專利名稱：一株耐冷凍面包酵母菌株及其基因無痕敲除方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體是涉及一株耐冷凍面包酵母菌株及其基因無痕敲除方法。
背景技術(shù)：
面包酵母(Baker’sYeast,學(xué)名 Saccharomyces cerevisiae)是一種重要的工業(yè)微生物，含有豐富的營養(yǎng)成分，是饅頭、面包、餅干等面食生產(chǎn)過程中最重要的微生物發(fā)酵齊U、生物疏松劑和生物營養(yǎng)劑。隨著冷凍面團生產(chǎn)技術(shù)的迅速發(fā)展，耐冷凍面包酵母及其耐冷凍機制得到了廣泛研究，在歐美、日本等發(fā)達國家，冷凍面團技術(shù)也已廣泛應(yīng)用于焙烤工業(yè)。普通面包酵母的耐冷凍性差是限制冷凍面團技術(shù)發(fā)展的主要因素。海藻糖是酵母細胞內(nèi)一種自身保護劑，可以保護細胞在冷凍過程免受凍傷。增加酵母胞內(nèi)海藻糖含量可以提高面包酵母的耐冷凍性能。但是隨著公眾對食品安全的關(guān)注，通過傳統(tǒng)遺傳學(xué)方法構(gòu)建的菌株，由于殘留非自身的外源基因，其生產(chǎn)應(yīng)用受到限制。因此有必要對酵母進行無痕基因敲除，以保證不會留下任何外源DNA。酵母菌的無痕修飾起初是為了除去篩選標記，以便在單個菌株中進行多基因操作。去除篩選標記主要有兩種方法，一種是在靶基因敲除后，利用敲除元件中正向重復(fù)序列(hisG)之間的同源重組。另一種則是利用重組酶介導(dǎo)的敲除系統(tǒng),例如Cre/Loxp系統(tǒng)等。利用第一種方法，首先需要構(gòu)建帶有“hisG-URA3-hisG”的質(zhì)粒，然后使用長引物直接PCR得到敲除元件，通過轉(zhuǎn)化敲除目的基因后，再反向篩選，利用正向重復(fù)序列(hisG)之間的同源重組去除篩選標記。此法中長引物包含兩部分序列，一部分是與質(zhì)粒退火的序列，另一部分是與靶基因兩側(cè)的側(cè)翼序列相同的基因序列。通過這種方法得到的轉(zhuǎn)化子，其基因組的靶位置上，會殘留一個重復(fù)序列。利用第二種方法，通過轉(zhuǎn)化篩選標記兩側(cè)帶有重組酶位點的敲除元件到酵母中，一步整合實現(xiàn)目的基因的敲除，然后轉(zhuǎn)化另一個編碼重組酶的質(zhì)粒，以實現(xiàn)抗性標記的去除。在工業(yè)酵母的改造中，這個系統(tǒng)具有很高的效率，但是其仍會留下外源序列(單一 1xp位點)，并且在進行多基因敲除時，留下的這些位點增大了發(fā)生染色體重排的可能性。2006年，日本學(xué)者使用帶有靶基因一側(cè)40bp重復(fù)序列的長引物，通過融合PCR構(gòu)建的無痕敲除元件，可以方便的實現(xiàn)重組，并且不會留下外源基因。但是這種方法中，40bp的重復(fù)序列重組效率較低?？傊?，本領(lǐng)域仍需要一種高效的無痕基因敲除方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供了一株耐冷凍面包酵母菌株及其基因無痕敲除方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技 術(shù)方案:本發(fā)明提供的面包酵母菌株是具有快速發(fā)酵性能的耐冷凍面包酵母菌株，具體為面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY_14aΔU。該菌已于2013年3月28保藏于中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱06110:，地址為:中國北京市朝陽區(qū)大屯路甲3號)，保藏編號為CGMCC N0.7379。所述面包酵母菌株在其他發(fā)酵性能不受影響的情況下，發(fā)酵后胞內(nèi)海藻糖含量占細胞干重11.7%，較親本菌株提高了 134%，細胞在液體面團中冷凍21天后，存活率達到78%，是親本菌株的2.6倍。所述面包酵母菌株具體可以通過對出發(fā)菌株面包酵母(Saccharomycescerevisiae) CICC31616 (中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心,公眾可以通過該保藏管理中心獲得出發(fā)菌株CICC31616)的中性海藻糖酶編碼基因NTHl的全部序列進行無痕敲除來實現(xiàn)。上述基因無痕敲除可以用以下方法實現(xiàn)。各步驟所涉及具體操作方法參考現(xiàn)有文獻報道，如Joseph Sambrook等，《分子克隆實驗指南》第二版,科學(xué)出版社，1995。用PCR方法獲得突變ura3片段，將其通過醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到面包酵母出發(fā)菌株，通過同源重組以實現(xiàn)出發(fā)菌株的URA3基因突變。用PCR方法分別擴增敲除靶基因NTHl的上游和下游、長度為0.5 2.0kb的同源序列片段，然后通過融合PCR，將上、下游序列融合成無縫片段。將該片段克隆至酵母整合質(zhì)粒YIplac211上，獲得能夠進行整合敲除的質(zhì)粒。在整合敲除質(zhì)粒的上游同源臂或者下游同源臂中，選擇合適的單一酶切位點，將質(zhì)粒酶切線性化。通過醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化法，將線性化的整合敲除質(zhì)粒導(dǎo)入面包酵母中，用不含尿嘧啶(uracil)的酵母合成培養(yǎng)基篩選發(fā)生第一步整合重組的酵母突變株。將經(jīng)過鑒定的發(fā)生第一步整合重組的酵母突變株，經(jīng)含有5-氟乳清酸(5-F0A)合成培養(yǎng)基平板反向篩選獲得發(fā)生第二步整合重組的酵母突變株。用PCR方法獲得出發(fā)菌株正常的URA3基因片段，將其導(dǎo)入到發(fā)生了第二步整合重組的酵母突變株中，以回復(fù)突變的ura3標記基因。本發(fā)明所述面包酵母菌株可應(yīng)用于面包生產(chǎn)中。本發(fā)明同時提供了一種專門用于鑒定所述耐冷凍面包酵母菌株的基因序列，該基因序列是用NTHl-D-F和NTHl-U-R引物對以所述耐冷凍面包酵母菌株基因組為模板擴增的片段，其序列如表I所示。有益效果:本發(fā)明針對面包酵母傳統(tǒng)基因敲除中篩選標記殘留，不便進行多基因敲除研究，以及殘留外源基因的問題，提供了一株面包酵母菌株及一種高效的無痕基因敲除方法。本發(fā)明不僅可用于研究酵母基因的功能和代謝機制，而且由于所獲得的突變株不殘留任何外源基因，可以安全的用于工業(yè)生產(chǎn)。


圖1為帶有突變ura3基因面包酵母菌株BY-HaA U的表型驗證圖。圖2為整合敲除質(zhì)粒YIplac211_UD的構(gòu)建流程示意圖。圖3為整合敲除質(zhì)粒YIplac211_UD的電泳驗證圖。圖4為整合敲除質(zhì)粒YIplac211_UD與酵母基因組的兩步整合重組流程示意圖。圖5為發(fā)生第一步整合重組的菌株BY-14aA U-U的電泳驗證圖。圖6為發(fā)生第二步整合重組的菌株BY-HaAU-Λ N的電泳驗證圖。

圖7為回復(fù)ura3突變的整合重組菌株BY_14a Λ N靶基因位置的部分測序圖。
具體實施例方式下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實質(zhì)和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護范圍。實施例1:無痕敲除中性海藻糖酶基因NTHl面包酵母的構(gòu)建本實例所用的出發(fā)菌株CICC31616，本實例中改造后的面包酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)于2013年3月28日保藏于中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC N0.7379。所述質(zhì)粒Hplac211的來源見R.D.Gietz,and A.Sugino，New yeast-Escherichia coli shuttle vectors constructed with invitro mutagenized yeast genes lacking six-base pair restriction sites.Gene74(1988)527-34。所述大腸桿菌DH5a購自Takara公司。所述YI3D培養(yǎng)基為通用的完全培養(yǎng)基，所述酵母合成培養(yǎng)基(SD)成分為2%葡萄糖、0.67% ΥΝΒ、不含尿嘧啶的氨基酸混合物溶液，固體培養(yǎng)基含2%進口瓊脂粉。根據(jù)Genebank中的酵母基因組數(shù)據(jù)和整合質(zhì)粒序列，設(shè)計了下述實施例中各引物。表1.本實施例中所用到的引物
權(quán)利要求
1.一株耐冷凍面包酵母菌株，具體為面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-14AAU，保藏編號為 CGMCC N0.7379。
2.如權(quán)利要求1所述的一株耐冷凍面包酵母菌株，其特征在于，所述面包酵母菌株發(fā)酵后胞內(nèi)海藻糖含量占細胞干重11.7% ;細胞在液體面團中冷凍21天后，存活率達到78%，是親本菌株的2.6倍。
3.如權(quán)利要求1所述的一株耐冷凍面包酵母菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法是通過融合PCR技術(shù)和整合型載體質(zhì)粒YIplac211介導(dǎo)的兩步基因整合法，將編碼中性海藻糖酶的基因NTHl無痕敲除來實現(xiàn)的。
4.如權(quán)利要求3所述的一株耐冷凍面包酵母菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，具體步驟包括:用PCR方法獲得突變ura3片段，將其通過醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到面包酵母出發(fā)菌株，通過同源重組實現(xiàn)出發(fā)菌株的URA3基因突變；用PCR方法分別擴增敲除靶基因NTHl上游和下游、長度為0.5 2.0kb的同源序列片段，然后通過融合PCR，將上、下游序列融合成無縫片段；將該片段克隆至酵母整合質(zhì)粒YIplac211上，獲得能夠進行整合敲除的質(zhì)粒；在整合敲除質(zhì)粒的上游同源臂或者下游同源臂中，選擇合適的單一酶切位點，將質(zhì)粒酶切線性化；通過醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化法，將線性化的整合敲除質(zhì)粒導(dǎo)入面包酵母中，用不含尿嘧啶的酵母合成培養(yǎng)基篩選發(fā)生第一步整合重組的酵母突變株；將經(jīng)過鑒定的發(fā)生第一步整合重組的酵母突變株，經(jīng)含有5-氟乳清酸合成培養(yǎng)基平板反向篩選獲得發(fā)生第二步整合重組的酵母突變株；用PCR方法獲得出發(fā)菌株正常的URA3基因片段，將其導(dǎo)入到發(fā)生了二步整合重組的酵母突變株中，以回復(fù)突變的ura3標記基因。
5.如權(quán)利要求1或2所述的一株耐冷凍面包酵母菌株在面包生產(chǎn)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公布了一株耐冷凍面包酵母菌株及其構(gòu)建方法，具體是通過無痕敲除基因NTH1構(gòu)建的耐冷凍面包酵母BY-14AΔU，保藏編號CGMCC No.7379。無痕基因敲除方法構(gòu)建耐冷凍面包酵母，是通過融合PCR和酵母整合質(zhì)粒YIplac211，敲除編碼中性海藻糖酶基因NTH1來實現(xiàn)的。本發(fā)明實現(xiàn)了將面包酵母NTH1基因快速、高效地?zé)o痕敲除，菌株BY-14AΔU在其他發(fā)酵性能不受影響的情況下，胞內(nèi)海藻糖含量較親本菌株提高了134％；細胞在液體面團中冷凍21天后，存活率達到78％，是親本菌株的2.6倍。本發(fā)明構(gòu)建的酵母菌中基因組上不殘留任何外源基因，因此可以安全的用于工業(yè)生產(chǎn)。
文檔編號C12N1/18GK103232947SQ201310127538
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月12日
發(fā)明者肖冬光, 王光路, 董建, 張翠英 申請人:天津科技大學(xué)