[0048]表1:不同培養(yǎng)方式培養(yǎng)的外周血來(lái)源PBMCs擴(kuò)增倍數(shù)(η=8)
[0049]
【權(quán)利要求】
1.一種高毒性、高增值能力的人D-CIK細(xì)胞的制備方法，其特征在于，包括步驟: 1)采集外周靜脈血，獲得單個(gè)核細(xì)胞； 2)進(jìn)一步分離獲得單核細(xì)胞和懸浮細(xì)胞； 3)單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟的DC； 4)⑶3+⑶8+CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)； 5)D-CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的高毒性、高增值能力的人D-CIK細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述步驟I)為將外周靜脈血經(jīng)聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心獲得單個(gè)核細(xì)胞；所述步驟2)為通過(guò)貼壁法將上述單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)一步分離獲得單核細(xì)胞和懸浮細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1所述的高毒性、高增值能力的人D-CIK細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述步驟3)具體包括:將含有8-10%自體血漿、800-1000IU/ml GM-CSF、800_1000IU/mlIL-4的X-VIVO-15?培養(yǎng)基或者AIM-V?培養(yǎng)基加入獲取的單核細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)2_3天后，更換新鮮培養(yǎng)基，并在新鮮培養(yǎng)基中加入I~20 μ g/ml的腫瘤抗原，繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)1-2 天后，加入 IL-1 P、IL-6、TNF-α，或者 IL-1 P、IL-6、TNF-α 與 Mtb-HAg 及 IFN-Y 中的一種或者兩種的組合；繼續(xù)培養(yǎng)1-2天，進(jìn)行DC成熟度和IL-12含量檢測(cè)。
4.如權(quán)利要求1所述的高毒性、高增值能力的人D-CIK細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述步驟4)具體包括:將步驟2)中收集的懸浮細(xì)胞重懸于含8-10%自體滅活血漿的ΡΑΑ?或者GT-T551?等商品化無(wú)血清培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度(1_2) X 106/ml左右，并加入IFN-Y至終濃度500-1500IU/ml，最后轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)20-28小時(shí)后加入抗CD3單抗、抗CD28單抗、IL-1a、IL-2,40-50小時(shí)后加入卡介苗(bacillusCallmette-Guerin, BCG)連續(xù)培養(yǎng)6~7天，其中每2~3天補(bǔ)加含有IL-2的新鮮培養(yǎng)基，使補(bǔ)加培養(yǎng)基后的細(xì)胞密度控制在(1-2) X106/ml。
5.如權(quán)利要求1所述的高毒性、高增值能力的人D-CIK細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述步驟5)具體包括:將步驟3)及步驟4)中培養(yǎng)的DC和CD3+CD8+CIK收集并重懸于含有5~20 μ g/ml的BCG,50~1000IU/ml的IL-2的GT-T551?培養(yǎng)基中在進(jìn)行培養(yǎng)14~21天，每2~3天進(jìn)行補(bǔ)加含有50~1000IU/ml的IL-2的GT-T551?培養(yǎng)基。
6.如權(quán)利要求3所述的高毒性、高增值能力的人D-CIK細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述 IL-1 β 終濃度為 8-15ng/mL，IL-6 終濃度為 50_150ng/mL，TNF-α 終濃度為 8_15ng/mL, Mtb-Hag終濃度為5~10 μ g/ml, IFN- Y終濃度為100~1000IU/ml ;所述的DC成熟度的檢測(cè)方法為流式細(xì)胞術(shù)，IL-12含量檢測(cè)方法為ELISA。
7.如權(quán)利要求4所述的高毒性、高增值能力的人D-CIK細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述抗CD3單抗?jié)舛葹?0~500ng/ml，抗CD28單抗的濃度為50~500ng/ml，IL-1 α的濃度為0.5~5ng/ml, IL-2的濃度為50~1000IU/ml ;加入卡介苗的濃度為5~20 μ g/ml。
8.如權(quán)利要求7所述的高毒性、高增值能力的人D-CIK細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述BCG濃度為10 μ g/ml，所述IL-2終濃度為1000IU/ml。
【文檔編號(hào)】C12N5/0783GK103642754SQ201310638842
【公開(kāi)日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月4日
【發(fā)明者】馬飛, 李龍?jiān)? 李正成 申請(qǐng)人:深圳市合一康生物科技有限公司