伏立諾他的用途及促進海綿共生土曲霉合成(+)-Terrein的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種伏立諾他的用途及促進海綿共生土曲霉合成(+)-Terrein的方法；所述伏立諾他能夠促進海綿共生土曲霉合成(+)-Terrein；本發(fā)明還涉及前述伏立諾他促進海綿共生土曲霉合成(+)-Terrein的方法，包括如下步驟：在海綿共生土曲霉發(fā)酵的過程中添加伏立諾他。本發(fā)明在搖瓶水平上，于第4天添加終濃度為900μM的伏立諾他，24天后，(+)-Terrein的產(chǎn)量達到5.58g/L，較未添加時的產(chǎn)量為4.31g/L，提高了49.8%，(+)-Terrein的產(chǎn)量有較為顯著的提高；本發(fā)明方法簡單，容易實現(xiàn)，效率高，效果顯著，有較好的應(yīng)用前景。
【專利說明】伏立諾他的用途及促進海綿共生土曲霉合成(+)-Terrein 的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種提高真菌代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法，具體是伏立諾他的用途及促進海綿共生土曲霉合成(+)-Terrein的方法。
【背景技術(shù)】
[0002](+)-Terrein (土曲霉酮)是由6_羥基蜂蜜曲菌素經(jīng)過后修飾而成的環(huán)戊烯酮類化合物，1935年首次從土曲霉中分離得到。(+) -Terrein有著良好的生物活性，如抗細菌和真菌、抑制雜草生長、抑制腫瘤細胞血管新生素的分泌、促進成骨細胞與鈦支架融合、抑制黑色素合成、抑制皮膚角質(zhì)增生、抑制牙髓細胞炎癥反應(yīng)還有乳腺癌細胞毒性等等。其在農(nóng)業(yè)、美容、醫(yī)藥等方面廣泛的應(yīng)用前景使得我們有必要提高其單位產(chǎn)量為后續(xù)更深入的研究提供原料基礎(chǔ)。
[0003]目前報道中，通過傳統(tǒng)的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)化,在Aspergillus terreus PF26中 (+)-Terrein 的產(chǎn)量倉泛達至Ij 3.71 g/L (Ying Yin, et al.Medium optimization for the high yield production of single(+)-Terrein by Aspergillus terreus strain PF26derived from marine sponge Phakellia fusca2012, 47 (5):887-891);在優(yōu)化后的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加聚酮合成途徑的促進劑檸檬酸鈉使得搖瓶上(+)-Terrein的產(chǎn)量倉泛提高至1J 5.38g/L (Yin Y，et al.Enhanced production of (+) -Terrein in fed-batch cultivation of Aspergillus terreus strain PF26with sodium citrate.World Journal of Microbiology and Biotechnology2013; 29 (3): 441-446.),但有必要進一步提高其產(chǎn)量。表觀遺傳修飾劑能夠調(diào)芐基因的轉(zhuǎn)錄水平從而影響代謝，本發(fā)明從促進土曲霉基因的轉(zhuǎn)錄水平著手，添加表觀遺傳修飾劑至土曲霉的發(fā)酵液中以期提高(+)-Terrein產(chǎn)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種伏立諾他的用途及促進海綿共生土曲霉合成(+)-Terrein的方法。
[0005]本發(fā)明的目的是通過 以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0006]第一方面，本發(fā)明涉及到一種伏立諾他作為促進劑的用途，所述伏立諾他能夠促進海綿共生土曲霉合成(+)_Terrein。
[0007]第二方面,本發(fā)明還涉及前述伏立諾他促進海綿共生土曲霉合成(+)_Terrein的方法，包括如下步驟:在海綿共生土曲霉發(fā)酵的過程中添加伏立諾他。
[0008]優(yōu)選地，包括如下步驟:發(fā)酵海綿共生土曲霉，向發(fā)酵液中添加伏立諾他，即可促進(+)-Terrein的合成。
[0009]優(yōu)選地，所述海綿共生土曲霉為土曲霉(Aspergillus terreus) PF26CGMCC N0.5208。
[0010]優(yōu)選地，所述發(fā)酵使用的培養(yǎng)基的制備方法包括如下步驟:每IL純水對應(yīng)取如下質(zhì)量的各組分:28.41g葡萄糖、23.18g麥芽糖、20.0Og甘露醇、8.52g麥芽提取物、10.0Og 谷氨酸鈉、10.0Og氯化銨、3.90g硫酸鈉，之后將所述組分溶于1L純水中，即得。[0011]優(yōu)選地，所述發(fā)酵采用搖瓶發(fā)酵，在發(fā)酵的第4天，添加伏立諾他。[0012]優(yōu)選地，所述添加伏立諾他具體為，發(fā)酵液中伏立諾他的終濃度為900 μm。[0013]優(yōu)選地，所述添加伏立諾他具體為:稱取適量的伏立諾他，溶解于DMSO中，使得伏立諾他的濃度為0.18Μ，之后采用無菌濾膜過濾，得到伏立諾他母液，之后添加于發(fā)酵液中。[0014]優(yōu)選地，所述無菌濾膜的孔徑為0.22 μm。[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果為:[0016](I)本發(fā)明在搖瓶水平上，于第4天添加終濃度為9 O O μm的伏立諾他，2 4天后，(+)-Terrein的產(chǎn)量達到5.58g/L，較未添加時的產(chǎn)量為4.31g/L，提高了 49.8%， (+)-Terrein的產(chǎn)量有較為顯著的提高。[0017](2)本發(fā)明方法簡單，容易實現(xiàn)，效率高，效果顯著，有較好的應(yīng)用前景?！緦＠綀D】

【附圖說明】[0018]通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發(fā)明的其它特征、 目的和優(yōu)點將會變得更明顯:[0019]圖1不同的表觀遺傳修飾劑對土曲霉產(chǎn)(+)_Terrein的影響圖；[0020]圖2不同濃度伏立諾他時對土曲霉產(chǎn)(+)-Terrein的影響圖；[0021]圖3為不同時間添加900 μm的伏立諾他時對土曲霉產(chǎn)(+)_Terrein的影響圖?！揪唧w實施方式】[0022]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。[0023]以下實施例中涉及(+)-Terrein的具體為土曲霉Aspergillus terreus菌株 PF26,分離自中國南海永興島Phakellia fusca海綿,其保藏信息為:該菌株已于2011年 8月31日遞交CGMCC中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為 CGMCC N0.5208 ;地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編: 100101。[0024]實施例1、確定添加的表觀修飾劑的種類[0025]選擇阿扎胞苷和伏立諾他作為候選促進劑。[0026]培養(yǎng)基的配制:28.41g葡萄糖、23.18g麥芽糖、20.0Og甘露醇、8.52g麥芽提取物、10.0Og谷氨酸鈉、10.0Og氯化銨、3.90g硫酸鈉溶于IL純水。[0027]阿扎胞苷母液的配制:準確稱量阿扎胞苷并將其溶解于DMSO中，濃度為0.10M，采用0.22 μm的無菌濾膜對其過濾得無菌阿扎胞苷母液。[0028]伏立諾他母液的配制:準確稱量伏立諾他并將其溶解于DMSO中，伏立諾他的濃度為0.18M，采用0.22 μm的無菌濾膜對其過濾得無菌伏立諾他母液。[0029]以上述培養(yǎng)基對土曲霉進行發(fā)酵，菌種接種量為4 X IO6個孢子/mL，250mL三角瓶中裝液量為100mL，28°C、180rpm的恒溫搖床中培養(yǎng)，pH自然，于培養(yǎng)的第2天向發(fā)酵液中分別添加終濃度為500 UM (500 u L母液)的阿扎胞苷和伏立諾他。
[0030]采用HPLC法測定(+)-Terrein含量，圖1所示為海綿共生土曲霉在添加不同種類的表觀修飾劑后(+)-Terrein的產(chǎn)量，由圖1可知:對照組、添加阿扎胞苷組、添加伏立諾他組的(+)-Terrein含量分別為:4.30g/L、3.00g/L、4.80g/L。添加伏立諾他時，促進效果較為明顯，由此，以伏立諾他作為較優(yōu)促進劑添加至發(fā)酵液中。
[0031]實施例2、單因素實驗確定伏立諾他的最佳添加濃度和添加時間
[0032]上述實施例1確定伏立諾他作為較優(yōu)促進劑，在此基礎(chǔ)上研究其添加濃度和添加時間對(+)-Terrein產(chǎn)量的影響。
[0033]研究伏立諾他的最佳添加濃度，設(shè)置4個濃度梯度，分別為500 ii M，900 ii M， 1300 u M，1700 u M0對土曲霉進行發(fā)酵，于培養(yǎng)的第2天分別添加終濃度為500 u M，900 u M， 1300 PM，1700 ii M的伏立諾他，第24天測量(+)-Terrein含量及菌體干重。結(jié)果如圖2所示，第2天添加900 u M的伏立諾他時，(+) -Terrein產(chǎn)量為5.21g/L，較對照組的4.31g/L， 提高了 21%，由此以900 u M作為伏立諾他的最佳添加濃度。
[0034]在此基礎(chǔ)上，研究伏立諾他的最佳添加時間，對土曲霉進行發(fā)酵，于培養(yǎng)的第0，2， 4,7,12天分別添加終濃度為900 u M的伏立諾他，于第24天測量(+) -Terrein含量及菌體干重。結(jié)果如圖3所示，于第4天添加900 ii M伏立諾他時，(+)-Terrein產(chǎn)量為5.58g/L， 較對照組的4.31g/L，提高了 39.8%。
[0035]由上，伏立諾他的最佳添加策略為:發(fā)酵第4天，添加900 u M的伏立諾他。采用這種方法，(+)-Terrein產(chǎn)量較對照提高了 39.8%。
[0036]以上對本發(fā)明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并 不影響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。
【權(quán)利要求】
1.一種伏立諾他作為促進劑的用途，其特征在于，所述伏立諾他能夠促進海綿共生土曲霉合成(+)-Terrein。
2.一種促進海綿共生土曲霉合成(+)-Terrein的方法，其特征在于，包括如下步驟:在海綿共生土曲霉發(fā)酵的過程中添加伏立諾他。
3.如權(quán)利要求2所述的促進海綿共生土曲霉合成(+)-Terrein的方法,其特征在于,包括如下步驟:發(fā)酵海綿共生土曲霉，向發(fā)酵液中添加伏立諾他，即可促進(+)-Terrein的合成。
4.如權(quán)利要求3所述的促進海綿共生土曲霉合成(+)-Terrein的方法,其特征在于,所述海綿共生土曲霉為土曲霉(Aspergillus terreus) PF26CGMCC N0.5208。
5.如權(quán)利要求3所述的促進海綿共生土曲霉合成(+)-Terrein的方法,其特征在于， 所述發(fā)酵使用的培養(yǎng)基的制備方法包括如下步驟:每IL純水對應(yīng)取如下質(zhì)量的各組分: 28.41g葡萄糖、23.18g麥芽糖、20.0Og甘露醇、8.52g麥芽提取物、10.0Og谷氨酸鈉、10.0Og 氯化銨、3.90g硫酸鈉，之后將所述組分溶于IL純水中，即得。
6.如權(quán)利要求3所述的促進海綿共生土曲霉合成(+)-Terrein的方法，其特征在于，所述發(fā)酵采用搖瓶發(fā)酵，在發(fā)酵的第4天，添加伏立諾他。
7.如權(quán)利要求3所述的促進海綿共生土曲霉合成(+)-Terrein的方法，其特征在于，所述添加伏立諾他具體為，發(fā)酵液中伏立諾他的終濃度為900 μ Mo
8.如權(quán)利要求3所述的促進海綿共生土曲霉合成(+)-Terrein的方法,其特征在于， 所述添加伏立諾他具體為:稱取適量的伏立諾他，溶解于DMSO中，使得伏立諾他的濃度為.0.18Μ，之后采用無菌濾膜過濾，得到伏立諾他母液，之后添加于發(fā)酵液中。
9.如權(quán)利要求8所述的促進海綿共生土曲霉合成(+)-Terrein的方法,其特征在于,所述無菌濾膜的孔徑為0.22 μ m。
【文檔編號】C12P7/26GK103497975SQ201310275382
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月2日
【發(fā)明者】肖嵐, 李志勇, 張風(fēng)麗 申請人:上海交通大學(xué)