棉蚜特異性ss-coi引物、含有該引物的試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及棉蚜特異性SS-COI引物以及含有該引物的檢測試劑盒，根據(jù)棉蚜特有的mtDNA序列，設(shè)計(jì)了一對棉蚜特異性SS-COI引物L(fēng)FAgF和LFAgR（SEQ?ID?No.1和2），該對引物僅對棉蚜具有特異性擴(kuò)增能力，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為300bp，質(zhì)粒濃度檢出限為5.27E+04，DNA濃度檢出限為0.179ng/μL。本發(fā)明采用SS-COI?PCR技術(shù)，提高了檢測準(zhǔn)確性，節(jié)約了檢測時間，適于基層推廣應(yīng)用。
【專利說明】棉蚜特異性SS-COI引物、含有該引物的試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及棉蚜特異性ss-coi引物、含有該引物的試劑盒及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]棉蟲牙(Aphis gossypii Glover),俗稱膩蟲、蜜蟲、油蟲,屬同翅目，蟲牙科,蟲牙屬，是一種世界性害蟲，除西藏外，在全國各地都有發(fā)生，其中以黃河流域和西北內(nèi)陸棉區(qū)發(fā)生危害較重。棉蚜的寄主范圍廣泛，全世界已知寄主植物74科285種，我國已記載113種，其中越冬寄主主要為木槿、花椒、石榴、鼠李等，夏季寄主有棉花及瓜類、茄科、豆科、菊科和十字花科植物等。棉蚜的成蚜、若蚜都主要集中在棉葉背面或嫩頭吸食汁液。苗期受害，棉葉卷縮，棉株生長發(fā)育緩慢，中部葉片出現(xiàn)油葉，葉表蚜蟲排泄的蜜露常誘發(fā)霉菌滋生，嚴(yán)重時導(dǎo)致蕾鈴脫落。
[0003]田間棉蚜有多種捕食性天敵(如瓢蟲、草蛉等)，其保護(hù)和利用是棉蚜防治的重要措施。其中，明確捕食性天敵對棉蚜的捕食作用，對于分析田間食物鏈營養(yǎng)關(guān)系及篩選優(yōu)勢天敵種類等具有指導(dǎo)意義。天敵捕食關(guān)系研究的方法很多，包括直接觀察法、解剖觀察法、田間系統(tǒng)調(diào)查及相關(guān)分析、實(shí)驗(yàn)種群觀察與分析、食痕與標(biāo)記法等。但是，這些方法都存在相應(yīng)的缺陷，如:費(fèi)時、費(fèi)力、花費(fèi)較高、不易成功等。
[0004]Species-Specific-COI PCR檢測技術(shù)是在mtDNACOI技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的特異序列擴(kuò)增區(qū)域標(biāo)記，是利用特異性的引物，根據(jù)預(yù)期DNA條帶的有無來判斷檢測結(jié)果，無需測序和序列比對，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速、簡便且重現(xiàn)性和穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。這為天敵對棉蚜捕食作用的定性與定量分析提供了可能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供棉蚜特異性SS-COI引物、含有該引物的試劑盒及其檢測方法。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的,本發(fā)明根據(jù)棉蚜的線粒體DNA序列，設(shè)計(jì)一對棉蚜特異性SS-COI引物，其包括:
[0007]正向引物L(fēng)FAgF:5’ -CAGATATATCTTTTCCACGAC-3 ’
[0008]反向引物L(fēng)FAgR: 5 ’ -TTAAAATTGATCATGGAAATAG-3 ’。
[0009]本發(fā)明還提供含有引物L(fēng)FAgF和LFAgR的用于檢測棉蚜的試劑盒。所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的至少一種。優(yōu)選地，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。
[0010]本發(fā)明還提供所述引物L(fēng)FAgF和LFAgR，以及含有引物L(fēng)FAgF和LFAgR的試劑盒在檢測棉蚜中的應(yīng)用。`
[0011]本發(fā)明還提供一種棉蚜的特異性快速PCR檢測方法，包括以下步驟:[0012]I)提取樣品DNA;
[0013]2)以步驟I)提取的DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物L(fēng)FAgF和LFAgR進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；
[0014]3)分析PCR產(chǎn)物。
[0015]PCR反應(yīng)體系以20 μ L計(jì)為:
[0016]
模板 DNA1.0pL
2.5mM dNTPs0.4μ?
ΙΟμπιοΙ/L 引物 LFAgF0.4μ?
ΙΟμπιοΙ/L引物L(fēng)FAgR0.4μ?
5υ/μΙ Easy Taq DNA聚合酶0_2μ?
10 x Easy 緩沖液2.0pL
CldH2O補(bǔ)足至 20,uL。
[0017]PCR反應(yīng)條件為:94°C 4分鐘；94°C 30秒，54°C 30秒，72°C 30秒，共45個循環(huán)；72 0C I 秒。
[0018]對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，若出現(xiàn)大小為300bp的DNA擴(kuò)增條帶(SEQ ID N0.3)，則判定樣品為棉蚜。
[0019]本發(fā)明根據(jù)GenBank中公布的棉蚜COI (AB506730)的一段基因序列，設(shè)計(jì)一對特異性引物，該引物特異性強(qiáng)，只對棉蚜具有擴(kuò)增能力，而對棉田中的其它昆蟲無擴(kuò)增產(chǎn)物。采用本發(fā)明提供的方法和引物檢測棉蚜，準(zhǔn)確性高，可擴(kuò)增出300bp大小的片段。采用SS-COI PCR技術(shù)檢測棉蚜，是對RAPD技術(shù)、RFLP技術(shù)和mtDNA COI檢測技術(shù)的補(bǔ)充和改進(jìn)，SS-COI PCR檢測技術(shù)操作簡單、快速、高效，一般可在5個小時內(nèi)完成檢測，且具有較高的靈敏度，質(zhì)粒濃度檢出限為5.27E+04, DNA濃度檢出限為0.179ng/ μ L。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中棉蚜特異性引物L(fēng)FAgF/LFAgR的PCR檢測結(jié)果；其中，M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)2000bp ladder ;1_114為表I中序號所對應(yīng)昆蟲的擴(kuò)增結(jié)果，-為陰性對照。
[0021]圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中棉蚜特異性引物L(fēng)FAgF/LFAgR的DNA濃度梯度檢測結(jié)果；其中，M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)5000bp ladder ； 1-8為模板DNA濃度179ng/ μ L依次10倍稀釋濃度梯度；-為陰性對照。
[0022]圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中棉蚜特異性引物L(fēng)FAgF/LFAgR的質(zhì)粒濃度梯度檢測結(jié)果；其中，M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)2000bp ladder ;1_10為模板質(zhì)粒濃度5.27E+10依次10倍稀釋濃度梯度；-為陰性對照。
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(Sambrook J & RussellDff, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001),或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0024]實(shí)施例1引物L(fēng)FAgF/LFAgR對棉蚜的擴(kuò)增效果
[0025](I)棉蚜基因組的制備
[0026]將單頭姆蟲放入1.5mL離心管中將其磨碎,用TIANamp Genomic DNA Kit血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)(天根生物有限公司，北京)提取單頭蚜蟲基因組。將DNA溶液儲于_20°C備用，進(jìn)行PCR擴(kuò)增時吸取I μ L溶液作為DNA模板。
[0027](2)合成檢測棉蚜的特異性SS-COI引物
[0028]特異性SS-COI引物序列如下:
[0029]LFAgF:5’-CAGATATATCTTTTCCACGAC-3’ (SEQ ID N0.1)
[0030]LFAgR:5’-TTAAAATTGATCATGGAAATAG-3’ (SEQ ID N0.2)
[0031](3) PCR 擴(kuò)增
[0032]反應(yīng)體系為20 μ L，包括:10 X EasyTaq 緩沖液 2.0 μ L、dNTP (2.5mM) 0.4 μ L、EasyTaq DNA 聚合酶(5U/μ L) 0.2 μ L、正、反向引物(lOymol/L)各 0.4yL、模板DNA1.0μ L、ddH2015.6μ L。
[0033]PCR擴(kuò)增程序:94°C預(yù)變性4分鐘；94°C 30秒，54°C 30秒，72°C 30秒，共45個循環(huán)；最后72°C延伸I秒。
[0034](4) PCR產(chǎn)物鑒定
[0035]取6 μ L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后，于凝膠成像系統(tǒng)中，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定。
[0036](5)結(jié)果
[0037]利用引物L(fēng)FAgF/LFAgR，以棉蚜DNA為模板，以棉蚜同域的59種其他昆蟲(見表I)為對照進(jìn)行Species-Specific-COI PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示，3、4泳道對應(yīng)的棉蚜擴(kuò)增出了 300bp的目的條帶,說明根據(jù)棉姆線粒體DNA設(shè)計(jì)的Species-Specific-COI PCR擴(kuò)增引物的特異性強(qiáng)?；厥丈鲜?00bp的目的條帶，進(jìn)行測序，其序列如SEQ ID N0.3所示。
[0038]表I引物特異性檢測中所涉及的昆蟲種類
【權(quán)利要求】
1.棉蚜特異性SS-COI引物，其特征在于，其包括: 正向引物 LFAgF:5’ -CAGATATATCTTTTCCACGAC-3’ 反向引物 LFAgR:5’ -TTAAAATTGATCATGGAAATAG-3’。
2.含有權(quán)利要求1所述引物的用于檢測棉蚜的試劑盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的至少一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。
5.權(quán)利要求1所述引物或權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述試劑盒在檢測棉蚜中的應(yīng)用。
6.棉蚜的特異性PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)提取樣品DNA； 2)以步驟I)提取的DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物L(fēng)FAgF和LFAgR進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)； 3)分析PCR產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)體系以20μ L計(jì)為:
模板 DNA1.C-L
2.5mM dNTPs0.4μ?
ΙΟμπιοΙ/L 引物 LFAgF0.4μΙ.ΙΟμπιοΙ/L引物L(fēng)FAgR0.4pL
5U/pL Easy Taq DNA聚合酶0.2μ?
10 x Easy 緩沖液2.0μ?ddH20補(bǔ)足至 20μΕ。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)條件為:94°C4分鐘；94°C30秒，54°C 30秒，72 °C 30秒，共45個循環(huán)；72°C I秒。
【文檔編號】C12N15/11GK103436618SQ201310373835
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月23日
【發(fā)明者】王倩, 楊帆, 陸宴輝, 楊益眾 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所