一種活體提取縊蟶dna的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)的一種活體提取縊蟶DNA的方法，其包括如下步驟：1）縊蟶出水管組織的剝離；2）出水管組織基因組DNA的提?。?)提取DNA的檢測(cè)。采用本發(fā)明方法是從縊蟶能夠再生的出水管組織中提取DNA，從而避免殺死縊蟶或者影響縊蟶的生長(zhǎng)發(fā)育。采用本發(fā)明方法提取縊蟶的DNA可以檢測(cè)其基因型，在縊蟶科研和育種中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。在家系培育中，親本十分珍貴，對(duì)親本的傷害影響其生產(chǎn)性能的考察和種質(zhì)利用。采用本發(fā)明方法可以檢測(cè)家系親本的基因型，從而預(yù)測(cè)子代的生產(chǎn)性能，篩選家系，提高縊蟶育種效率。
【專利說(shuō)明】一種活體提取縊蟶DNA的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及提取生物DNA的方法，特別涉及一種活體提取縊蟶DNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]溢経(Sinonovacula constricta Lamarck)為我國(guó)重要灘涂貝類,是四大海產(chǎn)養(yǎng)殖貝類之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)貝類養(yǎng)殖產(chǎn)量占海水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的82%。灘涂貝類年產(chǎn)量近200萬(wàn)噸，其中縊蟶產(chǎn)量達(dá)70萬(wàn)噸，約占我國(guó)灘涂貝類養(yǎng)殖總產(chǎn)量的30%。雖然我國(guó)縊蟶養(yǎng)殖有800多年的歷史，但是苗種都是來(lái)自于野生種，培育生長(zhǎng)速度快、經(jīng)濟(jì)性狀良好的優(yōu)良品種是保障縊蟶養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要途徑。[0003]但是單獨(dú)進(jìn)行傳統(tǒng)的選擇育種，其選育周期較長(zhǎng)，而且其表型性狀容易受到環(huán)境的影響，因此借助分子標(biāo)記輔助育種的技術(shù)手段，在基因水平上篩選與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，從而可以加快育種速度和準(zhǔn)確度。尤其是在微衛(wèi)星及SNP標(biāo)記的開(kāi)發(fā)中，檢測(cè)縊蟶基因型是進(jìn)行縊蟶生長(zhǎng)性狀與分子標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析的關(guān)鍵。而縊蟶DNA的提取是必不可少的環(huán)節(jié)，傳統(tǒng)提取DNA的方法需要處死縊蟶，獲取其外套膜。這對(duì)其生長(zhǎng)性狀的檢測(cè)以及接下來(lái)的種質(zhì)利用造成極大的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于針對(duì)現(xiàn)有傳統(tǒng)縊蟶DNA提取方法所存在的問(wèn)題而提供一種既能獲取DNA又無(wú)需殺死縊蟶活體提取縊蟶DNA的方法，在縊蟶育種中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):
[0006]一種活體提取縊蟶DNA的方法，包括如下步驟:
[0007]I)縊蟶出水管組織的剝離:
[0008]1.1)把待取組織的縊蟶放入水溫20_30°C的海水培養(yǎng)桶內(nèi)暫養(yǎng)，并在縊蟶外殼粘上帶號(hào)碼的標(biāo)記；
[0009]1.2)需要提取DNA時(shí)，將待取組織的縊蟶放置在冰上，麻醉待其出水管伸出后用剪刀剪取縊蟶出水管，長(zhǎng)度為0.3-1.0cm，放入相應(yīng)的第一離心管并記好編號(hào)；
[0010]2)出水管組織基因組DNA的提取:
[0011]往收集在離心管中的出水管組織中加入DNA提取液，渦旋離心15-30s，加入DNA提取液1/10倍體積的120mg/ml蛋白酶K，震蕩混勻，在56°C放置，直至組織完全溶解得到第一溶液；
[0012]3)向第一溶液中加入DNA提取液1.0_1.2倍體積的苯酚溶液翻轉(zhuǎn)使其充分混勻的第二溶液；將所得的第二溶液放入離心機(jī)以10000-12000rpm離心10min_20min得到第一上
清液，將第一上清液轉(zhuǎn)移到第二離心管；
[0013]4)加入等體積的氯仿/異丙醇混合溶液，充分混勻后放入離心機(jī)10000-12000rpm離心10min-20min得到第二上清液；所述氯仿/異丙醇混合溶液中氯仿與異丙醇的體積比為24:1 ;之后向第二上清液中加入兩倍體積的-20°C無(wú)水乙醇；以10000-12000rpm離心10-15min后用75%乙醇洗滌2次，倒掉離心管中液體，室溫晾干得到晾干物；加入40-120 μ I無(wú)菌水，4 °C冰箱內(nèi)過(guò)夜溶解。
[0014]5)提取DNA的檢測(cè):
[0015]用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA片段大小，DNA大分子條帶清晰。
[0016]分光光度計(jì)顯示所得DNA的濃度在50-3000ng/ μ 1，0D260/0D280在1.7-1.9。
[0017]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟I)的海水培養(yǎng)桶是指圓形塑料桶，內(nèi)加比重為1.015的海水，底下鋪泥，泥的顆粒直徑Φ〈150 μ m，厚度5-lOcm。
[0018]由于采用了如上的技術(shù)方案，本發(fā)明的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下顯著的技術(shù)效果:
[0019]1.采用本發(fā)明方法是從縊蟶能夠再生的出水管組織中提取DNA，從而避免殺死縊蟶或者影響縊蟶的生長(zhǎng)發(fā)育。
[0020]2.采用本發(fā)明方法提取縊蟶的DNA可以檢測(cè)其基因型，在縊蟶科研和育種中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。在家系培育中，親本十分珍貴，對(duì)親本的傷害影響其生產(chǎn)性能的考察和種質(zhì)利用。
[0021]3.采用本發(fā)明方法可以檢測(cè)家系親本的基因型，從而預(yù)測(cè)子代的生產(chǎn)性能，篩選家系，提高縊蟶育種效率。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1為縊蟶DNA1.0%瓊脂糖電泳圖片示意圖。
[0023]圖2為縊蟶DNA1.0%瓊脂糖電泳跑膠結(jié)果示意圖。
[0024]圖3為剪去出水管后的縊蟶存活率示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025]實(shí)施例1:
[0026]為了證實(shí)從同一個(gè)個(gè)體外套膜和出水管中提取的DNA是一樣的，該實(shí)施例1采用I對(duì)普通引物分別對(duì)5個(gè)縊蟶的外套膜和出水管中提取的DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。
[0027]1.縊蟶外套膜和出水管的獲取
[0028]在上海海洋大學(xué)省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，選用寧波長(zhǎng)街產(chǎn)縊蟶作為實(shí)驗(yàn)素材，在水溫25°C，比重1.015的海水培養(yǎng)桶內(nèi)暫養(yǎng)20個(gè)縊蟶，3天后隨機(jī)挑選5個(gè)縊蟶?？O蟶的出水管標(biāo)記為sl-5 ;縊蟶的外套膜標(biāo)記為ml-5。
[0029]2.DNA 的提取
[0030]往收集在離心管中的出水管組織中加入250 μ I DNA提取液，渦旋離心15s，加入20μ 120mg/ml蛋白酶K，震蕩混勻，在56°C放置，直至組織完全溶解。加入250 μ I苯酚溶液輕微翻轉(zhuǎn)IOmin使其充分混勻。將上一步所得溶液放入離心機(jī)12，OOOrpm離心20min,將上清液轉(zhuǎn)移到新離心管。加入等體積氯仿/異丙醇(24:1),充分混勻IOmin,以12，OOOrpm離心20min。之后向上清液中加入兩倍體積的無(wú)水乙醇(_20°C )。以12，OOOrpm離心lOmin。用75%乙醇洗滌2次，倒掉離心管中液體，室溫晾干。加入50 μ I無(wú)菌水，4°C冰箱內(nèi)過(guò)夜溶解。1.0%瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA完整度(參見(jiàn)圖1)。分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度與OD值，見(jiàn)表[0031 ] 表1分光光度計(jì)檢測(cè)DNA結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種活體提取縊蟶DNA的方法，其特征在于，包括如下步驟: 1）縊蟶出水管組織的剝離: . 1.1)把待取組織的縊蟶放入水溫20-30°C的海水培養(yǎng)桶內(nèi)暫養(yǎng)，并在縊蟶外殼粘上帶號(hào)碼的標(biāo)記；. 1.2)需要提取DNA時(shí)，將待取組織的縊蟶放置在冰上，麻醉待其出水管伸出后用剪刀剪取縊蟶出水管，長(zhǎng)度為0.3-1.0cm，放入相應(yīng)的第一離心管并記好編號(hào)； 2)出水管組織基因組DNA的提取: 往收集在離心管中的出水管組織中加入DNA提取液，渦旋離心15-30s，加入DNA提取液1/10倍體積的120mg/ml蛋白酶K，震蕩混勻，在56°C放置，直至組織完全溶解得到第一溶液； 3)向第一溶液中加入DNA提取液1.0-1.2倍體積的苯酚溶液翻轉(zhuǎn)使其充分混勻的第二溶液；將所得的第二溶液放入離心機(jī)以10000-12000rpm離心10_20min得到第一上清液，將第一上清液轉(zhuǎn)移到第二離心管； 4)加入等體積的氯仿/異丙醇混合溶液，充分混勻后放入離心機(jī)10000-12000rpm離心10-20min得到第二上清液；所述氯仿/異丙醇混合溶液中氯仿與異丙醇的體積比為24:1 ;之后向第二上清液中加入兩倍體積的-20°C無(wú)水乙醇；以10000-12000rpm離心10_20min后用75%乙醇洗滌2次，倒掉離心管中液體，室溫晾干得到晾干物；加入40-120 μ I無(wú)菌水，4°C冰箱內(nèi)過(guò)夜溶解。 5)提取DNA的檢測(cè): 用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA片段大小，DNA大分子條帶清晰。 分光光度計(jì)顯示所得DNA的濃度在50-3000ng/y 1，0D260/0D280在1.7-1.9。
2.如權(quán)利要求1所述的活體提取縊蟶DNA的方法，其特征在于，所述步驟I)的海水培養(yǎng)桶是指圓形塑料桶，內(nèi)加比重為1.015的海水，底下鋪泥，泥的顆粒直徑Φ〈150 μ m，厚度5_10cmo
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103602669SQ201310630359
【公開(kāi)日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】李家樂(lè), 王劦, 牛東紅, 沈和定, 李多, 王澤
申請(qǐng)人:上海海洋大學(xué)