一種發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物發(fā)酵生產(chǎn)領(lǐng)域，提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素(Erythromycin)的方法。該方法以紅色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea）為出發(fā)菌，主要包括斜面菌種的制備、搖瓶種子液的制備、種子液培養(yǎng)以及發(fā)酵罐工藝控制等四個步驟。本發(fā)明在種子罐、發(fā)酵罐培養(yǎng)基和發(fā)酵過程補(bǔ)料中使用精煉棉籽油代替豆油，降低了發(fā)酵成本，在優(yōu)化發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上使紅霉素的發(fā)酵效價和紅霉素A含量均有較大提高，適合于工業(yè)化大生產(chǎn)。
【專利說明】一種發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]紅霉素(Erythromycin,Er)是由紅色糖多抱菌(Saccharopolyspora erythraea)產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，屬于大環(huán)內(nèi)酯類的抗生素。紅霉素對需氧的革蘭氏陽性球菌和桿菌有強(qiáng)大抗菌作用，但對于大多數(shù)需氧革蘭氏陰性桿菌無效。然而對其它革蘭氏陰性細(xì)菌如淋病奈瑟球菌、流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟球菌、多殺巴氏菌、蒼白密螺旋體、百日咳桿菌、空腸彎曲菌及嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎支原體、沙眼衣原體有抑制作用。
[0003]近年來，由于紅霉素自身的抗藥性以及其它一些副作用影響了其自身的使用，但是后來開發(fā)出的第二代的紅霉素衍生物大都克服了紅霉素的缺點(diǎn)，這些衍生物是半合成的紅霉素，主要有阿奇霉素(Azithromycin),克拉霉素(Clarithromycin),地紅霉素(Dirithromycin),羅紅霉素(Roxithromycin),氟紅霉素(Flurithromycin)等，這些第二代的紅霉素是以紅霉素為母核合成的各種衍生物，經(jīng)結(jié)構(gòu)改造后，增加了對酸的穩(wěn)定性，吸收更好，可減少服藥次數(shù)，擴(kuò)大了抗菌譜，提高了抗菌活性，不良反應(yīng)明顯減少。由于紅霉素第二代衍生物的這些優(yōu)越性導(dǎo)致了紅霉素的需求與產(chǎn)量不斷增長，具有很好的市場前景。
[0004]自1952年發(fā)現(xiàn)紅霉素后，紅霉素就成為了抗生素生產(chǎn)中的一個重要品種。通過六十年的不斷發(fā)展，紅霉素的產(chǎn)量有了大幅度的提高，紅霉素的需求量也大幅度上升。但是，我國的紅霉素生產(chǎn)長期以來仍低于國外的水平，發(fā)酵單位低、成本高仍是重要的問題，影響了紅霉素生產(chǎn)的發(fā)展。進(jìn)行菌種改良和發(fā)酵工藝改進(jìn)是提高紅霉素生產(chǎn)水平的兩個重要途徑。進(jìn)行菌種改良需要較長的時間，進(jìn)行培養(yǎng)基改進(jìn)和工藝調(diào)整是比較快速的方法，對紅霉素生產(chǎn)水平的提高和成本的降低有著重要意義。
[0005]工藝改進(jìn)方面:宋小鋒等在《紅色糖多孢茵變溫發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素的研究》(中國抗生素雜志2009年12月第34卷第12期722-725)考察了不同溫度(29?34qE)對紅色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)合成紅霉素(erythromycin)的影響，對不同溫度下的發(fā)酵過程進(jìn)行動力學(xué)特性分析，在此基礎(chǔ)上提出了紅霉素合成的變溫培養(yǎng)方法:延滯期及對數(shù)期初期溫度控制在33?C，發(fā)酵中期32?C，后期降溫至29?C的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。采用此變溫培養(yǎng)進(jìn)行發(fā)酵，紅霉素的化學(xué)效價和生物效價比恒溫32°C培養(yǎng)對照組分別提高了 24%和 11.1%0
[0006]另夕卜，目前國內(nèi)外已有關(guān)于紅霉素發(fā)酵工藝的研究。Mirjalili N等在〈〈The effect of rapeseed oil uptake on the product1n of erythromycinand triketide latone by Saccharopolyspora erythraea)) (B1technologyProgress, 1999，15(5):911-918.)證實了菜籽油能夠有效提高紅霉素產(chǎn)量，Hamedi J等在((Enhancing of erythromycin product1n by Saccharopolyspora erythraea withcommon and uncommon oilsKJournal of industrial Microb1logy and B1technology,2004,31(10):447-456)—文中公開紅霉素發(fā)酵培養(yǎng)基中添加各種油脂，如菜籽油、棉籽油、胡桃油、芝麻油、橄欖油、紅花油、玉米油、大豆油、瓜子油等，這些油都可以提高紅霉素的產(chǎn)量，但是添加不同種類的油提高效價的程度有所不同，對于不同產(chǎn)地不同質(zhì)量的油脂對于紅霉素發(fā)酵影響程度也有一定的差別。
[0007]楊蓮芳等在《不同種類植物油對紅霉素發(fā)酵的影響》(《食品與發(fā)酵科技》2009年，第45卷第4期第46-48頁)公開不同種類植物油對紅霉素效價的影響結(jié)果是油菜籽油 > 花生油 > 大豆油 > 玉米油 > 芝麻油 > 茶油 > 橄欖油?蓖麻油 > 棉籽油。卞晨光等在《豆油對紅霉素生物合成的影響及作用機(jī)制分析》(華東理工大學(xué)學(xué)報，200430 (2): 139-142.)公開了在紅霉素?fù)u瓶中加入?油，使紅霉素效價提聞71.86%,沈兆兵等在《?油在紅霉素發(fā)酵中的作用及作用機(jī)制的研究》(中國抗生素雜志，2006，31(11):657-660.)公開通過在紅霉素發(fā)酵罐基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加豆油使效價提高43.1%,發(fā)酵過程中進(jìn)行補(bǔ)加豆油試驗后效價提高69.7%。在目前國內(nèi)的紅霉素的發(fā)酵生產(chǎn)中，普遍使用豆油，豆油是發(fā)酵中的一個重要的原料，使用量大，而且價格高，在生產(chǎn)成本中占據(jù)很大的比例。且大量研究表明在紅霉素發(fā)酵過程中豆油的效果要優(yōu)于棉籽油。
[0008]然而國內(nèi)紅霉素發(fā)酵水平普遍不高，距國際先進(jìn)水平低2000?5000u/ml，競爭力差。且早期菌種常規(guī)方法獲得的效價為2000-3000U/ml，紅霉素A的含量在55?65%。因此，為了提高競爭力，必須要降低生產(chǎn)成本，提高紅霉素發(fā)酵效價和組分A的含量。中國發(fā)明專利申請CN102732383A公開了一種改性植物油脂及其在紅霉素發(fā)酵過程中的應(yīng)用，該技術(shù)方案公開改性棉籽油效果優(yōu)于天然豆油，但是該技術(shù)方案并沒有公開所使用的菌種，眾所周知菌種對于發(fā)酵技術(shù)的影響是極其重要的。未改性的棉籽油使用情況沒有論述。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明公開了一種優(yōu)化發(fā)酵方法，用于提高紅霉素的發(fā)酵水平。
[0010]本發(fā)明利用紅色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素的方法，其具體包括如下步驟:
[0011]I)斜面菌種的制備:將凍干管的紅色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)菌種用無菌水稀釋后接種裝有固體培養(yǎng)基的斜面，在溫度32-34°C，濕度30 - 50%的條件下，培養(yǎng)9 一 lld，產(chǎn)孢后加無菌水制成孢子懸浮液；
[0012]2)搖瓶種子液制備:將孢子懸浮液接種搖瓶種子培養(yǎng)基，在搖床轉(zhuǎn)速為180-250rpm、溫度為32_34°C、濕度為20 — 50%的條件下培養(yǎng)40 — 52小時；
[0013]3)種子液的制備:將2)中培養(yǎng)好的搖瓶種子液接種到種子罐中，接種量為種子罐培養(yǎng)基體積的1.0-2.0%，在溫度為32-34°C、攪拌轉(zhuǎn)速為300 — 500rpm、通氣量為0.8VVM-1.5VVM、罐壓為0.05-0.06MPa的條件下培養(yǎng)40 — 60小時；
[0014]4)發(fā)酵培養(yǎng):將3)中培養(yǎng)好的菌液接到發(fā)酵罐中，接種量為發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積的10 - 15%，在溫度為32-34°C、攪拌轉(zhuǎn)速為500 — 700rpm、通氣量為0.8VVM-1.2VVM、罐壓為0.05 — 0.06MPa、pH為6.8-7.1、補(bǔ)入營養(yǎng)物質(zhì)糖、精煉棉籽油和正丙醇的條件下，培養(yǎng)180 — 200 小時。
[0015]本發(fā)明所用紅色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)菌種優(yōu)選的是CPCC240502、CPCC240538。
[0016]本發(fā)明步驟I)中所用固體培養(yǎng)基成分和含量優(yōu)選的是:淀粉10_12g/L，玉米漿9-12g/L，氯化鈉 2-5g/L，硫酸銨 2-5g/L，碳酸鈣 2_4g/L，瓊脂 20_25g/L，pH 為 6.5-7.5。
[0017]如本發(fā)明所述發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素的方法一般來說包括斜面培養(yǎng)、搖瓶種子液培養(yǎng)、種子液培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)明人在研究高效的發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素的過程中，意外發(fā)現(xiàn)在種子液培養(yǎng)過程中所用種子培養(yǎng)基、種子罐培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)過程中所用發(fā)酵培養(yǎng)基均使用市售的精煉棉籽油代替豆油，具有預(yù)料不到的技術(shù)效果。
[0018]本發(fā)明步驟2)搖瓶種子培養(yǎng)基的成分優(yōu)選的是:蔗糖，硫酸銨，玉米漿，磷酸二氫鉀，硫酸銨，碳酸鈣，精煉棉籽油，PH為5.5-6.5 ;更為優(yōu)選的是，所述種子培養(yǎng)基各成分的含量為:蔗糖20-50g/L，硫酸銨2-6g/L，玉米漿10_20g/L，磷酸二氫鉀0.1-0.2g/L，硫酸鎂
0.1-0.3g/L，碳酸鈣 5-8g/L，精煉棉籽油 0.05-0.075g/50ml，pH 為 5.5-6.5。
[0019]本發(fā)明步驟3)種子罐培養(yǎng)基的成分優(yōu)選的是:淀粉，糊精，黃豆餅粉，硫酸銨，氯化鈉，碳酸鈣，精煉棉籽油，消泡劑。更為優(yōu)選的是，所述種子培養(yǎng)基各成分的含量為:淀粉20-40g/L,糊精 20-40g/L，黃豆餅粉 20_40g/L，硫酸銨 2_5g/L，氯化鈉 2_5g/L，碳酸鈣 5_8g/L,精煉棉籽油5-8g/L，消泡劑0.2-0.4g/L，消后pH為6.5-7.2。
[0020]本發(fā)明步驟4)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分優(yōu)選的是:淀粉，黃豆餅粉，玉米漿，精煉棉籽油，硫酸銨，氯化鈉，碳酸鈣，消泡劑。更為優(yōu)選的是，所述發(fā)酵培養(yǎng)基各成分的含量為:淀粉30-55g/L，黃豆餅粉30-50g/L，精煉棉籽油5_8g/L，硫酸銨2_5g/L，氯化鈉2_5g/L，碳酸鈣 5-8g/L，消泡劑 0.2-0.3g/L，消后 pH 為 6.5-7.2。
[0021 ] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下明顯的優(yōu)勢。
[0022]和豆油相比，棉籽油價格較低。棉籽油是以棉花籽榨的油，顏色較其它油深紅，粗制棉籽油中含有一種含酚毒甙一棉酚，對菌體的生長代謝有影響，精煉后的棉籽油清除了棉酚等有害物質(zhì)，適合在發(fā)酵中使用。
[0023]本【技術(shù)領(lǐng)域】中，技術(shù)人員對于紅霉素發(fā)酵添加植物用油的理解普遍存在豆油等要優(yōu)于棉籽油，然而本發(fā)明人在菌種培養(yǎng)過程中添加使用了精煉棉籽油，提高了發(fā)酵效價，降低了發(fā)酵成本，解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的發(fā)酵效價低、生產(chǎn)成本高的缺點(diǎn)。同時，該發(fā)明克服了技術(shù)偏見，改變了人們對于棉籽油對紅霉素發(fā)酵過程中所產(chǎn)生作用的錯誤認(rèn)識。
[0024]同時，本發(fā)明優(yōu)化改進(jìn)了發(fā)酵工藝，發(fā)酵放罐時效價比使用豆油、粗制棉籽油的提高至少20%，紅霉素A含量也有較大幅度提高，且使用棉籽油成本稍低，更加有利于規(guī)?；笊a(chǎn)。

【具體實施方式】
[0025]以下結(jié)合實施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。
[0026]實施例1
[0027]斜面培養(yǎng):按如下比例配制培養(yǎng)基:淀粉10g/L，玉米漿10g/L，氯化鈉2g/L，硫酸銨3g/L，碳酸鈣3g/L，瓊脂22g/L，pH為7.0。配制培養(yǎng)基300ml，加熱瓊脂融化后攪拌均勻裝入10支試管中，121°C滅菌，時間為30min，做成斜面?zhèn)溆?。將凍干的紅色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea) CPCC240502 菌種用無菌水 5ml 溶解，取 4ml 均勻接種在10支斜面上，在溫度為33°C、濕度為40%的條件下，培養(yǎng)10d，產(chǎn)生大量孢子。加無菌水制成孢子懸浮液。
[0028]搖瓶種子液制備:按如下比例配制培養(yǎng)基:蔗糖40g/L，硫酸銨4g/L，玉米漿15g/L，磷酸二氫鉀0.lg/L，硫酸鎂0.2g/L，碳酸鈣7g/L，精煉棉籽油0.05g/50ml,pH為6.5。配制培養(yǎng)基200ml，裝500mL三角瓶4瓶(每瓶裝液量50mL)，118°C滅菌，時間為30min，滅菌后備用。將孢子懸浮液2mL接種到搖瓶中。在溫度為33.2°C、濕度為40%、搖床轉(zhuǎn)速為220rpm的條件下，培養(yǎng)48hour。
[0029]種子罐培養(yǎng):采用15L不銹鋼發(fā)酵罐進(jìn)行種子培養(yǎng)。按如下比例配制種子罐所用液體培養(yǎng)基(按實消后1L配制):淀粉20g/L，糊精40g/L，黃豆餅粉30g/L，硫酸銨3g/L，氯化鈉3g/L，碳酸鈣5g/L，精煉棉籽油8g/L，消泡劑0.3g/L，實消溫度為121°C，時間為30min,實消后體積為10L，消后pH為7.0。當(dāng)溫度降至32°C時，將150mL種子液(種子罐培養(yǎng)基體積的1.5%)接種到種子罐中，在溫度為32°C、攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm (轉(zhuǎn)/分)、通氣量為1.0VVM(體積/體積/分鐘)、罐壓為0.05MPa的條件下，培養(yǎng)60hour。
[0030]發(fā)酵罐培養(yǎng):采用50L不銹鋼發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)。按如下比例配制液體培養(yǎng)基(按實消并移種后35L配制):淀粉40g/L，黃豆餅粉30g/L，精煉棉籽油8g/L，硫酸銨4g/L，氯化鈉3g/L，碳酸鈣6g/L，消泡劑0.25g/L。實消溫度為121°C，時間為30min，實消后體積為30L，，消后PH為7.0，待溫度降至33°C時，將種子罐中培養(yǎng)好的菌液5L接到50L發(fā)酵罐中，接種量為發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積的14.3%，接種后培養(yǎng)條件為:溫度33°C，攪拌轉(zhuǎn)速為700rpm (轉(zhuǎn)/分)，通氣量1.0VVM(體積/體積/分鐘)，罐壓0.05MPa,培養(yǎng)13hour開始補(bǔ)入營養(yǎng)物質(zhì)糖，直到發(fā)酵結(jié)束，培養(yǎng)IShour開始補(bǔ)入精煉棉籽油和正丙醇，直到發(fā)酵結(jié)束。33hour后pH控制在6.8，培養(yǎng)時間為185hour。放罐時紅霉素含量為4704U/ml，紅霉素A含量73.9%。
[0031]實施例2
[0032]斜面培養(yǎng):按如下比例配制培養(yǎng)基:淀粉12g/L，玉米漿12g/L，氯化鈉3g/L，硫酸銨2g/L，碳酸鈣4g/L，瓊脂25g/L，pH為7.5。配制培養(yǎng)基300ml，加熱瓊脂融化后攪拌均勻裝入10支試管中，121°C滅菌，時間為30min，滅菌后做成斜面?zhèn)溆?。將凍干的紅色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)CPCC240502 用無菌水 5ml 溶解，取 4ml 均勻接種在 10 支斜面上，在溫度為32°C、濕度為30%的條件下培養(yǎng)lld，產(chǎn)生大量孢子。加無菌水制成孢子懸浮液。
[0033]搖瓶種子液制備:按如下比例配制培養(yǎng)基:蔗糖50g/L，硫酸銨6g/L，玉米漿1g/L，磷酸二氫鉀0.15g/L，硫酸鎂0.lg/L，碳酸鈣8g/L，精煉棉籽油0.05g/50ml，pH為6.0。配制培養(yǎng)基200ml，裝500mL三角瓶4瓶(每瓶裝液量50mL)，118°C滅菌，時間為30min，滅菌后備用。將孢子懸浮液2mL接種到搖瓶中。在溫度為321:、濕度為20%、搖床轉(zhuǎn)速為250印111的條件下，培養(yǎng)52hour。
[0034]種子罐培養(yǎng):采用15L不銹鋼發(fā)酵罐進(jìn)行種子培養(yǎng)。按如下比例配制種子罐所用液體培養(yǎng)基(按實消后1L配制):淀粉25g/L，糊精30g/L，黃豆餅粉20g/L，硫酸銨5g/L，氯化鈉2g/L，碳酸鈣6g/L，精煉棉籽油7g/L，消泡劑0.2g/L。實消溫度為121°C，時間為30min,實消后體積為10L，，消后pH為7.2，當(dāng)溫度降至33°C時，將10mL種子液(種子罐培養(yǎng)基體積的1%)接種到種子罐中，在溫度為33°C、攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm (轉(zhuǎn)/分)、通氣量為
0.8VVM(體積/體積/分鐘)、罐壓為0.05MPa的條件下，培養(yǎng)50hour。
[0035]發(fā)酵罐培養(yǎng):采用50L不銹鋼發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)。按如下比例配制液體培養(yǎng)基(按實消并移種后35L配制):淀粉30g/L，黃豆餅粉40g/L，精煉棉籽油7g/L，硫酸銨5g/L，氯化鈉2g/L，碳酸鈣5g/L，消泡劑0.2g/L。實消溫度為121°C，時間為30min，實消后體積為31L，，消后PH為7.2，待溫度降至32°C時，將種子罐中培養(yǎng)好的菌液4L接到50L發(fā)酵罐中，接種量為發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積的11.4%，接種后培養(yǎng)條件為:溫度32°C，攪拌轉(zhuǎn)速為600rpm (轉(zhuǎn)/分)，通氣量1.2VVM(體積/體積/分鐘)，罐壓0.05MPa, 3Ihour后將pH控制在7.0,培養(yǎng)Ilhour開始補(bǔ)入營養(yǎng)物質(zhì)糖，直到發(fā)酵結(jié)束，培養(yǎng)15hour開始補(bǔ)入精煉棉籽油和正丙醇，直到發(fā)酵結(jié)束。培養(yǎng)時間為180hour。放罐時紅霉素含量為4818U/ml，紅霉素A含量73.4%。
[0036]實施例3 (對比例)
[0037]將搖瓶種子液培養(yǎng)過程中使用的培養(yǎng)基、種子罐培養(yǎng)培養(yǎng)過程中所用的種子罐培養(yǎng)基和發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中的發(fā)酵罐基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)料使用豆油代替精煉棉籽油，其它同實施例2，放罐時紅霉素含量為3860U/ml，紅霉素A含量67.9%。
[0038]實施例4 (對比例)
[0039]將搖瓶種子液培養(yǎng)過程中使用的培養(yǎng)基、種子罐培養(yǎng)培養(yǎng)過程中所用的種子罐培養(yǎng)基和發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中的發(fā)酵罐基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)料使用粗制棉籽油(市售)代替精煉棉籽油，其它同實施例2，放罐時紅霉素含量為3244U/ml，紅霉素A含量63.7%。
[0040]實施例5
[0041]斜面培養(yǎng):按如下比例配制培養(yǎng)基:淀粉10g/L，玉米漿9g/L，氯化鈉4g/L，硫酸銨4g/L,碳酸|丐3g/L,瓊脂20g/L,pH為6.5。配制培養(yǎng)基300ml,加熱瓊脂融化后攪拌均勻裝入10支試管中，121°C滅菌，時間為30min，滅菌后做成斜面?zhèn)溆谩龈傻募t色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)CPCC240538 用無菌水 5ml 溶解，取 4ml 均勻接種在 10 支斜面上，在溫度為34°C、濕度為50%的條件下培養(yǎng)9d，產(chǎn)生大量孢子。加無菌水制成孢子懸浮液。
[0042]搖瓶種子液制備:按如下比例配制培養(yǎng)基:蔗糖20g/L，硫酸銨2g/L，玉米漿20g/L，磷酸二氫鉀0.15g/L，硫酸鎂0.3g/L，碳酸鈣5g/L，精煉棉籽油0.075g/50ml,pH為6。配制培養(yǎng)基250ml，裝500mL三角瓶5瓶(每瓶裝液量50mL)，在溫度為118°C，時間為30min的條件下滅菌，滅菌后備用。將孢子懸浮液2mL接種到搖瓶中。在溫度為34°C、濕度為50%、搖床轉(zhuǎn)速為180rpm的條件下培養(yǎng)40hour。
[0043]種子罐培養(yǎng):采用15L不銹鋼發(fā)酵罐進(jìn)行種子培養(yǎng)。按如下比例配制種子罐所用液體培養(yǎng)基(按實消后1L配制):淀粉40g/L，糊精20g/L，黃豆餅粉40g/L，硫酸銨2g/L，氯化鈉4g/L，碳酸鈣8g/L，精煉棉籽油5g/L，消泡劑0.4g/L。實消溫度為121°C，時間為30min，實消后體積為10L，消后pH為6.5，當(dāng)溫度降至33.5°C時，將200mL種子液(種子罐培養(yǎng)基體積的2%)接種到種子罐中，在溫度為33.5°C、攪拌轉(zhuǎn)速為300rpm (轉(zhuǎn)/分)、通氣量為1.5VVM(體積/體積/分鐘)、罐壓為0.06MPa的條件下，培養(yǎng)45hour。
[0044]發(fā)酵罐培養(yǎng):采用50L不銹鋼發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)。按如下比例配制液體培養(yǎng)基(按實消并移種后35L配制):淀粉50g/L，黃豆餅粉50g/L，精煉棉籽油6g/L，硫酸銨2g/L，氯化鈉5g/L，碳酸鈣8g/L，消泡劑0.3g/L。實消溫度為121°C，時間為30min，實消后體積為31.5L，消后PH為7.0，待溫度降至33.5°C時，將種子罐中培養(yǎng)好的菌液3.5L接到50L發(fā)酵罐中，接種量為發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積的10%，接種后培養(yǎng)條件為:溫度33.5°C，攪拌轉(zhuǎn)速為600rpm(轉(zhuǎn)/分)，通氣量0.8VVM(體積/體積/分鐘)，罐壓0.06MPa, 36hour后pH控制在6.9，培養(yǎng)15hour開始補(bǔ)入營養(yǎng)物質(zhì)糖，直到發(fā)酵結(jié)束，培養(yǎng)22hour開始補(bǔ)入精煉棉籽油和正丙醇，直到發(fā)酵結(jié)束。培養(yǎng)時間為200hour。放罐時紅霉素含量為4577U/ml，紅霉素A含量74.05%。
[0045]實施例6
[0046]斜面培養(yǎng):按如下比例配制培養(yǎng)基:淀粉llg/L，玉米漿10g/L，氯化鈉5g/L，硫酸銨3.5g/L，碳酸鈣2g/L，瓊脂23g/L，pH為7.0。配制培養(yǎng)基300ml，加熱瓊脂融化后攪拌均勻裝入10支試管中，121°C滅菌，時間為30min，滅菌后做成斜面?zhèn)溆?。將凍干的紅色糖多抱菌(Saccharopolyspora erythraea) CPCC240538 用無菌水 5ml 溶解，取 4ml 均勻接種在10支斜面上，在溫度為34°C、濕度為45%的條件下培養(yǎng)9d，產(chǎn)生大量孢子。加無菌水制成孢子懸浮液。
[0047]搖瓶種子液制備:按如下比例配制培養(yǎng)基:蔗糖35g/L，硫酸銨3g/L，玉米漿20g/L，磷酸二氫鉀0.2g/L，硫酸鎂0.2g/L，碳酸鈣6g/L，精煉棉籽油0.075g/50ml, pH為5.5。配制培養(yǎng)基200ml，裝500mL三角瓶4瓶(每瓶裝液量50mL)，在溫度為118°C、時間為30min的條件下滅菌，滅菌后備用。將孢子懸浮液2mL接種到搖瓶中。在溫度為33.5°C、濕度為35%、搖床轉(zhuǎn)速為200rpm的條件下，培養(yǎng)45hour。
[0048]種子罐培養(yǎng):采用15L不銹鋼發(fā)酵罐進(jìn)行種子培養(yǎng)。按如下比例配制種子罐所用液體培養(yǎng)基(按實消后1L配制):淀粉30g/L，糊精25g/L，黃豆餅粉35g/L，硫酸銨4g/L，氯化鈉5g/L，精煉棉籽油6g/L，碳酸鈣7g/L，消泡劑0.3g/L。實消溫度為121°C，時間為30min,實消后體積為10L，消后pH為7.0,當(dāng)溫度降至34°C時，將150mL種子液(種子罐培養(yǎng)基體積的1.5%)接種到種子罐中，在溫度為34°C、攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm (轉(zhuǎn)/分)、通氣量為
1.2VVM(體積/體積/分鐘)、罐壓為0.05MPa的條件下，培養(yǎng)40hour。
[0049]發(fā)酵罐培養(yǎng):采用50L不銹鋼發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)。按如下比例配制液體培養(yǎng)基(按實消并移種后35L配制):淀粉55g/L，黃豆餅粉45g/L，精煉棉籽油5g/L，硫酸銨3g/L，氯化鈉4g/L，碳酸鈣7g/L，消泡劑0.3g/L。實消溫度為121°C，時間為30min，實消后體積為29.7L，，消后PH為6.5，待溫度降至34°C時，將種子罐中培養(yǎng)好的菌液5.3L接到50L發(fā)酵罐中，接種量為發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積的15%，接種后培養(yǎng)條件為:溫度34°C，攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm (轉(zhuǎn)/分)，通氣量1.0VVM(體積/體積/分鐘)，罐壓0.06MPa, 34hour后pH控制在7.1，培養(yǎng)14hour開始補(bǔ)入營養(yǎng)物質(zhì)糖，直到發(fā)酵結(jié)束，培養(yǎng)20hour開始補(bǔ)入精煉棉籽油和正丙醇直到發(fā)酵結(jié)束。培養(yǎng)時間為193hour。放罐時紅霉素含量為4495U/ml，紅霉素A含量73.71%。
[0050]實施例7 (對比例)
[0051]將種子罐培養(yǎng)培養(yǎng)過程中所用的種子罐培養(yǎng)基和發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中的發(fā)酵罐基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)料使用豆油代替精煉棉籽油，其它同實施例5，放罐時紅霉素A含量為3642U/ml，紅霉素A含量68.35%。
[0052]實施例8 (對比例)
[0053]將種子罐培養(yǎng)培養(yǎng)過程中所用的種子罐培養(yǎng)基和發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中的發(fā)酵罐基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)料使用粗制棉籽油(市售)代替精煉棉籽油，其它同實施例6，放罐時紅霉素A含量為3021U/ml，紅霉素A含量64.35%。
【權(quán)利要求】
1.一種利用紅色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)過程包括如下步驟: 1)斜面菌種的制備:將凍干管的紅色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)菌種用無菌水稀釋后接種裝有固體培養(yǎng)基的斜面，在溫度32-34°C，濕度30 — 50%的條件下，培養(yǎng)9 一 lid,產(chǎn)孢后加無菌水制成孢子懸浮液； 2)搖瓶種子液制備:將孢子懸浮液接種搖瓶種子培養(yǎng)基，在搖床轉(zhuǎn)速為180-250rpm、溫度為32-34°C、濕度為20 - 50%的條件下培養(yǎng)40 — 52小時； 3)種子液的制備:將2)中培養(yǎng)好的搖瓶種子液接種到種子罐中，接種量為種子罐培養(yǎng)基體積的1.0-2.0%，在溫度為32-34 °C、攪拌轉(zhuǎn)速為300 — 500rpm、通氣量為0.8VVM-1.5VVM、罐壓為0.05-0.06MPa的條件下培養(yǎng)40 — 60小時； 4)發(fā)酵培養(yǎng):將3)中培養(yǎng)好的菌液接到發(fā)酵罐中，接種量為發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積的10 - 15%，在溫度為32-34°C、攪拌轉(zhuǎn)速為500 — 700rpm、通氣量為0.8VVM-1.2VVM、罐壓為0.05 — 0.06MPa、pH為6.8-7.1、補(bǔ)入營養(yǎng)物質(zhì)糖、精煉棉籽油和正丙醇的條件下，培養(yǎng)180 — 200 小時。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)固體培養(yǎng)基成分和含量為:淀粉10-12g/L，玉米漿9-12g/L，氯化鈉2_5g/L，硫酸銨2_5g/L，碳酸鈣2_4g/L，瓊脂20-25g/L,pH 為 6.5-7.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述搖瓶種子液培養(yǎng)過程所用培養(yǎng)基、種子液培養(yǎng)過程中所用種子罐培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)過程中所用發(fā)酵罐基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)料所添加的植物油為均為精煉棉籽油。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2)搖瓶種子液培養(yǎng)基還包括以下成分:蔗糖，硫酸銨，玉米漿，磷酸二氫鉀，硫酸鎂，碳酸鈣。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟2)搖瓶種子培養(yǎng)基成分和含量為:蔗糖20-50g/L，硫酸銨2-6g/L，玉米漿10_20g/L，磷酸二氫鉀0.1-0.2g/L，硫酸鎂0.1-0.3g/L，碳酸鈣 5-8g/L，精煉棉籽油 0.05-0.075g/50ml，pH 為 5.5-6.5。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3)種子罐培養(yǎng)基還包括以下成分:淀粉，糊精，黃豆餅粉，硫酸銨，氯化鈉，碳酸鈣，消泡劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述種子罐培養(yǎng)基各成分的含量為:淀粉20-40g/L，糊精20-40g/L，黃豆餅粉20_40g/L，硫酸銨2_5g/L，氯化鈉2_5g/L，碳酸鈣5_8g/L，消泡劑 0.2-0.4g/L，精煉棉籽油 5_8g/L，消后 pH 為 6.5-7.2。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括以下成分:淀粉，黃豆餅粉，玉米漿，硫酸銨，氯化鈉，碳酸鈣，消泡劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基各成分的含量為:淀粉30-55g/L，黃豆餅粉30-50g/L，精煉棉籽油5_8g/L，硫酸銨2_5g/L，氯化鈉2_5g/L，碳酸鈣 5-8g/L，消泡劑 0.2-0.3g/L，消后 pH 為 6.5-7.2。
【文檔編號】C12N1/20GK104419739SQ201310384527
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月28日
【發(fā)明者】趙志全, 譚麗華, 隋華芹, 孟祥學(xué) 申請人:魯南新時代生物技術(shù)有限公司