專利名稱：：穿刺巴氏桿菌活體繁殖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種細(xì)菌活體繁殖的方法，具體地講是涉及一種穿剌巴氏桿菌活體大量繁殖的方法。
背景技術(shù)：
：穿剌巴氏桿菌(Pasteuriapenetrans)寄生根結(jié)線蟲(Meloidogynespp.)，屬于革蘭氏陽(yáng)性菌。其繁殖方式是產(chǎn)生不具有游動(dòng)性的休眠內(nèi)生孢子。當(dāng)根結(jié)線蟲的二齡幼蟲在土壤中移動(dòng)遇到孢子，通過(guò)接觸，土壤中的休眠孢子附著于線蟲的體表上，并隨著二齡幼蟲侵入寄主植物的根系。當(dāng)二齡幼蟲在寄主植物中建立侵染點(diǎn)并開始取食之后，休眠孢子萌發(fā)，產(chǎn)生侵染管并穿過(guò)線蟲的體壁，侵入到線蟲的假體腔，侵染后的線蟲能繼續(xù)取食，脫皮，發(fā)育成三齡，四齡幼蟲直至成蟲。侵染后的雌蟲不能產(chǎn)卵或只產(chǎn)生少量的卵，其假體腔被穿剌巴氏桿菌充滿，菌絲體大量繁殖，形狀如花椰菜，菌絲體分化后進(jìn)入產(chǎn)孢階段，最終每個(gè)雌蟲體內(nèi)能產(chǎn)生多達(dá)二百萬(wàn)個(gè)內(nèi)生休眠孢子，這些休眠孢子隨著根系和雌蟲的分解進(jìn)入土壤中，完成其生活史。休眠孢子具有良好的抗逆性，能抗高溫、干旱(燥)、高濕及各種化學(xué)和物理因子。穿剌巴氏桿菌因其獨(dú)特的抗逆性和作用機(jī)制，大量研究證明它是一種非常有效防治根結(jié)線蟲病的生防因子，具有廣闊的開發(fā)前景。然而，目前該菌難以在人工合成培養(yǎng)基上大量繁殖，成為大規(guī)模應(yīng)用其防治線蟲的瓶頸，有學(xué)者將目光轉(zhuǎn)移到了該菌活體培養(yǎng)方式的研究。早在1980年，Stirling和Wachtel就提出了利用活體繁殖技術(shù)生產(chǎn)穿剌巴氏桿菌菌劑的技術(shù)(Stirling.G.R..andWachtel.M.F.1980.MassproductionofBacilluspenetransforthebiologicalcontrolofroot-knotnematodes.Nematologica26:308-312)，隨后Brown、Channer、Verdejo等學(xué)者相繼對(duì)活體擴(kuò)繁體系中孢子附著技術(shù)進(jìn)行了研究，確立了幾種穿刺巴氏桿菌？包子附著的技術(shù)體系(Brown.S.M.，Smark.G.C.Jr.1985.RootpenetrationbyMeloidogyneincognitajuvenilesinfectedwithBacilluspenetrans.JournalofNematology17:123—126;Cha皿er.A.G.，andS.R.Gowen.1988.PreliminarystudiesonthepotentialofPasteuri即enetranstocontrolMeliodogynespecies.Proceedingsofbrightoncropprotectionconference,pestsanddiseases.Surrey,England:TheBritishCropProtectionCouncil;Verdejo.S.，andB.A.Jaffee.1988.ReproductionofPasteuriapenetransinatissue—culturesystemcontainingMeloidogynejavanicaandAgrobacteriumrhizogenes-transformedroots.Phytopathology8:1284-1286)。此外，2006年Gomathi等人試驗(yàn)比較了四種不同植物活體繁殖穿剌巴氏桿菌的效率(Gomathi.C.，咖ar.S.，Subramanian.S.EffectofhostplantonmassproductionofPasteuriapenetrans.IndianJournalofNematology.NematologicalSocietyofIndia,NewDelhi,India:2006.36:2,297-299)。綜述以上研究，國(guó)內(nèi)外對(duì)活體擴(kuò)繁中的接種體系并未展開系統(tǒng)的研究。本發(fā)明擬通過(guò)對(duì)根結(jié)線蟲的寄主品種、接種量、接種次數(shù)、接種時(shí)期進(jìn)行篩選，優(yōu)化穿剌巴氏桿菌活體繁殖體系，期望進(jìn)一步提高穿剌巴氏桿菌活體繁殖的產(chǎn)量。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種活體大量繁殖穿剌巴氏桿菌繁殖的方法。本發(fā)明所提供的穿剌巴氏桿菌活體繁殖的方法，是將附著穿剌巴氏桿菌的根結(jié)線蟲接種于番茄上并進(jìn)行培養(yǎng)。其中，所述番茄選自下述番茄品種中的任意一種白果強(qiáng)豐、佳粉18、秦星908、毛粉802和嘉寶。上述番茄品種均可從當(dāng)?shù)厥卟朔N子公司(如北京德勝種業(yè)發(fā)展有限公司)購(gòu)買獲得。所述根結(jié)線蟲的接種量可為1000-12000條/株，優(yōu)選為2000-10000條/株。具體可為2000-5000條/株、5000-10000條/株。所述接種中，對(duì)所述番茄進(jìn)行接種的時(shí)期可為番茄的2-12片真葉期，優(yōu)選為4-10片真葉期。所述接種中，附著穿剌巴氏桿菌的根結(jié)線蟲對(duì)所述番茄進(jìn)行接種的次數(shù)可為1-7次，優(yōu)選為2-5次。將附著穿剌巴氏桿菌的根結(jié)線蟲幼蟲以最佳接種量在所述最佳番茄品種的最佳接種時(shí)期接種后，可先放置在最適溫度條件下培養(yǎng)一周后再轉(zhuǎn)移至溫室條件下進(jìn)行培養(yǎng)。所述最適溫度條件為18°C_36"，優(yōu)選為21°C_36°C;所述溫室條件為15°C_40°C。上述方法中，所述番茄品種可種植在最適宜穿剌巴氏桿菌繁殖的土壤中，所述土壤具體可為砂壤土、中壤土或輕壤土，優(yōu)選種植在中壤土中。所述土壤可為不同土壤肥力的土壤，具體可分為施用基肥、不施用基肥、施用基肥并追肥的土壤。所述土壤也可為施用或不施用殺線劑的土壤，具體可分為未施用殺線劑土壤、施用有機(jī)磷類殺線劑的土壤、施用氨基甲酸酯類殺線劑的土壤。上述方法中，所述穿剌巴氏桿菌是通過(guò)離心將穿剌巴氏桿菌的孢子附著在線蟲上并侵染到線蟲體內(nèi)得到的。上述方法中，所述附著穿剌巴氏桿菌的根結(jié)線蟲是將根結(jié)線蟲溶液和孢子溶液混合，通過(guò)離心方法獲得。上述方法中，所述附著穿剌巴氏桿菌的根結(jié)線蟲是將根結(jié)線蟲溶液和剌巴氏桿菌的孢子溶液混合后，離心得到的。所述離心的條件為3000g-9000g離心2-7min，具體可為9000g離心3min。本發(fā)明方法同樣適用于穿剌巴氏桿菌(參考文獻(xiàn)為SAYRERM，STARRMP.Pasteuriapenetrans(exThorne，1940)nom.rev.，combn，sp.n.，amycelialandendospore-formingbacteriumparasiticinplant-parasiticnematodes[J].ProceedingsoftheHelminthologicalSocietyofWashington,1985，52:149-165)種寄生其它根結(jié)線蟲種的穿剌巴氏桿菌的大量繁殖，如寄生南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincognita)、花生根結(jié)線蟲(Meloidogynearenaria)、爪哇根結(jié)線蟲(Meloidogynejavanica)等。上述穿剌巴氏桿菌均可從Pasteuriabioscience公司購(gòu)得。所述線蟲為根結(jié)線蟲(Meloidogynespp.)(殷友琴，楊寶君，王秋麗.根結(jié)線蟲病的病原鑒定[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，1989，(03))，包括南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincognita)、花生根結(jié)線蟲(Meloidogynearenaria)、爪哇根結(jié)線蟲(Meloidogynejavanica)等。所述根結(jié)線蟲(Meloidogynespp.)可由中國(guó)林業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CFCC)購(gòu)得。本發(fā)明提供了一種大量活體繁殖穿剌巴氏桿菌技術(shù)。該技術(shù)是在篩選出活體擴(kuò)繁根結(jié)線蟲及穿剌巴氏桿菌的最佳寄主植物品種基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)線蟲接種量，接種時(shí)間、線蟲接入次數(shù)及接入線蟲后初期培養(yǎng)溫度進(jìn)行篩選，最終提高了單株番茄繁殖穿剌巴氏桿菌孢子的能力，穿剌巴氏桿菌的陽(yáng)性侵染率可達(dá)40%以上，單株總產(chǎn)孢量可達(dá)9.0*108以上。具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)試劑商店購(gòu)買得到的。實(shí)施例1、穿剌巴氏桿菌大量活體繁殖效率對(duì)比研究1、供試線蟲及其分離供試線蟲為南方根結(jié)線蟲Meloidogyneincognita(中國(guó)林業(yè)微生物菌種保藏管理中心)。取已感染南方根結(jié)線蟲的番茄植株，將番茄的根用清水洗凈，放置于0.5%次氯酸鈉溶液中30sec，快速搓洗，過(guò)篩，沖洗，收集南方根結(jié)線蟲的卵粒于墊有3層濾紙的線蟲分離器中，在室溫下孵化3-4天，得到南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲。2、供試菌株及其分離供試菌株為穿剌巴氏桿菌Pasteuriapenetrans(美國(guó)PasteuriaBioscience公司)。挑取被穿剌巴氏桿菌侵染的根結(jié)線蟲雌蟲于一離心管中，壓破，釋放出成熟的穿剌巴氏桿菌孢子。3、穿剌巴氏桿菌附著南方根結(jié)線蟲將上述步驟(1)培養(yǎng)的南方根結(jié)線蟲與(2)獲得的穿剌巴氏桿菌孢子溶液混合，制成孢子_線蟲混合液，混合液中，根結(jié)線蟲的濃度為2000J2/ml，穿剌巴氏桿菌孢子的濃度為1.0X104個(gè)孢子/ml，將混合液吹打混勻后，平均分裝到6個(gè)離心管中，溶液體積小于離心管體積的1/2，9000g離心3min，收集沉淀備用。隨機(jī)取樣在400倍顯微鏡下計(jì)數(shù)每條線蟲體表附著的孢子數(shù)，結(jié)果表明，附著率為100%，且每條線蟲體表都附著有至少一個(gè)穿剌巴氏桿菌的孢子。4、穿剌巴氏桿菌活體繁殖效率對(duì)比研究(1)將步驟3中已附著穿剌巴氏桿菌的南方根結(jié)線蟲分別接種6葉期的番茄苗。(2)番茄品種為白果強(qiáng)豐、佳粉18和秦星908，每盆栽種1株番茄，每盆接種2000條，移入溫室中，隨機(jī)排列，每周澆水2-3次，并根據(jù)需要進(jìn)行病蟲害管理。(3)接種60天調(diào)查各個(gè)處理番茄的根重、根結(jié)級(jí)數(shù)、穿剌巴氏桿菌孢子侵染陽(yáng)性率及總產(chǎn)孢量。結(jié)果表明(見表1)，秦星908的陽(yáng)性侵染率最高為43.3%，其次為佳粉18陽(yáng)性侵5染率31.3%、最低為白果強(qiáng)豐23.3%，且秦星908的單株番茄總產(chǎn)孢量為白果強(qiáng)豐單株總產(chǎn)孢量的4倍，佳粉18單株番茄總產(chǎn)孢量為白果強(qiáng)豐單株總產(chǎn)孢量的2倍。表1穿剌巴氏桿菌活體繁殖對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例2、穿剌巴氏桿菌大量活體繁殖效率對(duì)比研究重復(fù)實(shí)施例1，但進(jìn)行下述修改選用實(shí)施例1步驟4(2)中番茄品種秦星908，線蟲接種量分別為2000條/盆、5000條/盆、10000條/盆，其它條件不變。結(jié)果表明(見表2)，接種10000條/盆時(shí)，根結(jié)級(jí)數(shù)、卵塊數(shù)、單株總產(chǎn)孢量與接種2000條/盆、5000條/盆都有顯著性提高，但陽(yáng)性率顯著性降低。接種5000條/盆時(shí)，秦星908的總產(chǎn)孢量為6.87*107株，為接種2000條/盆總產(chǎn)孢量的3倍；且陽(yáng)性侵染率同樣顯著性高于接種2000條/盆的陽(yáng)性侵染率。表2穿剌巴氏桿菌活體繁殖對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例3、穿剌巴氏桿菌大量活體繁殖效率對(duì)比研究重復(fù)實(shí)施例1，但進(jìn)行下述修改選用實(shí)施例1步驟4(2)中番茄品種秦星908，將線蟲的接種量改為5000條/盆，將線蟲接種時(shí)間分別改為番茄4葉期、6葉期、10葉期，其它條件不變。結(jié)果表明(見表3)，接種時(shí)期對(duì)根結(jié)級(jí)數(shù)及穿剌巴氏桿菌陽(yáng)性侵染率無(wú)顯著性影響，但影響番茄根系大小，10葉期接種附有穿剌巴氏桿菌的根結(jié)線蟲的根系最大，但單株產(chǎn)孢量與6葉期接種無(wú)顯著性差異，番茄4葉期接種單株產(chǎn)孢量最低，僅為5.34*107株。表3穿剌巴氏桿菌活體繁殖對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例4、穿剌巴氏桿菌大量活體繁殖效率對(duì)比研究重復(fù)實(shí)施例l，但進(jìn)行下述修改選用實(shí)施例1步驟4(2)中番茄品種秦星908，將線蟲的接種量改為5000條/盆，分為1次、2次、5次接種植物根系周圍，每次接種間隔時(shí)間為2天，其它條件不變。結(jié)果表明(見表4)，與接種l次相比，5000條線蟲分2次接種番茄根系可對(duì)番茄造成同等程度傷害，包括根結(jié)級(jí)數(shù)、每棵根上卵塊數(shù)都無(wú)顯著性差異，但分2次接種時(shí)穿剌巴氏桿菌陽(yáng)性侵染率和單株產(chǎn)孢量顯著性增高；5000條線蟲分5次接種后，穿剌巴氏桿菌的陽(yáng)性侵染率可顯著性增高，但與分2次接種相比，單株番茄總產(chǎn)孢量和單株番茄根系卵塊數(shù)顯著性降低。表4穿剌巴氏桿菌活體繁殖對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例5、穿剌巴氏桿菌大量活體繁殖效率對(duì)比研究重復(fù)實(shí)施例1，但進(jìn)行下述修改選用實(shí)施例1步驟4(2)中番茄品種秦星908，將線蟲的接種量改為5000條/盆，接種后分別放在21-24t:、27-3(TC、33-36t:條件下培養(yǎng)一周后轉(zhuǎn)移至溫室條件下15°C-401:中，其它條件不變。結(jié)果表明(見表5)，接種后先在27-3(TC條件下培養(yǎng)可顯著性提高穿剌巴氏桿菌的陽(yáng)性侵染率，33-36°C條件下單株產(chǎn)孢量最高，但與27-30°C條件下單株產(chǎn)孢量差異不顯著，比較溫度對(duì)線蟲侵染寄主根系能力，21-24t:、27-3(rC、33-36t:條件與28。C條件無(wú)顯著性差異。表5穿剌巴氏桿菌活體繁殖對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例6、穿剌巴氏桿菌大量活體繁殖效率對(duì)比研究重復(fù)實(shí)施例1，但進(jìn)行下述修改選用實(shí)施例1步驟4(2)中番茄品種秦星908，分別種植在砂壤土、中壤土、輕壤土中，將線蟲的接種量改為5000條/盆，其它條件不變。結(jié)果表明(見表6)，中壤土中番茄根系顯著性大于輕壤土、砂壤土中番茄根系，且穿剌巴氏桿菌的陽(yáng)性侵染率和單株總產(chǎn)孢量同樣顯著性高于輕壤土、砂壤土中穿剌巴氏桿菌的陽(yáng)性侵染率和單株總產(chǎn)孢量，砂壤土中陽(yáng)性侵染率和單株產(chǎn)孢量最低。表6穿剌巴氏桿菌活體繁殖對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果土壤質(zhì)地根重(g)根結(jié)級(jí)數(shù)陽(yáng)性率(％)總產(chǎn)孢量*io7株輕壤土19.03±2.956.05±0.5534.7±3.87.84±0.63中壤土28.43±7.405.75±0.4537.3±2.78.26±0.70砂壤土19.26±6.486.25±0.7531.3±3.47.15±0.63實(shí)施例7、穿剌巴氏桿菌大量活體繁殖效率對(duì)比研究重復(fù)實(shí)施例1，但進(jìn)行下述修改選用實(shí)施例1步驟4(2)中番茄品種秦星908，分別種植在不施用基肥土壤、施用基肥土壤、施用基肥土壤并追肥土壤中，將線蟲的接種量改為5000條/盆，其它條件不變。結(jié)果表明(見表7)，施用基肥可以促進(jìn)根的生長(zhǎng)發(fā)育，根系顯著性大于未施用基肥的番茄根系大小，但施用基肥及追肥不影響穿剌巴氏桿菌的陽(yáng)性侵染率及單株總產(chǎn)孢表7穿剌巴氏桿菌活體繁殖對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果土壤肥力根重(g)根結(jié)級(jí)數(shù)陽(yáng)性率(％)總產(chǎn)孢量*io7株不施用基肥32.2±4.17.25±0.4622.5±6.05.44±0.63施用基肥40.6±4.07.00±020.0±4.05.62±0.70施基肥并追肥65.2±7.47.50±0.5320.9±6.05.83±0.70實(shí)施例8、穿剌巴氏桿菌大量活體繁殖效率對(duì)比研究1、供試土壤供試土壤為田間未施用殺線劑的土壤，溫室中施用殺線劑福氣多(青島德地得農(nóng)化產(chǎn)品營(yíng)銷有限公司)的土壤及施用丁硫克百威(恒大百盛生物科技發(fā)展有限公司)的土壤。2、分別稱取上述土壤308，加入1.0*105個(gè)穿剌巴氏桿菌孢子，混勻，所得土壤即為含有穿剌巴氏桿菌孢子的施用殺線劑和未施用殺線劑的土壤。3、向上述所得土壤中分別加入2000條新孵化的南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲，室溫條8件下放置3天。4、采用懸浮離心法分離上述土壤中的二齡幼蟲，并在顯微鏡下記錄每條線蟲體表孢子數(shù)和被孢子附著的線蟲數(shù)。結(jié)果表明(見表8)，土壤中施用殺線劑福氣多或丁硫克百威不影響孢子附著線蟲的能力，比較施用殺線劑和未施用殺線劑土壤中線蟲體表孢子數(shù)、線蟲體表孢子附著率都無(wú)顯著性差異。表8穿剌巴氏桿菌活體繁殖對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>通過(guò)上述實(shí)施例1-8的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，本發(fā)明方法通過(guò)對(duì)線蟲寄主植物的篩選、接種時(shí)期和接種量的選擇、接種次數(shù)優(yōu)化、土壤質(zhì)地和接種后培養(yǎng)溫度的篩選，有效地提高了穿剌巴氏桿菌的活體繁殖量。權(quán)利要求一種穿刺巴氏桿菌活體繁殖的方法，是將附著穿刺巴氏桿菌的根結(jié)線蟲接種于番茄上并進(jìn)行培養(yǎng)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述番茄選自下述番茄品種中的任意一種白果強(qiáng)豐、佳粉18、秦星908、毛粉802和嘉寶。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述根結(jié)線蟲的接種量為1000-12000條/株，優(yōu)選為2000-10000條/株。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述接種中，對(duì)所述番茄進(jìn)行接種的時(shí)期為番茄的2-12片真葉期，優(yōu)選為4-10片真葉期。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述接種中，附著穿剌巴氏桿菌的根結(jié)線蟲對(duì)所述番茄進(jìn)行接種的次數(shù)為1-7次，優(yōu)選為2-5次。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)的方法是將接種后的番茄先放置在最適溫度條件下培養(yǎng)一周后，再轉(zhuǎn)移至溫室中進(jìn)行培養(yǎng)；所述最適溫度條件為18°C-36。C，優(yōu)選為21°C-36°C;所述溫室的溫度為15°C_40°C。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述番茄種植在砂壤土、中壤土或輕壤土中，優(yōu)選種植在中壤土中。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述附著穿剌巴氏桿菌的根結(jié)線蟲是將根結(jié)線蟲溶液和剌巴氏桿菌的孢子溶液混合后，離心得到的。9.根據(jù)權(quán)利要求8中任一所述的方法，其特征在于所述離心的條件為3000g-9000g離心2-7min，優(yōu)選為9000g離心3min。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一所述方法，其特征在于所述穿剌巴氏桿菌(Pasteuriapenetrans)為寄生于根結(jié)線蟲的所有穿剌巴氏桿菌菌株；所述根結(jié)線蟲(Meloidogynespp.)為根結(jié)線蟲屬中的任意一種根結(jié)線蟲。全文摘要本發(fā)明公開了一種活體大量繁殖穿刺巴氏桿菌的方法。該方法是將附著穿刺巴氏桿菌的根結(jié)線蟲接種于番茄上并進(jìn)行培養(yǎng)。本發(fā)明的方法在篩選出活體擴(kuò)繁根結(jié)線蟲及穿刺巴氏桿菌的最佳寄主植物品種基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)線蟲接種量，接種時(shí)間、線蟲接入次數(shù)及接入線蟲后初期培養(yǎng)溫度進(jìn)行篩選，最終提高了單株番茄繁殖穿刺巴氏桿菌孢子的能力，穿刺巴氏桿菌的陽(yáng)性侵染率可達(dá)40％以上，單株總產(chǎn)孢量可達(dá)9.0×108以上。文檔編號(hào)C12R1/01GK101735972SQ20101003375公開日2010年6月16日申請(qǐng)日期2010年1月8日優(yōu)先權(quán)日2010年1月8日發(fā)明者何強(qiáng),劉倩,卜祥霞,簡(jiǎn)恒,陳忠孝申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)