使用端點(diǎn)pcr確定蕓苔中fad-2基因的接合性的方法
【專利摘要】本公開(kāi)內(nèi)容部分涉及用于蕓苔中的FAD-2基因的檢測(cè)和高通量接合性分析的端點(diǎn)PCR測(cè)定法。本公開(kāi)內(nèi)容進(jìn)一步部分涉及野生型DNA作為參照用于確定接合性的用途。這些和其它相關(guān)步驟可用于獨(dú)特地鑒定包含提述基因的蕓苔系的接合性和品種。本公開(kāi)內(nèi)容還提供了例如用于從蕓苔植物或種子的樣品確定接合性的相關(guān)試劑盒。
【專利說(shuō)明】使用端點(diǎn)PCR確定蕓苔中FAD2基因的接合性的方法
[0001]對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求2011年10月21日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)N0.61/550，165的優(yōu)先權(quán)，其在此通過(guò)提述以其整體并入本文。
[0003]發(fā)明背景
[0004]蕓苔(Brassica)屬包括蕓苔(canola)，即世界上最重要的含油種子作物之一，且溫帶地理中種植的一種重要含油種子作物。蕓苔在傳統(tǒng)上表征為歐洲油菜(Brassica napus L.)( 一種由于完青(Brassica rapa)和甘藍(lán)(Brassica oleracea)的種間雜交的結(jié)果衍生的物種)，其中已經(jīng)通過(guò)常規(guī)育種消除或顯著降低芥酸和芥子油苷(glucosinolates)。大部分蕓苔油為生產(chǎn)用于人消費(fèi)的植物油形式。在工業(yè)應(yīng)用中使用蕓苔油也有一個(gè)不斷增長(zhǎng)的市場(chǎng)。
[0005]蕓苔屬由各擁有標(biāo)記為A基因組、B基因組或C基因組的獨(dú)特基因組的三種二倍體物種構(gòu)成。蕪青植物擁有二倍體A基因組。黑芥(Brassica nigra)植物擁有二倍體B基因組。甘藍(lán)植物擁有二倍體C基因組。這些物種的雜種可以經(jīng)由兩個(gè)二倍體物種之間的雜交生成。蕓苔是一種雙二倍體物種，認(rèn)為其產(chǎn)生自具有二倍體C基因組的甘藍(lán)和具有二倍體A基因組的蕪青的雜交。細(xì)胞遺傳研究揭示的AA和CC基因組顯示關(guān)聯(lián)性程度，其彼此部分同源，并且認(rèn)為源自共同的祖先基因組(Prakash和Hinata，1980)。雖然在技術(shù)上分類為二倍體，這兩種祖先物種的基因組含有高百分比的彼此重疊的(duplicative)區(qū)域(Song等，1991)。遺傳分析揭示了蕪青的AA基因組將10條染色體貢獻(xiàn)給歐洲油菜，而甘藍(lán)以母本供體貢獻(xiàn)來(lái)自 其CC基因組的9條染色體(Song等，1992)。
[0006]源自蕓苔種子的特定品種的可食用油和工業(yè)油的質(zhì)量由其組成性脂肪酸確定，因?yàn)橹舅岵伙柡偷念愋秃土繉?duì)飲食和工業(yè)應(yīng)用兩者都有牽連。常規(guī)的蕓苔油含有約60%油酸(C18:l)、20%亞油酸(C18:2)和10%亞麻酸(18:3)。常規(guī)蕓苔典型的多不飽和亞麻酸的水平是不合意的，因?yàn)橛腿菀妆谎趸?，氧化速率受到幾個(gè)因素影響，包括氧氣的存在、暴露于光和熱、和天然的或添加的抗氧化劑和促氧化劑在油中的存在。氧化引起由于重復(fù)油炸(誘導(dǎo)的氧化)或貯存延長(zhǎng)的時(shí)段(自身氧化)所致的臭氣和酸敗。氧化還可以改變蕓苔油的潤(rùn)滑和粘性性質(zhì)。
[0007]相對(duì)于常規(guī)蕓苔油展現(xiàn)出降低的多不飽和脂肪酸水平和升高的單不飽和油酸水平的蕓苔油譜(profile)與較高的氧化穩(wěn)定性有關(guān)。個(gè)別脂肪酸對(duì)氧化的易感性依賴于其不飽和程度。如此，亞麻酸(其擁有三個(gè)碳-碳雙鍵)的氧化速率是油酸(其僅具有I個(gè)碳-碳雙鍵)的氧化速率的25倍，且是亞油酸(其具有2個(gè)碳-碳雙鍵)的氧化速率的2倍。亞油酸和亞麻酸對(duì)風(fēng)味和氣味也具有最多的影響，因?yàn)樗鼈內(nèi)菀仔纬蓺溥^(guò)氧化物。高油酸油(.Gtoreq.70%油酸)在貯存、油炸和精煉過(guò)程中不太易于氧化，并且可以加熱至較高的溫度而不冒煙，使得其更適合作為烹調(diào)油。
[0008]蕓苔油的質(zhì)量由其組成性脂肪酸，如油酸(C18:l)、亞油酸(C18:2)和亞麻酸(C18:3)確定。大多數(shù)蕓苔栽培變種通常產(chǎn)生具有約55-65%油酸和8-12%亞麻酸的油。高濃度的亞麻酸導(dǎo)致油不穩(wěn)定性和非正常型(off-type)風(fēng)味，而高水平的油酸提高油的氧化穩(wěn)定性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。因此，開(kāi)發(fā)具有增加的油酸和減少的亞麻酸的蕓苔栽培變種對(duì)于蕓苔油質(zhì)量是高度期望的。
[0009]鑒定兩個(gè)基因座，并且其基因組位置從擁有增加的油酸和減少的亞麻酸數(shù)量的蕓苔栽培變種定位。一個(gè)基因座對(duì)增加的油酸和減少的亞麻酸的生成具有主要影響，而第二個(gè)基因座具有次要影響。高油酸(C18:l)的主要基因座確定為脂肪酸去飽和酶-2 (fad-2)基因，并且其位于連鎖群N5上。第二個(gè)次要基因座位于連鎖群NI上。亞麻酸(C18:3)的一個(gè)主要數(shù)量性狀基因座(QTL)是基因組C的脂肪酸去飽和酶-3基因(fad-3c)，并且其位于連鎖群N14上。第二個(gè)主要QTL駐留于N4連鎖群上，并且是基因組A的脂肪酸去飽和酶-3基因(fad_3a)。從甲磺酸乙酯(EMS)誘導(dǎo)的突變體和野生型蕓苔栽培變種兩者擴(kuò)增fad-2和fad_3c基因的基因組序列并且測(cè)序。fad_2和fad_3c基因的突變體和野生型等位基因序列的比較揭示來(lái)自EMS突變植物的基因中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)?；谕蛔凅w和野生型等位基因之間的序列差異，開(kāi)發(fā)出兩種SNP標(biāo)志物，其對(duì)應(yīng)于fad-2和fad_3c基因突變。(Hu等，2006)。
[0010]目前用于生成F1雜種蕓苔種子的方法就成本和種子純度而言具有局限。一般地，這些方法需要穩(wěn)定的、同胞不相容的(sib-1ncompatible)且自身不相容的(self-1ncompatible)、幾乎純合的親本育種系，該親本育種系僅在重復(fù)自交以生成近交系后可得到。此外，開(kāi)發(fā)和維持親本系的育種通過(guò)勞動(dòng)密集型技術(shù)，如芽傳粉實(shí)現(xiàn)，因?yàn)榛谧陨聿幌嗳菪誀畹氖|苔雜種種子生成系統(tǒng)必須利用強(qiáng)烈自身不相容性植物。育種過(guò)程期間的環(huán)境條件，如溫度和濕度，通常影 響植物脂質(zhì)代謝，如此還影響脂肪酸的含量水平(Harwood, 1999)。因此,環(huán)境可變性使得植物的表型選擇不太可靠。Deng和Scarth(1998)發(fā)現(xiàn)開(kāi)花后溫度的升高顯著降低C18:3的水平并且提高C18:1的水平。在其它研究中報(bào)告類似的結(jié)果(Yermanos 和 Goodin, 1965 ；Canvin, 1965)。
[0011]低亞麻酸品種的育種是特別有挑戰(zhàn)的，因?yàn)镃18:3含量是一種多基因性狀，并且以隱性方式以相對(duì)較低的遺傳力遺傳。源自"Stellar"(具有低C18:3含量(3%))和"Drakkar"(具有〃常規(guī)的〃C18:3水平(9-10% ))之間的雜交的群體的遺傳分析指示低C18:3性狀受到稱作LI和L2的具有加和效應(yīng)(additive effect)的兩個(gè)主要基因座控制(Jourdren等，1996b)。發(fā)現(xiàn)控制C18:3含量的這兩個(gè)主要基因座對(duì)應(yīng)于兩個(gè)fad_3 (脂肪酸去飽和酶-3)基因；一個(gè)位于A基因組(源自蕪青)上，而另一個(gè)位于C基因組(源自甘藍(lán)(Brassica olecera))上(Jourdren 等，I"6 ；Barret 等，I"9)。
[0012]由于遺傳(加和、顯性和上位)和環(huán)境影響而不斷變化的性狀通常稱為“數(shù)量性狀”?；趦蓚€(gè)因素可將數(shù)量性狀與“質(zhì)量”或“離散”性狀區(qū)別:對(duì)基因表達(dá)的環(huán)境影響，其產(chǎn)生表型的連續(xù)分布；和通過(guò)多基因遺傳力產(chǎn)生的復(fù)雜分離方式。與數(shù)量性狀的表達(dá)有關(guān)的基因組的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域的鑒定導(dǎo)致數(shù)量性狀基因座(“QTL”)的發(fā)現(xiàn)。Thormann等(1996)定位兩個(gè)QTL，其解釋亞麻酸含量的60%變化，而Somers等(1998)鑒定三個(gè)QTL，其共同解釋C18:3含量的51%表型變化。Chen和Beversdorf (1990)也報(bào)告了三基因座加和模型。Rucker和Robbelen (1996)指示幾個(gè)次要基因最可能牽涉去飽和步驟。
[0013]C18:3含量的遺傳力估計(jì)為26-59% (Kondra和Thomas, 1975)(其中與環(huán)境因素形成對(duì)比，遺傳力的變化性是遺傳學(xué)的函數(shù))。亞麻酸的遺傳力的復(fù)雜性可以是由于如下的事實(shí)，即亞麻酸可由C18:2的去飽和或C16:3的延長(zhǎng)而合成(Thompson, 1983)。[0014]與亞麻酸形成對(duì)比，油酸的遺傳力不太復(fù)雜，并且油酸的遺傳力是相對(duì)較高的。報(bào)告了高油酸含量受到稱作fad2(脂肪酸去飽和酶2)基因的主要基因座控制，該基因編碼負(fù)責(zé)將油酸去飽和成亞油酸(C18:2)的酶(Tanhuanpaa等，1998 ;Schierholt等，2001)。至今為止已經(jīng)報(bào)告和定位的fad2基因的所有功能性基因拷貝位于A基因組起源的連鎖群N5上(Scheffler 等,1997 ；Schierholt 等,2000)。Chen 和 Beversdorf (1990)報(bào)告了油酸的積累受到兩個(gè)分離遺傳系統(tǒng)控制，一個(gè)作用于鏈延長(zhǎng)，而另一個(gè)牽涉去飽和。C18:l含量的遺傳力分別估計(jì)為 53%至 78% (Kondra和 Thomasl975)及 94% (Schierholt 和 Becker, 1999)。由于較高的遺傳力，C18:1含量的表達(dá)不太受到環(huán)境影響且相對(duì)穩(wěn)定(Schierholt和Becker, 1999)。
[0015]在Nexera?蕓苔種質(zhì)中，發(fā)現(xiàn)I至2個(gè)基因控制C18:1含量，且至少3個(gè)基因參與C18:3表達(dá)(Nexera?是Dow AgroSciences, LLC的商標(biāo))。在分離后代中，種子C18:3含量的分布是連續(xù)的，由此使得難以鑒定具有期望C18:3水平的基因型類別。另外，溫室(GH)和田間種植的植物之間在脂肪酸含量上具有低的關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步使可靠選擇具有期望C18:3水平的GH植物變得有挑戰(zhàn)性。
[0016]可以使用多種方法檢測(cè)植物組織樣品中特定基因的存在。一個(gè)例子是Pyrosequencing 技術(shù)，如由 Winge (Innov.Pharma.Tech.00:18-24，2000)描述的。在此方法中，寡核苷酸設(shè)計(jì)為使得插入DNA序列和與其相鄰的基因組DNA重疊。將寡核苷酸與來(lái)自感興趣區(qū)域的單鏈PCR產(chǎn)物(“擴(kuò)增子”)雜交(即，插入序列中的一個(gè)引物和側(cè)翼基因組序列中的一個(gè))，并且在存在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、螢光素酶、腺苷三磷酸雙磷酸酶、腺苷5’磷酰硫酸和螢光素的情況下溫育。個(gè)別添加dNTP，并且并入導(dǎo)致測(cè)量的光信號(hào)。光信號(hào)指示由于成功的擴(kuò)增、雜交、和單或多堿基延長(zhǎng)所致的轉(zhuǎn)基因插入物/側(cè)翼序列的存在。(此技術(shù)通常用于初始測(cè)序，不用于特定基因已知時(shí)對(duì)其的檢測(cè)。)
[0017]熒光偏振是另一 種可用于檢測(cè)擴(kuò)增子的方法。遵循該方法，設(shè)計(jì)了與基因組側(cè)翼和插入的DNA連接處重疊的寡核苷酸。將寡核苷酸雜交于來(lái)自感興趣區(qū)域的單鏈PCR產(chǎn)物(一個(gè)引物在插入的DNA中，一個(gè)在側(cè)翼基因組DNA序列中)，并在DNA聚合酶和熒光標(biāo)記的ddNTP的存在下溫育。單堿基延伸導(dǎo)致ddNTP的并入。并入可使用熒光計(jì)作為偏振改變來(lái)測(cè)量。偏振的改變指示由于成功的擴(kuò)增、雜交和單堿基延伸所致的轉(zhuǎn)基因插入/側(cè)翼序列的存在。
[0018]已描述了分子燈塔(Molecular Beacon)用于序列檢測(cè)。簡(jiǎn)言之,分子燈塔包含F(xiàn)RET (熒光共振能量轉(zhuǎn)移)寡核苷酸探針，其經(jīng)設(shè)計(jì)與基因組側(cè)翼和插入DNA連接處重疊。FRET探針的獨(dú)特結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其含有保持熒光和淬滅部分緊密接近的二級(jí)結(jié)構(gòu)。在熱穩(wěn)定性聚合酶和dNTP的存在下循環(huán)FRET探針和PCR引物(一個(gè)引物在插入DNA序列中，一個(gè)在側(cè)翼基因組序列中)。在成功的PCR擴(kuò)增之后，F(xiàn)RET探針對(duì)靶序列的雜交導(dǎo)致探針二級(jí)結(jié)構(gòu)的去除和熒光和淬滅部分的空間上的分離。熒光信號(hào)指示由于成功的擴(kuò)增和雜交所致的側(cè)翼基因組/轉(zhuǎn)基因插入序列的存在。
[0019]水解探針測(cè)定法，亦稱作TaqMan? PCR( TaqMatl?,是 Roche MolecularSystems, Inc.的注冊(cè)商標(biāo))，提供了檢測(cè)和量化DNA序列的存在的方法。簡(jiǎn)言之，TaqMan:i PCR利用FRET寡核苷酸探針，其設(shè)計(jì)為具有轉(zhuǎn)基因內(nèi)的寡核苷酸的一部分和側(cè)翼基因組序列內(nèi)的寡核苷酸的另一部分以進(jìn)行事件特異性檢測(cè)。在熱穩(wěn)定性聚合酶和dNTP存在下循環(huán)FRET探針和PCR引物(一個(gè)引物在插入DNA序列中，而一個(gè)在側(cè)翼基因組序列中)。FRET探針的雜交，及隨后在PCR擴(kuò)增階段期間由于Taq聚合酶的5’外切核酸酶活性所致的消化導(dǎo)致FRET探針上將熒光部分從淬滅部分切割并釋放。熒光信號(hào)指示由于成功的擴(kuò)增和雜交所致的側(cè)翼/轉(zhuǎn)基因插入序列的存在。
[0020]分子標(biāo)志物也可用于DNA的序列特異性鑒定。分子標(biāo)志物選擇基于基因型，因此不依賴于環(huán)境效應(yīng)。分子標(biāo)志物有助于減輕溫室中植物的不可靠選擇的問(wèn)題，其可歸因于溫室種植植物和田間種植植物之間的脂肪酸含量的低關(guān)聯(lián)。顯著地，與控制C18:1和C18:3含量的基因緊密連鎖的分子標(biāo)志物可促進(jìn)攜帶高C18:1和低C18:3的基因的植物的早期選擇。早期階段的標(biāo)志物輔助選擇可幫助節(jié)省溫室空間，改善溫室使用的效率，并且降低田間的育種工作量。
[0021]更一般地，分子標(biāo)志物比形態(tài)學(xué)標(biāo)志物具有的優(yōu)勢(shì)在于:分子標(biāo)志物可以是高度多態(tài)性的，而形態(tài)學(xué)標(biāo)志物是嚴(yán)格表型依賴性的；形態(tài)學(xué)標(biāo)志物可以干擾某些數(shù)量表型的評(píng)分，而分子標(biāo)志物在基因型和表型之間展現(xiàn)出1:1關(guān)系(因此容許對(duì)給定基因座的所有可能基因型的明確評(píng)分)；并且上位相互作用趨于限制群體中有用的形態(tài)學(xué)標(biāo)志物的數(shù)目，而分子標(biāo)志物不會(huì)上位相互作用。
[0022]不同類型的分子標(biāo)志物如RAPD (隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA)標(biāo)志物(Tanhuanpaa等,1995 ；Hu 等,1995 ；Rajcan 等,1999 ; Jourdren 等,1996)、RFLP (限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性)標(biāo)志物(Thormann等，1996)和SCAR(序列表征的擴(kuò)增區(qū))標(biāo)志物(Hu等，1999)已經(jīng)鑒定為與歐洲油菜中的低C18:3水平有關(guān)。還已經(jīng)對(duì)高C18:1含量鑒定分子標(biāo)志物。RAH)標(biāo)志物鑒定為與影響春季蕪青油菜(蕪青油菜亞種(B.rapa ssp.0leifera))中的油酸濃度的QTL有關(guān)聯(lián)，并且后來(lái)轉(zhuǎn) 為SCAR標(biāo)志物(Tanhuanpaa等，1996)。Schierholt等(2000)鑒定出與冬季含油種子油菜(歐洲油菜)中的高油酸突變連鎖的三個(gè)AFLP(擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度多態(tài)性)標(biāo)志物。Tanhuanpaa等(1998)開(kāi)發(fā)出油酸的等位基因特異性PCR標(biāo)志物，其通過(guò)比較春季蕪青油菜(蕪青油菜亞種)中的fad2基因座的野生型和高油酸等位基因進(jìn)行。然而，這些中的大多數(shù)標(biāo)志物是低通量標(biāo)志物，如RAPD、AFLP和RFLP，并且不適合于通過(guò)自動(dòng)化的大規(guī)模篩選。
[0023]發(fā)明概述
[0024]本公開(kāi)內(nèi)容部分涉及端點(diǎn)TnqMan':: PCR測(cè)定法，用于蕓苔中fad-2基因的檢測(cè)和
高通量接合性分析。本公開(kāi)內(nèi)容進(jìn)一步部分涉及蕓苔中的野生型fad-2基因作為參照用于確定接合性的用途。這些和其它相關(guān)方法可用于獨(dú)特鑒定接合性和包含題述基因的蕓苔系的品種。
[0025]本公開(kāi)內(nèi)容還提供了用于從(例如蕓苔)的樣品確定接合性和品種的相關(guān)試劑盒。
[0026]如此，本公開(kāi)內(nèi)容的實(shí)施方案涉及TaqMane PCR，即一種用于高通量接合性和育
種分析的靈活平臺(tái)。在此與本公開(kāi)內(nèi)容一起提出的端點(diǎn)TacjManlliPCR應(yīng)用的利用提供蕓
苔的fad-2接合性和育種分析的可靠的、準(zhǔn)確的、且高通量的應(yīng)用。
[0027]附圖簡(jiǎn)述[0028]圖1:是fad-2基因序列的一部分(SEQ ID NO:1)，其顯示了由Hu等(2006)鑒定的fad-2c突變的位置。
[0029]圖2:是(蕓苔的)接合性分析結(jié)果的例子，其顯示了端點(diǎn)TaqMan1I則定法后的三個(gè) fad-2 基因型(使用可由 Applied Biosystems, Foster City, CA, USA 得到的 SDS2.4 軟件產(chǎn)生的結(jié)果)。
[0030]序列簡(jiǎn)述
[0031]SEQ ID NO:1提供了 fad_2基因序列的一部分，顯示了 fad_2c突變的位置。
[0032]SEQ ID N0:2提供了正向引物D-CL-FAD2-F(其結(jié)合側(cè)翼基因組序列)。
[0033]SEQ ID NO: 3提供了反向引物D-CL-FAD2-R2 (其結(jié)合插入序列)。
[0034]SEQ ID NO:4提供了探針D-CL-FAD2-VIC，用于優(yōu)先結(jié)合具有C至T單核苷酸多態(tài)性的突變fad-2基因。
[0035]SEQ ID NO:5提供了探針D-CL-FAD2-FAM，用于檢測(cè)野生型fad_2基因。
[0036]發(fā)明詳述
[0037]本公開(kāi)內(nèi)容部分涉及用于蕓苔中fad-2基因的檢測(cè)和高通量接合性分析的端點(diǎn)
TaqMan ': PCR測(cè)定法。本公開(kāi)內(nèi)容進(jìn)一步部分涉及蕓苔中的野生型fad-2基因作為參照 用于確定接合性的用途。這些和其它相關(guān)方法可用于獨(dú)特鑒定包含題述基因的蕓苔系的接合性和品種。本公開(kāi)內(nèi)容還提供了用于從(例如蕓苔)的樣品確定接合性和品種的相關(guān)試
劑盒。如此,本公開(kāi)內(nèi)容的實(shí)施方案涉及TaqMan? PCR,即一種用于高通量接合性和育種
分析的靈活平臺(tái)。在此與本公開(kāi)內(nèi)容一起提出的端點(diǎn)TaqMane PCR應(yīng)用的利用提供了對(duì)
于蕓苔的fad-2接合性和育種分析的可靠的、準(zhǔn)確的、且高通量的應(yīng)用。
[0038]部分基于由Hu等(2006)報(bào)道的fad_2等位基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)突變開(kāi)發(fā)本發(fā)明的新穎測(cè)定法。該測(cè)定法利用兩種引物區(qū)和兩種MGB探針檢測(cè)突變體和野生型fad-2等位基因(參見(jiàn)表1)。使用fad-2基因序列部分通過(guò)Primer Express軟件
(Applied Biosystems, Austin, Tx)設(shè)計(jì)了檢測(cè)此SNP突變的TaqMan?引物和探針。使
用從對(duì)于fad-2基因純合、半合和野生型(無(wú)突變)的蕓苔植物提取的DNA確認(rèn)此新的
fad-2 TaqMane:測(cè)定法。還使用快速PCR熱循環(huán)條件在96或384孔形式兩者上部分用
Applied Biosystems7900HT 實(shí)時(shí) PCR 系統(tǒng)優(yōu)化了 fad-2 TaqMan?測(cè)定法的性能。
[0039]表1:用于fad-2 丁aoMan⑩測(cè)定法的引物和探針序列
[0040]
【權(quán)利要求】
1.一種用于確定包含fad-2基因的蕓苔植物的接合性的方法，所述方法包括: 自所述蕓苔植物獲得基因組DNA樣品； 通過(guò)使所述基因組DNA樣品與第一引物和第二引物接觸而產(chǎn)生接觸樣品，其中所述第一引物優(yōu)先結(jié)合在感興趣的單核苷酸多態(tài)性位置上游的所述fad-2基因的區(qū)域，所述第二引物優(yōu)先結(jié)合在感興趣的單核苷酸多態(tài)性位置下游的所述fad-2基因的區(qū)域，其中所述第一引物和所述第二引物在進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)條件處理時(shí)生成擴(kuò)增子； 使所述接觸樣品進(jìn)行PCR條件處理，其中產(chǎn)生所述擴(kuò)增子； 容許第一熒光探針和第二熒光探針中每種于50-70攝氏度的溫度與所述擴(kuò)增子雜交一段時(shí)間，所述第一熒光探針在所述感興趣的單核苷酸多態(tài)性不存在于所述擴(kuò)增子中時(shí)優(yōu)先與所述擴(kuò)增子雜交，所述第二熒光探針在所述感興趣的單核苷酸多態(tài)性存在于所述擴(kuò)增子中時(shí)優(yōu)先與所述擴(kuò)增子結(jié)合； 在所述容許步驟中規(guī)定的時(shí)間段后提高所述溫度； 在提高步驟期間捕捉由所述第一和第二探針中每種產(chǎn)生的所述熒光；并 確定所述蕓苔植物的接合性，確定步驟包括比較由所述第一和第二探針中每種產(chǎn)生的所述熒光，其中主要反映純合SNP陽(yáng)性對(duì)照樣品中產(chǎn)生的熒光的所述第一和第二探針的熒光指示所述感興趣的 單核苷酸多態(tài)性的存在，主要反映純合SNP陰性對(duì)照樣品中產(chǎn)生的熒光的所述第一和第二探針的熒光指示所述感興趣的單核苷酸多態(tài)性的存在的缺乏，且主要反映雜合SNP陽(yáng)性對(duì)照樣品中產(chǎn)生的熒光的所述第一和第二探針的熒光指示所述蕓苔植物包含包括所述感興趣的單核苷酸多態(tài)性的第一等位基因和缺乏所述感興趣的單核苷酸多態(tài)性的第二等位基因。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述擴(kuò)增子由91個(gè)堿基對(duì)組成。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述單核苷酸多態(tài)性由C至T多態(tài)性組成。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述野生型序列包含所述位置處的胞嘧啶。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法用于雜交育種蕓苔植物的育種漸滲確認(rèn)(breeding introgression verification)。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述引物包含SEQID NO: 2和SEQ ID NO: 3，且所述第一和第二探針包含SEQ ID NO: 5和4。
7.權(quán)利要求1的方法，其中用突光染料和淬滅劑(quencher)兩者標(biāo)記所述第一和第二探針。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述第一探針包含在所述第一探針5’端作為所述熒光染料的FAM和在所述第一探針3’端的MGB淬滅劑。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述第二探針在所述第二探針的5’端用VIC標(biāo)記且在所述第二探針的3’端用MGB淬滅劑標(biāo)記。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二探針包含SEQID NO:4。
11.權(quán)利要求1的方法，其中在讀板儀中直接讀出所述方法的熒光結(jié)果。
12.權(quán)利要求1的方法，其中從田間的蕓苔植物獲得所述DNA樣品。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述提高步驟包括以每個(gè)時(shí)間段基本上一致的溫度增量提高所述溫度。
14.權(quán)利要求1的方法，其中在所述提高步驟的每個(gè)增量期間在所述捕捉步驟中捕捉所述提高步驟期間由所述第一和第二探針中每種產(chǎn)生的所述熒光。
15.一種用于實(shí)施權(quán) 利要求1的方法的試劑盒，所述試劑盒包含所述第一引物、所述第二引物、所述第一探針、和所述第二探針。
16.權(quán)利要求15的試劑盒，其中所述第一引物由SEQID NO: 2組成，所述第二引物由SEQID NO:3組成，所述第一探針由SEQ ID NO:5組成，且所述第二探針由SEQ ID NO:4組成。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104011226SQ201280063586
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2012年10月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月21日
【發(fā)明者】L.C.尤巴亞塞納, Z.埃勒特, C.S.A.錢納巴薩瓦拉德亞 申請(qǐng)人:陶氏益農(nóng)公司