一種中國人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系ctsc-2及其建立方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種中國人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-2的建立方法，為研究人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌的特性及其治療藥物提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。該方法包括如下具體步驟：采用組織塊貼壁法進(jìn)行舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞的原代培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到約80%的時候進(jìn)行傳代培養(yǎng)；將傳代穩(wěn)定的細(xì)胞經(jīng)RT-PCR檢測表明細(xì)胞表達(dá)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞標(biāo)志性分子CK8、18、19；經(jīng)免疫印跡實驗檢測貼壁細(xì)胞表達(dá)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞標(biāo)志性分子CK8、18蛋白，由此從分子水平上證明成功建立中國人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-2。
【專利說明】一種中國人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-2及其建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞【技術(shù)領(lǐng)域】,具體地,涉及一種中國人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-2及其建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002]1.1舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌的發(fā)病與預(yù)后
[0003]舌癌是最常見的口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌，常發(fā)生在舌前2/3處。舌癌高發(fā)于東南亞，以印度為最高，年發(fā)生率達(dá)到9.4/100萬。近年來研究顯示，世界范圍內(nèi)舌癌總發(fā)生率逐步提高，而且有年輕化的趨勢。由于其發(fā)生部位的組織學(xué)特點以及舌癌的生物學(xué)特性，舌癌使患者舌部運動受限，導(dǎo)致吞咽、說話、進(jìn)食困難。另外，舌癌易轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。
[0004]1.2腫瘤干細(xì)胞研究的進(jìn)展
[0005]1.2.1腫瘤干細(xì)胞理論的提出與發(fā)展 [0006]傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，腫瘤是一群由體細(xì)胞突變，獲得無限增殖能力的細(xì)胞組成，但是小鼠致瘤實驗和體外克隆形成實驗結(jié)果表明，并非所有的腫瘤細(xì)胞都可以增殖。說明腫瘤不是一個均質(zhì)的個體，它具有異質(zhì)性，在組織中存在不同的細(xì)胞亞群。腫瘤組織中可能有一部分具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，這類型細(xì)胞被稱為腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell, CSC)。
[0007]腫瘤干細(xì)胞理論最早在白血病中被證實，1994年Lapidot等通過FACS利用細(xì)胞表面標(biāo)志⑶34+⑶38-和小鼠致瘤模型中分離出人急性粒細(xì)胞白血病(Acutemyeloidleukemia，AML)干細(xì)胞，隨后，Bonnet等發(fā)現(xiàn)只有⑶34+/⑶38-白血病細(xì)胞能在非糖尿病重度聯(lián)合免疫缺陷(nonobese diabetic/severe combined immunodeflcient, N0D/SCID)小鼠體內(nèi)致瘤。2003年，Clarke等第一次將腫瘤干細(xì)胞理論運用到實體瘤中，他們在乳腺癌中證實了這個觀點，⑶44+⑶24-/low細(xì)胞只需要100個便可以致瘤。之后，研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等腦腫瘤、肝癌、肺癌等癌癥中也能分離出腫瘤干細(xì)胞，支持了這個學(xué)說。2006年，AACR(American As sociation for Cancer Research)對腫瘤干細(xì)胞做出了定義:腫瘤中具有自我更新能力，并能產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞。它具有三大特性:1、分化能力:腫瘤干細(xì)胞在腫瘤中擔(dān)任形成和分化各類型腫瘤細(xì)胞的角色，在腫瘤生長過程中，不斷補充所需的各類腫瘤細(xì)胞。2、自我更新能力:生成一部分與自己相同的，具有增殖、擴張和分化潛能的細(xì)胞，從而維持干細(xì)胞的衡定。3、穩(wěn)態(tài)控制能力:調(diào)節(jié)和平衡腫瘤的分化，根據(jù)環(huán)境的刺激對腫瘤做出調(diào)控。
[0008]1.2.2腫瘤干細(xì)胞在口腔癌中的研究及其應(yīng)用
[0009]口腔癌同一癌灶組織內(nèi)包含有不同分化程度、不同階段的癌細(xì)胞。有研究證實，頭頸部鱗狀上皮細(xì)胞癌中存在一群具有自我更新、多向分化潛能和有致瘤能力的癌細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞大多處于休眠狀態(tài)，對放、化療不敏感，是導(dǎo)致手術(shù)后腫瘤易復(fù)發(fā)、耐藥強、難治愈的根源，腫瘤干細(xì)胞理論的提出可以使治療的目標(biāo)從腫瘤整體轉(zhuǎn)移至腫瘤干細(xì)胞，提出針對癌細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞相結(jié)合的綜合性治療策略。腫瘤干細(xì)胞的研究也為腫瘤的研究帶來了一個新的思路。
[0010]1.3細(xì)胞系的建立
[0011]建立腫瘤細(xì)胞系是研究腫瘤致關(guān)重要的環(huán)節(jié)。細(xì)胞系廣泛應(yīng)用于生物學(xué)各個研究領(lǐng)域。它是指直接從生物體的組織中分離培養(yǎng)出細(xì)胞，為后續(xù)研究提供穩(wěn)定細(xì)胞系的一種方法。細(xì)胞系是研究特定細(xì)胞的生長、代謝、調(diào)控特性，細(xì)胞與細(xì)胞間相互作用，細(xì)胞與基質(zhì)的相互作用等有效的研究材料。人類的第一株連續(xù)細(xì)胞系是1951年由George Otto Gey實驗室建立的子宮頸癌細(xì)胞系(Hela)，這株細(xì)胞系的建立是人體細(xì)胞體外培養(yǎng)的里程碑，Hela細(xì)胞推進(jìn)了細(xì)胞、基因、病毒、疫苗等許多研究領(lǐng)域的進(jìn)程，也加深了人們對腫瘤的認(rèn)識:發(fā)現(xiàn)腫瘤的各種特性、研究腫瘤發(fā)生發(fā)展的原因和過程、篩選抗癌藥物等。
[0012]除了研究細(xì)胞本身的特性和癌癥的發(fā)生發(fā)展外，還應(yīng)用于遺傳、免疫、分化、發(fā)育的研究領(lǐng)域。此外，國內(nèi)外不少企業(yè)還可以利用細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)各種因子、蛋白等。細(xì)胞的廣泛應(yīng)用推動了細(xì)胞生物學(xué)的蓬勃發(fā)展。
[0013]原代培養(yǎng)主要有機械法和酶消化法。機械法主要是利用物理剪切，直接將組織剪碎，然后將這些組織小塊貼壁培養(yǎng)的方法。酶消化法是應(yīng)用適當(dāng)?shù)拿噶呀饨M織從而分離出單細(xì)胞，直接懸浮或貼壁培養(yǎng)的方法。用于消化的酶主要有:胰蛋白酶、膠原酶、鏈酶蛋白酶、透明質(zhì)酸酶等。
[0014]鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系的鑒定有以下幾個方面:1、病理切片鑒定:世界衛(wèi)生組織(WH0，2005)根據(jù)細(xì)胞和細(xì)胞核 的多形性、細(xì)胞分裂狀態(tài)、角化程度等將其分為高、中、低三級。高分化鱗癌與正常鱗狀上皮類似、角化明顯、核分裂相少、細(xì)胞和細(xì)胞核多形性不明顯；中分化鱗癌角化較少見，核分裂相多、細(xì)胞多形性明顯；低分化鱗癌有大量的核分裂相、細(xì)胞多形性明顯、角化非常少見；2、細(xì)胞形態(tài):一般為多角形上皮樣，核質(zhì)比高，核仁清晰個數(shù)較多，細(xì)胞排列緊密后呈鋪路石樣；3、細(xì)胞間橋粒連接:相鄰細(xì)胞之間的膜上有一塊圓形區(qū)域，負(fù)責(zé)細(xì)胞間的連接、通訊、抵抗外力拉扯，橋粒多見于上皮，皮膚、口腔、食管等處的復(fù)層扁平上皮細(xì)胞間較多，能被胰蛋白酶、膠原酶及透明質(zhì)酸酶所破壞，電鏡下可見致密斑和中間纖絲，上皮細(xì)胞中多是角蛋白絲；4、分子標(biāo)志:主要是細(xì)胞角蛋白(cytokeratin,CK)，特異地表達(dá)于上皮細(xì)胞，是構(gòu)成上皮細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架的中間纖絲類蛋白質(zhì)，共有20種，CK1-9是偏堿性或中性的II型角蛋白，CK10-20是偏酸性的I型角蛋白，這些角蛋白一般表達(dá)于特定的器官或組織，CK8、CK18、CK19常表達(dá)于單層上皮。鱗狀上皮細(xì)胞癌的上述特征為分析新建立的舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系的生物學(xué)特性提供了理論依據(jù)。
[0015]第一株舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系建立于1981年，是由日本報道的，這一株細(xì)胞系未能使小鼠致瘤。而后1983年在我國上海報道建立了一株舌癌Tca8113,1995在我國香港報道建立了一株舌癌細(xì)胞系PWH-S1?，F(xiàn)存在American type culture colIection(ATCC)中的舌癌細(xì)胞系共有5株，分別為SCC-15、SCC-4、SCC-25、SCC-9、CAL27，均是20世紀(jì)80年代的，之后鮮有報道。
[0016]不同舌癌細(xì)胞的生物學(xué)特性會存在差異，這種差異源于患者本身和接受治療的方法。有些舌癌的分化度低，惡性程度高；有些舌癌的分化度高，惡性程度低。有些患者在術(shù)前接受化療，因此術(shù)后所得到的細(xì)胞有較高的耐藥性。正是這種差異的存在，使我們對舌癌的多樣性和復(fù)雜性有了更多的認(rèn)識，而存在差異的舌癌細(xì)胞系便成為研究舌癌發(fā)生發(fā)展的有效體外模型。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0017]為此，本發(fā)明提供了一種中國人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-2及其建立方法。
[0018]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0019]中國人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-2的建立方法，包括如下具體步驟:
[0020]A)采用組織塊貼壁法進(jìn)行舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞的原代培養(yǎng)；
[0021]B)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到約80%的時候進(jìn)行傳代培養(yǎng)；
[0022]C)將傳代穩(wěn)定的細(xì)胞經(jīng)RT-PCR檢測表明細(xì)胞表達(dá)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞標(biāo)志性分子CK8、18、19 ；
[0023]D)經(jīng)免疫印跡實驗檢測貼壁細(xì)胞表達(dá)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞標(biāo)志性分子CK8U8蛋白，由此從分子水平上證明成功建立中國人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-2 ；獲得的CTSC-2保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國武漢市武漢大學(xué)；保藏號CCTCCNO C2012177，保藏日期為2012年11月14日。
[0024]所述的中國人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-2的建立方法，步驟A的具體方法為:
[0025]I) I型膠原包被培養(yǎng)皿，室溫靜止I小時以上，IXPBS洗皿一次，待用；
[0026]2)準(zhǔn)備培養(yǎng)液，放`于37°C恒溫水浴鍋中溫育10分鐘；
[0027]3)在超凈臺中取出舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌組織，在酒精中消毒不超過10秒，在IXPBS中浸泡一下，除去不需要的部位，放到培養(yǎng)液中；
[0028]4)將組織剪成小碎塊，均勻分種入培養(yǎng)皿中，加入適量培養(yǎng)液，使組織一半浸于培養(yǎng)液中；
[0029]5)置于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0030]6)第二天補充適量培養(yǎng)液至稍稍浸沒組織塊；
[0031]7)視細(xì)胞生長情況進(jìn)行適當(dāng)換液。
[0032]所述的中國人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-2的建立方法，步驟B的具體方法為:
[0033]I)棄培養(yǎng)液，用I XPBS洗一次，加入胰蛋白酶消化；
[0034]2)加入血清終止消化；
[0035]3)吹打細(xì)胞，置于離心管中，加入適量的培養(yǎng)液吹打；
[0036]4)離心 lOOOrpm，5 分鐘；
[0037]5)棄上清，加入適量培養(yǎng)液吹打散；
[0038]6)將細(xì)胞懸液加入新的培養(yǎng)皿中，得到所述中國人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-2。
[0039]所述的中國人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-2在研究治療人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌的藥物中的用途。
[0040]所述的中國人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-2在治療人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌的藥物中的用途。
[0041]所述中國人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-2已經(jīng)在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心)進(jìn)行保藏。
[0042]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明建立了中國人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-2，為研究人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌的特性及其治療藥物提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0043]圖1、細(xì)胞來源患者組織切片H&E染色，光鏡下觀察原代細(xì)胞和CTSC-2第16代傳代細(xì)胞系的細(xì)胞形態(tài)。
[0044]圖2、透射電鏡下觀察CTSC-2細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)圖。
[0045]圖3、瓊脂糖凝膠檢測正常頰粘膜細(xì)胞、CAL27舌癌細(xì)胞系、CTSC-2細(xì)胞的CK8、18、19的mRNA的表達(dá)情況；
[0046]圖4、Western免疫印跡方法檢測CAL27舌癌細(xì)胞系、CTSC-2細(xì)胞的CK8、18和E-cadherin的蛋白表達(dá)情況。
[0047]圖5、CTSC-2細(xì)胞染色體顯示；
[0048]圖6、隨機選擇計算了 100個分散均勻的CTSC-2細(xì)胞染色體后用SSCP統(tǒng)計所得結(jié)
果O
[0049]圖7、CTSC-2細(xì)胞的細(xì)胞生長曲線；
`[0050]圖8、CTSC-2細(xì)胞的克隆形成；
[0051]圖9、CTSC-2CTSC-2細(xì)胞小鼠移植瘤組織切片H&E染色；
[0052]圖10、免疫熒光檢測 CTSC-2 細(xì)胞系對 CD133，Sox2, Nanog, 0ct4, SSEA-1, SSEA-4,TRA-1-60, TRA-1-81 的表達(dá)；
[0053]圖11、無血清懸浮培養(yǎng)富集CTSC-2細(xì)胞系腫瘤干細(xì)胞及其形態(tài)學(xué)觀察；
[0054]圖12、H&E染色CTSC-2球囊細(xì)胞；
[0055]圖13、CTSC-2球囊細(xì)胞和貼壁細(xì)胞對CK8、CK18、CK19的表達(dá)；圖14、CTSC_2貼壁細(xì)胞和球囊細(xì)胞在BME中的克隆形成統(tǒng)計結(jié)果；
[0056]圖15、流式細(xì)胞儀檢測CTSC-2球囊細(xì)胞和貼壁細(xì)胞的干細(xì)胞分子標(biāo)志物表達(dá)的對比；
[0057]圖16、用脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法檢測CTSC-2球囊細(xì)胞的分化能力結(jié)果。
【具體實施方式】
[0058]以下將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明所述中國人舌癌細(xì)胞系CTSC-2的建立方法進(jìn)一步說明。
[0059]一、舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-2的建立以及特性鑒定
[0060]材料說明:
[0061]I臨床標(biāo)本
[0062]本實驗所用的口腔組織均取自中山大學(xué)附屬光華口腔醫(yī)院手術(shù)切除標(biāo)本。
[0063]2細(xì)胞系
[0064]本實驗所用的舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌CAL27細(xì)胞株購自ATCC。
[0065]3主要儀器
[0066]
【權(quán)利要求】
1.中國人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-2的建立方法,其特征在于,包括如下具體步驟: A)采用組織塊貼壁法進(jìn)行舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞的原代培養(yǎng)； B)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到約80%的時候進(jìn)行傳代培養(yǎng)； C)將傳代穩(wěn)定的細(xì)胞經(jīng)RT-PCR檢測表明細(xì)胞表達(dá)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞標(biāo)志性分子 CK8、18、19 ； D)經(jīng)免疫印跡實驗檢測貼壁細(xì)胞表達(dá)人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞標(biāo)志性分子CK8、18蛋白，由此從分子水平上證明成功建立中國人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-2，獲得的CTSC-2保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號CCTCC NO:C2012177。
2.如權(quán)利要求1所述的中國人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-2的建立方法，其特征在于，步驟A的具體方法為: O I型膠原包被培養(yǎng)皿，室溫靜止Ih以上，IXPBS洗皿一次，待用； 2)準(zhǔn)備培養(yǎng)液，放于37°C恒溫水浴鍋中溫育10分鐘； 3)在超凈臺中取出舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌組織，在酒精中消毒不超過10秒，在IXPBS中浸泡一下，除去不需要的部位，放到培養(yǎng)液中； 4)將口腔組織剪成小碎塊，均勻分種入培養(yǎng)皿中，加入適量培養(yǎng)液，使組織一半浸于培養(yǎng)液中； 5)置于370C, 5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 6)第二天補充適量培養(yǎng)液至稍稍浸沒組織塊； 7)視細(xì)胞生長情況進(jìn)行適當(dāng)換液。
3.如權(quán)利要求1所述的中國人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-2的建立方法，其特征在于，步驟B的具體方法為: O棄培養(yǎng)液，用IXPBS洗一次，加入胰蛋白酶消化； 2)加入血清終止消化； 3)吹打細(xì)胞，置于離心管中，加入適量的培養(yǎng)液吹打；
4)離心1000rpm, 5min ； 5)棄上清，加入適量培養(yǎng)液吹打散； 6)將細(xì)胞懸液加入新的培養(yǎng)皿中，得到所述中國人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-2。
4.如權(quán)利要求1所述的中國人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-2在研究治療人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌的藥物中的用途。
5.如權(quán)利要求1所述的中國人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞系CTSC-2在治療人舌部鱗狀上皮細(xì)胞癌的藥物中的用途。
【文檔編號】C12N5/095GK103756966SQ201310374502
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年8月23日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月24日
【發(fā)明者】張雁, 賀姮, 張海霞, 汪華 申請人:東莞中山大學(xué)研究院